guia de practica 2012 estructura func cel tisul ii

GUIA PRÁCTICA DE LABORATORIOS:

“ESTRUCTURA FUNCION CELULAR y TISULAR II

(BIOQUIMICA)

Responsable

Dra. Qco Fco. Violeta Morin Garrido M.Sc.

I Semestre 2012I Semestre 2012

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAFACULTAD DE MEDICINA HUMANA

DEPARTAMENTO DE MEDICINAAREA DE CIENCIAS BASICAS

DECANO FACULTAD DE MEDICINA HUMANADr. Arturo Seminario Cruz

COORDINADOR AREA CIENCIAS BASICASProf. Pedro Delgado Rodríguez

PROFESORES PRÁCTICA:

I Semestre 2012I Semestre 2012

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAFACULTAD DE MEDICINA HUMANA

DEPARTAMENTO DE MEDICINAAREA DE CIENCIAS BASICAS

INTRODUCCIÓN

El alumno utilizara en el desarrollo práctico de curso de estructura y funcionáis celular y tisular

equipos, técnicas, procedimientos y sus diferentes sus fundamentos para cuantificar diversos

Indicadores Bioquímicos explicando su interpretación y fundamento técnico ,científica integrando el

hallazgos a la interpretación diagnostica y integración de las funciones metabólicas también

integrara y el uso de tecnologías innovadoras a través de sus seminarios y trabajos de

Investigación

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAFACULTAD DE MEDICINA HUMANADEPARTAMENTO DE MEDICINAAREA DE CIENCIAS BASICAS

Curso: Estructura Función Celular y Tisular IIDocente: Dra. Qco Fco. Violeta Morin Garrido M.Sc.

LABORATORIO Nº 01

I SEMESTRE 20122do. Año Medicina

“SOLUCIONES BUFFER”

I. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS.En los organismos vivos se están produciendo continuamente ácidos orgánicos que son productos finales de reacciones metabólicas, catabolismo de proteínas y otras moléculas biológicamente activas. Mantener el pH en los fluidos intra y extracelulares es fundamental puesto que ello influye en la actividad biológica de las proteínas, enzimas, hormonas, la distribución de iones a través de membranas, etc… La manera en que podemos regular el pH dentro de los límites compatibles con la vida son:

Los tampones fisiológicos y. La eliminación de ácidos y bases por compensación respiratoria y renal.

Los tampones fisiológicos son la primera línea de defensa frente a los cambios de pH de los líquidos corporales, entre los que destacan: el tampón fosfato, el tampón bicarbonato y el tampón hemoglobina.Los objetivos de la práctica son entender:1) Cómo funciona una solución tampón.2) Como reacciona una sustancia al momento de verter una solución acida o alcalina.

II. MARCO TEÓRICO.

SOLUCIONES AMORTIGUADORASSoluciones amortiguadoras son aquellas soluciones cuya concentración de hidrogeniones varía muy poco al añadirles ácidos o bases fuertes. El objeto de su empleo, tanto en técnicas de laboratorio como en la finalidad funcional del plasma, es precisamente impedir o amortiguar las variaciones de pH y, por eso, suele decirse que sirven para mantener constante el pH. Los mas sencillos están formados por mezclas binarias de un ácido débil y una sal del mismo ácido con base fuerte, por ejemplo, una mezcla de ácido acético y acetato de sodio; o bien una base débil y la sal de esta base con un ácido fuerte, por ejemplo, amoníaco y cloruro de amonio.La aplicación más importante de esta teoría de los amortiguadores es, para los fisiólogos, el estudio de la regulación del equilibrio ácido-base. Para dar una idea de la importancia de los amortiguadores de la sangre, recordemos que la concentración de hidrogeniones del agua pura experimenta una elevación inmediata cuando se añade una mínima cantidad de un ácido cualquiera, y crece paralelamente a la cantidad de ácido añadido. No ocurre así en la sangre, que admite cantidades del mismo ácido, notablemente mayores, sin que la concentración de hidrogeniones aumente de una manera apreciable.Mecanismo de la acción amortiguadoraSupongamos un amortiguador constituido de ácido acético y acetato de sodio. El ácido estará parcialmente disociado estableciendo un equilibrio entre las partículas de ácido sin disociar los iones hidrógenos y los iones de base conjugada. El acetato de sodio, como todas las sales, está disociado completamente y, por esta causa, el ión acetato procedente de la sal desplaza el equilibrio hacia la formación de ácido, disminuyendo la concentración de hidrogeniones libres. La presencia conjunta de la sal y el ácido hace decrecer la acidez libre. Si las cantidades de sal y ácido son del mismo orden de magnitud, la concentración de iones hidrógenos se regulará por la reacción de equilibrio del ácido, es decir:

Si añadimos al sistema un ácido fuerte, por ejemplo ácido clorhídrico, se produce un aumento instantáneo de la concentración de iones hidrógenos, los cuales son neutralizados por la base conjugada del ácido liberando así, una cantidad equivalente de ácido débil.Si añadimos al sistema una base fuerte, por ejemplo hidróxido de sodio, los iones hidroxilos consumen rápidamente iones hidrógenos del sistema para formar agua, lo que provoca la transformación de una parte del ácido acético libre en acetato que es una base menos fuerte que el hidróxido de sodio.

La utilidad de las mezclas amortiguadoras en la regulación del equilibrio ácido-base del plasma sanguíneo, estriba precisamente en la posibilidad de mantener la concentración de iones hidrógeno dentro de límites estrechos, que con razón puede considerarse invariable.

El pH se puede mantener muy aproximadamente al nivel que convenga, escogiendo las mezclas adecuadas. Por un ejemplo, con un determinado amortiguador el pH de una cierta reacción puede ser tres, y con otro amortiguador la misma reacción se puede estudiar a pH ocho.

Ecuación de Henderson-HasselbachLa Ecuación de Henderson-Hasselbach permite calcular el pH de una mezcla amortiguadora conociendo su composición. En su deducción, para un amortiguador compuesto de un ácido débil y una sal de su base conjugada, se considera que la concentración de ácido libre es aproximadamente igual a la del ácido total, y la concentración del ión base conjugada coincide con la concentración de la sal. Con ello, La Ecuación de Henderson-Hasselbach expresa que el pH de una solución amortiguadora se calcula sumando al pK del ácido, el logaritmo de la relación concentración de sal / concentración de ácido, es decir

De acuerdo con todo lo anterior, el pKa de un ácido débil se puede definir como el pH del sistema amortiguador que resultaría al añadirle una cantidad equimolar de una sal fuerte del mismo ácido, o bien el pH alcanzado después de neutralizar con base fuerte, exactamente, la mitad de ácido. Para el ácido acético, una solución uno molar de ácido puro tiene un pH de 2.38, mientras que un sistema amortiguador con cantidades equimolares de ácido y sal tiene un pH igual al pK del ácido acético, es decir, 4.76.Propiedades de los amortiguadores1. El pH de una solución amortiguadora depende de la naturaleza del ácido débil que la integra, es decir del pKa del ácido.2. El pH de un sistema amortiguador depende de la proporción relativa entre la sal y el ácido, pero no de las concentraciones absolutas de estos componentes. Por ejemplo, un sistema amortiguador 2 M en sal y 1 M en ácido, regula el mismo pH que un sistema amortiguador 4 M en sal y 2 M en ácido, debido a que la relación concentración de sal / concentración de ácido es igual.3. La modificación del pH, en una solución amortiguadora, resulta exigua hasta que uno de los componentes esté próximo a agotarse, debido a que el pH varía con el logaritmo del cociente concentración de sal / concentración de ácido. Este cociente es afectado por la adición de ácido o base fuerte, pero el valor logarítmico de la relación concentración de sal / concentración de ácido varía muy poco.

Capacidad o eficacia amortiguadora

La capacidad de amortiguación puede definirse como "La cantidad de ácido o base fuerte que deben añadirse a un litro de solución amortiguadora para producir un cambio de pH de una unidad". También puede definirse como "El cambio de pH que se produce por la adición de una cantidad dada de ácido o base fuerte".

Puede demostrarse que la eficacia máxima de un amortiguador, tanto para neutralizar ácidos como bases, está en la zona de pH próxima al pK del ácido. El máximo de eficacia de un amortiguador frente a una base está en el punto de pH igual a pK - 0.5, mientras que la eficacia máxima frente a un ácido fuerte está en el punto de pH igual a pK + 0.5. A medida que nos alejamos del pK, la capacidad amortiguadora decrece, considerándose nula a tres unidades de distancia, es decir, a un valor de pK + 3 frente a las bases y de pK – 3 frente a los ácidos. En estas condiciones solo encontramos, prácticamente, uno de los componentes del sistema. Los amortiguadores fisiológicos rara vez tienen un valor de pK que coincide con el pH que van a amortiguar. Normalmente sus pK están unas décimas más abajo del pH fisiológico. Esto se traduce en una mayor eficacia de los sistemas para amortiguar ácidos que para amortiguar bases. De todo lo expuesto anteriormente, se deduce que puesto que el pH celular es próximo a siete, la eficacia amortiguadora máxima corresponde a los sistemas cuyo valor de pK esté comprendido entre seis y ocho.

III. Realización de la práctica.

1.-

a) Preparar 50 ml. De una solución 0.02M de buffer fosfato pH 7.5 a partir de:

Una solución 0.1M. de Na2HPO4 (fosfato disódico) Una solución de 0.05M. de NaH2HPO4 (fosfato monosódico)

b) Medir el pH.c) Añadir 1ml. HCl (0.05N), medir el pH nuevamente.d) Medir el pH de 50 ml. de H2O destilada.e) Añadir 1ml. HCl (0.05N).f) Medir el pH nuevamente

2.-a) Preparar 50ml. De una solución 1/50M de buffer fosfato pH 7.5 a partir de:

Una solución 0.1 M. de NaH2HPO4 (fosfato monosódico) Una solución 0.1 N de Na (OH)

b) Medir el pH.c) Añadir 1ml. HCl (0.05N), medir el pH nuevamente.d) Medir el pH de 50 ml. De H2O destilada.e) Añadir 1 ml. HCl (0.05N).a) Medir el pH nuevamente

3. a) Preparar 50 ml. de una solución 0.02M. de buffer fosfato pH 7.5 a partir de:

Una solución 0.1M. de Na2HPO4 (fosfato disódico) Una solución 0.05N de HCl

b) Medir el pH.c) Añadir 1ml. Na (0H), medir el pH nuevamente.d) Medir el pH de 50 ml. De H2O destilada.e) Añadir 1 ml. de Na (OH) 0.1N.

f) Medir el pH nuevamente

CUESTIONARIO 1

a) Las relaciones involucradas en c./ experimento.b) Los cálculos efectuados para la determinación de las cantidades diferentes soluciones a

emplearse a cada caso.c) Las lecturas obtenidas en el potenciómetro o con los indicadores

EL pH del HO si presento cambios bastante notorios según la escala de pH q estamos usando:

Rojo 4

Naranja 5

Amarillo 6

Verde 7

Azul 8

Índigo 9

Violeta 10

a).Cálculos de nuevo Ph al AGREGAR1 ml de Na OH:b). Al AGREGAR1 ml de HCl:

ACIDO TABLA DE PKCONSTANTE DE IONIZACIÒN. Pract.

Ácido fosfórico K1=1.1x 10-2

K2=2.2x10-7

K3=3.6x10-13

1.966.0012.44

CUESTIONARIO 2

1.- Señale sustancias de uso clínico que se usan como sustancia hidroelectrolíticas.2.- ¿Qué es una solución tampón o buffer? ¿Cómo se regula el pH?3.- ¿Qué sustancias de uso clínico se usan como indicadores del pH?4.- ¿Qué ocurre en los procesos de Alcalosis o Acidosis? (Metabólico y Respiratorio)5.- ¿Cómo influye la concentración molar de un buffer y la distribución de la concentración de la sal y

del ácido?6.- Cuales son los buffers orgánicos e inorgánicos en el organismo y de que dependen 7.- ¿Cómo se elimina amoniaco a nivel renal y porque se intercambia?



LABORATORIO Nº 02

“ DETERMINACIÓN DE CALCIO ”

I. DETERMINACIÓN DE CALCIO

El calcio desempeña papel preponderante en el microorganismo normal de los seres vivientes. Su concentración en sangre junto con la del fósforo, parece estar en equilibrio, con las sales que entran en la constitución del hueso, así cuando el producto de la concentración de estos dos iones excede de cierto valor, aumenta la intensidad de la calcificación y si es menor se produce descalcificación.

El calcio en la sangre se encuentra por entero en el plasma, donde existe en tres formas: ionizado (llamado calcio difusible); unido a la proteína (calcio no difusible) una pequeña cantidad que forma un


complejo probablemente bajo la forma de citrato. Todas estas formas de calcio en el suero se hallan en equilibrio unas con otras.

Para determinar el calcio en los medios biológicos, se han aplicado diversos principios, algunos basados en la precipitación como sulfato tuaostato, molibdato – ß – hidroxiquinolinato u oxalato de calcio.

Los valores normales se encuentran: 9.5 – 10.5 ml%

II.

2.1. Significación ClínicaEl calcio es esencial en la mayoría de las reacciones de la coagulación sanguínea y en la regulación de la excitabilidad de las fibras musculares. Su concentración en suero y orina esta regulada por la acción de factores tales como niveles de parathormona, vitamina D y fósforo, observándose fluctuaciones fisiológicas debido a la edad, sexo, embarazo, actividad física, cambios estaciónales (por acción de la luz solar).La hipercalcemia está relacionada con distintas patologías: hiperparatiroidismo, neoplasias óseas, intoxicaciones con vitamina D. La hipocalcemia se asocia con desordenes tales como hipoparatiroidismo, deficiencia de vitamina D, mala absorción.

2.2. Fundamentos del MétodoEl calcio reacciona con la cresolfaleín complexota (cfx) a pH 11, dando un complejo de adición color magenta que se mide fotocolorimétricamente a 570 nm.

2.3. Reactivos ProvistosReactivo Cfx: solución de cresolfaleín complexota 3,7 nmol/l.Buffer: solución de aminometil propanol (AMP) 0,2 mol/en metanol 35% V/V para pH final 11.Standard: solución de calcio 10 mg/dl.

2.4. Reactivos ProvistosAgua destilada

2.5. Instrucciones para su usoReactivos provistos: listos para usar.Standard: cada ves que se use, transferir una cantidad en exceso a un tubo limpio y pipetear de allí el volumen necesario, descartando el sobrenadante.

2.6. Precauciones:

Los reactivos son para uso diagnóstico “in vitro”

2.7. Estabilidad e instrucciones de almacenamientoReactivos Provistos: son estables a temperaturas ambientes hasta la fecha de vencimiento en la caja.

2.8. Indicios de Inestabilidad o deterioro de los ReactivosCa – Color se caracteriza por presentar Blancos más bajos que todos los temas similares que usan Cfx u otros indicadores de calcio. Absorbancias altas de los Blancos son indicios de contaminación con calcio. Desechar cuando las lecturas de los Blancos sean mayores o iguales a 0,200 D.O.

