informe de tesis ii bioquimica

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

INFORME DE TESIS II

Efecto de las nanopartículas de plata sobre Salmonella tiphy y Streptococcus pyogenes in vitro.

PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:

BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA

AUTOR(ES):

ASMAT AGUIRRE, Elena Cristila

ASMAT AGUIRRE, Sandra Nattier

ASESOR:

Q.F. RENGIFO PENADILLOS, Roger Antonio

TRUJILLO-PERÚ

2019

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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DEDICATORIAS

El presente trabajo es dedicado a Dios, por su apoyo incondicional en todo momento.

Gracias Dios por estar siempre.

A nuestro padre, Edgardo William Asmat Asmat, por la sabiduría que nos inculca para

culminar nuestros objetivos.

A nuestra madre, Cristila M. Aguirre Plasencia por el empuje para conseguir nuestros

objetivos.

A nuestros hermanos, Cristhian, Gabriela, Marino y Mariano por su compañía y darnos

la motivación necesaria en cada objetivo, por sus consejos brindándonos sus

experiencias, para no caer en los errores, gracias por los momentos tan gratos.



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AGRADECIMIENTOS

A Miguel Ángel.

A beu nen,

que nuestro encuentro sea muy especial.

A mis amistades, a Rosario.

A nuestro asesor Roger Antonio Rengifo Penadillos, gracias.

Sandra Nattier Asmat Aguirre.



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AGRADECIMIENTOS

Al maestro Roger A. Rengifo Penadillos,

así como también al jurado denominado;

por su apoyo incondicional y la paciencia

que nos tuvo, para la realización de

la presente tesis.

A David A. Asmat Campos,

por sus grandes conocimientos brindados

en la parte metodológica para lograr esta investigación,

y por su comprensión hacia nosotras, sus tesistas.

A la docente Manuelita Luján Velásquez,

por su colaboración en la parte

microbiológica experimental.

A Carlos A. Medina M.,

a R. Katherine Gutierréz V., Jonathan Collantes R.

y a Willans López G. por su apoyo incondicional,

por mantenerme firme en mis decisiones

para lograr mis metas;

gracias a ustedes me considero una mejor persona.

Elena Cristila Asmat Aguirre.



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PRESENTACIÓN

Señores miembros del Jurado Dictaminador:

Dando el cumplimiento a lo establecido por el reglamento de grados y títulos de la facultad de

Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, nos es grato someter a vuestra

consideración y elevado criterio profesional, el informe de tesis II intitulado:

EFECTO DE LAS NANOPARTÍCULAS DE PLATA SOBRE Salmonella tiphy Y

Streptococus pyogenes in vitro.

De manera muy especial agradecemos la colaboración de los señores miembros del jurado.

Dejemos a vuestra consideración señores miembros del jurado, la respectiva calificación del

presente informe.

Trujillo, marzo 2019

Las autoras.



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JURADO DICTAMINADOR

Mg. María Virginia Gonzalez Blas

Presidente

Mg. Roger Antonio Rengifo Penadillos

Miembro

Dr. Julio Víctor Campos Florian

Miembro



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RESUMEN

El presente trabajo tiene como objetivo determinar el efecto de las nanopartículas de plata

(NPs Ag) sobre Salmonella tiphy y Streptococus pyogenes, in vitro. Se sintetizó las NPs

Ag a partir del extracto acuoso de Vaccinium corymbosum y solución de Nitrato de plata,

se caracterizó las NPs Ag utilizando microscopio electrónico de trasmisión (TEM) y

espectrofotómetro UV-vis y se aplicó las NPs Ag sobre dos cultivos de bacterias

Salmonella typhi y Strepctococcus pyogenes midiéndose los diámetros de los halos de

inhibición del crecimiento bacteriano. Mediante TEM se pudo observar que las NPs Ag

tienen una forma esférica, la espectroscopía UV-vis presenta una longitud de onda de

408nm con una máxima absorbancia de 0,41; las medidas de los halos de inhibición de

crecimiento bacteriano por acción de las NPs Ag de 0,0116 mg/10uL, 0,0232 mg/20uL,

0,0348 mg/30uL y 0,0464 mg/40uL fueron de 6,4mm, 8,4mm, 12,6mm, 15mm para

Streptococcus pyogenes y 6,4mm, 8,6mm, 13,8mm, 19,3mm para Salmonella tiphy. Las

NPs Ag tienen forma esférica, presenta un diámetro de 13,19 nm correspondiente a λmáx

a 408nm, e inhiben el crecimiento de Salmonella tiphy y Streptococcus pyogenes.

Palabras claves: Streptococcus pyogenes, Salmonella tiphy, Nanopartículas de plata,

caracterización, antibacteriano.



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ABSTRACT

The objective of this work is to determine the effect of silver nanoparticles (Ag NPs) on

Salmonella tiphy and Streptococcus pyogenes, in vitro. The Ag NPs were synthesized

from the aqueous extract of Vaccinium corymbosum and silver nitrate solution, the Ag

NPs were characterized using transmission electron microscopy (TEM) and UV-vis

spectrophotometer and the Ag NPs were applied on two bacterial cultures of Salmonella

typhi and Strepctococcus pyogenes measuring the diameters of the halos of inhibition of

bacterial growth. . Using TEM it was observed that the Ag NPs have a spherical shape,

the UV-vis spectroscopy has a wavelength of 408nm with a maximum absorbance of

0,41; the measurements of the haloes of inhibition of bacterial growth by the action of the

Ag NPs 0.0116 mg/10uL, 0.0232 mg/20uL, 0.0348 mg/30uL and 0.0464 mg/40uL were

6,4mm, 8,4mm, 12,6mm, 15mm for Streptococcus pyogenes of 6,4mm, 8,6mm, 13,8mm,

19,3mm for Salmonella tiphy. The Ag NPs are spherical in shape, have a diameter of

13.19 nm corresponding to λmax at 408nm,, and inhibit the growth of Salmonella tiphy

and Streptococcus pyogenes.

