iib alberto sols memoria de la...

MEMORIA IIB ALBERTO SOLS 1

Alberto Maurel

4-8 julio 2016

IIB Alberto Sols

Memoria de la estancia

Lunes

Hemos visitado el laboratorio de cultivos y preparado un gel de acrilamida.

Cultivos celulares

El medio utilizado para mantener nuestras células es el DMEM. Uno de los componentes

de este medio es el rojo fenol. Este indicador permite detectar de visu, gracias a que es un

indicador colorimétrico, el estado del medio. A medida que las células van consumiendo el

medio, provocan que el rojo fenol vire del rojo intenso inicial hacia un rojo pálido,

anaranjado y posteriormente naranja amarillento, indicándonos estos últimos que es

necesario renovar el medio.


Las células que vamos a cultivar están adheridas a la placa petri. Por ello, quitamos el

medio a través de una bomba de vacío y una pipeta. Las células muertas se separan de la

placa, por lo que también las eliminamos.

Posteriormente, añadimos de nuevo DMEM para que las células sigan reproduciéndose.

Y añadimos también puromicina para que destruya aquellas células que no contengan el

plásmido transfectado (que contiene un gen de resistencia para este antibiótico).


Y ya tenemos nuestras células vivas listas para seleccionar y seguir reproduciéndose.


Otro de los cultivos está ya listo para cambiarlo de placa. De esta forma, evitamos que la

confluencia de las células sea excesiva, y permitimos que sigan creciendo. Para separar las

células en primer lugar eliminamos el DMEM (llevándonos al mismo tiempo las células

muertas).

Posteriormente las limpiamos con PBS (solución salina).

Tras esto, añadimos tripsina, que se encarga de separar las células vivas de la placa, y lo

incubamos. Al cabo de unos cinco minutos, las células ya están separadas.


Trasladamos esta disolución a un falcon para

centrifugarla. Tras 5 minutos a 1200 rpm, queda en el

sobrenadante la tripsina y en el pellet las células vivas.

Retiramos con cuidado la tripsina por medio de la bomba de vacío y trasladamos de

nuevo las células a una placa petri con DMEM. Las células ya están listas para seguir

reproduciéndose. !Y por supuesto rotulamos todo para no confundirnos!

Ruta de señalización Hedgehog (Hh)

La ruta de señalización Hedgehog está implicada en el desarrollo embrionario. El motivo de su estudio en

este caso es su relación con el síndrome de Ellis-van Creveld, causante de lesiones en los dientes, polidactilia y


desaparición del tabique entre aurículas. Este síndrome está causado por la mutación de las proteínas Evc y

Evc2, que forman parte de la ruta Hh.

La proteína IFT74 es una proteína que transporta unidades de tubulina de la base del cilio primario a la

punta. Dicha proteína interacciona con la Evc, y es la relación entre estas dos proteínas la que se trata de

dilucidar mediante este experimento.

Se ha descubierto que en genotipos IFT74 +/- (con solo una copia del gen que codifica para la proteína) se

forma menos IFT74 y Evc, formándose además cilio primario. En el caso de genotipos IFT74 -/- (sin copias

del gen para esta proteína) no se forma IFT74, pero se forma más Evc que en genotipos IFT74 +/+.

Además, no se forma cilio primario.

La hipótesis que se baraja para estos resultados es que la proteína IFT74 codifica para la formación del

cilio primario, estructura en la que se produce la degradación de la proteína Evc. En los genotipos IFT74 -/-

no se forma el cilio primario y, por ende, no se produce la degradación de la Evc.

En este experimento se infecta con retrovirus una célula IFT74 -/-. Dicho retrovirus contiene una

construcción con el gen que codifica la proteína IFT74. Si la hipótesis es acertada, en la célula infectada se

comenzaría a producir IFT74, se formaría de nuevo el cilio primario y se restablecerían los valores normales de

Evc.