2.9. MuestraSuero u orina

a. Recolección: Suero: obtener de la manera usual. Orina: recomendar al paciente una dieta libre de calcio (eliminar la leche y todos sus

derivados) durante por lo menos tres días previamente a los análisis y recolectar orina de 24 horas sobre 20 ml. de ácido clorhídrico al 50% durante su recolección.

b. Aditivos: si la muestra a emplear es orina, se debe acidificar con ácido clorhídrico al 50% durante su recolección.

c. Sustancias interferentes conocidas: los anticoagulantes complejan al calcio produciendo resultados erróneos. No interfieren: proteínas hasta 15g/dl, fosfatos hasta 5g/l, bilirrubina hasta 200mg/l, hemólisis intensa o lipemia hasta 15g/l. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.

d. Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. Puede conservarse una semana en refrigerador (2 – 10ºC) o más de 5 meses en le congelador, sin agregado de conservación.

2.10. Materiales Requeridos Provisto

Varilla plástica No provisto

Espectrofotómetro o fotocolorímetroMicropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.Tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas.

2.11. Condiciones de Relación Longitud de Onda: 570 nm en espectrofotómetro o 560 – 590 nm en fotocolorímetro con

filtro rojo. Temperatura de reacción: temperatura ambiente (15 – 25ºC). Volumen de muestra: 20ul. Volúmenes finales de reacción: 3,57 ml.

Los volúmenes de nuestra y de reactivos pueden disminuirse o aumentar proporcionalmente.

2.12. ProcedimientoSe aconseja trabajar con tubos de fotocolorímetro de manera que puedes determinar un Blanco interno para cada ensayo, condición indispensable para controlar las trazas de calcio que pudiera haber escapado al proceso de lavado material.

En dos tubos de fotocolorímetro marcados S (Standard) y D (Desconocido) colocar:

S DReactivo Cfx 50 ul 50 ulBuffer 3,5 ml 3,5 ul

Mezclar con la varilla provista y leer la absorbancia de ambos tubos (Blanco internos: BS y BD) en espectrofotómetro a 570 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (560 – 590 nm) llevados al aparto de cero con agua destilada. Agregar:

S DReactivo Cfx 20 ul -Buffer - 20 ul

Mezclar inmediatamente. Después de 10 minutos, volver a leer (Sº y Dº)

2.13. Estabilidad de la mezcla de reacción finalEl color de reacción final es estable 3 horas, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de este lapso:

Sº - BS = SDº - BD = D

Cálcio sérico (mg/dl) = D x f

Calcio Urinario (mg/24 hs)

2.14. Método de control de Calidad

Standard S – N y S – E 2 niveles

2.15. Valores referenciales Suero: 8,5 – 10,5 mg/dl Orina: 60 – 200 mg/24 hs.

2.16. Limitaciones del procedimientoVer sustancias interferentes conocidas en Muestra. Contaminaciones: el material a utilizar debe estar rigurosamente limpio, libre de calcio y de toda traza de anticoagulante. Para ello aconsejamos lavar con detergente no iónicos o ácidos minerales diluidos, efectuando un enjuague final con agua destilada.Se aconseja separar pipetas, tubos de fotocolorímetro para uso exclusivo de esta determinación.

III. CUESTIONARIO1. Quien gobierna la absorción de calcio y fósforo mencione la función de las hormonas Calcitonica

Paratohormona y Hipoparsatiroidismo 2. Como se encuentra el Fósforo en el interior y exterior celular y que son fosfatos macroergicos de

ejemplos 4.3. Cual es la concentración normal de calcio y fósforo en la sangre e indique en que forma se

encuentra el calcio y como puede variar el calcio ionico con el PH, proteínas plasmáticas y variaciones de fosforo, vita D.

4. cuales son las funciones del calcio en el organismo 5. Que es tetania y espasmo carpar y como se originan



LABORATORIO Nº 03

“ MÉTODO COLORIMÉTRICO EN LA DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS”

A. INTERACCIÓN DE LA ENERGÍA CON LA MATERIA : FOTOMETRÍA

Una característica de las moléculas es la de absorber determinados tipos de radiaciones dependiendo de su estructura electrónica. Así por ejemplo, una solución que contiene ión cúprico hidrato, absorbe energía radiante de la longitud de onda que corresponde al amarillo.

FOTOMETRÍA.- Comprende el estudio de los métodos que permiten medir la concentración establecer la estructura y lograr la identificación de ciertas sustancias, aprovechando su capacidad de absorber y emitir energía radiante.

B. MÉTODO CALORIMÉTRICO EN LA DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

B.1. OBJETIVO.- El objetivo de esta práctica es que el alumno utilice las propiedades químicas de los azúcares de oxidación, reducción y floculación .Para demostrar la presencia de azúcares en sangre y orina.

B.2. REACTIVOS.- Acuda a la presencia de reactivos en su grupo correspondiente. Grupo N° 1

1. H2O Destilada 2. Solución estándar de glucosa

A. Preparar una solución de 0.1 % de Ác. Benzoico en H2O dest.


Disolver al calor a 100°C.B. Secar la glucosa 2 gr. A 60-70° C enfriar en desecador.C. Pesar 1 gr. De glucosa y disolver a 100 ml. En Ác. Benzoico.D. Preparar los St. 1, St. 2 y St. 4 de glucosa.

50 mg% 0.1 mg/ml

St. 1

100 mg% 0.2 mg /ml St. 2

200mg% 0.3 St. 1 St. 3

300 mg/dl 0.8 mg/ml St. 4

Sol. Madre 1 2 4 8Ác. Benzoico Esp. 100 100 100 100

B.3. DISEÑOS EXPERIMENTALES.-

B.3.1. Glucosa en sangre (Método Foto calorimétrico) a) Sistema de trabajo Ortho-Toluidina

REACTIVOS B St. 1 St. 2 St. 3 St.4 Prob.H2O dest. 1 mlGlucosa 0.1 mg/ml 1 mlGlucosa 0.2 mg/ml 1 mlGlucosa 0.4 mg/ml 1 ml

Glucosa 0.82mg/ml 1 mlProblema 1 mlÁc. benzoico 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 mlReactivo de O-Toluidina 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

PRINCIPIO

a) La glucosa reacciona específicamente con la O-Toluidina en medio Acético y con calor dando una coloración verde copulación que se mide calorimétricamente.

b) Colocar los tubos en Baño maría a 100 °C X 8 minutos.c) Dejar enfriar.d) Realice un espectro de absorción de la siguiente manera:

1. Prenda el espectofotómetro guiado por el profesor.2. Ponga la (longitud de onda) = a 450 nm.3. Ponga el blanco a cero de tramitancia en el espectrofotómetro y llevarlo posteriormente con el botón de

la izquierda a 100% de tramitancia.4. Ponga el St. 3 en el lugar del blanco y lea la absorbancia.5. Ponga la de onda 10 mm. Y vuelva a realizar los pasos 4 y 5 y anote sus absorbancias.6. Grafique en papel milimetrado sus absorbancias de onda y localice la de onda de mayor absorbancia

aprox. 620 mm.7. Utilice de onda y lea todo su estándar y su muestra problema contra el blanco y anote su

absorbancia.8. Cálculos: Manera de averiguar la concentración del desconocido.

1.- Método Gráfico Inscribamos un papel milimetrado aritmético los valores de A en el eje de las ordenadas contra “ C ”

concentración en el de las abcisas de cada uno de los patrones o standard debe obtenerse una recta averiguar la concentración del desconocido por la gráfica.

2.- Método Analítico (Ecuación de Lambert y Beer) Dada la ecuación A = abc y b diámetro de las cubeta es 1cm., el valor de ab es una constancia o factor para

cada uno de las sustancias standars.

Ab = Factor = A Con

Los valores hallados deben ser iguales dentro del error experimental si se sigue la Ley de Lambert y Beer y tenemos el promedio factor.

Dividiendo la absorbancia del desconocido entre el valor del Factor Promedio obtiene la concentración del desconocido.

C Desconocido = A Desconocido Factor Promedio

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué es el Fotocolorímetro?2.- Diferencie entre Precisión y Exactitud.3.- Indique porqué se puede utilizar este método para medir glucosa.4.- Fundamente 5 razones médicas para utilizar el método Fotocolorímetro.5.- Para que se usa una longitud de onda y como cuantifica una sustancia6.- que es coeficiente de extinción molar7.-describa 3 métodos adicionales que usas la luz o radiación para cuantificar la materia explíquelos brevemente.



LABORATORIO Nº 04

“METODOS CROMATOGRAFICOS Y DE SEPARACIÓN EN LA DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS PUNTO ISOELECTRICO “

A.1 CROMATOGRAFÍA Es un método analítico de separación de sustancias de una mezcla, estas sustancias pueden ser coloreadas, o no, gases y compuestos volatilizables.

Partes del sistema cromatográfico

Fase Fija es la parte donde se realiza la separación del componente, puede ser papel silicagel, gas inerte, etc.

Fase móvil es el solvente que a través de la fase fija va a eludir arrastrando con el soluto que se quiere separar

Características para la separación1. Peso del soluto2. Polaridad del soluto y solvente3. Afinidad al soluto por la parte fija4. Coeficiente de participación

Fases de la cromatografía

1. Extracción, procesamiento de la muestra para extraer el principio activo por métodos físicosa. mecánicosb. solubilidad

2. Concentración, aplicando solventes orgánicos volátiles3. Cromatrograma. poner la muestra para su recorrido a través de la fase fija4. Revelado, usar sustancias patrones, densitómetro y reactivo apropiado

Tipos de cromatografía:1. cromatografía de papel (mono y bidimensional)2. capa fina3. de gas4. de partición o reparto5. de exclusión molecular Sphadex


6. de intercambio iónico7. de columna8. por electroforesis9. de exclusión molecular

Procedimiento de separaciónLas proteínas en disolución muestran cambios profundos de su solubilidad en función:

1. El pH2. fuerza iónica3. propiedades dieléctricas del disolvente4. temperatura

Estas variables que son reflejo del hecho de que las proteínas son electrolitos de peso molecular muy grande pueden utilizarse para separar mezclas de proteínas, ya que cada proteína posee su composición en aminoácidos característicos, la cual determina su comportamiento como electrolito.

Precipitación isoeléctrica

La solubilidad de la mayor parte de proteínas globulares se halla profundamente influida por el pH del sistema, casi todas las proteínas muestran un mínimo de solubilidad aunque el pH al que ello ocurre varía de una a otra.

El pH al que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su pH isoeléctrico definido como aquel valor del pH al que la molécula no posee carga eléctrica. Ej. ovo albúmina (huevo) pH 4.6 , ureasa pH 5 en esas condiciones no existe repulsión electrostática entre moléculas de proteínas vecinas y tiende a coalcer y precipitar, sin embargo, cuando los valores del pH esta por encima o debajo del punto isoeléctrico, todas las moléculas de proteínas poseen carga eléctrica neta del mismo signo Por dicha razón se repelen mutuamente impidiendo la coalescencias de moléculas para formar agregados insolubles.

Puesto que las diferentes proteínas poseen valores de pH isolectico diferentes, con frecuencia pueden separase una de otra, mediante precipitación isoeléctrica, cuando el pH de una mezcla de proteína se ajusta al pH isoeléctrico de uno de sus componentes.

La mayor parte o casi todo el componente precipitará que dando solución las proteínas cuyos valores de pH isoelectrico precipitada permanece en su conformación nativa y puede disolverse en un medio a pH apropiado y concentración salina adecuada.

B. METODOS PRACTICOS EN LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS Y AMINOÁCIDOS

B.1. OBJETIVOS1. Que el alumno utilice el método cromatográfico de capa fina para separar e identificar las

propiedades físico – químico de los aminoácidos en nuestros patrones y problemas.2. Que el alumno identifique el Pi, en el cual la ovo albúmina puede ser separado de una

muestra biológica, y explique en que se fundamentan los métodos de separación de proteínas.

B.2. REACTIVOS1. Fase móvil para cromatografía de papel metano –H2O Piridina (80-20-4)2. Fase fija para papel de filtro3. Solución de aminoácidos : arginina 1% en Na (OH) a pH neutro aspartico 1% hasta disolución histidina 1% hasta disolución4. Solución de ninhidrina

ninhidrina 0.1 % colidina 2 ml. acido acético glacial 10 ml.

5. Ácido acético 1 N : tomar60 ml. de acido acético glacial, densidad 1.06 pureza 96% y diluir hasta 100 ml con agua destilada

6. Solución de caseína en acetato de sodio 0.1 N7. Sal de fenoftaleína8. Na(OH) 10%

B.3 DISEÑO EXPERIMENTAL

1. Cromatografía de papel a) Les será dado un papel Whatman N-1 cortado en tiras de 15x25 cn. aproximadamente, manipule el

papel por las esquinas evitando agarrarlo en lo posible, colóquelo sobre un papel limpio.b) Engrape un hilo a la parte superior del papel whatmanc) Con un lápiz marque el punto de origen, trazando una línea, esta debe estar por encima de la altura

del solvente.d) Aplique utilizando los tubos capilares las diferentes muestras según el esquema :

HILO

MUESTRA A · B · C.

PATRONES EN HCL DE 3 AMINOACIDOS

NOTA:- Para Aplicar la muestra tocar el papel levemente con el tubo capilar puesto

verticalmente- retire el tubo cuando la mancha halla alcanzado unos 3mm de diámetro- una vez seca la mancha repetir la aplicación dos veces más.

a. Coloque el papel en la cámara dejando que el borde inferior quede sumergido 1 ó 2 cn. en el solvente.

b. Dejar el papel en posición rectal asegurando los hilos a los lados de la cinta adheridac. Una vez que la muestra halla corrido, sacar el papel.d. Marcar el límite de migración de frente del solventee. Secar los papeles en un hornof. Rociar una solución reveladora, Ninhidrina-colina-ácido acético glacialg. Calentar el papel en un horno a 100 ·C hasta que aparezca las manchash. Calcular el Rf de cada mancha, e identifique los aminoácidos

Rf = distancia del punto de origen al centro de la mancha distancia del punto de origen al frente del solvente.

i. Determinación del punto isoeléctrico de las proteínas

Procedimiento

- Marcar una serie de tubos del 1 al 9- En el tubo 1, medir 3.2 ml. de ácido acético 1N y 6.8 ml de agua destilada- Medir 5ml de agua destilada en cada uno de los otros 8 tubos- Sacar 5ml de solución del tubo 1 y agregarlos al tubo 2, mezclar- Sacar 5ml del tubo 2 y transferir al tubo 3, continuar así hasta el tubo 9, al Final se eliminan

5ml- Agregar 1ml de caseína en acetato de sodio 0.1 N , mezclar- Observar el efecto en la solubilidad en cada tubo .- Después de 30’ anotar el pH- Agregar 1 gts. de fenoftaleína y mezclar- agregar Na (OH) al 10% , agitar hasta la aparición de un color rosado y observar el efecto

sobre la solubilidad.

