1

1

Introducción a las técnicas de fluorescencia (2)

2

1. Un poco de historia..los inicios de la fluorescencia en biología2. Ensayos de fluorescencia en cubeta (con ejemplos):

a. Características de los espectros de fluorescencia:Regla de la imagen especular, corrimiento de stokesb. Instrumentaciónc. Tiempo de vida.

Bibliografía general1. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Bernard Valeur,

Wiley-VCH

2. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Joseph Lakowicz. Plenum Press, New York

Temas de la clase pasada:

2

3

Temas de la clase de hoy:

a. anisotropía de fluorescencia

b. Quenching (desactivación) de fluorescencia

c. FRET (Transferencia de energía por el mecanismo de Förster)

4

Anisotropía: Momento de una transición electrónica

fluoróforos

Luz polarizada linealmente: el vector E oscila en un plano determinado

Momento de la transición: durante una transición electrónica los e- se "desplazan": el momento dipolar del estado fundamental y el excitado puede ser distinto, generando un momento dipolar transitorio, asociado a la transición.

Para que se produzca la transición el momento de la transición debe tener un componente paralelo al plano de la luz polarizada

Fotoselección

excitación

3

5Bagatolli y col. Biophys J 1999

Para pensar: porqué la intensidad de fluorescenciano es homogénea?

Giant unilamellar vesicles (GUVs) marcadas con una sonda fluorescente lipídica que se intercala en la bicapa.Se observan por microscopía de fluorescencia con excitación por 2 fotones (por ahora no nos importa). Se utiliza un láser (polarizado) y sólo se detecta fluorescencia de el anillo central de la vesícula

6

Anisotropía de fluorescencia: Principios

Polarizadorde excitación

Polarizadorde emisión

Moléculafluorescente

Detector

4

7

Definición de anisotropía de fluorescencia (r)

IIIIr

llll

2

muestra

Polarizador de excitación

Polarizador de emisión

-0.2 < r < 0.4 (para moléculas random)

III lltotal 2

A veces se usa también el parámetro polarización (P)

IIIIP

llll

1

3

11

3

2

P

r

8

ro/

rr

1

Ecuación de Perrin

ro= anisotropía intrínsecar= tiempo de correlación rotacional = tiempo de vida de la sonda= viscosidad V= volumen de la partícula (esférica)k= constante de BoltzmannT= temperatura v1 = volumen específico del H20 (1.0018 cm3/g)v2 = volumen específico de la proteína (0.73 ml/g) = grado de hidratación

proteínas esféricas

)(kTMr

kTVr 12

5

9

Aplicaciones: Determinación del volumen molecular

VkT

rrr oro1

11

11

r-1

T/

ro-1

k/V

10

La anisotropía puede sensar la dinámica local y/oglobal de la molécula

Rotational Modalities(a) overall dimer rotation(b) movement of one C-domain relative to other domains(c) movement of dye molecule around its point of attachment

6

11

Otras aplicaciones de anisotropía de fluorescencia:

Determinación del binding de calmodulina del péptido RS20(la secuencia del péptido correspondiente a la región de unión a calmodulina de la myosin kight-chain kinasa)

* El péptido tiene un residuo Trp (Cam tiene sólo 1 Tyr)

13

Determinación de anisotropía de fluorescencia (formato L)

Monocromador de excitación

muestra

Monocromador de emisión

detector

Fuente de excitación

Polarizadorde excitación

Polarizadorde emisión

Esquema de espectrofluorímetro

7

14

hhhv

vhvvvhvv

IIG,

GIIGIIr

2

IIIIr

llll

2

Los monocromadores transmiten con distintaeficiencia luz polarizada vertical u horizontal.

Para el formato L:

Determinación de anisotropía de fluorescencia

15

Procesos intermoleculares que afectan a la fluorescencia

F* + Qk

products

8

16

Quencher (Q): molecule that provides a non-radiative path for deactivation of the fluorophore

Quenching: 2 posibles (pero no únicos) mecanismos

F* + Qkq

F + Q + heat collisional

F + QKs

F-Q static

no fluorescent

Como cambia la intensidad de fluorescencia en estos dos procesos?

17

Se puede explotar estos fenómenos para estudiar biomoléculas

Ejemplos:

9

18

Quenching dinámico

]Q[kIIo

oq 1 Stern-Volmer equation

Kd

F* + Qkq

F + Q + heat

F* kr

F + photon

F*knr

F

Io, in the absence of quencher

19

Quenching dinámico

La constante de quenching va a depender de la frecuencia y efectividad de los choques entre Q y F

kofk qq

eficiencia del choque

R=radio de choque (Rf+Rq) [cm]Di= coeficiente de difusion de i [cm2/s]N = nro de Avogadroko = [M-1s-1]

10

20

Collisional Quenching: Applications

lipid vesicle

lisozyme

4PC vesicle7.8buffer

Kd (M-1)condition

Gorbenko et al, Biophysical Journal 93:140-153 (2007)

acrylamide

21

Io, in the absence of quencher

Quenching estático

]Q[KIIo

s 1Stern-Volmer equation

F* kr

F + photon

F + QKs

F-Q

no fluorescente

F*knr

F

11

22

Diferencias entre quenching estático y dinámico

1) Tiempo de vida 2) temperatura3) alguna otra forma?