Key words: Streptococcus pyogenes, Salmonella tiphy, Silver nanoparticles,

characterization, antibacterial



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ÍNDICE

DEDICATORIAS …………………………………………………………………………………………………………. i AGRADECIMIENTOS …………………………………………………………………………………………………………….. ii

PRESENTACIÓN ……………………………………………………………………………………………………………………. iv

JURADO DICTAMINADOR …………………………………………………………………………………………………….. v

RESUMEN ......................................................................................................................................vi

ABSTRACT ..................................................................................................................................... vii

I. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1

II. MATERIAL Y MÉTODO ......................................................................................................... 11

III. RESULTADOS ................................................................................................................... 17

IV. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 21

V. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 24



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I. INTRODUCCIÓN

Las Nanopartículas (NPs) han existido desde siempre, para conservar la juventud y

mantener una buena salud; para fines curativos, también se empleaba como colorantes

inorgánicos en porcelanas1,2.

Existen NPs asociadas a distintos metales, por ejemplo, las Nanopartículas de oro, silicio,

polietilenglicol, aluminio, óxido de zinc y dióxido de titanio; que se están utilizando para

el tratamiento de algunas enfermedades de las plantas y para la mejora de la asimilación

de nutrientes esenciales por las plantas; también pueden usarse como nuevas

formulaciones de pesticidas, insecticidas y repelentes de insectos mediante técnicas de

nanoemulsión o nanoencapsulación3.

Estas NPs son capaces de entrar a las células, transitar a través de vasos sanguíneos,

atravesar la barrera hematoencefálica y llegar a sitios donde los compuestos

convencionales no logran llegar. En general, el uso de nanomateriales se ha enfocado en

el diagnóstico y tratamiento de cáncer en su mayoría, así como también en las

enfermedades infecciosas4.

Los mecanismos que presentan las NPs con acción bactericida sobre los microorganismos

no han sido completamente dilucidados, aunque se han postulado varios; entre éstos se

pueden mencionar perturbaciones en las funciones de la membrana celular (las cuales

alteran la permeabilidad y la respiración celular), el ingreso de las NPs a la célula, lo que

genera una alteración en las funciones de las proteínas y el ADN, o la producción de

especies oxidativas debido a la presencia de NPs en el interior de la célula6,7. Algunos

estudios han mostrado que su efecto depende de una serie de factores como son: el

tamaño, el área superficial, la forma, la carga superficial, la solubilidad y el estado de

aglomeración8.



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Todos esos factores son de gran importancia, en lo que respecta al tamaño y a la superficie

específica de las NPs Ag están en estrecha relación, ya que conforme disminuye el tamaño

de las NPs Ag la superficie específica aumenta dejando un mayor número de átomos

expuestos en la superficie, que estarán disponibles para las reacciones redox, reacciones

fotoquímicas y para interacciones físico-químicas con las células9,10. El tamaño también

influye en la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs); por ejemplo, con la

misma concentración de NPs Ag, NPs Ag de un tamaño de 15nm produjeron mayores

niveles de EROs en macrófagos que NPs Ag de 30 y 50nm11.

La forma influye en la toxicidad de las NPs Ag; esta está estrechamente relacionada con

el área superficial. Se ha comprobado que las NPs de forma esférica son más reactivas y

por ende poseen más efecto que aquellas de forma de triángulo truncado y alargadas, ya

que tienen un área superficial mayor9, 12.

La estabilidad de las NPs Ag influye en la toxicidad. Las NPs tienen una tendencia natural

a formar aglomerados o agregados14. Los aglomerados son grupos de partículas unidas

mediante fuerzas relativamente débiles de tipo van der Waals, electroestáticas o de

tensión superficial, que pueden resdispersarse por medios mecánicos. Mientras que los

agregados son grupos de partículas fuertemente asociadas cuya redispersión por medios

mecánicos no resulta fácil. Estos dos fenómenos pueden cambiar el lugar de depósito de

las NPs Ag en el organismo, ya que un agregado o aglomerado de NPs se deposita en

unas zonas u otras debido al distinto diámetro hidrodinámico. Además, también modifica

el efecto, ya que, al ser una estructura relativamente compacta, el área superficial es

menor y por tanto el efecto también será menor14, 15.

Badawy y col. observaron que las NPs Ag estabilizadas con citrato con cargas

superficiales negativas fueron menos citotóxicas que las NPs Ag con cargas superficiales



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positivas estabilizadas con polietilenimina ramificada; por lo tanto, es importante realizar

una caracterización detallada de cada una de las NPs con el fin de comprender y controlar

la síntesis y las aplicaciones de las NPs16.

Para la caracterización de las NPs se emplean una variedad de técnicas, como por

ejemplo, el microscopio electrónico de transmisión (TEM) (determina el tamaño del

núcleo metálico), el microscopio de fuerza atómica (AFM) (mide el tamaño de la NP y

su distribución), el microscopio electrónico de barrido (SEM), y por último, a través de

la dispersión de luz dinámica (DLS) (determina el radio hidrodinámico, esto es, el tamaño

de la NP)17, 18. Otras técnicas que también se podrían emplear para la caracterización de

las NPs son la espectrometría de infrarrojo (IR) y la espectrometría de ultra violeta (UV),

entre otras19,20.

Por otra parte, la capacidad microbicida de las NPs Ag se ha evaluado en diferentes

microorganismos y una de las características que hace más atractivo a la aplicación de las

NPs Ag, es la baja probabilidad del desarrollo de resistencia por parte de los

microorganismos en comparación a los antibióticos13.