CUESTIONARIO1.- ¿qué entiende por cromatografía?2.- Diga tres aplicaciones de la cromatografía en muestras biológicas3.- Diga el fundamento de 2 tipos de cromatografía4.- Diga dos importancias de la separación de proteínas desde el punto de vista de la aplicación

biológica5.- ¿qué entiende por punto isoeléctrico de las proteínas6.- ¿qué entiende por coagulación, precipitación y desnaturalización de proteínas7.- señalar 3 métodos de fraccionamiento de las proteínas y fundamentar8.- ¿cómo se clasifican las proteínas?9.- diga 8 funciones de las proteínas

10.- ¿en qué se fundamenta la electroforesis?11.- ¿en que se fundamenta el método cromatográfico de exclusión?



LABORATORIO Nº 05TRANSAMINASA

Determinación de Transaminasas

GOT y GPT

Fundamento del Método

La GOT cataliza la siguiente reacción:0 - aspartato + – cetoglutarato GOT glutamato + oxalacetato

La GPT Cataliza la siguiente reacción:1 - alanina + – cetoglutarato GPT glutamato + piruvato

El Piruvato formado reacciona con la 2,4 – dinitrofenilhidracina produciéndose, en medio alcalino, un compuesto coloreado que se mide a 505 nm.

Material

- Jeringa- Alcohol- Algodón- Ligadura-Tubos de ensayo 13 x 100- Gradilla- Pipetas 1 ml- Pipetas 5 ml-Muestra : Sangre (suero)

Equipos

EspectrofotómetroCentrífuga

Reactivos

- Set de Transaminasas:- Sustrato GOT- Sustrato GPT- 2,4 – DNFH- Hidróxido de Sodio (diluyente para enzimas)- Standard (Solución de pirulato de Sodio 2 mmo/l)


Procedimiento

En dos tubos de ensayo, colocar:

B DSustrato GOT ó GPT 0,5 ml 0,5 ml Colocar en Baño María Agregar :

A 37°C unos minutos

SueroAgua Destilada

----100 ul

100 ul----

Mezclar x agitación suave e incubar 30 minutosAgregar :

RVO 2,4 DNFM 0,5 ml 0,5 ml

Mezclar. Dejar 10 minutos a 37° C, Agregar luego:

Hidróxido de Sodio 5 ml 5 ml

- Mezclar por inversión y retirar del baño.- Después de 2 minutos leer la absorbancia en espectrofotómetro a 505 nm, llevando el aparato a

cero con Agua destilada.

Valores Normales: Hasta 12 U/l.

CALCULO DE LOS RESULTADOS

Elaborar una curva de Calibración utilizando el Estándar.

En un papel milimetrado trazar un sistema de coordenadas colocando en el eje vertical las absorbancias del diferente estándar y en el horizontal la actividad de GPT y GOT.

Las absorbancias obtenidas de las muestras llevarlas a estas curvas para determinar la concentración de transaminasas GOT y GPT

CUESTIONARIO

1. Para qué es útil la determinación de actividad enzimática, actividad especifica y recambio molecular 2. que es un sistema enzimático y de que elementos esta formado3. Cuales son las reacciones generales de ínterconversión de los aminoácidos y que importancia

tienen las transaminasa en la evacuación funcional de algunos tejidos4. Como interviene los estados malnutrición proteico calórico en las características osmolares y buffer

de las proteínas.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAFACULTAD DE MEDICINA HUMANADEPARTAMENTO DE MEDICINA I SEMESTRE 2012

2do. Año Medicina

AREA DE CIENCIAS BASICAS


LABORATORIO Nº 06CINETICA ENZIMATICA

CINETICA ENZIMATICA. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO. CINETICA DE MICHAELIS MENTEN

Objetivo: estudio de la actividad de fosfatasa alcalina del intestino de rata.

Introducción:

En esta práctica se estudiara algunos aspectos de la cinética de reacción de la fosfatasa alcalina, enzima que cataliza la siguiente reacción:

H H

H C OH O H C OH O

H C O P O H C OH + HO P O

O +H2O fosfatasa O alcalina

H C OH H C OH Fosfato

H H

B- glicerofosfato Glicerol

La enzima será extraída de la mucosa intestinal de rata y la actividad que presenta cuando se le añade un determinada concentración del sustrato (B-glicerofosfato) será medida determinando la cantidad de fosfato que se libera por unidad de tiempo. Midiendo la actividad obtenida con diferentes concentraciones del sustrato, se tratara de determinar la constante de Michaelis (km) m, la velocidad máxima (vm) de la reacción y la actividad específica del extracto.

METODO DE FISKE Y SUBOAROV PARA LA DETERMINACIÓN DEL FOSFORO INORGANICO

Este método servirá par determinar la cantidad de fosfato inorgánico presente en una muestra después de haber tratado al b- glicerofosfato con fosfatasa alcalina.

Fundamento: El fósforo inorgánico reacciona con el molibdato de sodio formando un complejo amarillo fosfomolibato de sodio. Este es reducido por el acido 1,2,4 – aminonaftolsufonico, formándose un complejo de color azul cuya intensidad medida a 660 nm es proporcional a la concentración de fósforo presente.

Procedimiento Experimental:

1. Preparación de la curva de calibración (absorvancia a 660nm vs. Concentración de fósforo)

Como se indica en el siguiente cuadro, prepara varias soluciones de fósforo de diferentes concentraciones a partir de un Standard de 8 ug/ml realizar las reacciones para la determinación del fósforo.

Standard De TUBO Fosfato 8ug/Ml H2o Dest Molibdato Solución (Ml) (Ml) (Ml) Reductora (ml)

Blanco 0 5 1 4 1 1 4 1 4 2 2 5 1 4 3 3 2 1 41 4 4 1 1 4 5 5 0 1 4

Mezclar y dejar en reposo 10 minutos. leer a 660 nm en el espectrofotómetro usando cubetas de 16 mm de diámetro contra el blanco. Procure hacer las lecturas antes de los 30 minutos de haber mezclado.

Graficar en papel milimetrado absorvancia vs/concentración de fósforo expresada como ug de fosforo/tubo. 5 5

A partir de los datos calcular la constante ab (E1 A= ab E, 0)

Cinética de la reacción : Preparar los tubos para las reacciones de la siguiente manera:

TUBOS REACTIVOS Blanco T1 T2 T3 T4 T5 T6

Glicerofosfato (75 umol /ml) 8 0.1 0.3 0.5 1 3 4

H2O destilada 4 3.9 3.7 3.5 3 1 0

Buffer Veronal PH 5 5 5 5 5 5 5

Mezclar bien y seguir el siguiente procedimiento para cada tubo (incluyendo el blanco). Tomar cuidadosamente el tiempo y añadir 1 ml. de la enzima (t=0) mezclar bien y agitar

periódicamente el tubo durante 15 minutos (cada 1’ o 2’). En la adición de la enzima se recomienda dejar intervalos de un minuto entre tubo y tubo.A los 15 minutos exactos tomar una elicuota de 2 ml, y verterla sobre 2ml de TCA 5% previamente medidos en otros tubos (TCA precipita proteínas paralizando la reacción). Agitar , dejar en reposo por 5 minutos como mínimo y centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos. Cuidando

de no remover el sedimento tome 1ml del sobrenadante para determinar el fósforo liberado por el método de Fiske y Subbrow.

Determinación de Fósforo: En tubos de prueba convenientemente rotulados (blanco, T1, T2….) coloca:

1 ml. del sobrenadante respectivo4 ml. del agua destilada1 ml. de molibdato4 ml. de solución reductora

Mezclar bien, dejar en reposo 10 min. Y leer a 660 nm antes de los minutos contar el blanco en el mismo tipo de cubetas utilizadas para la preparación de la curva de calibración. Utilizando la relación A=abc (ab previamente calculada) calcule los ug de fósforos provenientes del mililitro de sobrenadante de cada muestra. Apartir de este valor estima la velocidad de cada una de las seis reacciones: expréselas como ug de fosfato liberados por minuto( en lo 10 ml del sistema de incubación). Haga la grafica de 1/ v vs. 1/ s a partir de la cual puede estimar al km y vm de la reacción, exprésese el km en moles por litro. Calcule la actividad especifica en mg de proteínas de la preparación enzimático si 2ml, del preparado enzimático contiene 0,0602gr. de proteínas.

NOTA: las estudiantes deben a la practica papel milimetrado (aritmética), lápiz, regla, borrador y reloj con un minutero.

Si el extracto enzimatico pasa por purificación a través de una columna de filtración por sephadex y se coge una de dos elicuotas que da:

1. 2 veces la velocidad máxima.2. 5.7 veces la velocidad máxima.

Pregunta:

1. En que se fundamenta la purificación de una enzima por sephadex?2. Cual es el valor de la velocidad en los casos 1y 2 según su ejemplo busque su vmax y que

relación tiene con la actividad enzimática3. Si asumimos que la concentración se substrato es saturante, que orden de reacción es el

que sigue el modelo expuesto. Porque (grafique un esquema y explique). Porque juega un rol determinante la enzima.

4. cuales son las partes de un sistema enzimática 5. Ud. en su practica encontró KM , defina su importancia ejemplos



LABORATORIO Nº 07

CADENA RESPIRATORIA

“FUNCIONAMIENTO DE LA CADENA RESPIRATORIA”


OBJETIVO: Demostrar el funcionamiento de la cadena respiratoria a través del efecto de inhibidores sobre la cadena oxido-reducción biológica.

I. GENERALIDADES

Se ha demostrado que muchas sustancias inhiben la cadena respiratoria en mitocondrias aisladas, células intactas y tejidos, produciendo en consecuencia deficiente respiración celular y deficiente oxidación de los sustratos. Algunos antibióticos como la antimicina A, la elaborada por un Streptomyces, inhiben la cadena respiratoria en, o cerca del sitio II. Algunos barbitúricos como el amital y el seconal inhibirán la NADH2.El cianuro, la azida sódica (NaN3) y el CO pueden inactivar en forma eficaz la citocromooxidasa.El estudio de estos inhibidores es importante porque permite comprender la causa de la toxicidad de estos compuestos y también porque contribuyen a la realización de trabajos de investigación relacionados con la estructura y función de la cadena respiratoria.En el presente trabajo se trata de demostrar el efecto de algunos inhibidores de la óxido-reducción empleando como fuente enzimática el homogenizado celular de hígado.

II. REACTIVOS

- Buffer fosfato de sodio 0.1 M, ph 7.4- 2.6 diclorofenolindofenol 0.02%- P-fenilondiamina 1%- Succionato 0.1 M- Malonato 0.1 M- Cianuro de sodio 0.1 M- Barbiturato de sodio 0.1 M- Homogenizado hepático

III. PROCEDIMIENTO

A. SISTEMA DE SUCCINATO :

COMPONENTES 1 2 3 4 5 6- Buffer fosfato de sodio 0.1 M, ph 7.4 - 2.6 diclorofenolindofenol 0.02%- Succionato 0.1 M- Malonato 0.1 M- Cianuro de sodio 0.1 M- Barbiturato de sodio 0.1 M- Homogenizado hepático

1.51.00.2----

1.21.0----

0.5

1.01.00.2---

0.5

0.51.00.20.5--

0.5

0.51.00.2-

0.5-

0.5

0.51.00.2--

0.50.5

Mezclar: Dejar en reposo a temperatura ambiental.Observar: Constantemente los cambios de color del indicador.Interpretar sus resultados.

B. SISTEMA USANDO P-FENILENDIAMINA

COMPONENTES 1 2 3 4 5- Buffer fosfato de sodio 0.1 M, ph 7.4 - Cianuro de sodio 0.1 M- Malonato 0.1 M- Barbiturato de sodio 0.1 M- P-fenilendiamina- Homogenizado hepático

2.0---

0.5-

1.5---

0.50.5

1.00.5--

0.50.5

1.0-

0.5-

0.50.5

1.0--

0.50.50.5

Mezclar: Dejar en reposo a temperatura ambiental.Observar: Constantemente los cambios de color del indicador.Interpretar los resultados.

IV. CUESTIONARIO de interpretación de la practica

1. ¿Qué interpretación le da a los tubos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 del primer experimento?2. ¿Qué interpretación le da a los tubos 1, 2, 3, 4 y 5 del segundo experimento?3. ¿Cómo Ud. separaría Mitocondrias puras?4. ¿Cuál es la finalidad del homogenizado hepático?5. Que otros inhibidores existen de 3 ejemplos y en que sitios actuan 6. que son dadores y aceptores artificiales y cuales y para que se usaron en practica especifique el

sistema.



LABORATORIO Nº 08

TEST DE TOLERANCIA A LA CLUCOSA

TOLERANCIA A LA GLUCOSA

I. GENERALIDADES:

El test de tolerancia a la glucosa es un test que permite establecer la respuesta insulínica frene a un estímulo fisiológica por glucosa.


La ingestión de glucosa es seguida de un aumento transitorio en el nivel de la glicemia, debido a que la velocidad de la absorción intestinal exede a la capacidad del hígado y los tejidos para su utilización. En sujeto normal el nivel máximo de glucosa – después de la absorción rara vez pasa de 170 mg/100 ml. El organismo vuelve a ajustarse el nivel de la glicemia, a los valores del estado de ayuno con un período de una hora y media o dos horas y media de iniciada la prueba.

En condiciones anormales de utilización de glucosa; la elevación y reajuste de la glicemia se aparta del patrón normal teniendo estas variaciones valor diagnóstico y pronóstico.

A través del test, la orina e personas aparentemente sanas se presentan siempre libre de glucosa.

II. PROCEDIMIENTO: TOMA DE MUESTRAS SANGUÍNEAS:

a. El paciente debe ser preparado para este test, indicándosele una dieta diaria que contenga 300 g. De hidratos de carbono, durante los tres días anteriores del test.

b. Al iniciarse el test e paciente debe encontrarse en ayunas por un período de 8 a 12 horas.c. Obtener una muestra de sangre y por micción voluntaria recoger una muestra de orina del

paciente en ayunas.d. Administrar por vía hora una solución de 40 por 100 de glucosa de tal manera que el paciente

ingiera en total 1g. De glucosa por kilogramo de peso (no es necesario dar mas de 100 g. En total); si se desea, peude mejorarse el sabor de la solución con jugo de limón.

e. Extraer muestras de sangre a los 30, 60, 90 y 120 en frasco con Fluoruro de Sodio anticoagulante.

f. Colectar muestras de orina a los 60 y 120 minutos.g. Determinar la concentración de glucosa en cada una de las muestras de sangre agtenidas

conforme al método de Ortotoluidina de su práctica anterior.h. Determinar cualitativamente la presencia de glucosa en las muestras de oina con el reactivo

cualitativo de Benedict.i. En un papel milimetrado graficar los resultados obtenidos de glicemia en dada muestra, contra el

tiempo.

