1

1

Introducción a las técnicas de fluorescencia (2)

2

1. Ensayos de fluorescencia en cubeta (con ejemplos):

a. Características de los espectros de fluorescencia:Regla de la imagen especular, corrimiento de stokesb. Instrumentaciónc. Tiempo de vida.

Bibliografía general1. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Bernard Valeur,

Wiley-VCH

2. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Joseph Lakowicz. Plenum Press, New York

Temas de la clase pasada:

2

3

Temas de la clase de hoy:

a. Anisotropía de fluorescencia

b. Quenching (desactivación) de fluorescencia

c. FRET (Transferencia de energía por el mecanismo de Förster)

4

Anisotropía: Momento de una transición electrónica

fluoróforos

Luz polarizada linealmente: el vector E oscila en un plano determinado

Momento de la transición: durante una transición electrónica los e- se "desplazan": el momento dipolar del estado fundamental y el excitado puede ser distinto, generando un momento dipolar transitorio, asociado a la transición.

Para que se produzca la transición el momento de la transición debe tener un componente paralelo al plano de la luz polarizada

Fotoselección

excitación

3

5Bagatolli y col. Biophys J 1999

Para pensar: porqué la intensidad de fluorescencia no es homogénea?

Giant unilamellar vesicles (GUVs) marcadas con una sonda fluorescente lipídica que se intercala en la bicapa.Se observan por microscopía de fluorescencia con excitación por 2 fotones (por ahora no nos importa). Se utiliza un láser (polarizado) y sólo se detecta fluorescencia de el anillo central de la vesícula

6

Anisotropía de fluorescencia: Principios

Polarizador de excitación

Polarizador de emisión

Molécula fluorescente

Detector

4

7

Definición de anisotropía de fluorescencia (r)

⊥

⊥+−

=IIII

rll

ll2

muestra

Polarizador de excitación

Polarizador de emisión

-0.2 < r < 0.4 (para moléculas random)

⊥+= III lltotal 2

A veces se usa también el parámetro polarización (P)

⊥

⊥+−

=IIII

Pll

ll1

3

11

3

2 −

−=P

r

8

r

o/

rrφτ+

=1

Ecuación de Perrin

ro= anisotropía intrínsecaφr= tiempo de correlación rotacional τ = tiempo de vida de la sondaη= viscosidad V= volumen de la partícula (esférica)k= constante de Boltzmann T= temperatura v1 = volumen específico del H20 (1.0018 cm3/g)v2 = volumen específico de la proteína (0.73 ml/g)δ = grado de hidratación

proteínas esféricas

)(kTMr

kTVr 12 δν+νη≅η=φ

5

9

Aplicaciones: Determinación del volumen molecular

τη

+=

φτ+=

VkT

rrr oro1

11

11

r-1

T/η

ro-1

kτ/roV

11

Otras aplicaciones de anisotropía de fluorescencia:

Determinación del binding de calmodulina del péptido RS20(la secuencia del péptido correspondiente a la región de unión a calmodulina de la myosin kight-chain kinasa)

* El péptido tiene un residuo Trp (Cam tiene sólo 1 Tyr)

6

13

Determinación de anisotropía de fluorescencia (formato L)

Monocromador de excitación

muestra

Monocromador de emisión

detector

Fuente de excitación

Polarizadorde excitación

Polarizadorde emisión

Esquema de espectrofluorímetro

14

hh

hv

vhvvvhvv

II

G,GIIGII

r =+−

=2

⊥

⊥+−

=IIII

rll

ll2

Los monocromadores transmiten con distinta eficiencia luz polarizada vertical u horizontal.

Para el formato L:

Determinación de anisotropía de fluorescencia

7

15

Procesos intermoleculares que afectan a la fluorescencia

F* + Qk

products

16

Quencher (Q): molecule that provides a non-radiative path for deactivation of the fluorophore

Quenching: 2 posibles (pero no únicos) mecanismos

F* + Qkq

F + Q + heat collisional

F + QKs

F-Q static

no fluorescent

Como cambia la intensidad de fluorescencia en estos dos procesos?

8

17

Se puede explotar estos fenómenos para estudiar biomoléculas

Ejemplos:

18

Quenching dinámico

]Q[kIIo

oqτ+= 1 Stern-Volmer equation

Kd

F* + Qkq

F + Q + heat

F* kr

F + photon

F*knr

F

Io, in the absence of quencher

9

19

Quenching dinámico

La constante de quenching va a depender de la frecuencia y efectividad de los choques entre Q y F

kofk qq ⋅=

eficiencia del choque

R=radio de choque (Rf+Rq) [cm]Di= coeficiente de difusion de i [cm2/s]N = nro de Avogadroko = [M-1s-1]

20

Collisional Quenching: Applications

lipid vesicle

lisozyme

condition Kd (M-1)

buffer 7.8

PC vesicle 4

Gorbenko et al, Biophysical Journal 93:140-153 (2007)

acrylamide

10

21

Io, in the absence of quencher

Quenching estático

]Q[KIIo

s+= 1Stern-Volmer equation

F* kr

F + photon

F + QKs

F-Q

no fluorescente

F*knr

F

22

Diferencias entre quenching estático y dinámico

1) Tiempo de vida 2) temperatura3) alguna otra forma?