En la actualidad se están buscando nuevas alternativas para la producción de las

nanopartículas como la síntesis verde, ya que producen una menor cantidad de desechos

tóxicos; este tipo de síntesis incluyen elementos como pétalos de flores y extractos de

plantas21.

La síntesis química de nanopartículas de plata, generalmente se realiza a partir de una

solución acuosa o no acuosa de sales de plata en presencia de un medio protector para el

crecimiento de las nanopartículas. Los mecanismos involucrados durante el proceso de

síntesis son: la reducción de iones Ag+, el choque de dos o más átomos de plata para dar

origen a un cúmulo estable y el crecimiento de los cúmulos por agregación de más átomos



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obtenidos de la reducción de los iones o por agregación de cúmulos hasta que finalmente

se detiene el crecimiento utilizando algún medio protector. Las sustancias utilizadas para

estabilizar las nanopartículas de plata son: micelas inversas, vesículas o surfactantes,

polifosfato de sodio, polivinilpirrolidona, polímeros y otras sustancias. La sal de plata

más intensamente utilizada en esta síntesis es AgNO322.

La síntesis verde de nanopartículas, también denominada “síntesis biológica” ha

permitido la formación de nanoestructuras metálicas a partir del uso de bacterias, hongos,

plantas o sus extractos, por lo que esta representa una alternativa presumiblemente no

tóxica, amigable con el medio ambiente y además es simple, económicamente costeable,

conveniente, compatible y segura23, 24.

Uno de los elementos, parte de la naturaleza, son los frutos de Vaccinium corymbosum;

estos, tienen un alto contenido de fibra, vitamina C y vitamina K, bajas concentraciones

en calorías. Su gran capacidad antioxidante es la más alta entre las frutas y vegetales que

consumimos debido al conjunto de metabolitos secundarios con los que cuenta25.

Esta especie de arándanos, pertenecen a la familia de las Ericáceas, que son de mayor

interés comercial; estos son arbustos que alcanzan alturas que miden entre 20 y 60cm. El

fruto de Vaccinium corymbosum, es una baya redondeada, de 7 a 9 mm de diámetro, de

color negro azulado, cubierta de pruina azul y con un ribete en lo alto a modo de coronita,

su carne, de un agradable sabor agridulce, es de color vinoso, y en la parte central contiene

diversas simienes25, 26, 27.

La resistencia a los antibióticos es hoy una de las mayores amenazas para la salud

mundial, la seguridad alimentaria y el desarrollo; es un fenómeno natural, aunque el uso

indebido de estos fármacos en el ser humano y los animales está acelerando el proceso.

Cada vez es mayor el número de infecciones, por ejemplo, neumonía, tuberculosis,



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gonorrea y salmonelosis cuyo tratamiento se vuelve más difícil debido a la pérdida de

eficacia de los antibióticos, siendo difíciles de erradicar. La resistencia a los antibióticos

prolonga las estancias hospitalarias, incrementa los costos médicos y aumenta la

mortalidad28, 29.

Uno de los principales impulsores de la propagación de la resistencia entre las bacterias

son los transposones, también llamados ADN saltarines: elementos genéticos que pueden

cambiar sus ubicaciones en el genoma de forma autónoma. Cuando se transfieren entre

bacterias, los transposones pueden transportar genes de resistencia a antibióticos dentro

de ellos29.

El nuevo Sistema Mundial de Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos de la

Organización, denominado GLASS por sus siglas en inglés, ha revelado la presencia

generalizada de resistencia a los antibióticos en muestras de 500 000 personas de 22

países en las que se sospechaban infecciones bacterianas30.

Entre las bacterias resistentes, las más frecuentes hasta la actualidad son Escherichia

coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae,

Streptococcus pyogenes, seguidas de Salmonella spp30.

Los estreptococos β-hemolíticos del Grupo A, o Streptococcus pyogenes; tienen varias

características que contribuyen a su virulencia, y sus mecanismos han sido estudiados

en forma extensa. Este microorganismo sigue siendo un patógeno humano

extremadamente importante cuyos únicos reservorios conocidos en la naturaleza son

la piel y las mucosas de los seres humanos31.

La infección más frecuente causada por estos estreptococos es la faringitis estreptocócica.

La mayoría de los casos de faringitis se observan en niños de edad escolar (5-15 años)



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durante el invierno o la primavera. Luego de un periodo de incubación inicial de 2 a 4

días, el inicio suele ser súbito, con fiebre, odinofagia, cefalea, malestar general y dolor

abdominal. La porción posterior de la faringe suele estar inflamada y tumefacta, y se

puede presentar un exudado blanco grisáceo sobre las amígdalas. Los ganglios linfáticos

cervicales anteriores habitualmente son dolorosos a la palpación y están tumefactos32, 33.

En la actualidad, las recomendaciones para el tratamiento de la faringitis estreptocócica

son penicilina V por vía oral (niños:250mg/2 o 3 veces por día; adolescentes y adultos:

250mg/ 3 o 4 veces por día; o 500mg/2 veces por día), durante 10 días, o penicilina G

benzatínica intramuscular (600 000 a 1,2 millones de unidades)33. La Eritromicina

(dosificación dependiente de la fórmula utilizada) es una alternativa apropiada para los

pacientes alérgicos a la penicilina; aunque se ha comunicado una resistencia importante

a los macrólidos entre los estreptococos del grupo A, en varios países (Australia,

Filipinas, Canadá, Hawai, Japón, Italia, Grecia, Filipinas, Suecia) se ha demostrado que

menos del 5% de las cepas son resistentes a la eritromicina34.