MATERIAL:

- Jeringa Alcohol –Algodón –Ligadura -Tubos de ensayo –Gradilla -Pipetas de 5 ml -Pipetas salí - Vasos de Precipitación –Bagueta.

EQUIPOS:

-Espectrofotómetro -Centrífuga

REACTIVOS:

SET DE GLUCOSA ENZIMATICA:- GOD/POD: Solución de Glucosa Oxidasa y Peroxidasa.- REACTIVO 4-AF : Reactivo de 4-aminofenazona- REACTIVO FENOL- STANDARD: Solución de glucosa 100 mg%.

REACTIVO DE TRABAJO: Para usar estos reactivos, en la determinación de la Glucosa, se procede de la siguiente manera:- 50 ml de agua destilada- 5 ml de reactivo 4 –AF- 5 ml de reactivo FenolLlevar a 100 ml con agua destilada

- Agregar 0,3 ml de GOD/POD previamente homogeneizadas.- Mezclar por inversión, rotular y usar.

SOLUCION GLUCOSADA: Para preparar esta solución se debe conocer el peso del paciente.

- De acuerdo al peso preparar una solución glucosada de 1gr de glucosa/ Kg. de peso.Ejm:

Si tenemos un paciente con 63 Kg. De peso, la solución glucosada será de 63 gr. de glucosa disueltos en 250 ml de agua.

1° MUESTRA: Extraer la 1° muestra en ayunas, aprox. 3 – 4 ml. (Ayunas) Indicar al paciente que recolecte su orina.

SOLUCION GLUCIOSADA: Dar al paciente la solución glucosada, y controlar a partir De ese momento 30 minutos.

2° MUESTRA: Cumplidos los 30 minutos, tomar la 2° muestra de sangre. (30 minutos) Nuevamente controlar 30 minutos.

3° MUESTRA: Extraer la 3° muestra y controlar nuevamente 30 minutos. (60 minutos)

4° MUESTRA: Extraer la 4° muestra y controlar 30 minutos más. (90 minutos)

5° MUESTRA: Extraer finalmente la 5° muestra. (120 minutos)

Después de tomadas las muestras, proceder a separar el suero de la sangre y procesar.

PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA:

En tres tubos de ensayo colocar:

B STD D1 D2 D3 D4

Standard - 25 ul - - - -

Muestra - - 25 ul 25 ul 25 ul 25 ul

Rvo.de Trabajo 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml

Incubar 10 minutos en Baño María a 37C.Leer En Espectrofotómetro a 505 nm, llevando a cero con el blanco.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:

GLUCOSA mg%: Abs. Muestra X factor

FACTOR: Conc. Std (100 mg%) Abs. std

Lipoproteína lipasa

Glicerol linasa

GPO

Cuestionario:

1. Factores que pueden influenciar los niveles de glucosa sanguínea2. En ayunas como se encuentran las siguientes vías:

- La glucogenelisis en el hígado.- La glucolisis en e hígado.- El ciclo de Krebs.- La gluconeogenisis en ayunas prolongadas.- Que enzima activa en el ayuno, para elevar la glucosa en sangre? Explique los niveles de

regulación en el hígado y músculo.3. ¿Qué hormonas tienen efecto sobre le nivel de glucosa?4. Tipos de diabetes señala la literatura5. Señale las consecuencias de la Hiper e Hipo glucemia



LABORATORIO Nº 09

PERFIL LIPIDICO (triglicéridos, Colesterol, HDL y LDL)

1. TRIGLICERIDOS

SIGNIFICACIÓN CLÍNICALos triglicéridos son lípidos absorbidos en la dieta y también producidos en forma endógena a partir de los carbohidratos. Su medición es importante en el diagnóstico y manejo de las hiperlipidemias. Estas enfermedades pueden tener origen genético o ser secundarias a otras tales como nefrosis, diabetes mellitus y disfunciones endocrinas. El aumento de triglicéridos se ha identificado como un factor de riesgo ateroscleróticas.

FUNDAMENTOS DEL METODOEl esquema de reacción es el siguiente

Triglicéridos glicerol + ácidos grasos

Glicerol + ATP glicerol - 1 - P + ADP


POD

Glicerol -1 – fosfato + O2 H2O2 + dihidroxiacetonafosfato

2H2O2 + 4-AF + clorofenol quinonimina roja

REACTIVOS PROVISTOSBuffer: solución buffer Good conteniendo cloro fenol, pH 7,5.Enzimas: viales conteniendo lipoproteína lipasa, glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF). Standard: solución de glicerol 2,26 mmol/l (equivale a 2 g/l de trioleína).

Concentraciones finalesGood………………………………………………50 mmol/l; pH 7,5Clorofenol…………………………………………………..2 mmol/lLipoprotein lipasa………………………………………..…≥800 U/lGK…………………………………………………………≥ 500 U/lGPO………………………………………………..……..≥ 1500 U/lPOD……………………………………………………….≥ 900 U/lATP…………………………………………………......…2 mmol/l4-AF………………………………………………..……0,4 mmol/l

INSTRUCCIONES PARA SU USOStandard: Listo para usarReactivo de trabajo:

5/10 x 20ml de Buffer a un vial de Enzimas.Mezclar hasta disolución completa. Homogenizar y fechar.

4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una porción de Buffer y luego transferir al frasco de Buffer enjuagando varias veces. Homogenizar y fechar.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOReactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10°C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No mantener a temperaturas elevadas durante lapsos prolongados.

Reactivo de Trabajo: es estable 30 días en refrigerados (2-10°C)

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOSEl Reactivo de Trabajo puede presentar una coloración rosada que no afecta su funcionamiento.Lecturas del Blanco superiores a 0.160 D.O. o lecturas del Standard anormalmente bajas, son indicios de deterioro del Reactivo. En tal caso, desechar.

MUESTRASuero o plasma.

a) Recolección: previo ayuno de 21 a 14 horas, obtener suero o plasma. Separar de los glóbulos rojos dentro de las 2 horas de extracción.

b) Aditivos: en caso de emplear plasma, se recomienda el uso de Anticoagulante W o heparina para su obtención.

c) Sustancias interferentes conocidas: los sueros con hemólisis intensa o marcadamente ictéricos producen resultados erróneos, por lo que no deben ser usados.

d) Estabilidad e instrucciones: los triglicéridos en suero son estables 3 días en refrigerador (2-10°C). No congelar.

MATERIAL REQUERIDO Espectofotómetro o fotocolorímetro. Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. Tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas. Baño de agua a 37 °C Reloj o timer.

CONDICIONES DE REACCION Longitud de onda: 505 nm en espectofotómetro o 490 – 530 en fotocolorímetro con filtro verde. Temperatura de reacción: 37°C Tiempo de reacción: 5 minutos Volumen de muestra: 2,5 ml Volumen de reactivo: 2,5 ml Volumen final de reacción: 2,5 ml

PROCEDIMIENTOHomogeneizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros lechosos.En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas de espectrofotométricas marcadas B (blanco), S (Standar) y D(Desconocido) colocar.

B S DMuestra - - 2,5 mlStandard - 2,5 ml -Reactivo de Trabajo 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml

Mezclar, incubar 5 minutos a 37ºC y leer a 505nmESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCIÓN FINAL El color de reacción final es estable 60 minutos, por la absorbancia debe ser leída dentro de este lapso.

CALCULO DE LOS RESULTADOSCorregir las lecturas con el blanco de reactivos y usar las lecturas corregidas para los cálculos.

TG g/l = D x factor

VALORES DE REFERENCIAEl panel de expertos de National cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes valores de triglicéridos:

Deseable: < 1,50 g/lModeradamente elevado a elevado: 1,50-1,99 g/lElevado: 2,00-4,99 g/lMuy elevado: 5,00 g/l

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Los reductores disminuyen la respuesta de color, mientras que los oxidantes colorean el Reactivo aumentando los Blancos. Las contaminaciones con glicerol producen resultados falsamente aumentados.

PERFORMANCEa) Reproductibilidad: procesando simultáneamente replicados de las mismas muestras en 10

días diferentes, se obtuvieron los siguientes datos:

Nivel D.S. C.V.1,14 g/l ± 0,021 g/l 1,82%7,41 g/l ± 0,074 g/l 2,11%

b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de trioleína y distintos sueros, se obtuvo una recuperación entre 99,2 y 100,7 % para todo el rango de linealidad del método.

c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 10 g/l de triglicéridos. Para valores superiores, repetir la determinación con muestra diluida 1:2 con solución fisiológica. Multiplicar el resultado obtenido por la dilución efectuada.

d) Límites de detección: depende del fotómetro empleado. En espectrofotómetro, el cambio mínimo de contracción detectable en las condiciones de reacción descritas, para una variación de absorbncia de 0,001 D.O. será aproximadamente de 0,008g/l.

PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOSLongitud de onda primaria 505nmLongitud de onda secundaria 700nmTipo de reacción punto finalDirección de reacción aumentaTemperatura de reacción 37ºCRelación muestra/reactivo 1:100Tiempo de equilibrio 3 segundosTiempo de retardo 300 segundosTiempo de lectura 5-20 segundosAbsorbancia de Blanco < 0,250 D.O.Límite de Absorbancia 2,000 D.O.Linealidad 10g/l

2. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL TOTAL

FUNDAMENTO DEL METODO:

La secuencia reaccional es la sgte:

Esteres del colesterol CHE colesterol ácidos grasos

Colesterol O2 CHOD Colesten-3-ona H2O2

H2O2 4-AF aceptor POD quinonimina roja.

MATERIAL: Material para toma de muestra: Tubos de ensayo - Gradillas - Pipetas automáticas- Pipetas de 5 ml

EQUIPOS: - Baño María - Espectrofotómetro – Centrífuga

REACTIVOS:

STANDARD : Solución Colesterol 200 mg%ENZIMAS : Colesterol Esterasa ( CHE ) Colesterol Oxidasa (CHOD) Peroxidasa (POD) 4 aminofenazona (4-AF)BUFFER : Solución Buffer Ph 6,8 conteniendo Fenol y Colato de Sodio.

REACTIVO DE TRABAJO: Reconstituir el contenido de un vial de enzimas con una parte de enzimas con una parte de Buffer. Transferir al frasco de Buffer enjuagando varias veces el Víal con el mismo. Mezclar hasta disolución completa. Homogeneizar y usar.

PROCEDIMIENTO:

En tres tubos de ensayo, colocar:

B STD200mg %

D

STANDARD --- 30 ul ---MUESTRA --- --- 30 ulRVO DE TRABAJO 3 ml 3 ml 3ml

Incubar 5 minutos en Baño María a 37C.

Leer en Espectrofotómetro a 505 nm , llevando el aparato a cero con el blanco.


Colesterol mg%: Abs.D x Factor

Factor : Conc.Std (200 mg%) Abs.Conc

VALORES NORMALES: 170 – 240 mg%

3.- DETERMINACION DE HDL

FUNDAMENTOS DEL METODO

Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las lipoproteínas de baja densidad y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de Sulfato de Dextrán de PM 50.000 en presencia de iones Mg .

En el sobrenadante separado por centrifugación, quedan las HDL y se realiza la determinación del colesterol ligado a las mismas.

MATERIALES: - Material para toma de muestra. -Tubos de ensayo -Gradilla -Pipetas de 1 ml -Micropipetas

EQUIPOS: -Espectrofotómetro - Centrífuga

REACTIVOS:

-REACTIVO DEXTRÁN: Solución de sulfato de Dextrán.

-REACTIVO MAGNESIO: Solución de cloruro de magnesio

-REACTIVO DE TRABAJO DE COLESTEROL ENZIMÁTICO

PROCEDIMIENTO:

En un tubo de ensayo, colocar:

- 01 ml de muestra + 100 ul de Reactivo Precipitante.- Homogeneizar agitando durante 20 segundos.- Dejar 30 minutos en refrigerador.- Centrifugar 15 minutos a 3,000 rpm.- Extraer el sobrenadante límpido y usarlo como muestra en el sgte procedimiento:


B S DSobrenadante -- -- 150 ulStandard -- 30 ul --Rvo de trabajo de colesterol 3 ml 3 ml 3 ml

Mezclar e incubar durante 15 minutos a 37°C.Retirar del Baño y enfriar.Leer a 505 nm en espectrofotómetro, llevando a cero con el blanco.


Desconocido: HDL Colesterol mg% = Abs. D x F Calclo del factor F = Conc del estándar 200 mg% = 45,7

Abs. Std VALORES NORMALES:

Hombres: 30 – 70 mg%Mujeres: 30 – 85 mg%4.- DETERMINACIÓN DE LDL

FUNDAMENTO DEL METODO:

Las lipoproteínas de baja densidad se separan del suero, precipitándolas selectivamente mediante el agregado de polímeros de alto peso molecular.Luego de centrifugar, en el sobrenadante quedan las demás lipoproteínas (HDL y VLDL); el colesterol ligado a las mismas se determina empleando el sistema enzimático Colesterol Oxidasa/ Peroxidasa con colorimetría según Trinder (Fenol/ 4-AF ).Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene el colesterol unido a las LDL.

MATERIALES: -Tubos de ensayo de 10x75 -Gradilla -Pipetas de 1 ml -Pipetas de 5 ml -Micropipetas

EQUIPOS: - Centrífuga - Espectrofotómetro

REACTIVOS: - REACTIVO PRECIPITANTE: Solución de sulfato de polivinilo disuelto en polietilenglicol - REACTIVO DE TRABAJO DE COLESTEROL.

PROCEDIMIENTO:

En un tubo de ensayo, colocar:

Muestra 400 ulReactivo Precipitante 200 ul

Homogeneizar agitando durante 20 segundos y dejar 15 minutos en Baño María a 20-25 °CCentrifugar 15 minutos a 3000 r.p.mSeparar inmediatamente el sobrenadante.Usar el sobrenadante como muestra para el sgte procedimiento:


B S DSobrenadante -- -- 150ulStandard -- 30ul --Reactivo de Trabajo 3 ml 3 ml 3 ml

Mezclar e incubar 15 minutos a 37 °C. Retirar del Baño María y dejar enfriar.Leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco.

CALCULOS DE LOS RESULTADOS:

LDL Colesterol mg% = Colest. Total - (D x F)

F = 62,4 Abs.St

VALORES NORMALES: Menos de 140 mg%

Cuestionario

1.- Haga un balance energético del ácido palmítico.2.-. ¿Qué características tiene los quilomicrones y los VLDL, qué transportan y cómo se regulan

comente sobre sus apolipoproteinas B100, B48, Apo C, Apo e?3.- ¿Con qué enzimas y por qué hormonas es regulado en el tejido adiposo el movimiento lipídico?4.- ¿Cómo y cuando produce lipólisis activa el stress metabólico incluya los cuerpos cetónicos riesgos

importancia?5.- Porque es importante la -oxidación?6.- como puede sintetizarse triglicéridos en dietas ricas en carbohidratos o Proteínas que vias utilizaría

cada una.7Señale y comente sobre que tipos de lipoproteínas transportan los diferentes tipos de colesterol en la

sangre y ¿qué características tienen?11¿Qué factores controlan la regulación de la HMG-coA reductasa y la Lipasa li política indique dos

fármacos o productos fisiológicos que las regulan comente brevemente?12¿Qué utilidad tiene la alimentación rica en lípidos, carbohidratos o colesterol en la síntesis de

colesterol sanguíneo?13.- ¿Cómo influye el colesterol alto en la síntesis de cuerpos cetónicos?



