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ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGÍA E INGENIERÍA201504 - Microbiología

GUÍAS DE COMPONENTE PRÁCTICO

CURSO: MICROBIOLOGÍA 201504

MERY LILIANA LÓPEZ MARTÍNEZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGÍA E INGENIERÍA

CEAD PASTO

DICIEMBRE DE 2014

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A continuación encuentran las guías de laboratorios que van a desarrollar de forma presencial en cada uno de los CEAD. Los laboratorios son de carácter obligatorio.

Esta guía se puede ser modificada por los docentes que van a orientar los laboratorios, de acuerdo a la necesidad y disponibilidad de equipos en cada uno de los centros.

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PRACTICA 1. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

1. Objetivos:

Establecer normas y principios básicos de comportamiento en el laboratorio.

2. Introducción

La bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas encaminadas a reducir el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas, las plagas de cuarentena, las especies exóticas invasoras, organismos vivos modificados.

Cuando se trabaja en laboratorio con microorganismos se deben poner en práctica varias normas de bioseguridad para evitar accidentes y adquirir enfermedades.

3. Procedimiento

A continuación encuentra las normas de bioseguridad básicas de cualquier laboratorio y los cuidados que se deben tener al lavar material del vidrio. Por favor realice una buena lectura pero principalmente ponga en práctica todas las recomendaciones.

Normas generales de bioseguridad.

Mantener una actitud responsable, no se permite hacer bromas, jugar, correr o gritar.

No se permite el ingreso de personas ajenas al laboratorio y/o que no porten sus implementos de bioseguridad adecuados.

No se permitirá el ingreso de personas bajo efectos de bebidas alcohólicas o sustancias psicoactivas.

Para el ingreso a los laboratorios, préstamo de material o equipo se debe presentar el carnet vigente.

Todas las superficies de trabajos se limpiaran y desinfectaran diariamente y siempre que se produzca un derrame.

Usar bata de manga larga con puños, la cual debe estar completamente cerrada.

Usar guantes de nitrilo, tapabocas, gorro, gafas de seguridad y todos los elementos de seguridad solicitados dependiendo del riesgo.

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Evitar tocar sus ojos o piel con las manos enguantadas.

Usar cabello recogido, calzado cerrado y bajo, no usar falda, joyas, manillas, reloj o elementos que puedan entorpecer la manipulación de los materiales o equipos.

Bajo ninguna circunstancia se permitirá comer, beber o fumar en el laboratorio.

Bajo ninguna circunstancia, se debe tocar, oler o probar las sustancias químicas o biológicas utilizadas en el desarrollo de las prácticas.

No trabajar nunca solo en el laboratorio.

No pipetear sustancias con la boca.

Cuando en el desarrollo de las prácticas se utilice ácido y agua en diluciones, agregue el ácido sobre el agua.

No devolver reactivos a los frascos, así no hayan sido utilizados.

Siga fielmente todas las recomendaciones dadas por el docente responsable del laboratorio.

Al calentar los tubos de ensayo en el mechero dirija la boca donde nadie corra peligro de quemarse.

Los residuos y muestras de procedimientos de microbiología que van a ser incinerados fuera del laboratorio deber ser sometidos a desactivación en autoclave.

Como norma general no se podrá verter ninguna sustancia peligrosa para el medio ambiente por el desagüe.

Al culminar el trabajo, dejar limpio y ordenado el mesón, devolver los elementos y materiales perfectamente limpios, asegúrese de dejar cerrado el gas, agua y lavarse las manos.

Para la eliminación de los residuos se deben utilizar los recipientes destinados para este fin siguiendo las indicaciones del docente responsable del laboratorio.

Cualquier accidente por pequeño que sea debe comunicarse al docente responsable del laboratorio.

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Trabajo con material de vidrio

No se debe calentar recipientes de vidrio común.

No calentar directamente al mechero de gas ni colocar recipientes de vidrio vacíos o húmedos por fuera en la parrilla eléctrica.

Cuando utilice cubreobjetos, se deben revisar los mesones y evitar que queden sobre ellos.

Comprobar la temperatura del material de vidrio.

No forzar el cierre del material.

Comprobar cuidadosamente la temperatura de los recipientes que hayan estado sometidos a calor antes de tomarlos directamente con las manos.