Además de la faringitis, los estreptococos β-hemolíticos del grupo A causan distintas

infecciones cutáneas superficiales, entre ellas impétigo, erisipela, celulitis, sepsis

puerperal e infecciones posparto35; también puede causar neumonía, meningitis,

osteomielitis, endocarditis, peritonitis e infecciones hospitalarias36. Estos estreptococos

se han unido a la lista creciente de otros microorganismos implicados en la peritonitis

asociada con diálisis peritoneal ambulatoria continua37.

Otra bacteria resistente a los antibióticos es la Salmonella, que pertenece a la familia

Enterobacteriaceae. La ingestión de esta es la principal ruta de infección, así como la

mucosa del tracto respiratorio y la conjuntiva38. Salmonella spp constituye uno de los



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agentes infecciosos más comunes y ampliamente distribuidos dentro de las enfermedades

trasmitidas por los alimentos, instituyéndose en un problema de salud pública y animal39.

Las infecciones por Salmonella se transmiten al hombre por el consumo de alimentos

contaminados con heces humanas. La mayoría de las infecciones por Salmonella se

presentan como cuadros de gastroenteritis (salmonelosis); sin embargo, también se

asocian a infecciones extraintestinales, algunas de las cuales pueden evolucionar a

cuadros severos e incluso a la muerte40.

La fiebre tifoidea es un problema de salud pública en los países en desarrollo. De acuerdo

con el Boletín de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se observa un incremento

de 21,6 millones a 26,9 millones de casos de fiebre tifoidea, con más de 200 mil muertes

por año. La región de Latinoamérica tiene una incidencia media de fiebre tifoidea de 10

a 120 casos por cada 100 mil habitantes, por año41. Se trata con antibióticos, pero existe

resistencia a algunos de ellos, como las Fluoroquinolonas, por ello, es que se están

utilizando antibióticos más recientes, como las Cefalosporinas y la Azitromicina.

Esporádicamente se ha descrito resistencia a esta última, pero todavía no es frecuente.

Los pacientes pueden seguir siendo portadores de la bacteria después de la desaparición

de los síntomas, lo cual significa que pueden transmitirla a otras personas a través de las

heces41.

Se recomiendan utilizar cualquier de los siguientes fármacos para el tratamiento de S.

typhi: Ampicilina, Amoxicilina, Trimetoprim,-Sulfametoxazol, Ciprofloxacina, Cefixima

y Cloranfenicol. La elección se establecerá de acuerdo con la sensibilidad y resistencia

locales a los antimicrobianos, así como a la evolución clínica del caso en específico

(aislado, o fuera de brote epidémico): 42, 43.



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El uso indebido de antibióticos, incluyendo la subdosificación, así como la terapia con un

único principio activo y en algunos casos la utilización de antibióticos como preventivo,

ha conllevado al desarrollo de resistencia a antimicrobianos en bacterias asociadas a

animales de consumo44.

Panyman y col. en su trabajo de investigación intitulada “Nanopartículas biodegradables

para el suministro de fármacos y genes a células y tejidos”; evaluaron la utilización de las

NPs Ag contra el tratamiento de enfermedades que requieren una concentración

mantenida de fármaco en sangre o con un direccionamiento específico a células u órganos

como el virus del VIH-1, ya que ha sido demostrado que el tratamiento in vitro con NPs

Ag interacciona con el virus e inhibe su capacidad para unirse a las células del

huésped45,46.

Hernández R. y col, estudiaron los efectos selectivos y específicos de las NPs Ag

inducidos en las células endoteliales coronarias y el tono vascular regular en los anillos

de la aorta; y observaron que las NPs Ag interaccionaron con las células endoteliales de

dos maneras: a bajas concentraciones, las NPs Ag actuaron como factores

antiproliferativos/ vasoconstrictores que perjudicaron la producción de Óxido nítrico

(NO). Sin embargo, a altas concentraciones, las NPs Ag estimularon la proliferación/ vaso

relajación mediada por NO. Este estudio indica que los niveles de exposición de las NPs

Ag juegan un papel significativo en la toxicidad y puede tener otro impacto

físicoquimico47.

Debido a lo anteriormente planteado se ha buscado la manera de utilizar agentes naturales

y renovables como las plantas, especialmente las cultivables en nuestro país, para

introducirlas en los procesos químicos y con esto reducir en lo posible no solo los costos



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de manufactura sino los daños a la salud humana y al medio ambiente, además de

aprovechar las bondades y propiedades de algunas plantas como los arándanos.

Por ello, el presente trabajo de investigación, busca determinar el efecto de las

Nanopartículas de plata sintetizadas a partir de Nitrato de plata y el extracto acuoso de

Vaccinium corymbosum, sobre bacterias Salmonella tiphy y sobre Streptococcus

pyogenes; por lo que, si esta acción in vitro logra inhibir el crecimiento de las bacterias

estudiadas, se podrá comparar con un medicamento respectivo que las combata con la

finalidad de comprobar cuál es el más eficaz; usándolos posteriormente en estudios

experimentales in vivo.



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PROBLEMA

¿Qué efecto tendrán las Nanopartículas de plata sobre Salmonella tiphy y Streptococcus

pyogenes in vitro?

HIPÓTESIS

Las nanopartículas de plata inhiben el crecimiento de Salmonella tiphy y de Streptococcus

pyogenes in vitro.

OBJETIVOS

Objetivo General

1. Determinar el efecto de las Nanopartículas de plata sobre el crecimiento de

Salmonella tiphy y Streptococcus pyogenes in vitro.

Objetivos Específicos

1. Sintetizar nanopartículas de plata a partir de extracto acuoso de Vaccinium

corimbosum y Nitrato de plata.

