MICROSCOPIA

Dr. José A. Gutiérrez Bustamante Area de Genética y Biología Molecular y Celular

Dpto. de Morfología HumanaFac. de Medicina UNT

GALILEO GALILEI

La “Accademia dei Linceii” publica un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja

MALPIGHI

En 1660 y 1665 Malpighi observa los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia

ANTONY VAN LEENWENHOEK

En el siglo XVII , utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos

MICROSCOPIO DE LEEUWENHOEK

CARACTERÍSTICAS DEL MICROSCOPIO DE LEEUWENHOEK

Dos lupas

combinadas

260 aumentos,

Visualizó algunos

protozoos e infusorios

MICROSCOPIOS DEL SIGLO XVIII

CALR ZEISS

Mejora la microscopía de inmersión

Sustituye el agua por aceite de cedro

Obtiene 2000 aumentos

FUNDAMENTO DE LA MICROSCOPÍA

Cuando el observador se acerca, el objeto se agranda

Si se aumenta el ángulo visual se ve con claridad

EVOLUCIÓN DEL MICROSCOPIO

ESQUEMA DEL MICROSCOPIO

Un tubo cilíndrico aloja el sistema ópticoocular/objetivo. Una platina de original diseño permite observar las preparaciones, que son iluminadas por un espejo cóncavo que concentra la luz sobre el objeto a estudiar.

PARÁMETROS ÓPTICOS

Aumento

Poder de resolución

Nº de campo

Profundidad de foco

Contraste

AUMENTO

Se calcula multiplicando el aumento del objetivopor el aumento del ocular

PODER DE RESOLUCIÓN

Distancia si dos puntos se distinguen

Mayor, cuando menor es la longitud de onda

Mayor, cuanto mas grande es la apertura numérica

Mayor, con aceite de cedro

MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

PARTE MECÁNICA QUE SE PUEDE DESMONTAR

Estativo

Oculares

Objetivos

Condensador

Cabezal

Tornillos

de la

platina

SISTEMA DE SOPORTE O ESTATIVO

Píe

Brazo

Tubo

Platina

SISTEMA DE AJUSTE (1)

Anillo de

ajuste de los

oculares

Tornillo que

permite

mover el

cabezal

Tornillos

reguladores

de la platina

Tornillos del

condensador

Palanca de

cierre del

diafragma

SISTEMA DE ENFOQUE

Tornillo

micrométric

o

Tornillo

macrométrico

Freno

PLATINA

Escala

Pinza

PARTE ÓPTICA

Sistema de iluminación: fuente de luz, condensador y diafragma

Lentes: objetivos y oculares

SISTEMA DE ILUMINACIÓN: FUENTE DE LUZ

Suele ser una lámpara halógena de intensidad graduable

Se enciende y apaga con un interruptor

En el exterior puede tener un filtro

Interruptor y

graduación de la luz

Lámpara

Filtro

CONDENSADOR Y DIAFRAGMA

• Condensador: concentra la luz de la lámpara en un punto de la preparación

• Diafragma o iris (está dentro del condensador):si se cierra mejora el contraste, pero empeora la resolución

LENTES: OBJETIVOS

Están colocados en el revolver

Tienen un sistema de amortiguación

Un anillo coloreado indica los aumentos

Son de 4, 10, 40 y 100 (inmersión) aumentos

OBJETIVOS

Azul

40x

Amarillo

10x

Rojo

4x

Blanco

100x

Amortiguación

LENTES: OCULARES

Ajuste de la

distancia interpupilar

Oculares

OCULARES: 10x; 15x; 20x

MATERIAL NECESARIO: PORTAS Y CUBRES

ACEITE DE INMERSIÓN

De baja, media y alta viscosidad

Es imprescindible con el objetivo de inmersión (100x)

MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. No poner la preparación al revés

