5. microscopía de fluorescencia y epifluorescencia

5. Microscopía de fluorescencia y epifluorescencia

Fluorescencia

Espectro de luz visible:

La longitud de onda determina el color

5. Microscopía de fluorescencia

Fluorescencia

¿Qué es?

Es un proceso de interacción entre la radiación y la

materia en el cual un material absorbe radiación de

una fuente específica y muy rápidamente emite luz

cuya energía es menor (de mayor longitud de onda)

que la de la radiación que ha absorbido.


Fluorescencia

Espectro de luz visible:

Excitación Emisión


Fluorescencia

¿Cómo se produce?

Los electrones son excitados a estados

vibracionales y rotacionales más altos y cuando

vuelven a su estado fundamental emiten la energía

de excitación en forma de radiación.


Fluorescencia

¿Cómo se produce? Diagrama de Jablonski


S0

E S'1

S1

Fluorescencia


1) La absorción de la luz de excitación eleva la

molécula del fluorocromo a un estado de excitación

con un mayor contenido de energía, S’1.


Fluorescencia



S0

E S'1

S1

Fluorescencia


2) En este estado de excitación se mantienen un

tiempo determinado, de 10-9 a 10-8 segundos, en el

cual la molécula sufre cambios conformacionales e

interacciones con las moléculas de su entorno.

Como consecuencia, parte de la energía del estado

S’1

se disipa, creándose un estado S1

de menor

energía.


Fluorescencia



S0

E S'1

S1

Fluorescencia


3) Pasado este tiempo de excitación la molécula

emite luz de menor energía volviendo a su estado

fundamental, S0.


Fluorescencia



S0

E S'1

S1

Fluorescencia

● Debido a la disipación interna de energía la luz

emitida tiene siempre una longitud de onda mayor

(menor energía) que la luz de excitación.

● La cantidad de luz emitida es muy pequeña en

comparación con la utilizada para la excitación.


Fluorescencia

● Lo que diferencia a la fluorescencia de la

fosforescencia (ambos son procesos de

luminiscencia) es el tiempo de vida más largo de

éste último proceso que puede ir desde

milisegundos a minutos y ocurre después de que el

proceso de absorción haya terminado.


Fluorescencia

● Los materiales que fluorescen lo hacen porque

contienen estructuras con configuraciones

moleculares particulares conocidas como fluoróforos

o fluorocromos.


Fluorescencia

● Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber

fotones y emitir fotones de menor energía (mayor

longitud de onda).

● Un fluoróforo es la parte del fluorocromo

responsable de la emisión de la fluorescencia.


Fluorescencia

Tipos de fluorescencia:● La fluorescencia primaria es la que se da porque

existe una configuración inherente a la estructura molecular.Algunas de las fluorescencias más intensas que se observan se asocian con moléculas aromáticas, la fluorescencia de materiales inorgánicos se observa en muchos minerales y piedras preciosas, y quelatos específicos:Clorofila, aceite de inmersión, GFP


Fluorescencia

Tipos de fluorescencia:● La fluorescencia secundaria ocurre cuando una

molécula específica o un grupo capaz de fluorescer, un fluorocromo, se introduce en la estructura de la muestra.

Éste es el procedimiento para la mayoría de las aplicaciones biológicas de la microscopía de fluorescencia.


Fluorescencia

Espectros de excitación y emisión:

Debido a la diferente configuración electrónica de los

fluorocromos cada uno presenta un espectro de

excitación y de emisión característico y único.

Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y

el pico de máxima emisión o bien los espectros de

excitación y emisión.


FluorescenciaEspectro de excitación:Muestra la diferente intensidad de la luz de emisión máxima a diferentes longitudes de onda de excitación.


fluor

esce

ncia

λ

excitación emisión

FluorescenciaEspectro de emisión:Muestra la intensidad relativa de emisión a diferentes longitudes de onda al excitar con la longitud de onda máxima.


fluor

esce

ncia

λ

λ excitación máxima emisión

Fluorescencia

Espectros de excitación y emisión: Fluoresceína


pH = 9 pH = 13

FluorescenciaDisminución de la fluorescencia:

Una molécula del fluorocromo puede tener varios

ciclos de excitación-emisión.

Pero bajo condiciones de iluminación de alta

intensidad hay una destrucción irreversible del

fluorocromo excitado que se denomina

fotoblanqueado (photobleaching) limitando la

detección de fluorescencia.