Para comprobar la veracidad de esta hipótesis, tras introducir el gen se emplea el Western Blot para

cuantificar las cantidades de Evc e IFT74 sintetizadas, y microscopía de fluorescencia para detectar, por medio

de fluoróforos, la formación del cilio primario.

Preparación del gel de acrilamida para realizar el Western Blot

En primer lugar, montamos el molde para los geles.


Posteriormente, siguiendo el protocolo preparamos gel para dos moldes. Primero

cargamos el gel separador, cubriéndolo de agua mientras solidifica.

Cuando ha solidificado (lo podemos comprobar gracias a que en el falcon la disolución

sobrante ha solidificado), cargamos el gel concentrador, sobre el cual colocamos el peine para

formar los pocillos.


Martes

Tras hablar sobre la historia de la secuenciación del ADN, hemos acudido al Instituto de

Genética Médica y Molecular (INGEMM) para ver las máquinas y técnicas de secuenciación.

Osteogénesis imperfecta

Este laboratorio del IIB está especializado en las alteraciones del desarrollo óseo, concretamente en dos: el

síndrome de Ellis-van Creveld (del que ya hemos hablado) y el síndrome de osteogénesis imperfecta.

Esta enfermedad está causada en un 90% de los casos por mutaciones que afectan a los genes Col1a1 y

Col1a2, y en un 10% de los casos por mutaciones en los genes que regulan el plegamiento de la proteínas en el

retículo.

El colágeno es una proteína formada por una triple hélice. Dos de las hebras son alfa 1, codificada por el

gen Col1a1, y la otra es de alfa 2, codificada por el gen Col1a2.

Tras formarse en los polirribosomas, el procolágeno no funcional pasa al retículo endoplasmático. Allí se

cortan los propéptidos (se encuentran en los extremos del procolágeno) y se entrecruzan las dos cadenas alfa 1

con otra alfa 2 (a este proceso afectaría el 10% de las mutaciones previamente mencionadas).

En esta enfermedad podemos distinguir además varias clases de mutaciones que la originan:

1. Puede aparecer una delección en una de las copias del ADN. Esto provoca que se produzca tan solo la

mitad del colágeno, lo que ya origina la enfermedad.

2. Puede existir una mutación, que cause una modificación en los aminoácidos (aa) de la cadena. Las

cadenas están formadas por 338 repeticiones de un trímero de aminoácidos, de los cuales el primero siempre

es la glicina. La modificación de estos aa puede conducir a que todo el colágeno que se forme sea defectuoso.

Historia de la secuenciación

Inicios

En sus inicios, para localizar los genes causantes de las enfermedades monogénicas se empleaban zonas

polimórficas. Estas zonas se localizan en los intrones, y son repeticiones de determinadas secuencias de

nucleótidos, y que presentan varias variantes en la población. Si no se realiza recombinación entre la zona

polimórfica y la enfermedad, sabemos que están próximos en el cromosoma.

Para realizar un mapeo del gen requiere tener por un lado un mapa con las zonas polimórficas y por otro un

árbol genealógico grande con el que hacer el estudio (y ver de padres a hijos con que zonas polimórficas

recombinan los genes causantes de la enfermedad y con cuáles no).


Además, se construían bibliotecas genómicas, en las que en el interior de una bacteria (BAC) o de una

levadura (YAC) se guardaban fragmentos del ADN. Tras acotar por el procedimiento previamente mencionado

la posición del gen, se podía trabajar con esa región del ADN, acotándola aún más.

Secuenciación Sanger

La secuenciación Sanger es una técnica de secuenciación del ADN que se lleva a cabo en unos aparatos

llamados secuenciadores, y que permite secuencias fragmentos de tamaño variable dependiendo de la longitud del

capilar (unos 600 pb para 36 cm de capilar). Para llevar a cabo esta técnica se parte de una copia de ADN

molde, la cual se amplifica por medio de una PCR. Posteriormente, se introduce el fragmento amplificado en

una mezcla que contiene DNTPs, didesoxirribonucleótidos marcados con fluorocromos (cada tipo de base

nitrogenada está marcada con un fluorocromo distinto), ADN polimerasas, cebadores y factores de duplicación

(esencialmente cationes como el Mg 2+).

