informe nº9 determinaciÓn de residou 1 y 4 (autoguardado)
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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Facultad de Farmacia y Bioquímica
E.A.P. Farmacia y Bioquímica
Quinto Año Semestre 2013-I
Profesor Responsable: Q.F. José Llahuilla Quea
Integrantes:
Cano Mori, César Eduardo 08040003
Chávez Carbajal, Lucero 08040103
Gamarra Domínguez, Eliane 08040007
Pérez Guerrero, Fiorella 08040106
Quispe Ibarra Anthony 08040024
Horario de Laboratorio: Martes10:00 am – 2:00
pm
Práctica Nº9: Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos-Identificación de Residuos 1 y 4
Introducción
La toxicología forense ayuda al establecimiento de la relación causa-efecto entre la exposición de un medicamento o sustancia química y los efectos tóxicos o mortales que puedan causar esa exposición, las primeras investigaciones en toxicología forense datan del año 1850 en donde el Conde Hipólito de Bocarmé, asesina a su cuñado administrándole nicotina; para demostrar la causa de esta muerte Stass crea un método de aislamiento y extracción de tóxicos orgánicos fijos.1 A raíz de estos avances químicos y muchos otros, la Toxicología Forense adquiere un gran desarrollo que se va consolidando a medida que sus resultados analíticos pueden ser confirmados mediante la variada tecnología instrumental, cada vez más específica y sensible.
Hoy en día las drogas de abuso han pasado a ser de un problema global que afecta a muchos países, obligando a las naciones a intensificar sus esfuerzos por el control y regulación de algunas drogas3, es por ello que como futuros investigadores en el presente informe vamos a identificar los principales metabolítos producto de la biotransformación de sustancias tóxicas presentes en los fluidos y tejidos corporal.
Para la identificación de estas sustancias previamente es necesario realizar una extracción en un disolvente orgánico ya sea en medio ácido o alcalino de modo que nos permita extraer la mayor cantidad y pureza2 de estos tóxicos. Dentro de estos compuestos vamos a poder encontrar sustancias como las benzodiacepinas, carbamacepina, fenotiazinas, anfetaminas, antidepresivos tricíclicos, alcaloides, plaguicidas organofosforados, barbitúricos, salicilatos y otros analgésicos antipiréticos que hayan sido empleados como sustancias de abuso por el paciente.
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Práctica Nº9: Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos-Identificación de Residuos 1 y 4
Objetivos
Identificar los compuestos orgánicos fijos presentes en una muestra biológica de orina mediante reacciones específicas.
Determinar la presencia de salicilatos, fenotiazidicos y benzodiacepinas presentes en una muestra biológica de orina.
Conocer las propiedades, mecanismos de acción y las consecuencias de sus efectos lesivos.
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Determinación de Tóxicos orgánicos fijos
Identificación de Residuo 1 y 4
1. Marco teórico1.1. Salicilatos
Son sustancias hoy en día ampliamente empleadas por sus propiedades antiinflamatoria y analgésica, por ello se expenden de forma libre en muchos establecimientos farmacéuticos en sus presentaciones de salicilatos, acido acetil salicílico, salicilato de sodio o salicilato de dietilamina.5
Los salicilatos poseen como núcleo fundamental el ácido salicílico (ácido ortohidroxibenzoico) un potente irritante que solo puede usarse por vía tópica; sin embargo para su utilización y mejor absorción se han sustituido grupos carboxilos e hidroxilos dando como resultado la conocida aspirina, paracetamol, salicilato de metilo, entre otros.4
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Mecanismo de acción y toxicidadAbsorción: GI, Dérmica.Metabolismo: Hepático (depuración 3.9L/h)Unión a Proteína : 50-80%Volumen de distribución: 0.15L/kgExcreta: Orina depende ph alcalino
Efectos tóxicosSNC: hiperventilación, alcalosis respiratoria, deshidratación.S.RESPIRAT: edema pulmonar.S.HEMATO: alteración factor de coagulación, hemorragia.GI:nauseas, emesis, dolor abdominal,
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1.2. FenotiazinasLas fenotiazinas son un grupo de fármacos que se emplean principalmente en el tratamiento de la psicosis, se caracterizan por presentar un anillo tricíclico en el cual están ligados dos anillos de benceno por un átomo de nitrógeno y azufre.6 A partir
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Dosis tóxica
D.TERAPÉUTICA:40-60mg/Kg/día D. AGUDA: 150-200mg/Kg/díaD.SEVERA:300-500mg/Kg
Manifestaciones Clínicas
NauseasDeshidrataciónHipertemiaLetarcoConvulsiones
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de esta base se han podido sintetizar más de 30 fenotiazinas con diferentes acciones farmacológicas; uno de los primeros fármacos sintetizados fue la Clorpromazina indicado para estados de ansiedad, psicosis y agitaciones.