La forma de la curva es igual para dinámico y estático..como se pueden diferenciar?

23

Métodos radiométricos: determinación de [Cl-] por quenching2 sondas en 1 molécula

aceptor de e-(quenchea por Cl-)

dador de e- (no se quenchea)

Jayaraman y col. Am J Physiol (1999)

12

25

Qué está pasando?

27

FRET (Förster resonance energy transfer)A todos nos encanta FRET...por qué?

•Sirve para ver asociaciones•Medir distancias en el rango de los Å•Determinar cambios conformacionales•y muchas cosas mas

En qué consiste FRET?

D*-Akt D-A*

Es un mecanismo de quenching, con propiedades muy interesantes

Ojo! no hay emisión y reabsorción de fotones! Es una interacción dipolar

13

28

Porqué es tan lindo FRET?

61

rRkt o

oD

D* -Akt D-A*

Agregamos esta reacción a las anteriores y calculamos t:

D* kr

D + photon

D*knr

D

Considerando una única distancia fija r entre D y A

66

6

rR

R

o

oT

29

Resonance energy transfer

61

rRkt o

oD

66

6

rRR

kr)(knrkk

oo

tt

T

1/oD

D* + Akt

D +A*D* D + photon

kr

D* Dknr

oD = donor lifetime, no acceptor

14

30

0 20 40 600.0

0.5

1.0

Tr (Å)

Ro

66

6

rR

R

o

oT

Resonance energy transfer

Ro = Förster distance

range of FRET: 10-100 Å

El fenómeno de FRET ocurre a distancias moleculares

31

Orientationfactor

Overlap integral

04

44

26

128

109000d)()(I

nN

)(lnR AD

A

oD

o

La distancia de Forster

15

32

0

4d)()(I AD

Integral de solapamiento

Fluo

resc

ence

Absorbance

Para calcularla, normalizar el espectro de fluorescencia:

0

1d)(ID

33

Factor de orientación

K2 = factor de orientación

K2 = 4 (colineales)K2 = 2/3 (random)K2 = 0 (perpendicular)K2 = 1 (paralelos)

DA=ángulo entre los dipolos de emisión de D y de absorción de A (T)A(D)= ángulo entre el dipolo del A(D) de la transición y el vector de separación

Pregunta: cómo verificarían experimentalmente que K2=2/3?

16

34

0 20 40 600.0

0.5

1.0

Tr (Å)

Ro

66

6

rR

R

o

oT

Resonance energy transfer

Ro = Förster distance

range of FRET: 10-100 Å

35

Consecuencias de FRET: estado estacionario

Donor

excitation

Acceptor

I

Fluorescence of the donor Fluorescence of the acceptor (at ex, donor)Qué pasa con el del donor?

17

36

1. Fluorescencia del donor (evaluada a D)

2. Fluorescencia del aceptor (evaluada a em)

Estado estacionario

DoD

D

)A(D

)D(FLUO

)A,D(FLUOT I

IA

A

11

en general AD(A) = AD

1)em,(I)em,(I

)(A)(A

AoA

DA

T

demostrar esa ecuaciónPista:

)em,(A)em,(AC)em,(I DTAAA

Pregunta: cual es el problema del método 2?

absorciónfluorescencia

D A

emD

37

Tiempo de vida del donor

0 10 20 300.0

0.5

1.0

Rela

tive

inte

nsity

time (ns)

D

A,Dtnrr

tT kkk

k

1

with FRETD*+ A

ktD + A*

D* D + photonkr

D* Dknr

Preguntas:1. Cambia el tiempo de vida del aceptor?2. Cómo varía IA vs t?

18

38

Aplicaciones 1: FRET en sensores biológicos

Kraynov y col, Science 2000

39

Aplicaciones 1: FRET en sensores biológicos

células que se mueven

célula quieta

alto FRET o I

bajo FRET o I

Kraynov y col, Science 2000

19

40

Aplicaciones 2: mecanismo de ATP sintasa

donoracceptor

ATP synthase

Zimmermann et al. EMBO J (2005)

ADP + Pi

ATP

H+

H+

donor (TMR)aceptor (Cy5 bis)

41

Aplicaciones 3: mecanismo de ATP sintasa

ATP sATP sííntesisntesisATP hidrólisis

Zimmermann et al. EMBO J (2005)

20

42

Homo-FRET

fluoresceína

Hay solapamiento entre los espectros de absorción y emisiónde la misma sonda, si el valor de k2 y r son los adecuados:

D + D* → D* + D

43

Homo-FRET

Cómo se detecta homo-FRET?

Intensidad?Tiempo de vida?Anisotropía?

21

44

Detección de la dimerización de Myo-VI en endosomas porHomo-FRET

Altman y col. Plos Biol 2007

endosomas