La ADN polimerasa comienza a sintetizar copias de la cadena amplificada. De forma aleatoria la ADN

polimerasa inserta o bien un desoxirribonucleótido o bien un didesoxirribonucleótido. En el caso de que inserte

un desoxirribonucleótido, se sigue sintetizando la copia de ADN. En el caso de insertar un

didesoxirribonucleótido, no puede continuar sintetizando la copia porque carece del 3OH, el cual debería formar

el enlace fosfodiéster.

Después, la disolución con el ADN sintetizado con diferentes longitudes se hace pasar por un capilar con un

diámetro que solo permite que pase una copia de ADN a la vez. En el interior del capilar se encuentra un gel de

acrilamida. En el extremo opuesto del capilar se halla una carga positiva (el ADN posee carga negativa). Los

fragmentos más pequeños correrán por el gel a mayor velocidad. En un lugar del capilar se encuentra un lector

de fluorescencia, que permite leer las bases de los didesoxirribonucleótidos marcadas con fluorocromos. De esta

forma, se obtiene la secuencia de bases del fragmento.

Arrays

Sirven para detectar mutaciones (delecciones, inserciones...) de tamaño superior a unas cuantas bases o para

realizar mapeos de homocigosidad. En un chip se sitúan las variantes de oligonucleótidos (SNPS) que se

emplean como marcadores. Posteriormente, se marca el ADN humano, se híbrida el ADN con los

oligonucleótidos del array y este chip se puede leer con un escáner.

Entre los datos que nos arroja esta técnica, destacan dos:


1. Frecuencia del alelo b: nos permite saber si el individuo es homocigoto para el alelo b (la frecuencia del

alelo b será 1), homocigoto para el alelo a (la frecuencia del alelo b será del 0%), o heterocigoto (la

frecuencia del alelo b será 0,5%)

2. Frecuencia de hibridación: los valores rondan el 0'5%. Si los valores en una zona son inferiores, nos

indica que hay una delección en esta zona.

En el caso del artículo Long interspersed nuclear element-1 (LINE1)-mediated deletion of EVC,

EVC2, C4orf6, and STK32B in Ellis-van Creveld syndrome with borderline intelligence, con el que

hemos trabajado, podemos ver que en el individuo 1 (control) no presenta delecciones, el

individuo 2 presenta la delección de una de las copias del gen y el individuo 3 presenta la

delección de ambas copias del gen.

FISH (Fluorescence In Situ

Hybridization)

Esta técnica consiste en híbridar el cromosoma con un fragmento de ADN con fluorescencia (sonda).

De esta forma, podemos ver mediante microscopía de fluorescencia la localización de las zonas

complementarias a nuestra sonda.

En este caso, se marca el telón eso del brazo q del cromosoma 4 en verde, y en rojo se

marca el gen EVC.

Sin delección

Delección de uno de los alelos

Delección de ambos alelos


En los individuos 1 y 2 vemos que ambos cromosomas de la pareja 4 tienen sus telómeros

marcados en verde, y el gen EVC (que se localiza en el cromosoma 4 y ha sufrido una

delección) se marca en rojo en tan solo un cromosoma. Se corresponderían al segundo

individuo del array anterior.

El individuo 3 ha perdido ambas copias del

gen EVC, y por ello encontramos tan solo las

marcas verdes de los telómeros de los dos cromosomas homólogos de la pareja 4, pero no las

señales rojas del gen EVC. Se correspondería al tercer individuo del array anterior.


Secuenciación masiva o NGS (Next Generation Sequency)

A diferencia de la secuenciación Sanger, que tan solo

permite secuenciar una secuencia de bases corta, la NGS

permite secuenciar un conjunto de exones es concreto, el

exoma o el genoma completo. Este proceso consta de 4

pasos:

A. Preparación de los fragmentos de ADN

que queremos secuenciar.

B. Fijación de los fragmentos al clúster por

medio de adaptadores (uno a cada extremo) y

posterior replicación de los fragmentos.