LABORATORIO Nº 10

PROTEINAS TOTALES Y FRACCIONADAS

DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES ALBUMINAS Y GLOBULINASMATERIAL

Jeringa Alcohol Algodón Ligadura Tubos de ensayo 13 x 100 Gradilla Pipetas 1ml Pipetas 5ml Muestra : sangre (suero)

EQUIPOS: Espectrofotómetro Centrífuga

Reactivos:

Procedimiento

En dos tubos de ensayo, colocar:

Proteínas totales AlbúminaSustrato sueraColocar en baño María a 37°C unos cinco minutos.

Agregar:Reactivo Biuret Albumina

Mezclar x agitación suave e incubar 15 minutos para proteínas totales y 5 para albúmina temperatura ambiente.

Valores Normales: Proteínas totales 4-7.5 gr. /100ml. Albúmina de: 4-6 mg/100ml.Globulinas de 1.9-2.9gr/100ml

Cálculos de los resultados.


CUESTIONARIO

1. Para que es útil la determinación de proteínas totales y fraccionadas.2. Cual es el destino final de interconverción o de eliminación de las proteínas.3. Cuales son las reacciones generales de ínter conversión de los aminoácidos.4. Como interviene la nutrición en los estados malnutrición proteico calórico y que repercusión tiene

las características osmolares y buffer de las proteínas.5. Como interviene la sobrealimentación de las proteínas en el manejo del nitrógeno y de riesgos

ejemp: problemas de ácido Úrico “Gota”, Obesidad, Colesteronemia.

Desarrollo

1.- Para qué es útil la determinación de proteínas totales y fraccionadas?2.- Cuál es el destino final de interconversiòn o eliminación de las proteínas?3.- Cuáles son las reacciones generales de interconversiòn de los aminoácidos.4.-como interviene la nutrición en los estados malnutrición proteico calórico y que repercusión tiene

en las características osmolares y buffer de las proteínas5.- Como interviene la sobrealimentación de las proteínas en el manejo del nitrógeno y de riesgos.

Problemas de ácido úrico “Gota”, Obesidad, Colesteronemia.




LABORATORIO Nº 11

ACIDO URICO Y UREA

INTRODUCCION

En el hombre el Ácido úrico, es el producto terminal del catabolismo de Purinas (Ácidos nucleicos) y Proteínas. Esto se debe a que el hombre no posee a diferencia de los primates la Enzima uricasa que permite catabolizar por hidrólisis el Ácido úrico hasta Alantoina .

Es por esto que cuanto más proteína (Carnes rojas principalmente) comemos, más Ácido úrico produciremos, y si esta concentración de ácido úrico excede su límite de Solubilidad precipitaran más cristales de urato de Sodio tanto en tejidos Blandos como articulaciones, produciendo una patología llamada “Gota” la cual se manifiesta por Artritis gotosa.

Resulta importante la medición de Ácido úrico y urea, par lo cual contamos como métodos como los isotópicos y los espectrofotométricos, este último empleado en la presente práctica

DETERMINACIÓN DE UREA Y ACIDO URICO – SUSTANCIA DEL METABOLISMO PROTEICO

MARCO TEORICO

UREA

Es un análisis que se realiza por separado o en una petición general de bioquímico en la sangre. Mide la cantidad (concentración) de urea o nitrógeno ureico presente en la sangre. La urea es el resultado final del metabolismo de las proteínas. Se forma en el hígado a partir de la destrucción de las proteínas. Durante la digestión las proteínas son separadas en aminoácidos, estos contiene nitrógeno que se libera como ión amonio, y el resto de la molécula se utiliza para generar energía en las células y tejidos. El amonio se une a pequeñas moléculas para producir urea, la cual aparece en la sangre y es eliminada por la orina. Si el riñón no funciona bien la urea se acumula en la sangre y se eleva su concentración.

Compuesto cristalino incoloro, de fórmula CO(NH2)2, con un punto de fusión de 132,7 °C, conocido también como carbamida.

Se encuentra abundantemente en la orina de los humanos y otros mamíferos. En cantidades menores, está presente en la sangre, en el hígado, en la linfa y en los fluidos serosos, y también en los excrementos de los peces y muchos otros animales inferiores. La urea se forma principalmente en el hígado como un producto final del metabolismo.

El nitrógeno de la urea, que constituye la mayor parte del nitrógeno de la orina, procede de la descomposición de las células del cuerpo, pero, sobre todo, de las proteínas de los alimentos. La urea está presente también en mohos de los hongos así como en las hojas y semillas de numerosas legumbres y cereales. Es soluble en agua y en alcohol, y ligeramente soluble en éter. La urea se obtiene mediante la síntesis de Wöhler, que fue diseñada en 1828 por el químico alemán Friedrich Wöhler.

Debido a su alto contenido en nitrógeno, la urea preparada comercialmente se utiliza en la fabricación de fertilizantes agrícolas. La urea se utiliza también como estabilizador en explosivos de nitrocelulosa y es un componente básico de resinas preparadas sintéticamente.

- La enzima que controla la descomposición de la urea recibe el nombre de ureasa- urea, el principal producto de degradación del metabolismo de las proteínas- Se sintetiza la urea

El químico alemán Friedrich Wöhler sintetiza la urea, un compuesto orgánico, a partir de cianato de amonio, un compuesto inorgánico. Anteriormente, la urea sólo se había conseguido aislar a partir de la orina.

MOTIVO DEL ESTUDIO

En general es un parámetro que indica la función renal, aunque puede estar alterado en enfermedades del hígado o en la deshidratación.

TÉCNICA DE REALIZACIÓN

Para realizar este análisis no se precisa estar en ayunas. Se puede realizar la toma en un lugar apropiado (consulta, clínica, hospital) pero en ocasiones se realiza en el propio domicilio del paciente.

- Para realizar la toma se precisa de localizar una vena apropiada y en general se utilizan las venas situadas en la flexura del codo. La persona encargada de tomar la muestra utilizará guantes sanitarios, una aguja (con una jeringa o tubo de extracción) .

- Le pondrá un tortor (cinta de goma-látex) en el brazo para que las venas retengan más sangre y aparezcan más visibles y accesibles.

- Limpiará la zona del pinchazo con un antiséptico y mediante una palpación localizará la vena apropiada y accederá a ella con la aguja. Le soltarán el tortor.

- Cuando la sangre fluya por la aguja el sanitario realizará una aspiración (mediante la jeringa o mediante la aplicación de un tubo con vacío).

- Al terminar la toma, se extrae la aguja y se presiona la zona con una torunda de algodón o similar para favorecer la coagulación y se le indicará que flexione el brazo y mantenga la zona presionada con un esparadrapo durante unas horas.

PROBLEMAS Y POSIBLES RIESGOS

1. La obtención mediante un pinchazo de la vena puede producir cierto dolor. 2. La posible dificultad en encontrar la vena apropiada puede dar lugar a varios pinchazos 3. Aparición de un hematoma (moratón o cardenal) en la zona de extracción, suele deberse a que la

vena no se ha cerrado bien tras la presión posterior y ha seguido saliendo sangre produciendo este problema. Puede aplicarse una pomada tipo Hirudoid o Trombocid en la zona.

4. Inflamación de la vena (flebitis), a veces la vena se ve alterada, bien sea por una causa meramente física o por que se ha infectado. Se deberá mantener la zona relajada unos días y se puede aplicar una pomada tipo Hirudoid o Trombocid en la zona. Si el problema persiste o aparece fiebre deberá consultarlo con su médico.

VALORES NORMALES DE UREA EN SANGRE

Los valores normales en los adultos son entre 7 y 20 mg por decilitro. En los niños pequeños se aceptan valores de 5 a 18 mg/dl.

Los valores más altos de 100 mg/dl se deben a un fallo renal importante.

VALORACIÓN DE RESULTADOS ANORMALES

Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en:

- Dietas con exceso de proteínas

- Enfermedades renales

- Fallo cardiaco

- Hemorragias gastrointestinales

- Hipovolemia (quemaduras, deshidratación)

- Inanición

- Obstrucciones renales (piedras, tumores)

Puede aparecer la urea disminuida en:

- Dieta pobre en proteínas

- Fallo hepático

- Embarazo

- Exceso de hidratación.

- Malnutrición

ACIDO URICO

Compuesto nitrogenado, blanco, incoloro e insípido, de fórmula C3H4N4O3, que se forma en el cuerpo como resultado del metabolismo de las proteínas.

Está presente en pequeñas cantidades en la orina humana, y en cantidades mayores en la orina de los pájaros y reptiles. El ácido úrico es muy poco soluble en agua e insoluble en alcohol y éter. Al calentarse forma urea, amoníaco y dióxido de carbono.

La gota es el resultado de una alteración en el metabolismo del ácido úrico. Las piedras en los riñones formadas por sales de ácido úrico aparecen en personas con altos niveles de este ácido en la orina.

Es un análisis que se realiza por separado o en una petición general de bioquímico en la sangre. Mide la cantidad (concentración) del ácido úrico presente en la sangre.

El ácido úrico es el resultado final del metabolismo de las purinas (partes de DNA y RNA). La mayor parte del ácido úrico se excreta por el riñón, y algo por el sistema intestinal. Cuando aumenta la destrucción de los tejidos (como en diversos tipos de cáncer) el ácido úrico aparece elevado en sangre, aunque la causa más común de su elevación es la gota.

MOTIVO DEL ESTUDIO

Sobre todo para hacer un diagnóstico de gota, pero en ciertos procesos puede aparecer elevado y es útil para evaluar otras enfermedades.TÉCNICA DE REALIZACIÓN

Para realizar este análisis se precisa estar en ayunas al menos las 6 horas previas.

Se puede realizar la toma en un lugar apropiado (consulta, clínica, hospital) pero en ocasiones se realiza en el propio domicilio del paciente.

- Para realizar la toma se precisa de localizar una vena apropiada y, en general, se utilizan las venas situadas en la flexura del codo. La persona encargada de tomar la muestra utilizará guantes sanitarios, una aguja (con una jeringa o tubo de extracción).

- Le pondrá un tortor (cinta de goma-látex) en el brazo para que las venas retengan más sangre y aparezcan más visibles y accesibles.

- Limpiará la zona del pinchazo con un antiséptico y mediante una palpación localizará la vena apropiada y accederá a ella con la aguja.

- Le soltarán el tortor.

- Cuando la sangre fluya por la aguja, el sanitario realizará una aspiración (mediante la jeringa o mediante la aplicación de un tubo con vacío).

- Si se requiere varias muestras para diferentes tipos de análisis se le extraerá más o menos sangre o se aplicarán diferentes tubos de vacío.

- Al terminar la toma, se extrae la aguja y se presiona la zona con una torunda de algodón o similar para favorecer la coagulación y se le indicará que flexione el brazo y mantenga la zona presionada con un esparadrapo durante unas horas.

PROBLEMAS Y POSIBLES RIESGOS

- La obtención mediante un pinchazo de la vena puede producir cierto dolor.

- La posible dificultad en encontrar la vena apropiada puede dar lugar a varios pinchazos

- Aparición de un hematoma (moratón o cardenal) en la zona de extracción, suele deberse a que la vena no se ha cerrado bien tras la presión posterior y ha seguido saliendo sangre produciendo este problema. Puede aplicarse una pomada tipo Hirudoid o Trombocid en la zona.

- Inflamación de la vena (flebitis), a veces la vena se ve alterada, bien sea por una causa meramente física o por que se ha infectado. Se deberá mantener la zona relajada unos días y se puede aplicar una pomada tipo Hirudoid o Trombocid en la zona. Si el problema persiste o aparece fiebre deberá consultarlo con su médico.

VALORES DEL ÁCIDO ÚRICO

Los valores normales en los hombres adultos son entre 4 y 8,5 mg por decilitro. En las mujeres adultas 2,5 a 7,5 mg/dl. En los niños pequeños se aceptan valores de 2,5 a 5 mg/dl.Los valores más altos de 12 mg/dl se consideran altos (hiperuricemia).

Pueden modificar los valores de ácido úrico y no ser por una gota ciertas situaciones: 1. Estrés en general puede elevar los niveles de ácido úrico. 2. La utilización de contrastes radiológicos también 3. Ciertos productos y medicamentos pueden aumentar el ácido úrico, la cafeína, el alcohol, las

teofilinas, etc. 4. Pueden disminuir los valores de ácido úrico, la aspirina, el alopurinol, los corticoides, las hormonas

femeninas.

DIAGNÓSTICOS POSIBLES EN VALORES ANORMALES

Puede aparecer el ácido úrico elevado en sangre (hiperuricemia) en:

- Acidosis metabólica

- Alcoholismo

- Diabetes mellitus

- Dieta rica en purinas (carnes rojas, vísceras de animales, embutidos, mariscos, frutos secos)

- Eclampsia en el embarazo

- Exceso de ejercicio

- Fallo renal

- Gota

- Hipoparatiroidismo

- Lesiones graves en los tejidos (quemaduras, traumatismos)

- Leucemia

- Litiasis renal

- Policitemia vera

- Quimioterapia del cáncer

Puede aparecer el ácido úrico disminuido (hipouricemia) en:

- Dietas baja en purinas (proteínas)

- Síndrome de Fanconi

- Síndrome de Wilson

COMPOSICIÓN DE LA ORINA

En los seres humanos la orina normal suele ser un líquido transparente o amarillento. Se eliminan aproximadamente 1,4 litros de orina al día. La orina normal contiene un 96% de agua y un 4% de sólidos en solución. Cerca de la mitad de los sólidos son urea, el principal producto de degradación del metabolismo de las proteínas. El resto incluye nitrógeno, cloruros, cetosteroides, fósforo, amonio, creatinina y ácido úrico.

GOTA

Enfermedad compleja de origen incierto causada por una alteración del metabolismo del ácido úrico producido en el organismo por la ruptura de proteínas, y como resultado de una elevación de los niveles de ácido úrico en la sangre. Una dieta rica en licores de malta, vinos, y proteínas puede desencadenar ataques aislados pero no originar la enfermedad. Su incidencia no se ve particularmente afectada por el clima o las estaciones; cerca del 95% de los pacientes son hombres. La enfermedad es rara en sujetos con edad inferior a los 30 años; en un 10 a 20% de los casos existen antecedentes familiares de la enfermedad.

Los ataques agudos se caracterizan por un dolor articular intenso, que se localiza con frecuencia en el dedo gordo del pie, aunque a veces puede situarse en el tobillo, la rodilla, la cadera, el hombro, la muñeca, o el codo. El ataque suele comenzar de forma brusca; la articulación se hincha, enrojece, e inflama, y es muy sensible. Sin tratamiento los ataques duran entre unos días a varias semanas.