No lavar los elementos de vidrio de laboratorio con medios abrasivos que al rayar la superficie debilitan el vidrio.

Al lavar el material utilice guantes y gafas de seguridad y no deje residuos.

Al lavar la vidriería de laboratorios no se debe someter a cambios brusco de temperatura.

4. Cuestionario

¿Qué es bioseguridad?

¿Cuáles son las normas básicas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología?

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PRACTICA 2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Objetivos

Aprender la preparación y manipulación de los medios de cultivo.

2. Introducción

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.

3. Procedimiento

Revise las etiquetas de los recipientes de diferentes medios de cultivo, anote el nombre, la composición y forma de preparación.

En las instrucciones de forma de preparación le dicen la cantidad en gramos de medio deshidratado que se necesitan para disolver en un litro de agua. En muchas ocasiones no es necesario preparar un litro de medio, por lo tanto mediante un cálculo matemático sencillo ustedes pueden preparar una cantidad menor.

Supongamos que desean preparar 325 mililitros de medio de cultivo, al leer las instrucciones de preparación en la etiqueta dice que para preparar 1 litro (1000 ml) de medio se necesitan 20 gramos medio deshidratado.

Para hacer el cálculo se realiza un regla de tres simple:

20 gr....... 1000 mlX= (20 gr.x 325ml)/1000= 6.5 gr.

X gr......... 325ml

Esto quiere decir que se necesitan 6,5 gramos de medio deshidratado para preparar 325 ml de medio de cultivo. Para preparar el medio se hace el siguiente procedimiento:

Pese 6.5 gramos del agar deshidratado. Mida 325 mililitros de agua destilada con una probeta. De esos 325 mililitros de agua destilada coloque la mitad en un erlenmeyer previamente lavado con agua destilada, para eliminar residuos de otras sustancias. El erlenmeyer debe ser de volumen superior a la cantidad que se va a preparar. Agregue los 6.5 gramos de agar deshidratado al agua

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contenida en el erlenmeyer y posteriormente adicione el resto del agua destilada. Mezcle con el agitador.

A continuación lleve la preparación a disolver en la plancha de calentamiento, agite constantemente con ayuda de la varilla de vidrio hasta que ebulla para lograr la disolución total del Agar.

Tape la boca del erlenmeyer papel aluminio. Si las normas de preparación no indican otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave, a 121 grados centígrados, durante 15 minutos.

Esterilizado el medio deje enfriar aproximadamente a 45°C.

Proceda a servir el medio en presencia del mechero y en cajas de Petri, previamente esterilizadas. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan “abanicando” brevemente la superficie con la llama no luminosa de un mechero Bunsen. Deje enfriar hasta que solidifique.

Los medios de cultivo líquidos se preparan de la misma forma y se sirven en tubos con tapa rosca. Posteriormente lleve los tubos con caldo a esterilizar en autoclave. No olvide que cuando se va a esterilizar medios directamente en los tubos estos no deben tener la tapa ajustada. Finalmente tenga en cuenta que para preparar Agar inclinado en tubo, solo cambia el momento en que se pone a solidificar ya que los tubos deben colocarse sobre una pipeta para lograr que se forme el pico de agar inclinado.

Tome un medio de cultivo al azar y realice los cálculos para preparar volúmenes de 356 ml, 1567 ml, 131 ml y 24 ml.

Experimentalmente prepare 70 ml de medio de cultivo sólidos y sírvalos en 2 cajas de Petri, 2 tubos con agar y 2 tubos con agar inclinado. Prepare 20 ml. de cualquier caldo de cultivo y sírvalos en 2 tubos de ensayo con tapa.

4. Cuestionario

1. ¿Qué es un medio de cultivo; de qué están compuestos principalmente; cómo se clasifican según su proporción de Agar y según su suministro de nutrientes?

2. ¿Cuál es la utilidad de los medios de cultivo y qué diferencia un caldo de un medio sólido?

3. ¿En qué momento se esteriliza un medio de cultivo y por qué?

PRACTICA 3. MICROORGANISMOS DEL AMBIENTE

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1. Objetivos

Explicar cómo se puede demostrar la presencia de microorganismos en diferentes sitios.