C. Secuenciación de los fragmentos gracias a

nucleótidos marcados con fluorocromos

D. Alineación de los miles de fragmentos secuencia

dos y análisis de las secuencias obtenidas.


Esta técnica permite secuenciar de una forma relativamente barata (1000€ ) el genoma de un paciente, para

así poder detectar el origen de su patología. En el caso de la osteogénesis imperfecta, son 17 los genes en los que

suele residir la mutación, por lo que mediante la secuenciación de esos exones concretos podemos conocer su

origen.

Instituto de Genética Médica y Molecular (INGEMM)

El INGEMM está situado en el Hospital de La Paz. En él, entre otros, encontramos un

servicio de secuenciación Sanger, arrays y secuenciación masiva, que se emplea para detectar

el origen de patologías con origen genético

Secuenciación Sanger

Se llevan a cabo en estos aparatos llamados secuenciadores


La muestra se coloca en una placa de 96 pocillos, y se va haciendo correr por los capilares

para realizar la secuenciación

Arrays

En un portaobjetos con pocillos se colocan las muestras de ADN

Y posteriormente se cubre con otro portaobjetos que tiene los oligonucleótidos fijados.

Tras fijarse el ADN en el segundo portaobjetos, se lee el resultado en esta máquina

Obteniendo en el ordenador algo similar a lo mostrado en el apartado teórico

Capilares

P96


Secuenciación masiva

Esta máquina es la encargada de

realizar la NGS.

Las muestras se preparan de forma automatizada gracias a este robot


Y posteriormente se introducen en esta placa, llamada flow cell.

Miércoles

Realizamos una PCR con electroforesis y visitamos el citómetro de flujo.

Relación entre metabolismo del colesterol y la respuesta inflamatoria en la

proteína LXR

El LXR es una proteína que posee dos isotipos: alfa y beta. Esta proteína actúa como un receptor nuclear,

ya que se encuentra disuelta en el núcleo. Este receptor se activa con los oxisteroles. Al activarse cumple dos

funciones. Por un lado se activan genes que se encargan de metabolizar y degradar el colesterol. Por otro lado

promueve la transcripción de genes implicados en la regulación de la inflamación.

Esta función (la de reducir la inflamación) es llevada a cabo el LXR en los macrófagos, de ahí que estas

células sean el objeto de este experimento.

En el experimento se emplean dos clases de ratones:

- DKO (doble ko): carece de ambas copias de los alelos que codifican para los isotipos alfa y beta.

- KO para los alelos que codifican el LXR beta y carecen de uno de los alelos que codifica para el LXR alfa,

que está sustituido por dos genes. Uno que codifica para una proteína rojo fluorescente (DSRed), y el otro

para sintetizar el receptor para la toxina de la difteria humana (DTR).

El KO se logra introduciendo un virus que codifica para una enzima de restricción que corta el gen deseado.

Citometería de flujo

El citómetro de flujo es un aparato que permite medir de forma cuantitativa 3 parámetros:

- Tamaño del evento


- Complejidad del evento

- Fluorescencia del evento (en el caso de que este evento sea fluorescente por sí mismo o lo hayamos marcado

nosotros con fluorescencia)

Por evento entendemos una célula, fragmento de célula....

Para realizar este proceso, hace pasar cada uno de estos eventos frente a un láser. Dependiendo de

trayectoria, dirección... del rayo tras atravesar el objeto, el citómetro puede calcular su tamaño y complejidad.

Por otro lado, los rayos emitidos por los fluorocromos adheridos a los eventos se hacen pasar por unos filtros

para diferentes longitudes de onda, lo que permite distinguir entre unos y otros.

Posteriormente podemos analizar estos datos por medio de un software.

En este caso, lo que queremos es distinguir la población de monocitos de una muestra

sanguínea. Para ello seleccionamos en primer lugar los parámetros de tamaño (FSC-A) frente

a complejidad (SSC-A), y elegimos la región donde deberían localizarse los monocitos.