2. Caracterizar espectrofotométricamente las nanopartículas de plata sintetizadas a

partir de Nitrato de plata y del extracto acuoso de Vaccinium corymbosum.

3. Evaluar el efecto de los diferentes volúmenes de suspensión de nanopartículas de

plata sobre el crecimiento de Salmonella tiphy y Streptococcus pyogenes in vitro.



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II. MATERIAL Y MÉTODO

1. MATERIAL

1.1. Material botánico:

- 1Kg. de Vaccinium corymbosum, procedente del distrito de Virú.

- Salmonella Typhi (ATCC 14028)

- Streptococcus pyogenes Rosenbach (ATCC 19615)

1.2. Reactivos

- Nitrato de Plata Merck

- Hidróxido de sodio Scharlab S. L.

1.3. Solventes

- Agua ultrapuraAgua destilada

- Alcohol de 96° G.L.

1.4. Material de laboratorio:

1.4.1 Material de vidrio: los de uso común en laboratorios de Química Física e

Inmunología de la Universidad Nacional de Trujillo.

1.4.2 Equipos:

- Espectrofotómetro, Marca Thermo Scientific, modelo Genesys 10S.

- Centrifugadora, Marca Hermle, modelo Z206A

- Refrigeradora, marca Samsung, modelo RT22FARADWW

- Balanza analítica, marca Ohaus, modelo PA 224C

- Multiparámetro, Marca Hanna, modelo HI 2221

- Cocina eléctrica, Marca Rommelsbacher, modelo THS 2022/E

- Agitador magnético, Marca Velp Scientifica, modelo MST

- Incubadora, Marca Faithful, modelo Dh.

- Autoclave, marca BIOBASE, modelo CE



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- Estufa, marca Dilabo, modelo digital.

- Microscopio electrónico de transmisión, Marca Hitachi, Modelo H-7500

2. MÉTODO

2.1. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO:

2.1.1. Recolección de la muestra:

Se recolectó 1 Kg del fruto Vaccinium corymbosum del distrito de Virú y se llevó al

Herbarium Truxillense de la Universidad Nacional de Trujillo, donde se identificó

asignándole el código 58210 para su almacenamiento.

2.1.2. Tipo y diseño general del estudio.

Se realizó un estudio experimental del tipo estímulo creciente, en el que se evaluó el

efecto que tiene las NPs Ag obtenidas por síntesis verde a distintos pesos, sobre dos

tipos de bacterias.

A………..E1……..A’

B……….E2……..B’

C……….E3.....….C’

D……….E4.…….D’

Leyenda:

A, B, C, D, F: Son UFC de Salmonella Typhi y Streptococcus pyogenes antes del

estímulo.

E1, E2, E3, E4: Pesos crecientes de NPs Ag en uL.

A’, B’, C’, D’, F’: Son UFC de Salmonella Typhi y Streptococcus pyogene post estímulo.



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2.1.3. Preparación de la muestra vegetal:

Después de que se identificó al fruto, fue abierto por la mitad para su secado a

temperatura ambiente por 24 horas, procediendo luego al secado en estufa a 40ºC hasta

alcanzar un peso constante49.

2.1.4. Preparación del extracto etanólico:

Se colocó 20g de muestra vegetal seca en un matraz conteniendo 100mL de etanol a

96ºG.L., luego se sometió a reflujo por 15 minutos; se dejó enfriar a temperatura

ambiente hasta 30ºC, luego el contenido del matraz se filtró para obtener el extracto

etanólico libre de partículas sólidas, se aforó a 100mL con etanol de 96ºG.L.,

obteniéndose un extracto etanólico de 20% P/V de concentración50.

2.1.5. Obtención del extracto acuoso:

Del extracto etanólico, se dejó secar en estufa a 40°C por 24 horas, hasta obtener un

peso constante (extracto seco). Posteriormente, se pesó 12g del extracto seco, y se diluyó

en 25mL de agua ultrapura; obteniéndose un extracto acuoso al 48% de concentración51.

2.1.6. Preparación de la solución de nitrato de plata (AgNO3):

Se preparó 50mL de solución de Nitrato de plata (AgNO3), pesando 0,08492g AgNO3 y

se disolvió con 50mL agua ultra pura; obteniendo una concentración de 1mM24.

2.1.7. Síntesis de nanopartículas de plata:

En un vaso de precipitación se mezcló 2,5mL de extracto acuoso de Vaccinium

corymbosum con 50mL de Nitrato de plata 1mM; homogenizándolo mediante un

agitador magnético por 10 minutos a temperatura ambiente, para luego incrementarse la



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temperatura a 65 °C; paso seguido, se procedió a colocar las muestras en tubos de ensayo

y se llevó a la centrífuga a 3500rpm por un tiempo de 10 minutos, procediéndose luego

a retirar con mucho cuidado el sobrenadante; el residuo obtenido se diluyó con agua

ultra pura, llenando los tubos de ensayo hasta las ¾ partes, finalmente el coloide se

trasvasó en un vaso de precipitación para modificar el pH hasta 10 añadiéndose gota a

gota NaOH 0,1N52,21.

2.1.8. Caracterización de las nanopartículas de plata:

Con la solución obtenida se realizó la caracterización por espectrofotometría UV-vis,

así como también, la Microscopía Electrónica por Transmisión (TEM) para validar la

presencia de NPs Ag53.

Para la técnica de la espectrofotometría UV-vis. se diluyó el coloide al décimo con agua

ultra pura y se colocó en la cubeta de cuarzo; posteriormente se colocó en el

espectrofotómetro, para determinar la forma geométrica de estas NPs Ag.