Describir las características macroscópicas de las colonias bacterianas.

2. Introducción

En esta práctica se va a demostrar la presencia de microorganismos en el ambiente que nos rodea. Con este fin se toman muestras de diferentes sitios y se las siembra en un medio de cultivo que contiene las sustancias nutritivas que las bacterias necesitan para desarrollarse, se las lleva a incubar a la temperatura apropiada y se las deja el tiempo necesario para que crezcan y se puedan observar las colonias a simple vista y así determinar las características macroscópicas de esas colonias.

3. Procedimiento

Marcar cada caja de Petri que se va a utilizar con los siguientes datos: Nombre, Sitio del cual se tomó la muestra, Fecha de la práctica.

Tome cajas de Petri que contengan agar nutritivo y tome muestras de los diferentes sitios que se relacionan a continuación:

Deje una caja de Petri abierta durante 30 minutos en el sitio del laboratorio que desee.

Pase un copito sobre la superficie del mesón en el cual está trabajando y siembre en una caja de Petri.

Pase sus dedos por el cabello y rasque suavemente para que el producto que salga caiga sobre la caja de Petri.

Toque con sus dedos la superficie de una caja de Petri.

Tosa o estornude sobre una caja de Petri.

Introduzca un copito en su oído y siembre en una caja de Petri.

Siembre una muestra tomándola del sitio que desee.

Todas las cajas llévelas a incubar durante 24-48 horas a 37 Grados.

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Para sembrar hongos tome cajas de Petri que contengan Agar PDA, destápelas y déjelas al aire libre durante 30 minutos en el sitio que desee y luego tápelas. Déjelas a temperatura ambiente y en las oscuridad durante 48- 72 horas.

4. Resultados

Observe las colonias y basándose en la figura 1, llene los datos de la tabla describiendo las características de las colonias y la cantidad de crecimiento (mucho, abundante, regular, poco). Describa 2 colonias de cada caja teniendo en cuenta las siguientes características:

Tamaño

Forma: circular, irregular, extendida

Color: pigmentada, incolora

Textura: Granular, friable, húmeda, seca, membranosa.

Superficie: suave, áspera, rugosa, opaca, resbalosa.

Elevación: Plana, convexa, Umblicada.

Borde: irregular, aserrado, discreto, regular, entero ondulado,

Olor: inodora, aromática desagradable.

TABLA 1. CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS

SITIO DE TOMA DE LAS MUESTRAS

CANTIDAD DE CRECIMIENTO

CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS

Superficie del mesón

Cabello

……

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Figura 1. Forma, elevación y borde de las colonias microbianas

Fuente: Valencia (2004) Manual de prácticas de microbiología básica. Colección Notas de Clase. Editorial UNIBIBLIOS. Universidad Nacional de Colombia.

5. Cuestionario

Consulte la composición de los medios de cultivo empleados y regístrelos en su informe

¿Qué es un medio de cultivo selectivo y un medio de cultivo no selectivo?

En ciertos procesos industriales se requiere de áreas blancas. ¿Qué significa el término anterior?

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PRÁCTICA 4. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

1. Objetivos

Determinar las condiciones necesarias para realizar la siembra de microorganismos

Reconocer los distintos sistemas de siembra y su utilidad.

2. Introducción

Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un medio compuesto por las sustancias que necesitan los microorganismos para crecer. A veces se añaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que podrían contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con líquidos nutritivos para los microorganismos.

Si el cultivo bacteriano tiene éxito, crecerán "colonias" de bacterias en el medio de cultivo. Estas colonias tienen características de color, forma, tamaño etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. También se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas bioquímicas o de otro tipo para lograr su identificación. Algunas bacterias son muy difíciles de cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han conseguido cultivar.

3. Procedimiento

3.1 Siembra de medio sólido a medio líquido

Marque correctamente los tubos con el número del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha.

Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de él.

Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y déjela enfriar.

Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tápelo y déjelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra, destápelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida.

Realice movimientos de rotación con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape.

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Esterilice el asa en el mechero después de usarla.

Incube los tubos a 37ºC por 24 horas.

Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente

3.2 Siembra de medio líquido a sólido

Proceda en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es en tubo recuerde hacer punción y estría. Si es en caja puede utilizar diferentes sistemas como estría, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro.