El tratamiento de la gota requiere el reposo completo del miembro afectado y una dieta simple baja en proteínas, además de una ingesta elevada de agua con el fin de reducir el contenido de ácido úrico del organismo. La fase aguda se trata con fármacos antiinflamatorios, como la colchicina o la indometacina. La gota crónica se acostumbra tratar con agentes que favorecen la eliminación de ácido úrico, como el probenecid, y agentes que inhiben su producción, como el alopurinol.

CÁLCULO DE RESULTADOS DE LA UREMIA:

Factor = 60 mg% S

Factor = 60 mg% 0.26

Factor = 25.38 mg%

ÚREA mg% = D x FACTOR ÚREA mg% = 0.11 x 230.7

ÚREA mg% = 25.38 Valores normales de úrea : 15- 40 mg%

OBSERVACIONES EN EL LABORATORIO

Se pudo observar en el laboratorio que los tubitos tenían un color celestito bajito en el caso del Blanco y en el caso del Standard tubo un color celestito más oscuro.

Se dice que la urea aumenta con la alimentación y que también se forma en el hígado y en el riñón

CÁLCULO DE RESULTADOS DEL ÁCIDO ÚRICO:

Factor = 10 mg% S

Factor = 10 mg% 0.29

Factor = 34.48 mg%

ÁCIDO ÚRICO mg% = D x FACTOR ÁCIDO ÚRICO mg% = 0.1 x 34.48

ÁCIDO ÚRICO mg% = 3.48

Valores normales de ácido úrico:

Hombre: 2.5 – 6.0 mg%

Mujer : 2 – 5 mg%

OBSERVACIONES EN EL LABORATORIO

Se pudo observar en el laboratorio que los tubitos tomaron un color rosado ,en el caso del blanco el color fue rosado bajito, en el caso del standar fue color rosado oscuro .

CUESTIONARIO

1. La urea es un producto del metabolismo proteico exógeno o endógeno

Es un producto del metabolismo exógeno, ya que el cuerpo produce en promedio de 25 a 30 gr. de urea al día – algo más en las personas que comen una dieta rica en proteínas, menos en personas con dieta pobre en proteínas. Toda la urea debe eliminarse por la orina; de lo contrario se acumulará en los líquidos corporales. Su concentración normal en el plasma es de aproximadamente 26 mg/100 ml, pero se han observado en estados anormales raros (deficiencia de proteínas plasmáticas) valores de hasta de 800 mg/100 ml.; pacientes con insuficiencia renal muchas veces tienen valores tan altos como 200 mg/100ml.

2. La urea puede ser usada como fuente de nitrógeno, explique su respuesta

No, porque al ser la urea producto final del catabolismo del nitrógeno en el ser humano compuesto de amoníaco, bióxido de carbono y del nitrógeno amídico del asparteto, no existe una vía metabólica que degrade la urea a productos como el nitrógeno que requiere el organismo. Además al degradar la urea se formaría amoníaco como residuo en niveles alarmantes en el organismo ya que el amoníaco es un veneno para el individuo.

3. El ácido úrico es el producto del metabolismo. De que sustancia y que alteraciones produce en el organismo.

El ser humano convierte los nucleoridos de la purina, adenosina, y guanosina, el producto final excretado, ácido úrico, a través de intermediarios y reacciones. Primero, la adenosinadesaminasa. La fosforólisis de los enlaces N-glucosidicos de enosina y gunosina, catalizada por nucleósido de purina fosforilasa, libera ribosa 1- fosfato y una base purínica. A continuación, en hipoxantina y guanina, forman xentina en reacciones catalizadas por xentina oxidasa y guanasa.

En la hiperuricemia, la concentración sérica de uratos excede el límite de solubilidad. La cristalización resultante de urato de sodio en tejidos blandos y articulaciones forma los depósitos llamados tefos, que causan una reacción infalmatoria, artritis, gotosa aguda, que puede progresar a artritis gotosa crónica.

Síndrome de Lesch – Nyhan.

Deficiencia inmunitaria.

Litiasis renal.

Xentinuria

4. En otros organismos vivos, que otras sustancias catabólicas existen del metabolismo proteico.

En otros mamíferos distintos de los primates superiores, la enzima uricasa escinde el ácido urico y forma el producto final muy hidrosoluble, alantoína.

No obstante, dado que el ser humano carece de uricasa el producto final del catabolismo de purinas en éste es ácido úrico. Al igual que en el ser humano, los anfibios, aves y reptiles carecen también de uricasa y excretan ácido úrico y guanina como productos finales del catabolismo de las purinas.

5. Dibuje un esquema de la regulación de los ácidos nucleicos T, G, C, A.

PRPP

ATP + Ribosa 5-fosfato

ATP + CO2 + Glutamina

ACA

ADHO

AO

OMP

UMPUDP

UTPCTP

CAP

UDP

dUDPTMP

TDP

Nucleótidos purínicos

Aspartato

PRPP

SIGNIFICACIÓN CLINICA

El ácido úrico es un metabolito de las purinas, ácidos nucleicos y nucleoproteínas. Habitualmente la concentración de ácido úrico es suero varia de un individuo a otro de acuerdo a diversos factores tales como: sexo, dieta, origen étnico, constitución genética, embarazo.

Niveles anormales de ácido úrico en suero son índice de desorden en el metabolismo de las sustancias que lo originan o de los defectos en su eliminación.


El esquema racional es el siguiente:

UOD

Ácido úrico + 2H20 +02 ------------------------ alantoína + H202 + C02

POD

H202 + 4 – AF + clorofenol ------------------------ quinona coloreada + H20

REACTIVOS PROVISTOS

Standard: solución de ácido úrico 100 mg/l

Uricaza: Solución de Uricaza (UOD) Mayor O Igual A 3 U/l

Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo más de 100 U de peroxidasa (POD), 12,5 mmol de buffer fosfatos para pH 7,3 y 3 mmol de 4- aminofenazona.

Reactivo Fenol: solución de clorofenol 24 mmol/l

Concentraciones finales

UOD ............................................................ 26 U/l

POD ............................................................ 200 U/l

Fosfatos ................................................ 25 mM

4-AF ............................................................. 6 mM

Clorofenol .................................................... 2,4 mM

pH ............................................................. 7,3 + 0,1

REACTIVOS NO PROVISTOS

Agua destilada. Ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMENTO

INSTRUCCIONES PARA USO

Standard: listo para usar

Uricaza: lista para usar

Reactivo 4-AF/POD: reconstituir agregando 50 ml de agua destilada, homogenizando inmediatamente por inversión para permitir la disolución. Rotular y fechar. Antes de usar, mezclar por inversión, sin agitar.

Reactivo Fenol: listo para usar Ver PRECAUCIONES.

Reactivo de Trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo, colocar en una probeta 80 parte de agua destilada, 10 partes de reactivo Fenol, 10 partes de Reactivo 4 AF/POD (reconstituido) y 0,8 partes de uricasa. Mezclar por inversión, sin agitar, evitando la formación de espuma. Rotular y flechar. Pueden prepararse distintas cantidades respetando las proporcione establecidas. Es importante además, espectar el orden de agregado de los reactivos y asegurar una perfecta homogeneización de los mismos, a fin de que el Reactivo Fenol no deteriore el reactivo de trabajo.

PRECAUCIONES

Los reactivos son para uso “in Vitro” El fenol es toxico e irritante.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALAMCACENAMIENTO

Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2- 10°C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No mantener a temperaturas elevadas durante lapsos prolongados.

Reactivo 4AF/POD (reconstituido): es estable 3 meses a temperatura ambiente (menor de 25°C o 10 meses e refrigerad9r (2-10°C a partir de la fecha de su preconstitución. A bajas temperaturas este reactivo puede cristalizar. En este caso, antes de usar, redisolver completamente a temperatura ambiente y homogenizar. La disolución pude acelerarse colocando el frasco en baño de 37C unos minutos.

Reactivo de trabajo: en frasco de vidrio colocar caramelo y en refrigerador (2-10°C ) es estable 30 días a partir de la fecha de su preparación. A temperatura ambiente es estable 5 días.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS

Durante el uso, el Reactivo de trabajo puede desarrollar un ligero color rosado que no afecta su funcionamiento siempre que se procese un Blanco con cada lote de determinaciones y un Standard periódicamente. Desechar cuando las lecturas del Blanco sean superiores a 0,160 D.0. o las lecturas del Standard sean anormalmente bajas.

MUESTRA

Suero o plasma heparinizado

a) Recolección: 0btener suero de la manera usual. Separar el coagulo dentro de las dos horas posteriores a la obtención.

b) Aditivos: en caso de emplear plasma, usar solamente heparina como anticoagulante.c) Sustancias interferentes conocidas:

- Los sueros histéricos o con hemólisis visible o intensa producen resultados erróneos por lo que no deben ser usados.

- El fluoruro inhibe la uricaza.- Medicamentos: sustancias fuertemente reductoras, como ácido ascórbico (Vitamina C),

buscapina (butil bromuro de hioscina) etc suministrados en dosis elevadas interfieren en la reacción consumiendo H202 . Por tal razón siempre que sea posible, debe suspenderse la medicación al paciente 24 horas antes de la toma de muestra. Caso contrario, pueden obtenerse valores falsamente disminuidos.

- No se observan interferencias por: bilirrubina hasta 120 mg/l, hiperlipemia o hemólisis ligera.

Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.

d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: emplear suero fresco. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento, el suero puede conservarse hasta 3 días en el congelador (sin agregado de conservadores).

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Espectrofotómetro o fotocolorímetro.- Tubos de fotocolorimetro o cubetas espectrofotometricas de caras paralelas.- Frasco de vidrio color caramelo- Baño de agua a 37°C (opcional)- Reloj o timer

CONDICIONES DE REACCION

- Longitud de onda: 505 nm en espectofotometro o en fotocolorimetro con filtro verde (490-530 nm)

- Temperatura DE reaccion: 37°C o temperatura ambiente (18-25°C)- Tiempo de reaccion: 15 mnutos a 37°C o 30 minutos a temperatura ambiente (18-

25°C)- Volumen de muestra: 50 ul- Volumen de reactivo de trabajo: 2,5 ml- Volumen final de reacción: 2,55 mlVolúmenes de Muestra y de Reactivo pueden disminuirse o aumentarse proporcionalmente. (Ej. 20 ul de muestra + 1 ml de reactivo de trabajo o 100 ul+ 5 ml).

PROCEDIMIENTO

En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco), S(Standard) y D (Desconocido), colocar:

B S D

Standard - 50 ul -

Muestra - -- 50 ul

Reactivo de trabajo 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml

Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37°C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 – 25°C) Retirar, enfriar y leer en espectrofotómetro a 5005 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm) llevando el aparato a cero con el Blanco.

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL

El color de reacción final es estable 45 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de este lapso.


100 MG/Lácido úrico mg/l = D x f donde f = ------------------

s

METODO DE CONTROL DE CALIDAD

Standatrol S-N y Standatrol S-E 2 niveles

VALORES DE REFERENCIA

En adultos normales, con ingesta normal de proteínas, se observan los siguientes rangos de valores:

Hombres: 25 – 60 mg/1

Mujeres: 20 – 50 mg/1

Los niveles d ácido úrico varían de acuerdo a la edad, el sexo y las diferentes dietas: incluso se ha observado una variación estacional. Se recomienda por lo tanto, que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia, teniendo en cuenta estos factores.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Ver sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.

Los reductores disminuyen la respuesta de color, mientras que los oxidantes colorean el Reactivo aumentando los Blancos.

Dichos agentes son frecuentemente encontrados en el agua destilada empleada para preparar el Reactivo de trabajo por lo que se recomienda controlar la calidad de la misma.

Los detergentes, metales pesados y cianuros son inhibidores enzimáticos.

PERFORMANCE

a. Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes datos:

Nivel D.S C.V

45,6 mg/l + 1,03 mg/l 2,26 %

97,0 mg/l + 1,31 mg/l 1,35 %

b. Recuperación: agregando cantidades conocidas de ácido úrico a distintos sueros, se obtuvo una recuperación entre 97 y 101 % para un nivel de uricemia de 100 mg/l.

c. Limite de detección: Depende del fotómetro empleando. En espectrofotómetros, el Standard de 100 mg/l proporciona una lectura de aproximadamente 0,190 D.o lo que significa que el cambio mínimo de concentración detestable en esas condiciones para 0,001 D.O será aproximadamente de 0,5 mg/l

d. Linealidad: la reacción es lineal hasta 200 mg/l Para valores superiores, repetir la determinación empleando la mitad del volumen de muestra y multiplicar el resultado final por 2.

PRESENTACIÓN

Equipo para 500 ml (Cod. 1840101)

BIBLIOGRAFÍA

-Chu, S.Y – Can J. Med Technol. 4

-MURRAY, Mayes y otros (2001) “Bioquímica de Harper” 15º edición Editorial manual moderno s.a .1040 pp.



LABORATORIO Nº 12

CREATININA Y BILIRRUBINA

DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS ESPECIALES DE FORMACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS Y BILIRRUBINA EN SUERO

DETERMINACIÓN DE CREATININA

GeneralidadesLa creatinina es el anhídrido de la creatina, se transforma en gran parte en los músculos por la eliminación no enzimática e irreversible del agua del fosfato de creatina y creatinina.

La creatinina es un producto terminal del catabolismo proteico que se elimina por la orina.

En condiciones normales la creatina se encuentra sólo en la orina de los niños o en las mujeres embarazadas o en puerperio, pero no en hombre adulto. La creatinina en cambio es un constituyente habitual de la orina cuya excresión no depende como en el caso de otros compuestos nitrogenados, de la ingestión de proteínas de la dieta. De modo normal se elimina 7gr al día y esta cantidad es bastante fija para un determinado individuo dependiendo en forma directa de la masa muscular que tenga el sujeto. La creatinina es eliminada por un simple proceso de ultrafiltración glomerural por la cual se determinación simultánea en sangre y en orina representa un buen índice de la función renal.

Fundamentos del método

La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con el ácido pícrico en medio alcalino dando un complejo color rojo que se cuantifica mediante lectura fotométrica.

Materiales- Tubos de ensayo- Gradilla- Pipetas y micropipetas

Equipos - Centrífuga- Baño María- Espectrofotómetro

Reactivos Standard : Solución de creatinina 20mg/lÁcido pícrico : Solución de ácido pícrico 41,4 mmol/lBuffer/Ple : Solución de polioxietilen laurel éter (PLE)

DANS 15mmol/l en buffer glicina/NaOHStopper : Ácido acético al 20%


Procedimiento Equilibrar el Reactivo de Trabajo a la temperatura de reacción (25ºC). Antes de agregar la muestra, llevar el aparato a cero con agua destilada. En dos tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas S (Standard) y D (Desconocido), colocar:

S DReactivo de trabajo 1ml 1mlStandard 0,2ml -Muestra - 0,2ml

Mezclar inmediatamente, disparando al mismo tiempo el cronómetro y proseguir la incubación. A los 30 segundos exactos medir la absorbancia (S1 y D1) y continuar la incubación. Medir nuevamente la absorbancia (S2 y D2) a los 5 minutos (4 minutos 30 segundos después de la primera lectura).