Para la técnica del TEM, se tomó una gota de la síntesis de NPs Ag, y se puso en la

rejilla del TEM, se puso a secar en una fuente térmica, con el objetivo que se evapore el

agua; este mismo protocolo se repitió 10 veces para así crear una capa considerable del

material a analizar, posteriormente se llevó al TEM.

2.1.9. Reactivación de cultivos

Se diluyó 10g de Infusión cerebro-corazón (BHI por sus siglas en inglés: Brain-Heart

Infusion) en 100mL de agua ultrapura, obteniéndose una dilución uniforme54.

- Para Streptococcus pyogenes:

Se llenó en un tubo de ensayo esterilizado las ¾ partes de la dilución de Caldo

Infusión Cerebro Corazón (BHI) y con ayuda de dos mecheros, se colocó la cepa



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patrón (Streptococcus pyogenes) e inmediatamente se tapó con algodón y se llevó a

un frasco hermético con una vela encendida dentro, creándole así una microaerofilia;

una vez que la vela se apague, se llevó a incubar por 24 horas54.

- Para Salmonella typhi:

No fue necesario la reactivación, debido a que estuvieron activas, pero también se

colocó en condiciones de microaerofilia a 48 horas54.

2.1.10. Preparación de las bacterias

Se preparó dos suspensiones, una de S. typhi en un tubo de ensayo esterilizado con ¾

partes de suero fisiológico, y otra de S. pyogenes en un tubo de ensayo esterilizado con

¾ partes del caldo BHI; posteriormente se disolvió hasta obtener una dilución turbia54.

2.1.11. Sembrado de las bacterias54:

Se preparó 200mL de Agar Mueller-Hinton, siguiendo la Norma Técnica N°30 del

Manual de Procedimientos para la Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana por el

Método de Difusión en Disco del Instituto Nacional de Salud y las especificaciones del

fabricante.

Se trasvasó equitativamente en 10 placas Petri, con ayuda de dos mecheros, luego se

dejó enfriar a temperatura ambiente.

Se colocó 0,2mL de cada suspensión en 10 placas Petri respectivamente, se esparció con

un hisopo esterilizado la suspensión agregada a cada placa Petri.



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2.1.12. Aplicación de nanopartículas de plata mediante el extracto acuoso de

Vaccinium corymbosum frente a las bacterias Salmonella tiphy y Strepctococcus

pyogenes:

Con ayuda de un sacabocado, se hicieron 4 orificios en cada placa Petri, luego se colocó

0,0116 mg/10uL, 0,0232 mg/20uL, 0,0348 mg/30uL y 0,0464 mg/40uL de NPs Ag en las

10 placas Petri, sin voltear, se forró con papel, y se llevó a incubar por 24 horas a 35°C,

observándose posteriormente la presencia del halo de inhibición alrededor de cada uno

de los cilindros21,46.

2.1.13. Medición de los diámetros de inhibición del crecimiento bacteriano:

Transcurridas las 24 horas de la aplicación de la síntesis preparada, se procedió a medir

con una regla milimetrada el halo de inhibición de crecimiento de Streptococcus

pyogenes ATCC 19615 y Salmonella thypi ATCC 14028, obtenidas para cada peso de

las Nanopartículas de plata; dichos resultados fueron expresados como diámetro (mm)

de halo de inhibición55.

2.1.14. Evaluación estadística:

A los resultados obtenidos se le realizó un tratamiento estadístico utilizando los

estimadores estadísticos de promedio y desviación estándar, así como también el

análisis de varianza (ANOVA) para determinar si hay diferencia intra e inter grupos

problemas; se consideró un valor de p<0,05 para establecer significancia estadística.



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III. RESULTADOS

Caracterización de nanopartículas de plata (NPs Ag)

Figura 1: Forma esférica de nanopartículas de plata, observadas por el método de

microscopía electrónica de transmisión (TEM) a escalas de 100nm, 50nm y 10nm.

Figura 2: Tamaño de nanopartículas de plata = 13,19nm de diámetro.



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Figura 3: Espectro de absorbancia en rango visible de la solución de NPs Ag,

λmáx= 408nm, Abs = 0,41

Tabla 1.- Diámetro promedio de los halos de inhibición de crecimiento de S.

pyogenes mediante la acción de las nanopartículas de plata.

Peso de NPs Ag

(mg/uL)

ni

Media

(mm)

Desv.est

0,0116 / 10 5 6,44 0,67

0,0232 / 20 5 8,36 0,68

0,0348 / 30 5 12,64 0,96

0,0464 / 40 5 14,96 1,44

Fuente: Datos obtenidos de la parte experimental de este trabajo.

ni: número de cultivos de Streptococcus pyogenes.



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Tabla 2.- Diámetro promedio de los halos de inhibición de crecimiento de S. tiphy

mediante la acción de las nanopartículas de plata.

Peso de NPs Ag

(mg/uL)

ni Media

(mm) Desv. Est

0,0116 / 10 5 6,38 0,68

0,0232 / 20 5 8,6 1,87

0,0348 / 30 5 13,82 1,33

0,0464 / 40 5 19,26 1,58

Fuente: Datos obtenidos de la parte experimental de este trabajo

ni: número de cultivos de Salmonella tiphy.

Gráfico 1: Efecto de las NPs Ag sobre la inhibición de crecimiento de S. pyogenes in

vitro.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Diá

met

ro p

rom

edio

de

los

hal

os

de

inh

ibic

ión

de

crec

imie

nto

de S.puogenes

Volumen deNPs Ag (uL)



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Gráfico 2: Efecto de las NPs Ag sobre la inhibición de crecimiento de S. pyogenes in

vitro.

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45Diá

met

ro d

e lo

s h

alo

s d

e in

hib

ició

n d

e cr

ecim

ien

to d

e S.

