Fluorescencia y fosforescencia Fluorescencia y fosforescencia

Fotoluminiscencia Fotoluminiscencia

La fosforescencia es el fenómeno en el cual ciertas sustancias tienen la La fosforescencia es el fenómeno en el cual ciertas sustancias tienen la propiedad de absorber energía y almacenarla, para emitirla posteriormente en propiedad de absorber energía y almacenarla, para emitirla posteriormente en forma de radiación.forma de radiación.

La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación.electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación.

Fluorescencia y fosforescencia en Fluorescencia y fosforescencia en las regiones.las regiones.

La longitud de onda para la fluorescencia La longitud de onda para la fluorescencia ocurre entre 662 y 728 nm. ocurre entre 662 y 728 nm.

La fosforescencia tiene una duración de La fosforescencia tiene una duración de vida media más prolongada que la vida media más prolongada que la fluorescencia, y ésta asociada con la fluorescencia, y ésta asociada con la intensidad de luz absorbida.intensidad de luz absorbida.

Mecanismo de fluorescencia Mecanismo de fluorescencia

Absorción Absorción

Disipación no radiactivaDisipación no radiactiva

Emisión Emisión

Diagrama de niveles de energía para las Diagrama de niveles de energía para las moléculas fotoluminiscentes.moléculas fotoluminiscentes.

Proceso de desactivación.Proceso de desactivación.

Relajación vibracionalRelajación vibracional. Diversos niveles . Diversos niveles vibracionales de excitación. vibracionales de excitación.

Conversión internaConversión interna.. Procesos intermoleculares. Procesos intermoleculares.

Conversión externa. Conversión externa. Transferencia de energía.Transferencia de energía.

Cruce entre sistemasCruce entre sistemas. Se invierte el espín de . Se invierte el espín de un de un electrón.un de un electrón.

Variables que afectan el proceso de Variables que afectan el proceso de fotoluminiscencia.fotoluminiscencia.

Rendimiento cuántico:Rendimiento cuántico:• Moléculas que emiten luminiscenciaMoléculas que emiten luminiscencia• Moléculas excitadasMoléculas excitadas

Efectos de la temperatura.Efectos de la temperatura.

Efectos del pHEfectos del pH. Detección de puntos finales.. Detección de puntos finales.

INSTRUMENTACIÒN DE INSTRUMENTACIÒN DE FLUORESCENCIA Y FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIAFOSFORESCENCIA

Los distintos componentes de los Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la instrumentos para la medida de la

fotoluminiscencia son similares a los fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o que se encuentran en los fotómetros o

espectrofotómetrosespectrofotómetros

Los fluorometros son analogos a los Los fluorometros son analogos a los fotometros de absorcion , en ambos se fotometros de absorcion , en ambos se utilizan filtros para seleccionar las utilizan filtros para seleccionar las longitudes de onda de los haces de longitudes de onda de los haces de exitacion y emision. exitacion y emision.

Los espectrofluorimetros son de dos Los espectrofluorimetros son de dos tipostipos

Los primeros utilizan un filtro adecuado para Los primeros utilizan un filtro adecuado para seleccionar la radiación de excitación y un seleccionar la radiación de excitación y un monocromador de red o de prisma para monocromador de red o de prisma para obtener el espectro de fluorescenciaobtener el espectro de fluorescencia

Los verdaderos espectrofluorìmetros son Los verdaderos espectrofluorìmetros son instrumentos especializados equipados con instrumentos especializados equipados con dos monocromadores; uno de ellos permite dos monocromadores; uno de ellos permite variar la longitud de onda de excitación y el variar la longitud de onda de excitación y el otro permite obtener un espectro de emisión otro permite obtener un espectro de emisión

Componentes de los fluorimetros y Componentes de los fluorimetros y de los espectrofluorìmetrosde los espectrofluorìmetros