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Mecanismo de acción y toxicidadAbsorción: GI, Parenteral.Metabolismo: Hepático . Efecto anticolinérgico produce taquicardia, y el bloqueo alfa-adrenérgico causa hipotensión ortostática.Concentración plasmática máxima: 2- 4h Unión a Proteína : 80%Volumen de distribución: 20 L/kgExcreta: Orina y bilisVida media: 20-40h
Efectos tóxicosSNC: depresión.S.CARDIO: alteración en la repolarización, conducción auriculo-ventricular, S.DÉRMICO: hipersensisbilidad, reacciones cutáneas.S.METABÓLICO: hipercolesterolemia.
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1.3. Benzodiacepinas
Están compuestas por un anillo de benceno unido a un anillo de diazepina de siete miembros, sin embargo presentan una sustitución a nivel del carbono 5. Son tranquilizantes menores empleados con fines terapéuticos en el tratamiento psiquiátrico; sin embargo hoy en día también se emplean con fines delictivos junto con otros depresores del sistema nerviosos como el alcohol llevando al paciente a un estado de coma. Sus efectos más relevantes son la sedación, hipnosis, disminución de la ansiedad, relajación muscular, amnesia y actividad anticonvulsiva.7
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Dosis tóxica
D.LETAL: 150mg/Kg
Manifestaciones Clínicas
MiosisHipotensiónArritmiaDepresión respiratoriaAgitacionesHiper- HiportemiaLetarcoConvulsiones
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Mecanismo de acción y toxicidadAbsorción: GIMetabolismo: Hepático . Mecanismo de acción: potencian la acción inhibitoria del neurotransmisor (GABA), favoreciendo el ingreso de iones de cloro a la célula, lo cual genera hiperpolarización celular y disminuye la excitabilidad neuronal.Concentración plasmática máxima: 2- 3h Unión a Proteína : 80-90%Volumen de distribución: 1-3.5 L/kgExcreta:RenalVida media: 10h
Efectos tóxicos
SNC: depresión.S.RESPIRATORIO: complicaciones
Dosis tóxica
D.LETAL: ≥2000mg/Kg
Manifestaciones Clínicas
AtaxiaLetargiaSomnolenciaMidriasisBradicardiaTaquicardiaHipotensiónHipotermia
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2.
Parte experimental
2.1. Reactivos, materiales y equipos
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REAC
T IVOS
T e t r a c lo r u r o d e fi e r r o C l3 F e 5 %Á c id o c lo r h ídr ic o H C l 1 0 %R v o d e T r in d e rR v o F .P .N .R v o D r a g e nd o r fN it r ito d e s o d io N O 2 N a 0 .1 %S u lfa ma t o d e a m o n io 1 %N -n a ft ile tile n d iam in o c lo r h idr a t o 0 .1 %
MA
T ER IA
L ES
C a p s u la d e p o r c e lan aT u b o d e e n s a y o d e v id r ioB a ñ o m a r iaP la c a c ro m a tog rá fi c a d e s il ic a g e lC á m a ra c ro m a tog rá fi c aC a p ila rP ip e ta d e v id r io d e 1 , 5 y 1 0 m lP ro p ite ta d e p lá s ti c o o b o m b illa
EQUIPOS
C á m a ra e x t ra c to r a d e g a s e s d e la b o r a to r ioE s p e c t ro fo t óm e t r o
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2.2. Técnica operatoria 2.2.1. Identificación de Salicilatos (R1)
A. Reacciones Generales
Se basa en la formación de un complejo coloreado de tetrafenol-hierro, por la presencia de hierro (III) y el anillo fenólico de los salicilatos. La formación de una coloración roja, azul o púrpura indica una reacción positiva frente a la presencia de fenoles.