Tyo

hi

Volumen deNPs Ag (uL)



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IV. DISCUSIÓN

En esta investigación se realizó la síntesis de NPs Ag por reacción del AgNO3 con el

extracto acuoso de Vaccinium corymbosum para posteriormente evidenciar el efecto

antibacteriano de las mismas. Los elementos químicos en su forma nanométrica muestran

propiedades distintas a las que se manifiestan en la escala macroscópica o bien cuando se

encuentran en forma iónica; así, las NPs metálicas presentan propiedades electrónicas,

magnéticas, catalíticas y ópticas únicas que difieren de aquellas que presenta el mismo

material a granel. Debido a estas diferencias es preciso tener la certeza de que lo que se

sintetizó son NPs Ag, para ello se emplearon técnicas de microscopía electrónica y

espectroscopía Uv-Vis.

Las técnicas de microscopía electrónica (EM) más destacadas son la microscopía

electrónica de transmisión (TEM) y la microscopía electrónica de barrido (SEM). Las

imágenes TEM no sólo proporcionan el tamaño y la forma de las nanopartículas, sino

también la morfología y el estado de agregación de las mismas9, 12.

La figura 1 muestra la caracterización de NPs Ag empleando TEM, a diferentes escalas

de referencia se observan NPs en estados individuales y aglomeradas, así como también

se observa la forma esférica de las mismas. Las NPs esféricas poseen un mayor efecto

que aquellas que tienen otras formas geométricas, esto debido a su mayor área superficial

y a la presencia de un mayor número de átomos superficiales disponibles para

interaccionar con los diferentes componentes celulares de las bacterias.

408nm es el valor de λmáx del coloide sintetizado, lo que indica que los flavonoides,

terpenos, polifenoles diversos del extracto acuoso de arándano a concentración de 48%

produce una reducción de la plata en el AgNO3, y se obtienen NPs de tamaño uniforme y

de forma esférica como lo muestra el TEM.

La figura 2, se observa el tamaño de las nanopartículas de plata que se han formado,

observando que es de 13,19nm de diámetro; la cual este valor corresponde a una longitud

de onda de 408nm aproximadamente.

En la figura 3, el espectro de UV-Vis de las NPs Ag muestra la banda de absorción con

un máximo a 408nm asociado a la resonancia de plasmón superficial (SPR) (Figura 2).



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El fenómeno SPR ocurre porque los electrones en la superficie de una nanopartícula

metálica oscilan al interactuar con una onda electromagnética y se induce un momento

dipolar sobre la nanopartícula en un intervalo de tiempo. Cuando la componente eléctrica

de la onda electromagnética (de un haz de luz visible) que incide sobre la nanopartícula

oscila a la misma frecuencia que los electrones de esta, ocurre el fenómeno SPR. Metales

como la Ag, el Au y otros metales alcalinos con electrones libres muestran resonancia del

plasmón en el espectro visible, dando lugar a colores no observados en los mismos

materiales a escala macrométrica. Las NPs de Ag poseen una intensa SPR en los

intervalos de longitud de onda 400 – 430nm57.

Se ha reportado que a medida que el tamaño de nanopartículas metálicas aumenta, el pico

de absorción tiende a ubicarse a longitudes de onda mayores por lo que, mediante la

posición y la forma del pico es posible predecir el tamaño y polidispersidad de las NPs

Ag59.

Pradeep reporta valores aproximados de longitudes de onda que permiten predecir el

tamaño de nanopartículas de plata: a) Posición del pico: aproximadamente 400nm, 430nm

y 438nm b) Tamaño de partícula: 10-14nm, 35-50nm, 60-80nm respectivamente. A

menor longitud de onda del pico de absorción máximo, menor será el tamaño de las

nanopartículas60.

La tabla Nº1 (Anexo 2) muestra que a mayor longitud de onda el tamaño de las

nanopartículas es menor, lo cual contradice lo mencionado por Pradeep, esto tiene una

explicación pues al observar la imagen TEM (Figura Nº1, Anexo 2) se aprecia que se ha

formado un “Cluster” de nanopartículas. Los Clúster son cúmulos o agregados que se

unen por fuerzas relativamente débiles como Van der Walls, fuerzas electrostáticas o de

tensión superficial.

En las Tabla 1 y 2 se observa el efecto de las NPs Ag, expresado en las medidas de los

halos de inhibición de crecimiento de las bacterias estudiadas. Al analizar ambas tablas,

se evidencia que al aumentar el volumen de solución de NPs Ag en las placas se produce

una mayor inhibición del crecimiento de ambas bacterias, esto debido a consideraciones

importantes como el mecanismo de acción que es propio de la NP y la formación de un

gradiente de concentración, el mismo que permite que la NP difunda desde el cilindro en

el que se encuentra hacia el medio que lo rodea (bacterias en crecimiento).



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La acción de inhibición del crecimiento bacteriano por las nanopartículas de plata se debe

a su actuación como metal, ion o NPs. Su efecto antimicrobiano se relaciona con varios

procesos biológicos, entre ellos, la generación de especies de oxígeno reactivas (EROS)

y la inducción de estrés oxidativo (EO), por el desacoplamiento del transporte de

electrones y la desactivación de enzimas, particularmente a causa de la desnaturalización

de los enlaces disulfuro de las proteínas bacterianas, que conduce a la muerte celular62.