Los componentes de los fluorometros y de los Los componentes de los fluorometros y de los espectrofluorìmetros difieren solo en espectrofluorìmetros difieren solo en detalles de los que componen los detalles de los que componen los fotometros y los espectrofotometros; solo es fotometros y los espectrofotometros; solo es necesario considerar estas diferencias necesario considerar estas diferencias

fuentesfuentes

En la mayoria de las aplicaciones se En la mayoria de las aplicaciones se necesitan fuentes mas intensa que las necesitan fuentes mas intensa que las lamparas de wolframioo hidrogeno lamparas de wolframioo hidrogeno utilizadas en las medidas de absorcionutilizadas en las medidas de absorcion

Lamparas Lamparas

La lampara mas comun para los fluorometros La lampara mas comun para los fluorometros de filtro es la lampara de arco de mercurio a de filtro es la lampara de arco de mercurio a baja presion equipada con una ventana de baja presion equipada con una ventana de silice fundida. Esta fuente emite lineas utiles silice fundida. Esta fuente emite lineas utiles para producir la exitacion previa a la para producir la exitacion previa a la fluorescencia a 254,302,313,546,578,691 y fluorescencia a 254,302,313,546,578,691 y 773 nm773 nm

Para los espectrofluorimetros, en donde se requiere Para los espectrofluorimetros, en donde se requiere una fuente de radiacion continua, normalmente se una fuente de radiacion continua, normalmente se utiliza una lampara de arco de xenon de alta utiliza una lampara de arco de xenon de alta presion, de 75 a 450 W. estas lamparas requieren presion, de 75 a 450 W. estas lamparas requieren una fuente de alimentacion potente capaz de una fuente de alimentacion potente capaz de producir corrientes continuas de 5 a 20 A y de 15 producir corrientes continuas de 5 a 20 A y de 15 a30 V. el espectro de una lampara de arco de a30 V. el espectro de una lampara de arco de xenon es continuo desde aproximadamente 300 a xenon es continuo desde aproximadamente 300 a 1300 nm1300 nm

Laseres Laseres

La mayoria de los espectrofluorimetros La mayoria de los espectrofluorimetros comerciales utilizan lamparas como fuentes, comerciales utilizan lamparas como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las fuentes de laser de uso. Sin embargo, las fuentes de laser ofrecen importantes ventajas en ofrecen importantes ventajas en determinados casos, por ejemplo:determinados casos, por ejemplo:

Cuando las muestras son muy pequeñas como en Cuando las muestras son muy pequeñas como en cromatografia con microcolumnas y en cromatografia con microcolumnas y en electroforesis capilar donde la cantidad de electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un microlitro o menormuestra es de un microlitro o menor

En los sensores de control remoto , como en la En los sensores de control remoto , como en la deteccion fluorimetrica de radicales hidroxilo en la deteccion fluorimetrica de radicales hidroxilo en la atmosfera o de clorofila en seres vivos acuaticos, atmosfera o de clorofila en seres vivos acuaticos, donde la naturaleza colimada de los haces de donde la naturaleza colimada de los haces de laser es vitallaser es vital

Cuando se requiere una radiacion de exitacion Cuando se requiere una radiacion de exitacion altamente monocromatica para minimizar los altamente monocromatica para minimizar los efectos de interferencias fluorescentesefectos de interferencias fluorescentes

Filtros y monocromadores Filtros y monocromadores

Tanto los filtros de interferencia como los de Tanto los filtros de interferencia como los de absorcion se han utilizado en los absorcion se han utilizado en los fluorometros para la selección de la fluorometros para la selección de la longitud de onda del haz de exitacion y de la longitud de onda del haz de exitacion y de la radiacion fluorescente resultante. La radiacion fluorescente resultante. La mayoria de los espctrofluorimetros estan mayoria de los espctrofluorimetros estan equpipados con al menos uno y a veces equpipados con al menos uno y a veces dos monocromadores de reddos monocromadores de red