2. Regular la luz a intensidad media

3. Ajustar condensador y diafragma al medio

4. Empezar por poco aumento

5. Mirando por fuera subir la platina

6. Enfocar y ajustar

7. Pasar al siguiente aumento y enfocar

8. Al acabar retirar la preparación

9. Apagar la luz

CONSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO

Ponerle su funda al guardarlo

Limpieza de lentes con papel de gafas

El exceso de xilol al limpiar las lentes desgasta el cemento

Usar pincel y pera de aire

TIPOS DE MICROSCOPIOS

Tipos de

microscopios

Microscopio

óptico

Microscopio

electrónico

Microscopio

Óptico Simple

Microscopio

Óptico

Compuesto

M.O. Normal

Campo oscuro

Contraste de fases

Fluorescencia

Transmisión

Barrido

Digital

Efecto túnel o cuántico

Lupa

PODER DE OBSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO

MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASES

Células epiteliales 20 x

VENTAJAS

Examina la estructura de los organelos

Observa el movimiento de los organelos, núcleo y mitocondrias

Observa células vivas en cultivo

DESVENTAJA

Observa células individuales

MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Células epiteliales 200 x

Aplicaciones

Detecta proteínas específicas

Revela organelos dentro de la célula

Limitaciones

En cortes celulares finos

Utiliza fijadores que destruyen la antigenicidad de las proteínas

ERNST RUSKA

El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) consiguió aumentos de 100.000 X. Fue desarrollado por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931

PRIMER MICROSCOPIO ELECTRONICO

Utilizó un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra.

Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM).

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO

Obtiene una imagen tridimensional

Tamaño pequeño y sencillo

Utiliza los e-dispersos a partir de la superficie de la muestra

M.E. DE BARRIDO

Glóbulo blanco

M.E. DE TRANSMISIÓN

Bacilos en división

Similar al óptico pero de mayor tamaño

Complejo e invertido

Utiliza electrones que atravieza la muestra

COMPARACION

Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido

por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es

lavado con el disolvente.

Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al colorante .

Metacromáticas: componente celular se tiñe con un color

diferente.

Métodos de coloración:

-Coloración directa: existe afinidad entre el colorante y el objeto.

- Coloración indirecta: requiere la intervención de mordientes.

- Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta su

punto óptimo.

- Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y

luego se elimina el resto del colorante por medio de

diferenciadores.

- Coloración simple: se colorean algunos elementos del preparado.

- Coloración combinada: colorea los elementos nucleares y

citoplasmáticos .

- Coloración panóptica: coloración combinada realizada

sucesivamente por colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa).

- Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos

los colorantes neutros que se necesiten.

Clasificación de los colorantes:

Según su origen :

COLORANTES NATURALES:

- Animales carmín

- Vegetales hematoxilina, orceína, azafrán

COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS :

- Ácidos: eosina o eosinato de sodio. Son colorantes

citoplasmáticos.

- Básicos: azul de metileno. Son colorantes nucleares.

- Neutros: Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de

otro.

- Indiferentes: Sudán lll, rojo escarlata.

Colorantes: reciben esta denominación las

sustancias que pueden conferir color a

otros cuerpos.

FIJACION

La fijación tiene por objeto

matar las células y

conservarlas, en el estado

en que se encontraban

durante la vida.

Es un método histológico

destinado a obtener

preparados duraderos que

conservan la estructura

morfológica y química de

las células y tejidos al

estado vivo

1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células.

2. Poseer alto poder de penetración.

3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que

presentaban in vivo.

4. Permitir el empleo de los procedimientos necesarios

para su observación posterior .

5. Impedir la desaparición de los

6. elementos solubles durante la fijación o después de

ella.

7. No provocar la producción de estructuras artificiales.

8. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos

quebradizos.

CUALIDADES DE UN FIJADOR

TIPOS DE FIJADORES

Fijadores Químicos:

Fijadores simples: Constituido por una sola

sustancia quimica

FIJADORES SIMPLES:

a) Formol al 10%

b) Alcohol etílico absoluto o de 96%.

c) Alcohol metílico

d) Ácido ósmico al 1 ó 2%,

e) Bicromato de potasio al 3-5%.

Fijadores compuestos: Utiliza dos o mas fijadores

simples

a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.

b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-

acética.

c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.

d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.

e) Liquido de Bouin alcohólico.

Fijadores Físicos:

1. Desecación.

2. Calor seco.

3. Calor húmedo.

4. Frío.