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Fundamento
Reacción Química
Mecanismo de acción
FeCl3 + 3 C7H6O3 = Fe (C7H6O3)3 + Cl3
Método operatorio
Gts R1 (Disuelto en etanol) Gts Cl3Fe 5%
Coloración azul, roja, púrpura.
Si la reacción es positiva
Agregar HCl 10%
Desaparece el color.
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Reactivo Positivo/Negativo ColoraciónCl3Fe ++ PúrpuraHCl ++ Amarillo
B. Cuantificación
El reactivo de Trinder [HgCl2-Fe(NO3)3] produce un color púrpura, aconsejable para la determinación cuantitativa de salicilatos por espectrofotometría U.V. siendo característico a una absorción cuya longitud de onda es 540 nm
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Resultado
Fundamento
Método operatorio
MP ST
5ml Rvo Trinder
1ml HCl 1ml MP o St
(5mg Ácido salicílico)
5mg AAS100mlX = 0.05mg AAS 1ml
0.508 A ST0.05mg AAS0.549 AMPX= 0.0540mg AAS
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Absorbancia MP 0.549ST 0.508
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Reacción Química
Mecanismo de acción
Resultado
Leer a 540nm por espectrofotometría
FeCl3 + 3 C7H6O3 = Fe (C7H6O3)3 + Cl3
0.0540mg AAS2ml ORINA X100X=2.7mg%
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2.2.2. Identificación de Fenotiazínicos (R4)A. Reacción de caracterización
Se basa en la formación de un compuesto coloreado verde oscuro o azul-verde que indica la presencia de compuestos fenólico como el ácido fenilpiruvico (metabolítos) o de ácidos relacionados. El color puede aclararse lentamente pasando al amarillo.
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Fundamento
Método operatorio
Gts R4(diluido en etanol)
Evaporar II gts Cl3Fe al
5%
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B. Reacción específica
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Mecanismo de acción
Resultado
Reacción Química
El color azul-verde no debe desaparecer.
Reactivo Positivo/Negativo ColoraciónCl3Fe ++ Azul HCl 10% ++ No desaparece
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Forrest F.M y Forrest F.L, en 1960, propusieron un método de determinación cualitativa basado en el uso de FeCl3, HClO3 y HNO3 (el reactivo FPN, de fierro, perclórico y nítrico), el cual produce un radical libre con coloración variable (azul, azul violáceo).
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Fundamento
Método operatorio
Mecanismo de acción
III Gts del Rvo FPN
5 mlCl3Fe 5% 45ml NO3H C
50ml Ac. Perclórico
Gts R4 (diluido en etanol)
Evaporar
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2.2.3. Identificación de Benzodiacepinas (R4)A. Reacción general ( Dragendorff)
Se basa en la identificación de alcaloides, siendo específico para compuestos nitrogenados presentes en la benzodiacepinas que por acción del Reactivo de Dragendorff (yoduro de potasio y bismuto) han de formar un compuesto rojo ladrillo característico.
B. Reacción específica
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Resultado
Fundamento
Método operatorio
Resultado
III Gts R4
Evaporar III Gts Rvo Dragendorff
Formación de precipitado rojo ladrillo
Reactivo Positivo/Negativo ColoraciónFPN + Rojo violáceo
Reactivo Positivo/Negativo ColoraciónDragendorff +++ Rojo ladrillo
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Se fundamenta en el empleo del reactivo de Bratton- Marshall (Nitrito de sodio, sulfamato de amonio y N- (1- Naftil) etilendiamina.) para la determinación de benzodiacepinas por diazotización.Este reactivo fue propuesto originalmente por sus creadores para la determinación de sulfonamidas en orina, en donde previamente la orina debía ser sometida a una hidrólisis ácida con HCl para la producción de una benzofenona, con el medio ácido proporcionado previamente, el nitrito de sodio se convierte a ácido nitroso y se lleva a cabo la reacción de diazotización
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Fundamento
Método operatorio
Gts R4
5ml HCl 6N
Baño en glicerina
A temperatura de 124ºC
Por 30´min
Enfriar
1ml NO2Na 0.1% 1ml Sulfamato
de amonio 1% 1ml N-
naftiletilendiamino clorhidrato 0.1%
Azul, rojo violáceo
Reacción Química
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Mecanismo de acción
Resultado
Reactivo Positivo/Negativo
Coloración
N-naftiletilendiamino
+++ Rojo violáceo
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2.2.4. Screenig en Cromatografía de capa fina
La cromatografía en capa fina es la separación de dos o más moléculas presentes en una mezcla en base al principio de reparto entre dos fases. Sirve para hacer una determinación en serie de los metabolítos que queremos evaluar, aunque tienen la ventaja de ser rápidos y de rutina, puede que en algunos casos no sean tan específicos como los métodos anteriormente descritos.