DetectoresDetectores

La señal de fluorescencia tipica es de baja La señal de fluorescencia tipica es de baja intensidad, por ello,para su medida se intensidad, por ello,para su medida se necesitan ganancias de amplificador necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los detectores mas utilizados en los detectores mas utilizados en instrumentos de fuorescencia sensibles. instrumentos de fuorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad de recuento Suelen trabajar en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la relacion de fotones para mejorar la relacion señal/ruidoseñal/ruido

Cubetas y compartimentos para las Cubetas y compartimentos para las cubetascubetas

Para medidas de fluorescencia se utilizan Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilindricas como tanto cubetas cilindricas como rectangulares, fabricadas con vidrio o con rectangulares, fabricadas con vidrio o con silice. Se debe tener cuidado en el diseño silice. Se debe tener cuidado en el diseño del compartimento de la cubeta para reducir del compartimento de la cubeta para reducir la cantidad de radiacion dispersada que la cantidad de radiacion dispersada que llega hasta el detector llega hasta el detector

FosforimetrosFosforimetros

Los instrumentos que se utilizan para estudios de Los instrumentos que se utilizan para estudios de fosforescencia tienen diseños similares a los fosforescencia tienen diseños similares a los fluorometros y a los espectrofluorometros antes fluorometros y a los espectrofluorometros antes considerados,solo difieren en que requieren dos considerados,solo difieren en que requieren dos componentes adicionales. El primero es un componentes adicionales. El primero es un dispositivo que irradia alternativamente la muestra dispositivo que irradia alternativamente la muestra y, despues de un retraso adecuado, mide la y, despues de un retraso adecuado, mide la intensidad de fosforesencia . El retraso en el intensidad de fosforesencia . El retraso en el tiempo es necesario para diferenciar la emision tiempo es necesario para diferenciar la emision fosforecente de larga vida de la emiscion fosforecente de larga vida de la emiscion fluorescente de corta vida que podrian originarse fluorescente de corta vida que podrian originarse en la misma muestra en la misma muestra

Normalmente, las medidas de fosforescencia Normalmente, las medidas de fosforescencia se realizan a la temperatura del nitrogeno se realizan a la temperatura del nitrogeno liquido para prevenir la degradacion de la liquido para prevenir la degradacion de la señalde salida por desactivacion colisionalseñalde salida por desactivacion colisional

APLICACIONES Y APLICACIONES Y METODOS METODOS

FOTOLUMINISCENTESFOTOLUMINISCENTES

APLICACIONES Y APLICACIONES Y METODOS METODOS

FOTOLUMINISCENTESFOTOLUMINISCENTES

METODOSMETODOS

1.- METODO FLORUMETRICOS: tienen 1.- METODO FLORUMETRICOS: tienen generalmente sensibilidades que son de generalmente sensibilidades que son de uno o tres ordenes de magnitud superiores uno o tres ordenes de magnitud superiores a los correspondientes de adsorción.a los correspondientes de adsorción.

2.-METODOS INORGANICOS 2.-METODOS INORGANICOS FLORUMETRICOS:FLORUMETRICOS:

los métodos directos conllevan a al los métodos directos conllevan a al formación de un quelato fluorescente y la formación de un quelato fluorescente y la medida de emisión. Un segundo grupo se medida de emisión. Un segundo grupo se basa en el descenso de la fluorescencia que basa en el descenso de la fluorescencia que resulta de la acción amortiguadora de la resulta de la acción amortiguadora de la sustancia que será determinada.sustancia que será determinada.

Determinación fluorimetrica de especies Determinación fluorimetrica de especies orgánicas: método para la determinación de orgánicas: método para la determinación de mas de 200 sustancias, incluyendo mas de 200 sustancias, incluyendo compuestos orgánicos, enzimas y compuestos orgánicos, enzimas y coenzimas, agentes medicinales, productos coenzimas, agentes medicinales, productos naturales, vitaminas etc.naturales, vitaminas etc.