En las bacterias, como en las células eucariotas, el blanco principal para su toxicidad es

la alteración de la pared celular y de la membrana celular bacteriana, inhibiendo los

procesos de respiración e interactuando con el azufre que contiene la membrana

bacteriana y con los grupos fosfatos del DNA. Así, se impide la replicación y se inactiva

la enzima fosfo-manosa isomerasa encargada de catalizar la conversión de manosa-6-

fosfato a fructuosa-6-fosfato, intermediario de la glucólisis, por una vía común en

bacterias para llevar a cabo el catabolismo de azúcar. No obstante, el mecanismo

detonante de la toxicidad en las bacterias se debe a su interferencia con la ubiquinona o

coenzima Q que en la mitocondria participa en el proceso respiratorio. La coenzima Q en

las membranas, tiene una función antioxidante, de forma directa, contra la formación de

lipoperóxidos o de manera indirecta, a través del reciclado de otros antioxidantes lipídicos

como la vitamina D. La consecuencia del efecto de la Ag+ sobre la ubiquinona es el

desacoplamiento del transporte iónico de sodio y potasio entre otros, de ahí su gran

toxicidad y afectación63.

El análisis de varianza ofrece un valor de P, de la prueba estadística, menor a 0,05 lo que

indica aceptar la hipótesis alterna (H1), es decir, afirmar que existen diferencias

significativas entre las medidas promedio de los halos de inhibición de crecimiento de S.

pyogenes y S. typhi (anexo 2).



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V. CONCLUSIONES

1. Se sintetizó nanopartículas de plata a partir de extracto acuoso de Vaccinium

corymbosum y solución de Nitrato de plata.

2. Las Nanopartículas de plata tienen un diámetro de 13,19nm; una forma geométrica

de esfera y presentan un λmáx de 408nm.

3. Las Nanopartículas de plata inhiben el crecimiento de Salmonella tiphy y

Streptococcus pyogenes in vitro.



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ANEXOS



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Anexo 1

ESQUEMA DEL TRABAJO REALIZADO

1. RECOLECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA

2. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO

Ejemplar de la hoja de Vaccinium corymbosum

Código del fruto de Vaccinium corymbosum

Extracto etanólico en ebullición. Filtración del extracto etanólico del

fruto Vaccinium corymbosum.



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3. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE NITRATO DE PLATA

4. SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA

Solución de Nitrato de plata (AgNO3) 1mM

Extracto + AgNO3 en agitador magnético. Centrifugación

Eliminación del sobrenadante; se

diluyó con agua ultra pura.

Modificación del pH



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5. CARACTERIZACIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS DE PLATA

Caracterización de nanopartículas de plata mediante microscopía electrónica de

transmisión (TEM)

Tamaño de nanopartículas de plata = 13,19nm de diámetro.



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6. REACTIVACIÓN DE CULTIVOS

7. PREPARACIÓN Y SEMBRADO DE LAS BACTERIAS

Dilución de BHI en agua ultrapura. Para Streptococcus pyogenes. Para Salmonella typhi.

Preparación de soluciones. Solución de Mueller-Hilton

Siembra de cultivo con hisopo esterilizado a placas Petri.



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8. APLICACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA FRENTE A LAS

bacterias Salmonella typhi Y Strepctococcus pyogenes.

Aplicación de NPs Ag Incubación

9. MEDICIÓN DE LOS DIÁMETROS DE INHIBICIÓN DEL

CRECIMIENTO BACTERIANO:

Inhibición de crecimiento

Salmonella typhi Strepctococcus pyogenes



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Anexo 2

Tabla 1: Diámetro promedio de los halos de inhibición de crecimiento de S. pyogenes


Peso de NPs

Ag

(mg / uL)

Diámetro de inhibición del crecimiento bacteriano

(mm)

Placa N°1 Placa N°2 Placa N°3 Placa N°4 Placa N°5 X(Promedio)

0,0116 / 10 6 7 5.8 6.3 7.1 6.44

0,0232 / 20 8 9.1 7.5 8.2 9 8.36

0,0348 / 30 11.5 13 14 12.7 12 12.6

0,0464 / 40 13 15 15.3 17 14.5 14.96

Tabla 2: Diámetro promedio de los halos de inhibición de crecimiento de S. tiphy


Peso de NPs

Ag

(mg / uL)

Diámetro de inhibición del crecimiento bacteriano

( mm)

Placa N°1 Placa N°2 Placa N°3 Placa N°4 Placa N°5 X(Promedio)

0,0116 / 10 7mm 6mm 6.3mm 5.5mm 7.1mm 6.38

0,0232 / 20 8mm 6.4mm 7.6 11mm 10mm 8.6

0,0348 / 30 13mm 12mm 15mm 14mm 15.1mm 13.82

0,0464 / 40 19mm 17mm 20mm 19mm 21.3 19.26



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Anexo 3

Tabla Nº1: Análisis de varianza (ANOVA) para determinar diferencias

significativas sobre el parámetro efecto de las nanopartículas de plata sobre el

crecimiento de S. pyogenes

Origen de

las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados

F Probabilidad

Entre

grupos

227.47 3 75.82 79.563 7.86912E-10

Dentro de

los grupos

15.25 16 0.95

Total 242.72 19

Interpretación: p< 0,05

Existe diferencia significativa. Esto significa que los diferentes pesos de nanopartículas

de plata afectan significativamente el promedio de formación de halos de inhibición.

Tabla Nº2: Análisis de varianza (ANOVA) para determinar diferencias

significativas sobre el parámetro efecto de las nanopartículas de plata sobre el

crecimiento de S. tiphy

Origen De

Las

Variaciones

Suma De

Cuadrados

Grados De

Libertad

Promedio De Los

Cuadrados

F Probabilidad

ENTRE

GRUPOS

495.82 3 165.27 80.749 7.04583E-10

DENTRO

DE LOS

GRUPOS

32.75 16 2.05

TOTAL 528.57 19

Interpretación: p< 0,05

Existe diferencia significativa. Esto significa que los diferentes pesos de nanopartículas

de plata afectan significativamente el promedio de formación de halos de inhibición.



informe de tesis ii bioquimica

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