La forma de la curva es igual para dinámico y estático..como se pueden diferenciar?

11

23

Métodos radiométricos: determinación de [Cl-] por quenching

2 sondas en 1 molécula

aceptor de e-(quenchea por Cl-)

dador de e- (no se quenchea)

Jayaraman y col. Am J Physiol (1999)

27

FRET (Förster resonance energy transfer)

•Sirve para ver asociaciones•Medir distancias en el rango de los Å•Determinar cambios conformacionales•y muchas cosas más

En qué consiste FRET?

D*-Akt D-A*

Es un mecanismo de quenching, con propiedades muy interesantes

Ojo! no hay emisión y reabsorción de fotones! Es una interacción dipolar

12

28

Porqué es tan importante FRET en Biología?

61

=

τ rRkt o

oD

D* -Akt D-A*

Agregamos esta reacción a las anteriores y calculamos φt:

D* kr

D + photon

D*knr

D

Considerando una única distancia fija r entre D y A

66

6

rR

R

o

oT +

=φ

29

Resonance energy transfer

61

=

τ rRkt o

oD

66

6

rRR

kr)(knrkk

o

o

t

tT +

=++

=φ∑

1/τoD

D* + Akt

D +A*

D* D + photonkr

D* Dknr

τoD = donor lifetime, no acceptor

13

30

0 20 40 600.0

0.5

1.0

φ Tr (Å)

Ro

66

6

rR

R

o

oT +

=φ

Resonance energy transfer

Ro = Förster distance

range of FRET: 10-100 Å

El fenómeno de FRET ocurre a distancias moleculares

31

Orientationfactor

Overlap integral

∫∞

λλλελπ

φκ=

04

44

26

128

109000d)()(I

nN

)(lnR AD

A

oD

o

La distancia de Forster

14

32

∫∞

λλλελ0

4d)()(I AD

Integral de solapamiento

Fluo

resc

ence

Absorbance

λ

Para calcularla, normalizar el espectro de fluorescencia: ∫∞

=λλ0

1d)(ID

33

Factor de orientación

K2 = factor de orientación

K2 = 4 (colineales)K2 = 2/3 (random)K2 = 0 (perpendicular)K2 = 1 (paralelos)

φDA=ángulo entre los dipolos de emisión de D y de absorción de A (φT)φA(D)= ángulo entre el dipolo del A(D) de la transición y el vector de separación

15

34

0 20 40 600.0

0.5

1.0

φ Tr (Å)

Ro

66

6

rR

R

o

oT +

=φ

Resonance energy transfer

Ro = Förster distance

range of FRET: 10-100 Å

35

Consecuencias de FRET: estado estacionario

Donor

excitation

Acceptor

I

λ

� Fluorescence of the donor � Fluorescence of the acceptor (at λex, donor)Qué pasa con el τ del donor?

16

36

1. Fluorescencia del donor (evaluada a λD)

2. Fluorescencia del aceptor (evaluada a λem)

Estado estacionario

DoD

TI

I1−=φ

−

λλλλ

λλ=φ 1

)em,(I

)em,(I)(A)(A

AoA

D

AT

absorciónfluorescencia

D A

λ λemλD

37

Tiempo de vida del donor

0 10 20 300.0

0.5

1.0

Rela

tive

inte

nsi

ty

time (ns)

D

oD

tnrr

tT 1

kkkk

ττφ −=

++=

∑

with FRETD*+ A

ktD + A*

D* D + photonkr

D* Dknr

17

38

Aplicaciones 1: FRET en sensores biológicos

Kraynov y col, Science 2000

39

Aplicaciones 1: FRET en sensores biológicos

células que se mueven

célula quieta

alto FRET o I

bajo FRET o I

Kraynov y col, Science 2000

18

40

Aplicaciones 2: mecanismo de ATP sintasa

donoracceptor

ATP synthase

Zimmermann et al. EMBO J (2005)

ADP + Pi

ATP

H+

H+

donor (TMR)aceptor (Cy5 bis)

41

Aplicaciones 3: mecanismo de ATP sintasa

ATP síntesisATP hidrólisis

Zimmermann et al. EMBO J (2005)

19

42

Homo-FRET

fluoresceína

Hay solapamiento entre los espectros de absorción y emisión de la misma sonda, si el valor de k2 y r son los adecuados:

D + D* → D* + D

43

Homo-FRET

Cómo se detecta homo-FRET?

Intensidad?Tiempo de vida?Anisotropía?

20

44

Detección de la dimerización de Myo-VI en endosomas por Homo-FRET

Altman y col. Plos Biol 2007

endosomas