METODO FOSFORIMETRICOS: METODO FOSFORIMETRICOS: los métodos fosforescentes y los métodos fosforescentes y

fluorescentes tienen a ser fluorescentes tienen a ser complementarios ya que los complementarios ya que los compuestos fluorescentes compuestos fluorescentes

presentan una débil fosforescencia presentan una débil fosforescencia viceversa.viceversa.

METODO FOSFORIMETRIA: se ha METODO FOSFORIMETRIA: se ha utilizado para determinar una gran variedad utilizado para determinar una gran variedad de especies orgánicas y bioquímicas que de especies orgánicas y bioquímicas que incluyen sustancias tales como ácidos incluyen sustancias tales como ácidos nucleicos, aminoácidos, pirina y pirimidina, nucleicos, aminoácidos, pirina y pirimidina, enzimas, hidrocarburos de petróleo y enzimas, hidrocarburos de petróleo y pesticidas.pesticidas.

Medidas de tiempo de vida: en Medidas de tiempo de vida: en luminiscencia estaba restringida luminiscencia estaba restringida inicialmente a sistemas fosforescentes, inicialmente a sistemas fosforescentes, donde los tiempos de caída eran suficientes donde los tiempos de caída eran suficientes largos permitir una fácil medida de la largos permitir una fácil medida de la intensidad emitida en función del tiempo.intensidad emitida en función del tiempo.

TRATAMIENTO DE MUESTRASTRATAMIENTO DE MUESTRASen sustancias inorgánicasen sustancias inorgánicas

a) Análisis directoa) Análisis directo b) Formación de quelatos fluorescentes b) Formación de quelatos fluorescentes

(combinación de un ion metálico con un (combinación de un ion metálico con un ligando orgánico)ligando orgánico)

c) Determinaciones indirectas.c) Determinaciones indirectas.

Análisis directoAnálisis directoAunque bastantes especies inorgánicas Aunque bastantes especies inorgánicas presentas fluorescencia en estado solido presentas fluorescencia en estado solido

pocos son los sistemas de este tipo pocos son los sistemas de este tipo aplicables analíticamente algunos elementos aplicables analíticamente algunos elementos pertenecientes a las tierras raras muestran pertenecientes a las tierras raras muestran una intensa emisión fluorescente a 450nm, una intensa emisión fluorescente a 450nm, para Tl se basa en su fluorescencia violeta para Tl se basa en su fluorescencia violeta

en presencia de KClen presencia de KCl

Quelatos fluorescentes Quelatos fluorescentes Especie Reactivo (ligando

organico)Sensibilidad (g/mL)

Ag+ Butilrodamina S 0.01

Al3+ Morina 0.05

Al3+ Rojo de alizarina R 0.007

Cu2+ Luminocupferrón 0.1

Li+ 8-hidroxiquinoleína 0.2

Sn4+ Flavonol 0.1

Determinaciones indirectasDeterminaciones indirectas

Especie Reactivo Sensibilidad (g/mL)

Cl–

F–

(PO4)-3

Nitrato de uranilo Al–morina Al–morina

1.0 0.2 0.05

TRATAMIENTO DE MUESTRASTRATAMIENTO DE MUESTRASEN SUSTANCIAS ORGÁNICASEN SUSTANCIAS ORGÁNICAS

Existe una gran variedad de compuestos Existe una gran variedad de compuestos orgánicos que pueden determinarse por orgánicos que pueden determinarse por métodos fluorimetricos en niveles inferiores a métodos fluorimetricos en niveles inferiores a 1 ppm 1 ppm Determinación de vitaminasDeterminación de vitaminasFármacos y drogasFármacos y drogas

Determinación fluorimétrica de Determinación fluorimétrica de vitaminasvitaminas

Vitamina Reactivo λex λem

A B1 (Tiamina)

B2 (Riboflavina)

B6 (Piridoxina)

B12 (Cianocobalamina)

C

D2D3E (tocoferol)K

fluorescencia nativa +Ox. ferricianuro fluorescencia nativa + Ox KMnO4fluorescencia nativa ac. dehidroascórbico + o-fenilendiamina + ac. tricloroacètico + ac. tricloroacètico fluorescencia nativa _descomposición en luz ultravioleta______