Posteriormente, sobre la región seleccionada empleamos un colorante que solo penetra en las

células muertas (PerCP-Cy5-5-A). Por ello, las células que se encuentren a la derecha estarán

muertas, lo que nos lleva a descartarlas. Por último empleamos dos fluorocromos (APC-A y

FITC-A) con los que hemos marcado nuestros monocitos, y los que den doble positivo serán

los monocitos. En este caso, podemos hacerlo siguiendo el camino A o el camino B (utilizar

Complejidad

Tamaño

Marcador muerte celular Fluorocromo Fluorocromo

Dobles positivos,

son las células

que estamos

buscando

Dobles positivos,

son las células

que estamos

buscando

A

B


los dos es redundante, simplemente estamos colocando los parámetros en los ejes de forma

distinta). Los nombres entre paréntesis (PerCP-Cy5-5-A, APC-A, …) son el nombre del canal

en el que se encuentran esos parámetros, no el nombre de los colorantes.

PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)

La PCR es una técnica que nos permite amplificar un fragmento de DNA. Para ello, se introduce una

mezcla que, además de contener el fragmento a amplificar, contiene también DNTPs, ADN polimerasas,

factores de duplicación y dos clases de cebadores (cada uno de

ellos es complementario a uno de los extremos del fragmento a

amplificar).

Esta técnica se lleva a cabo en un aparato llamado

termociclador, que repite de forma cíclica 3 pasos:

- Desnaturalización: se separan las hebras del ADN

- Cebado: se une el primer a la hebra monocatenaria de ADN

- Elongación: la DNApolimerasa sintetiza la cadena de ADN

La repetición de estos tres pasos permite duplicar de forma

exponencial el ADN.

En este caso, se amplifica ADN de un trozo de oreja

de ratón para identificar su genotipo.

Electroforesis

La electroforesis es una técnica que se emplea a continuación de la PCR y que permite cuantificar los

resultados. En primer lugar se fabrica el gel de agarosa en el que se van a correr las muestras. Para ello se

mezcla agarosa, buffer y RedSafe (agente que favorece la desnaturalización del ADN) y se deja solidificar.

Eppendorf de 200 µl, especial para el termociclador


Posteriormente, se carga en el gel con una micropipeta el ADN amplificado, y se conecta a la corriente. La carga

negativa del ADN hace que se desplace hacia el polo positivo, separándose los fragmentos de ADN de acuerdo a

su tamaño y complejidad.

Y al finalizarla, se ve el gel en el transiluminador para poder

observar las bandas de ADN.

En esta ocasión se emplea la electroforesis para ver si el ADN de los ratones amplificados con

la PCR pertenecía a ratones WT o heterocigotos.


Jueves

Realizamos un citospyn y teñimos una muestra de macrófagos para observar mañana.

Citospyn

El citospyn es una técnica que se emplea para concentrar la muestra líquida en un punto de un portaobjetos.

Esto facilita el recuento diferencial.

Para ello en primer lugar montamos nuestro portaobjetos en el compartimento del citospyn. Lo cubrimos con un

cartón que deja tan solo un círculo del portaobjetos libre, donde se concentrará la muestra.

Por último, pipetamos en el círculo la disolución a concentrar.

Tras esto, introducimos el montaje en la máquina y lo tenemos a 600 rpm durante 4 minutos.Al sacar la

muestra, la disolución se ha secado y la tenemos ya en el portaobjetos.

Tinción azul de metileno según Giemsa

Con esta tinción teñimos los núcleos de la célula de color azul y el citoplasma de color rosáceo.


El protocolo es el siguiente. Tras realizar el citospyn cubrimos la muestra con azul de metileno . Tras 1

minuto añadimos la misma cantidad de agua y mezclamos soplando y agitando el colorante con el agua. 3

minutos después se lava el portaobjetos para retirar el exceso de colorante.