Siembra de medio sólido a sólido

Proceda de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta.

Los medios sólidos contienen agar en proporción de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios métodos: como estrías, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro.

3.3 Siembra por agotamiento

Tome una placa de agar, marque la base de la caja de Petri con los números 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el número 1, realice estrías hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire la caja hasta el número 2, tome las dos últimas estrías y siga estriando hasta el número 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estrías ya hechas.

3.4 Siembra por estrías

Marque la caja en 6 puntos. Coloque la muestra en el punto número uno, realice estrías hasta el número 2. Esterilice el asa, tome las dos últimas estrías y extiéndalas hasta el número 3, tome las dos últimas estrías y extiéndalas hasta el número 4 y así sucesivamente hasta llegar al número 6.

3.5 Siembra en agar inclinado

Esta se realiza por punción y por estría. Por punción: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Por estría: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag.

No olvide flamear la boca del tubo antes y después de la siembra.

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Evalué la presencia de crecimiento en el agar por la formación de una película o por el crecimiento de colonias en la superficie.

3.6 Siembra en profundidad

Marque la caja de Petri estéril con el número de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero.

Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plástica, transfiera 1 ml de éste cultivo a la base de la caja de Petri estéril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox.

Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesón, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por último en forma de 8. Esto garantiza una distribución homogénea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento.

Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, márquelos con el número de grupo, la fecha. Luego incube 37º c por 48 horas.

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PRACTICA 5. TÉCNICAS DE TINCIÓN

1. Objetivos

Preparar frotis de bacterias para observaciones microscópicas

Observar las bacterias teñidas al microscopio y clasificarlas por su forma y su reacción a la coloración de Gram.

2. Introducción

La observación microscópica de las bacterias se facilita cuando han sido coloreadas. Se acostumbra fijar las bacterias en la lámina portaobjetos para poder teñirlas con facilidad.

La fijación puede hacerse con solventes o con calor. En cualquier caso se trata e deshidratar la célula y coagularla con proteínas.

Las coloraciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante o compuestas cuando se utilizan 2 ó más colorantes. También se puede hacer una coloración negativa en la cual se tiñe el fondo, además de la bacteria, para poder observar la cápsula.

3. Procedimiento

3.1 Coloración Simple

Para la coloración simple se utiliza azul de metileno y se trabaja con Staphylococcus aureus. Se toma una pequeña muestra del microorganismo y se fija con calor, posteriormente se añade una gota pequeña de azul de metileno, se coloca la laminilla o cubre objetos y se observa al microscopio en un aumento de 100x.

3.2 Tinción de Gram

La tinción de Gram se realiza en cultivos de Staphylococcus aureus, y Escherichia coli.

La tinción de Gram. Es una coloración compuesta porque en ella se utilizan 2 colorantes, uno primario: cristal violeta o violeta de genciana y uno de contraste, safranina o fucsina de Gram. Es una tinción diferencial porque según la composición química de la pared celular las bacterias quedan teñidas con el cristal violeta o la safranina, como mordiente o sustancia fijadora del color se utiliza lugol.

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El agente diferenciador, es decir, el que actúa de modo diferente sobre la pared celular de las Gram. Positivas y las Gram negativas es la solución alcohol cetona ó alcohol- ácido.

Los pasos de la tinción de gran son los siguientes:

Fijar la muestra al calor

Añadir el violeta de genciana o cristal violeta y dejarlo actuar durante 1minuto

Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante

Añadir lugol y dejarlo actuar durante 1 minuto


Añadir alcohol- ácido y dejarlo actuar durante 15 segundos y lavar rápidamente con agua

Añadir fucsina y dejar actuar durante 5 minutos


Secar al aire libre o con una toalla absorbente según las indicaciones del profesor

Observar en el microscopio a un aumento de 100x.

Observe todas las bacterias con las diferentes coloraciones, determine su morfología y trate de identificar sus partes, determine si son bacterias Gram. Positivas ó bacterias gran negativas. Dibuje lo observado.

4. Cuestionario

Establezca las diferencias entre una coloración simple y una coloración de gram

Investigue que coloración se debe utilizar para observar las endoporas o esporas bacterianas, y para observar la cápsula

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