340 365 370 350 275

350

390 270 —

480 445 440 450 305

430

480 370—

Otras aplicaciones Otras aplicaciones

Quimica clinicaQuimica clinica

Análisis forenseAnálisis forense

Fármacos y drogasFármacos y drogas

Quimica agroalimentariaQuimica agroalimentaria

Contaminacion ambiental Contaminacion ambiental

Quimica clinicaQuimica clinica

Muchas determinaciones clinicas se realizan por Muchas determinaciones clinicas se realizan por este metodo por alta sensibilidad y bajo costo este metodo por alta sensibilidad y bajo costo

A) fenilalanina en orinaA) fenilalanina en orina B) estrogenos en orinaB) estrogenos en orina C)corticosteroidesC)corticosteroides D) catecolaminasD) catecolaminas E) porfirinas en orinaE) porfirinas en orina f) nucliotidos en el ADN f) nucliotidos en el ADN

Analisis forenseAnalisis forense

Por este metodo fluorimetrico Por este metodo fluorimetrico podemos analizar huellas digitales podemos analizar huellas digitales

0.05 micro gr corresponde a sustancias 0.05 micro gr corresponde a sustancias inorganicas como NaCl otro 0.05 micro inorganicas como NaCl otro 0.05 micro gr corresponde a sustacias organicas gr corresponde a sustacias organicas

(aminoacios, lipidos o vitaminas) (aminoacios, lipidos o vitaminas)

Para detectar aminoacidos se trata con Para detectar aminoacidos se trata con ninhidrina (1) originando un producto ninhidrina (1) originando un producto

purpura (II) no fluorescente invisible si la purpura (II) no fluorescente invisible si la cantidad es muy pequeña posteriormente cantidad es muy pequeña posteriormente

con tratamiento de cloruro de zinc se con tratamiento de cloruro de zinc se forma un producto fluorescenteforma un producto fluorescente

Determinación fluorimétrica de Determinación fluorimétrica de fármacos y drogasfármacos y drogas

Sustancia Condiciones λex(nm)

λem(nm)

Sensibilidad (µg/mL)

Adrenalina Ac. salicílico Ampicilina Aspirina Atropina Codeina Digital Estreptomicina LSD Morfina Pentotal Quinina

pH 1 pH 11 hidrólisis HAc–CHCl3eosina pH 1 HCl-glicerina pH 13 pH 7 pH 1 pH 13 pH 1

295 310 346 280 365 245,285 350 366 325 285 315 350

335 435 422 335 556 350 465 445 365 350 530 450

0.1 0.1 0.05 0.01 1.0 0.1 0.1 0.1 0.002 0.1 0.1 0.002

Quimica agroalimentariaQuimica agroalimentaria

En los antioxidantes En los antioxidantes

Ejemplo: hidrimetriaroxianisol Ejemplo: hidrimetriaroxianisol butilado butilado

Puede separarse por destilacion Puede separarse por destilacion con arrastre en corriente de vapor con arrastre en corriente de vapor y determinarla direcamente en el y determinarla direcamente en el destilado por espectofluorimetia destilado por espectofluorimetia

((λλex=293nm;ex=293nm; λ λem=323nm)em=323nm)

Contaminación ambientalContaminación ambiental

Gran parte de la aplicación de estos Gran parte de la aplicación de estos metodos a contaminacion atmosferica se metodos a contaminacion atmosferica se

referiere a la determinacion de referiere a la determinacion de hidrocarburos aromaticos polinucleaares hidrocarburos aromaticos polinucleaares

pueden cuantificarse productos no pueden cuantificarse productos no fluorecentes mediante una reaccion de fluorecentes mediante una reaccion de metodos luminiscentes que origina un metodos luminiscentes que origina un

fluoróforo en combinación con tecnicas de fluoróforo en combinación con tecnicas de separacion cromatografica separacion cromatografica