Compuesto en estudio
Revelador
Salicilatos Reactivo de Trinder
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Fundamento
Método operatorio
Soporte: Silicagel G
Sistema de solvente
Reveladores
Compuesto en estudio
Sistema de solvente
Proporción
Salicilatos Metanol 5mlAgua 5ml
FenotiazinicosBenzodiacepínico
Metanol 5mlAgua 5ml
Trietanolamina 0.03ml
Rf: Mide la retención de un componente.Rf= Distancia de la muestra desde el origen
Distancia del eluyente desde el origen
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Fenotiazinicos Reactivo de FPNBenzodiacepínico Reactivo de Dragendorff
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Se realiza la siembra hasta 15 veces de las muestras problemas y los estándares con ayuda de un capilar pequeño.El punto de siembra debe estar por encima del nivel de la fase móvil.
Introducir las placas o soportes de silicagel G en la cámara cromatográfica para realizada la corrida.
Se procede a secar con cuidado las placas y se revela, tienen que colocarse en distintos roceadores para evitar mezclas.
Resultado
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3. Discusión de resultados
Para la identificación de tóxicos orgánico fijos como los salicilatos, fenotiazinas y benzodiacepinas se emplearon métodos químicos de reacciones cualitativas y cuantitativas colorimétricas que fueron específicas para cada uno de estos compuestos, los resultados fueron positivos; sin embargo las cantidades encontradas en los residuos R1 Y R4 fueron mínimos según los valores obtenidos al confirmar con los calores limites. Para una mejor identificación de
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Rx: Mide la relación entre el estándar
Rx= Distancia recorrida por el compuesto de referencia
Distancia recorrida por el eluyente
Sustancia Rf RxSalicilatos 0.46 0.53
Fenotiazinicos 0.52 0.50Benzodiacepinas 0.70 0.66
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estos compuestos se realizó una determinación por cromatografía en capa fina empleando sílica gel-G que permitió comparar nuestras muestras problema frente a un compuesto estándar; para ello se emplearon diferentes reactivos como el Rvo de Trinder, Rvo FPN y Rvo de Dragendorff los cuales fueron potenciados al agregar nitrato de sodio en el proceso de revelado.
4. Conclusiones
Se determinó la presencia de salicilatos, benzodiacepinas y fenotiazinas en los residuos R1 y2 de una muestra biológica de orina mediante reacciones específicas colorimétricas.
Las concentraciones encontradas de salicilatos no sobrepasa el límite tolerado, por lo tanto no podrían causar grandes consecuencias de efectos lesivos a corto plazo.
La presencia de benzodiacepinas y fenotiazinas podría causar efectos lesivos si se encuentran a altas concentraciones en el organismo.
5. Bibliografía
1. Drogas en pelo: sus alcances y limitaciones I" Perkins de Piacentino, A. M.; Locani, O. A.; Lorenzo, J. L. LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL. Cuerpo Médico Forense, Corte Suprema de Justicia de la Nación Argentina.
2. Repetto, Manuel; Repetto, Guillermo. Toxicológica fundamental. 4a ed. Sevilla: Editorial Diaz de Santos; 2009. Pág. 526
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Práctica Nº9: Determinación de Tóxicos Orgánicos Fijos-Identificación de Residuos 1 y 4
3. Osvaldo Romo Pizarro. Medicina legal: elementos de ciencias forenses. 1ª edición. Santiago de Chile. 2000. Pág. 5
4. Lorenzo F.P. Moreno G.I Hernández J.C. Farmacología: Básica y Clínica. 18ª edición. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana. 2008. Pág. 532
5. Secretaria de salud del Gobierno del estado de Veracruz. Guía de diagnostico y tratamiento intoxicación por salicilato. 2012. Disponible en [www.ssaver.gob.mx./cilver]
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7. Rozo U.R. Alvarado B.J. Guía de Práctica clínica Toxicología. 1ª edición. Volumen II, Tomo IV. Bogotá: Editorial Médica Latinoamericana. 2004. Pág 76-78.
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