DETERMINACIÓN DE BILIRRUBINA GENERALIDADES

Generalidades Entre los pigmentos biliares tenemos:

a. Bilirrubina no conjugada o Bilirrubina Indirecta : Se forma a nivel del bazo y de la medula ósea. Se caracteriza por ser insoluble en agua, de la reacción de Vender Bergh indirecta y no se elimina por el riñón.b. Bilirrubina Conjugada ó Bilirrubina Directa : Formada en 8,0 a 85 96 en el hígado, se caracteriza por estar conjugada con una molécula de Ácido Glucorónico (Monoglucorónida) ó con dos moléculas de de Ácido Glucorónico (Diglucorumida) y con una molécula de Ácido sulfúrico (sulfoconjugada ) de tal manera que existen tres tipos de bilirrubina directa

1. Monoglucorónido de Bilirrubina, buena parte se forma en el RES2. Diglucorónido de Bilirrubina, formado en su totalidad en el hígado. 3. Bilirrubina Sulfoconjugada formada también en el hígado.

Estos tipos son solubles en el agua, dan la reacción de Van den Bergh Directa (Biconjugada) ó Bifásica (que estaría dado por las dos restantes; se filtran por el riñón y son las formas con la bilirrubina se excreta por la bilis al intestino.c. Urobilinógeno o Urobilina y el Estercobilinógeno y la Estercobilina que resultan de la acción de las bacterias de la flora intestinal sobre la Bilirrubina producto de reacciones y oxidación. Una parte es absorbida por la mucosa intestinal para luego el nivel hepático ser transformado nuevamente en Bilirrubina y otra parte ser eliminado por vía renal. Pero la mayor parte de los vbilinógenos formados en el intestino son eliminados por las heces.

FUNDAMENTOS DEL METODOLa bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo violáceo (azobilirrubina)Que se mide fotocolorimétrica7lente a 530 nm5i bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona con el diazoreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador- acuoso que posibilite su reacción. De forma tal que, para que reaccione la Bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción.

Materiales- Tubos de ensayo- Gradilla - Pipetas de 2ml- Pipetas de 5ml

Equipos

- Centrífuga - Baño María- Espectrofotómetro

Reactivos

Desarrollador: Solución acuosa de benzoato de cafeína, tamponada y estabilizada.Nitrito de sodio: Solución de nitrito de sodio 0,07 mol/lReactivo sulfanílico: Solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0,17 mol/lDiazoreactivo: Mezclar 1 parte de Nitrito de sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico.

Procedimiento En tres tubos de ensayo, colocar:

B D TSuero 200 ul 200ul 200ulAgua destilada 2,5ml 2,5ml -Desarrollador - - 2.5mlReactivo sulfanílico 200ul - -Diazorreactivo - 200ul 200ul

Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. Luego de 5 minutos leer en el espectrofotómetro a 530mm, llevando el aparato a cero con agua destilada. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos.Si se lee antes habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. Si se lee después habrá sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre.


Bilirrubina Total (mg/l) : (T-B) x FBilirrubina Directa (mg/l): (D-B) x FBilirrubina Libre (indirecta) : B-Total- B. Directa

VALORES DE REFERENCIA

Adultos Recién Nacidos Directa : Hasta 2mg/l Hasta las 24 horas : 60mg/lTotal : Hasta 10mg/l Hasta las 48 horas : 75mg/l

Del 3 al 5 día : 1250mg/lCuestionario

1. Señale los factores de riesgo para influenciar los niveles elevados de Bilirrubina.2. señale dietas especiales para controlar los niveles de Bilirrubina.

Determinación de Bilirrubina y creatinina1. Qué es ictericia? Explique Bioquímicamente.2. El urobilinogeno como aparece en sangre y en orina.3. La Bilirrubina directa del metabolismo de que compuestos resulta, explique los pasos de la degradación del

hem4. Para qué sirve la glucoronidoconnjugación. De 3 ejemplos.5. La Bilirrubina es tóxica para el organismo del recién nacido. Porqué.6. cuales son las reacciones de la síntesis de creatinina y que metabolito final deja 7. porrqué puede aumentar la creatinina en sangre.8. La creatinina fosfato, en qué tejido se encuentra y qué fines cumple.


Curso: Estructura Función Celular y Tisular II


Docente: Dra. Qco Fco. Violeta Morin Garrido M.Sc.

LABORATORIO Nº 13

TECNICA DE ELISA

TÉCNICAS DE ELISA Y DETERMINACIÓN DE HORMONAS

OBJETIVOS

La técnica de Elisa es un procedimiento de ensayo inmunoenzimático cuyo nombre resulta de la asociación de las iniciales de su denominación inglesa (enzyme linked inmuno sorbent assay). Como todo ensayo inmunoenzimático, la prueba recurre al empleo de inmunógenos, haptenos ó anticuerpos marcados con una enzima, para revelar el reactivo complementario a nivel de distintos fluidos biológicos.Fue concebida independientemente en 1971 en Suecia y Holanda, siendo aplicada posteriormente a la revelación y a la cuantificación de los más diversos tipos de sustancias presentes en líquidos orgánicos (antígenos, anticuerpos, hormonas, fármacos, etc.).El área de sus aplicaciones médicas se ha expandido en forma sostenida, siendo utilizada como el primer sustituto de la técnica de Radioinmunoensayo* en la medición de hormonas, inmunoglobulinas, antígenos y anticuerpos en infecciones bacterianas, micósicas, parasitarias o virósicas.De un modo general se procede a la fijación de uno de los componentes de la reacción inmunológica (antígeno Ag o anticuerpo Ac) a un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario. El complejo inmunológico formado es enfrentado luego a las moléculas capaces de reconocer a su componente más superficial, marcadas con una enzima (peroxidasa de rábano picante); agregándose posteriormente un sustrato cromogénico de la enzima marcadora. La existencia de una reacción inmunológica se demuestra y se cuantifica midiendo espectrofotométricamente la cantidad de producto enzimático resultante.

MARCO TEORICO

Introducción

La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal : es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos : diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc..

Dispositivos empleados en ELISA

Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de absorción de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros

http://www.labgeminis.com/publicidad/la_tecnica_elisa.htm#_ftn1

http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/elisaplates96.jpg

para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas robotizados (HTS, 'High troughput system')

Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizado.

Fases de un ensayo ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes : Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.

Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.

Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.

Tipos de ensayos ELISA

http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/elisaplates1536.jpg

http://www.ub.es/biocel/wbc/images/inmunocitoquimica-s3/elisa2.jpg



Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ej. en el clonaje de anticuerpos monoclonales), o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, ...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.

ELISA 'sandwich'. (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

PROCEDIMIENTOS GENERALES DE UNA TÉCNICA ELISA:

Dispensar muestrasDispensar conjugado Incubar a 37ºC o a temperatura ambienteLavar los pozosDispensar cromógeno/sustratoIncubar a 37ºC o a temperatura ambienteDispensar solución de paradaLeer en lector de tiras ó placas de ELISA

El procedimiento se efectúa de dos formas principalmente:Método indirecto: También conocido como método Sándwich (Anticuerpo-antígeno-anticuerpo), se basa en la fijación de un anticuerpo a la fase sólida, el cual atrapa los antígenos homólogos en la muestras que posteriormente son identificados con un anticuerpo específico marcado con una enzima. En estos casos la cantidad de antígeno es directamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.

[< [<о [<о>-Peroxidasa [Generación de colorPozos Recubiertos Muestra Conjugado Sustrato

Método competitivo: Se basa en la competencia que se establece entre un antígeno marcado enzimáticamente y el mismo antígeno sin marcar (muestra objetivo) al ser colocados frente a una cantidad limitada del anticuerpo homólogo fijado a la fase sólida. En estos casos la cantidad de antígeno es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.

[< [<о о-Peroxidasa [Generación de colorPozosRecubiertos Muestra -Conjugado Sustrato

TIPOS DE TÉCNICAS ELISA:

Técnicas cualitativas:Son técnicas Elisa que nos indican la ausencia ó presencia de un antígeno o anticuerpo determinando. Los kits incluyen controles positivos y negativos para poder determinar esta presencia o ausencia de antígenos.Ejemplo: HIV, Hepatitis, etc.Técnicas cuantitativas: Son técnicas Elisa que nos indican la cantidad de antígeno ó anticuerpo presente en la muestra. Los kits incluyen +/-6 standards (sueros de diferentes concentraciones del antígeno objetivo) con los cuales se realiza una curva para así poder determinar la concentración de la muestra. Ejemplo: Hormonas, Marcadores tumorales, etc. Técnicas semi-cuantitativas: Son técnicas Elisa que nos dan un indicio de la cantidad de antígeno ó anticuerpo presente en la muestra con la utilización de un standard ó calibrador Ejemplo: ANA, nDNA, etc.

QUE EQUIPOS SE NECESITAN PARA MONTAR LAS TÉCNICAS ELISAPipetas P20, P100, P200 y P1000 para servir las muestras y los reactivos. Baño de María o baño seco.Agitador de placasLavador automático, pipeta Multicanal ó Distriman (repetidora)Lector de tiras ó placa de Elisa.Opcionalmente un procesador automatizado de placas de Elisa

Radioinmunoanálisis RIA, representa una variedad de técnicas inmunológicas en las cuales un radio nucleido es utilizado para detectar antígenos ó anticuerpos.

TIPOS DE ENSAYOS ELISA

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución ( por ej: en el clonaje de anticuerpos monoclonales), o la dterminación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,…) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.

ELISA “sándwich” (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un

segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado.

Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

INMUNOLISA T3

PRINCIPIO DEL ENSAYO

En el inmunoLISA T3, un segundo anticuerpo (la cabra el ratón anti-IgG) es cubierto sobre los pozos de microtítulo. Una cantidad moderada de suero paciente, una cierta cantidad de ratón monoclonal Anti-T3 el anticuerpo, y una cantidad constante de T3 conjugado con el rábano picante peroxidasa es añadida a los pozos de microtítulo. Durante la incubación, el ratón anti T3 el anticuerpo está destinado al segundo anticuerpo sobre los pozos. T3 y la enzima conjugada-T3 compiten por los sitios limitados obligatorios sobre el anticuerpo anti-T3.

Después de una incubación de un 60 minuto en la temperatura ambiente, los pozos son lavados 5 veces por mar para quitar desatado T3 conjugado. Una solución de TMB entonces es añadida e incubada durante 20 minutos en la temperatura ambiente, causando el desarrollo de un color azul.

El desarrollo en color es parado con la adición de HCL, y la absorbancia es medida espectrofotométricamente en 450 nm. La intensidad del color formado es proporcional por la suma del presente de enzima, y esta inversamente relacionada a la suma de normas inetiquetadas T3 probadas de la misma manera. La concentración de T3 en la muestra desconocida entonces es calculada.

LOS REACTIVOS Y MATERIALES REQUERIDOS

1. Pozos cubiertos por anticuerpo (1(placa), 96 pozos). Pozos de microtítulo cubiertos de antiratón de cabra IgG.

2. Enzima Concentrado Conjugado (11x) 1,3 mL. Contiene T3-HRPO Conjugado, con el parachoques de TRIS, pH =7,60 y ProClin-300.

3. La Enzima Conjugada diluida (1 botella, 1,3 mL) Contiene ANS, el parachoques de TRIS, pH=7,60 y ProClin-300.

4. Estándar de referencia (1 frasco mL) Contiene 0,0.75,1.5,3.0,6.0 y 10.0 ng/ml, triyodotironina en el suero T3/T4-libre y ProClin-300.

5. T3 el Reactivo de Anticuerpo (1bottle, 7mL)Contiene el ratón monoclonal anti-T3 en el parachoques de fosfato, pH=7,60 y ProClin-300.

6. TMB el reactivo (1 botella, 11 mL) Contienen 3,3 '5,5' tretaodilbenzidino (TMB) estabilizado en la solución parachoques.

7. Parar la Solución (EN HCL) (1 botella, 11 mL). Contiene diluido ácido clorhídrico

LA CALIBRACIÓN DEL ENSAYO

Las normas T3 son calibradas contra el Total de la Corporación de Productos Diagnóstico T3 de la prueba el Abrigo de Conde RIA. La exactitud de esta calibración es el 100 el 5 %. Por lo tanto, la exactitud de muestras pacientes probadas con el InmunoLISA T3 puede variar en el 5 %.

EL EJEMPLO DE LACURVA ESTÁNDAR

Los resultados de un estándar típico controlado con lecturas de densidad ópticas en 450 nm mostrados sobre el Eje de ordenadas contra el Total T3 concentraciones (ng/mL) mostrado sobre el eje X-, es presentado debajo.

NOTA: la curva estándar es para la ilustración sólo, y no debería ser usada para calcular cosas desconocidas. Cada laboratorio debe proporcionar sus propios datos y la curva estándar para cada ensaye controlado.

Además, los valores de la absorbancia (450nm) pueden ser variados debido a la incubación en la temperatura ambiente diferente en laboratorios diferentes.

TOTAL CONC (ng/ml) ABSORBANCE (450 nm)

0.0 2.685

0.75 2.381

1.5 2.028

3.0 1.502

6.0 0.992

10.0 0.518

CUESTIONARIO:

1.- ¿Para que se usa la técnica de Elisa?

La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal : es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.

Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.

Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos : diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc..

2.- Cuantos tipos de Elisa conoce describa cada uno de ellos?

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ej. en el clonaje de anticuerpos monoclonales), o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, ...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpo secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.

ELISA 'sandwich'. (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

3.- ¿Qué hormonas se pueden detectar por medio de la técnica de Elisa y por que métodos?

Se pueden identificar hormonas como Insulina, Estrógenos, Progesterona; y hormonas Tiroideas.Gran parte de los progresos alcanzados por la biología moderna se deben al perfeccionamiento de los métodos analíticos de medida. La introducción de los procedimientos basados en las reacciones inmunológicas ha representado un importante avance en el análisis de sustancias de interés en biología animal y vegetal difíciles de medir empleando los métodos bioquímicos habituales. Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos

indirectos (marcaje con fluoresceína, con radioisótopos o con enzimas) hacen que estos métodos se empleen ampliamente.

Existen diversos métodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unión Ag-Ac Así tenemos:

1. Técnicas de aglutinación. Cuando el antígenos e encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado.

2. Técnicas de fluorescencia y citometría de flujo. Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.

3. Técnicas de radioinmunoensayo. En estas técnicas al anticuerpo se une un isótopo radiactivo siendo posible la cuantificación del complejo Ag-Ac a través de la radiactividad emitida.