Como tenemos que observar la muestra a gran aumento, necesitamos emplear un objetivo de inmersión. Por

ello es necesario fijar un cubreobjetos sobre nuestra muestra. Para este proceso se emplea un pegamento

denominado DPX. Primero colocamos el DPX sobre nuestra muestra y posteriormente dejamos caer suavemente

el cubreobjetos encima. Si se forman burbujas aplastamos

cuidadosamente el cubreobjetos para

eliminarlas.

Esto nos permite ver los monocitos seleccionados mediante un sorter al

microscopio.


Viernes

Realizamos una herida y visitamos el servicio de microscopía del IIB.

Realización de una herida

Consiste en trazar una línea en una placa de Petri confluente (se puede trazar con

una punta de micropipeta). Las células de la placa, si tienen capacidad de movimiento, van a

moverse para rellenar la línea vacía de células que ha quedado. Tras trazarla, vamos

tomando fotos cada cierto intervalo de tiempo para poder medir la velocidad de movimiento

las células. Este estudio será evidentemente así solo cuando las células no estén en división.

La forma más fácil de realizarlo es introducir nuestra herida en el cell observer, microscopio

que será explicado posteriormente.

Microscopía

Los microscopios ópticos nos permiten observar muestras de pequeño tamaño. Dentro de

los microscopios encontramos múltiples variedades. Hoy vemos microscopios de campo claro,

de fluorescencia, el cell observer y con focal.

Microscopio de campo claro

En él observamos la preparación de macrófagos de ayer. Esta tinción nos permitiría contar

cuantos macrófagos son maduros y cuáles no. Para observar las muestras empleamos el

objetivo de x100, para el cual hay que emplear aceite.

Inmadura (núcleo arriñonado)

Madura (núcleo irregular)


Microscopía de fluorescencia

Permite observar estructuras marcadas con fluoróforos. Su funcionamiento es el siguiente:

1. Una lámpara de mercurio, de haluros metálicos o led emiten un rayo de luz a con una longitud

determinada.

2. Un espejo dicroico es aquel que deja pasar prácticamente todas las longitudes de onda, excepto una, que

es reflejada.

3. Esta longitud reflejada incide sobre la muestra, que excita el fluoróforo.

4. El fluoróforo excitado emite energía. En la transacción energética se pierde energía, por lo que la

energía liberada es menor que la incidida. Siguiendo la ley de Plank

5. La frecuencia será mayor y por tanto, la longitud de onda emitida será mayor que la incidida. Al ser

luz en el aire, v ≈ c

6. Al ser una mayor longitud de onda, el espejo dicroico deja pasar el rayo, que va al ocular y permite al

observador ver la fluorescencia de la muestra.

Funcionamiento de un microscopio de

fluorescencia

Longitudes de onda a la que el espejo deja pasar la luz

Longitudes de onda a la

que el espejo refleja la luz


Microscopio de campo claro frente a microscopio de fluorescencia

Diferentes clases de fluoróforos, que se excitan a diferentes longitudes de onda


Cell observer

Es un microscopio de campo claro (que además posee fluorescencia). Tiene la particularidad de que las

muestras pueden mantenerse a una temperatura y concentración de CO2 constante, lo que permite observar las

células de un cultivo mientras este prolifera. También permite tomar fotos de forma automatizada,

algo muy útil para observar, por ejemplo, como se desplazan las células en el cultivo en el que

hemos hecho anteriormente la herida.

Campana que mantiene la temperatura

Membrana que mantiene el CO2

Herida a medio regenerar


Microscopio con focal

Es practicamente igual a un microscopio de campo claro con fluorescencia. Sin embargo, en el ocular tiene

un pinhole, por el que solo pueden pasar los rayos procedentes de una capa de células del tejido.

Esto permite que el microscopio capte cortes del tejido a diferentes alturas, pudiendo o bien ver células de una

única capa del tejido (incluso aunque esta capa esté en el centro de la muestra y recubierta por otras) o bien

realizar una reconstrucción tridimensional de la muestra.


Corte de la cóclea

Corte de mioblastos (en azul, núcleos; en rojo, mitocondrias)

iib alberto sols memoria de la...

Documents