4. Cromatografía de afinidad. La especificidad de la unión Ag-Ac puede utilizarse para obtener Acs y Ags puros.

5. Inmunoprecipitación e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y anticuerpos específicos.



LABORATORIO Nº 14

INDICE DE MASA MUSCULAR IMC

Evaluación nutricionalÍndice de masa corporal

Nutrición e índice de masa corporal

Objetivos de alimentación.Los propósitos principales de la alimentación pueden ser varios, pero en general se los puede resumir de acuerdo a cuatro objetivos principales: el aporte energético, el plástico, el regulador y el aporte de reserva.

Aporte energético


Este es el principal para cualquier ser humano y para cualquier actividad que se desempeñe. Los aportes de hidratos de carbono, proteínas y grasas (sustratos) deben estar dados en cantidad, calidad y proporción adecuados. A través de esto, lo que se logra es energéticamente, los carbohidratos 4 Kcal. por gramo de peso seco. Se recomienda que mínimamente se efectúe una ingesta diaria de 100 gramos. Energéticamente las grasas se constituyen una verdadera reserva energética, ya que brindan 9 Kcal. por gramo.

Aporte plástico

Para cumplir este propósito deben considerarse la incorporación adecuada de proteínas y ciertos minerales. La función indispensable de construcción de tejidos y huesos.

El aporte regulador

Viene dado generalmente por la incorporación al organismo de vitaminas y minerales. En el caso de las vitaminas, funcionando como catalizadores de las reacciones bioquímicas.

El aporte de reserva

Teniendo en cuenta que hidratos de carbono y grasas son las principales fuentes de energía permitiendo la liberación de energía.

La utilización diaria de energía se divide básicamente en tres partes:

- La primera es el índice metabólico de reposo y es la energía básica que necesita el organismo para las actividades elementales de todos lo días, a saber: mantener sui temperatura, respirar, circular nuestra sangre, digerir, alimentarnos, pensar, hablar, etc.

- La segunda es la necesaria para la actividad física que desarrollemos sea deporte, trabajo o estar en casa, y es conocida como factor de actividad.

- La tercera es el factor de injuria, y se aplica en los casos que existen enfermedades, opresiones o periodos de recuperación de alguna operación o enfermedad.

La eficiencia con que una persona convierte la energía de reserva en otra depende siempre de cada organismo. Estas corresponden a la masa corporal, edad, sexo, estados biológicos (embarazo), efecto térmico del ejercicio y el cambio inducido por la propia ingestión de los alimentos.

Las reservas (bacterias) de energía del organismo, sin de mayor parte las grasas y en menor parte los carbohidratos, representando en una persona en óptimo estado físico un 15 % y un 0.5% del peso total de la persona respectivamente. Por eso, cuando una persona esta excedida en peso, la energía acumulada o de sobra es un exceso de tejido graso.

El promedio de consumo de alimentos de una persona es de 2000 K Calorías por día.

Índice de masa corporal

Conocido también como BMI (body mass index) indica el estado nutricional de la persona considerando dos factores elementales: su peso actual o su altura.Este índice es el primer paso para conocer el estado nutricional de cualquier persona. Su cálculo arroja como resultado un valor que indica se la persona de la cual se habla se encuentra por debajo, entro o excedida del peso establecido como normal para su tamaño físico.

La ecuación matemática que permite obtener su valor es la siguiente:BMI: peso actualConsiderando el peso de la persona en kilogramos y su altura en metro.

El valor obesidad leve:

Varones: 25-29.9 Kg. /m cuadradoMujeres: 24-28.9 Kg. /m cuadrado

Obesidad severa:

Varones: 30-40 Kg. /m cuadradoMujeres: 29-37 Kg. /m cuadrado

Obesidad muy severa:

Varones: mayor que 40 Kg. /m cuadradoMujeres: mayor que 37 Kg. /m cuadrado

Referencia Valor mínimo Punto de corte Valor máximod3 Deficiencia nutricional en tercer

grado 16

d2 16 Deficiencia nutricional en segundo grado

17

d1 17 Deficiencia nutricional en primer grado

18.5

dp 18.5 Bajo peso 20Normal 20 Normal 25

sp 25 Sobrepeso 30o1 30 Obesidad en tercer grado 35o2 35 Obesidad en segundo grado 40o3 45 Obesidad en tercer grado

Como se podrá presumir, lo recomendado para un estado nutricional bueno, es que el valor del BMI personal se encuentre dentro del rango especificado como normal, es decir, en valores que van desde 20 hasta 25.Objetivo: calcular el índice de masa corporal de los alumnos y clasificar su estado nutricional de acuerdo a la tabla nutricional esto con el objeto de sugerir un plan de alimentación a las persona y evaluar dicho plan.Además, muchos otros factores influencian a la salud de una persona, entre los cuales se pueden mencionar: la dieta, la actividad física, el consumo del tabaco, los niveles de colesterol, la presión sanguínea y los niveles de azúcar en la sangre.

Método de trabajo:

Pesar y tallar a todos los alumnos.Calcular el índice de masa corporal.IMC= Peso (Kg.) / (altura) al cuadrado en (m) al cuadrado.

Interpretar los valores de acuerdo a la tablaActividad cotidiana: correlacionar IMC con la actividad física y tabule.Su actividad física es:

Ligera (estudio, oficina, comercio, casa, reposo) Moderada (camino permanentemente) Intensa (soy deportista) Practica deportes: ocasionalmente (actividad ligera) Diaria (actividad moderada) Muy intensa o actividad muy intensa.

¿Cual es el deporte? Recibió últimamente tratamientos: si no

Preguntas:

1. ¿Para qué se usa el índice de masa corporal?

indica el estado nutricional de la persona considerando dos factores elementales: su peso actual o su altura.

2. Qué aplicación tiene en la evaluación de dietas?3. ¿Para la evaluación de tratamiento del paciente diabético como cree que se le usa? ¿Tiene

importancia en el control del diabético, por qué?4. ¿Tiene utilización en el seguimiento de otras enfermedades agobiantes, por qué?



LABORATORIO Nº 15INDICADORES TUMORALES

Para la Cuantificación de Fosfatasa Acida Prostática en suero

Existen a la fecha diferente tipo de marcadores tumorales usados en el laboratorio de rutina como:

- Alfafetoproteínas- Antígeno prostático específico (PSA)- Antígeno prostático libre (PSAL) - B2 Microglobulina- C.A. 2.1 .1- C.A. .125- C.A. 15.:3- C.A. 19.:9- C.A. 72.4- C E.A. (Antígeno Carcinoembrionario)- GCH (ßGonadotropina coriónica) - Índice PSAL/PSA Total- Marcador Cáncer de Vejiga- NSE (Enolasa Neuroespecifica)

También la actividad de enzimas sirve en algunas ocasiones para descartar cáncer, como es el caso de la actividad de la fosfatasa acida total y prostática.


La próstata tiene altas concentraciones de fosfatasa acida. Trascendencia clínica: Útil en el diagnóstico y monitoreo del carcinoma prostático invasivo y metastásico.

SUMARIO y EXPLICACION

"Fosfatasa Acida" es el térnino usado para describir la actividad de todas las fosfatasas a un pH óptimo por debajo de 7.0 Aunque los niveles significativos de la actividad de esta enzima aparecen en diferentes tejidos, la fosfatasa ácida prostática tiene el mayor interés clínico desde que las elevaciones de esta isoenzima aparecen en sueros de pacientes que padecen carcinoma prostático con metástasis. posterior a la terapia, los niveles de actividad sérica gradualmente alcanzan la normalidad, Si el tumor está localizado, los niveles séricos de fosfatasa ácida permanecerán normales o ligeramente elevados (1).

Significación Clínica

Las fosfatasas ácidas se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente altas las cantidades de estas enzimas en próstata, estómago, hígado, músculo, bazo, eritrocitos y plaquetas. Las distintas isoenzimas se diferencian entre si por su pH óptimo, peso molecular, y requerimientos de activado de activadores e inhibidores.La fosfatasa ácida prostática (FAcP) constituye un valioso auxiliar en el diagnóstico precoz de cáncer prostático, una de las formas neoplásicas de mayor morbilidad. En este sentido, la determinación cinética de FAcP usando -naftil fosfato como sustrato ha mostrado sensibilidad y especificidad comparables a las técnicas radioinmunológicas, con semejante poder discriminatorio y evidentes ventajas de orden práctico.


La FAcP (E.C.3.1.3.2.) hidroliza el -naftil fosfato a pH 5,2 con liberación de fosfato y -naftol. El naftol reacciona a su vez con un diazorreactivo presente en el sistema 4cloro-tolueno-1,5-diazo -naftaléndisulfonato (4-CTD) produciendo un pigmento amarillo de modo que el aumento de la absorbancia leído a 405 nm es proporcional a la actividad fosfatásica de la muestra.

REACTIVOS PROVISTOS

Buffer Citrato: buffer citrato 0,1 mol/I, pH 5,4 con 14 mmol/I de activador (1,5-pentanodiol + butanol).Sustrato NF: comprimidos conteniendo cada uno 6 umol de -naftil fosfato y 2 umol de 4-CTD.

Concentraciones finalesNF........................................................3 mmol/I4-CTD.......::.........................................1 mmol/Ibuffer citrato.............................0,1 mol/I, pH 5,2

INSTRUCCIONES PARA SU USOSustrato; preparación: para cada determinación disolver un comprimido de Sustrato NF en 2 ml de Buffer Citrato, agitando suavemente hasta lograr disolución completa.PRECAUCIONESLos reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOReactivos Provistos: son estables en refrigerador (210°C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. La exposición prolongada a temperatura ambiente puede deteriorar el sustrato.

Sustrato reconstituido: estable 24 horas refrigerado (2-10°C) o 12 horas a temperatura ambiente.

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOSLecturas a 405 nm del Sustrato reconstituido mayores de 0,250 0.0. leídas contra agua, son indicio de deterioro de los reactivos. En tal caso desechar.

MUESTRA

Suero

a) Recolección: obtener suero libre de hemólisis. No utilizar plasma. La fosfatasa ácida prostática es sumamente inestable "in vitro" y al pH del suero a temperatura ambiente puede perderse hasta un 50% de actividad en pocas horas. Por lo tanto debe separarse el suero del coágulo dentro de una hora de la extracción, conservándolo refrigerado hasta el momento de usar.

b) Aditivos: para evitar la inactivación durante el almacenamiento puede acidificarse la muestra agregando 20 ul de buffer acetato, 5 M, pH 5 por cada mi de suero. Este conservador se prepara agregando Diluyente para Enzimas concentrado Wiener lab. a 29 mi de ácido acético glacial p.a. hasta obtener pH 5 completando a 100 ml con agua destilada.

c) Sustancias interferentes conocidas:- Sueros con intensa ictericia muestran baja recuperación de la actividad enzimática por lo que su

uso debe evitarse. - no usar sueros con hemólisis visibles.- Los anticoagulantes interfieren en la reacción por lo que no debe emplearse plasma en la

determinación. - Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.

d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: si se emplea el conservador descripto en b) la muestra puede conservarse refrigerada (2-10°C) durante varios días sin pérdida significativa de la actividad. De no utilizarse este conservador la muestra deberá procesarse inmediatamente.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Espectrofotómetro.- Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados. - Cubetas espectrofotométricas de caras paralelas.- Cronómetro.

CONDICIONES DE REACCION

- Longitud de onda: 405 nm- Temperatura de reacción: 25, 30 ó 37°C.- Tiempo de reacción: 4-5 minutos - Volumen de muestra: 200 ul- Volumen final de reacción: 2,2 ml

PROCEDIMIENTOEn una cubeta mantenida a la temperatura seleccionada colocar:-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Sustrato 2ml-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Preincubar unos minutos. Luego agregar:---------------------------------------------------------------------------------------------------------------Muestra 200 ul----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Disparar simultáneamente un cronómetro. A los 4 minutos registrar la D.0. Leer posteriormente la absorbancia cada minuto durante 3 minutos. Determinar la diferencia promedio de absorbancia / minuto (∆A/min) restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. Utilizar este promedio para los cálculos.


Fosfatasa ácida prostática (U/l) = ∆A/min x 853 (405 nm; relación muestra/sustrato 1: 1 O)

VALORES ESPERADOS

La actividad de FAcP es muy escasa en el hombre sano y casi nula en la mujer, de modo que los valores esperados se encuentran en el límite del error instrumental o muy cercanos al límite de detección del sistema.

Debe sospecharse la presencia de cáncer prostático toda vez que los valores superen en un 60% al valor superior normal.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

- Es sabido que las enzimas son sensibles a la acción de ciertos contaminantes y venenos enzimáticos (metales pesados, cianuros, tensioactivos, etc.) por lo que se recomienda extremar las precauciones en la limpieza del material empleado en la extracción de muestras y en la determinación.

- Los comprimidos pueden presentar color rosado, o pequeñas manchas en su superficie que no alteran su reactividad. .

- Alteraciones iatrogénicas: existen algunos medicamentos que pueden afectar los valores plasmáticos de FAcP, igual que el masaje, cateterismo y otras manipulaciones prostáticas por lo que es conveniente interrogar al paciente o al médico tratante sobre toda medicación, tratamiento o procedimiento diagnóstico a que esté sujeto el paciente.

PERFORMANCE

a) Reproducibilidad: procesando simultáneamente replicados de una misma muestra, se obtuvo lo siguiente:

Nivel D.S. C.V.10U/1 :t0,51 U/I 5,1 %52 U/I :t 0,71 U/I 1,3 %

c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 128 U/I ((∆A/min = 0,150 D.0.). Para valores superiores repetir la determinación con muestra diluida 1:2 ó 1:5 con solución fisiológica, corrigiendo consecuentemente los resultados.

c) Límite de detección: depende del fotómetro empleado y de la longitud de onda. De acuerdo con la

Temperatura 25ºC 30ºC 37ºCFAcP 0-2.6 0-3.0 0-3.7

sensibilidad requerida, en espectrofotómetros con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor, reproducibilidad: 2 nm, luz espuria 0,5% Y semiancho de banda 8 nm, para un ∆A/min de 0,001 el mínimo cambio de actividad detectable será de 0,8 U/L.

PRESENTACIONEquipo para 20 determinaciones.

CUESTIONARIO

1. Explique los resultados observados, consulte bibliografía sobre cáncer de próstata, cáncer al hueso y explique porque se eleva la fosfatasa en estos casos .

2. Indique que son los marcadores tumorales y de 4 ejemplos explicando por qué se le usan3. ¿Que son Oncogenes? De 3 ejemplos4. Que son prontooncogenes y como se convierten en oncogenes?5. Que son genes supresores de tumores, de 3 ejemplos, Explique brevemente 2 mecanismos

como actúan incluya por lo menos 1 del ciclo cellar ,y endonucleasa de restricción 6. Que es amplificación en tandén en oncogenes? , acción viral y cáncer y su relacion como

amplificadores celulares.

guia de practica 2012 estructura func cel tisul ii

Documents