Fluorescencia



Fading, decoloración

Puede ser por dos procesos:1) Photobleaching: Descomposición irreversible de las moléculas de los fluorocromos.Está directamente relacionado con la intensidad de la excitación y con el tiempo durante el cual estamos excitando la muestra.Para evitar este efecto se debe trabajar en condiciones de mínima iluminación posible.



2) Quenching: Disminución de la intensidad de la emisión debida a condiciones de temperatura o presión elevada, agentes oxidantes y algunas sales.También puede ser debida a interacciones entre moléculas de fluorocromo, por lo que aumentar la concentración de éste no siempre supone un aumento de fluorescencia.Se debe trabajar con agentes secuestradores de oxígeno.


FluorescenciaUso de la microscopía de fluorescencia:

1) El objetivo principal es la identificación de una sustancia específica observando sus propiedades características de emisión cuando se ilumina con radiación de longitud de onda apropiada.

2) Un objetivo difícil es la determinación de parámetros específicos inherentes a la muestra, o que son resultado de la preparación de la misma, que influyen en la fluorescencia de un fluorocromo específico en un material dado.


FluorescenciaUso de la microscopía de fluorescencia:

3) Un tercer objetivo incluye la medida de la intensidad de la fluorescencia y una comparación de esta intensidad con estándares de fluorescencia bien establecidos.

4) El cuarto objetivo es el barrido localizado de una muestra para determinar la distribución de los fluorocromos que contiene, que es la microscopía de barrido confocal.


Instrumentación: Epi-iluminación

La gran mayoría de los microscopios trabajan

en modo de luz incidente, epi-iluminación,

aunque algunos todavía lo hacen en modo de

luz transmitida.


Instrumentación: Epi-iluminación


Instrumentación: Fuentes de luz● La elección de la fuente de luz es función del

fluorocromo específico que se investiga, sus

requisitos de excitación y su eficiencia cuántica.

● Para excitar la fluorescencia de un fluorocromo se

necesita una fuente de luz intensa que suministre las

longitudes de onda de excitación del fluorocromo en

uso.


Instrumentación: Fuentes de luzLámparas de mercurio a alta presión:

● Son las más utilizadas.● Exhiben máximos discretos sobre un fondo continuo que

proporcionan excitación en el rango del ultravioleta así como en las regiones azul y verde.


Instrumentación: Fuentes de luzLámparas de mercurio a alta presión:

● Estas lámparas son caras, requieren unidades de encendido especiales y el coste de funcionamiento es elevado.

● La salida de la luz se va reduciendo con el tiempo debido al ennegrecimiento del envoltorio de cuarzo.

● Nunca deben utilizarse más tiempo del recomendado por el fabricante ya que existe riesgo de explosión que dañaría el microscopio y llenaría la habitación de vapores de mercurio.

● Generalmente llevan un contador de horas incorporado.


Instrumentación: Fuentes de luzLámparas de xenon a alta presión:

● Se caracterizan por un flujo luminoso estable y regular.● Muestran un continuo de elevada intensidad con algunos

máximos irregulares entre longitudes de onda de 800 y 1.000 nm.

Esta fuerte intensidad en el infrarrojo cercano debe ser eliminada con filtros.

● Suministran suficiente radiación azul-verde en la región de 440 - 540 nm donde las lámparas de mercurio no son muy útiles, sin embargo son deficientes en el ultravioleta.

● Su vida media es más larga que las de mercurio.


Instrumentación: Fuentes de luzLámparas de xenon a alta presión:


Instrumentación: Fuentes de luzLámparas halógenas de wolframio:

● También se conocen como lámparas de yoduro de cuarzo.

● Son del tipo de fuente de filamento incandescente que tienen un espectro de radiación continuo.

● Dan poca emisión en el rango del ultravioleta pero es aceptable en las regiones azul y verde.

● Permiten un apagado y encendido con frecuencia lo que acortaría la vida de las de mercurio.



● Son más baratas y más seguras que las de mercurio pero sólo son apropiadas en técnicas donde se espere tener una elevada fluorescencia ya que tienen una menor energía de excitación.

● Si el trabajo requiere fluorescencia de dos colores o se necesitan elevados aumentos o la fluorescencia es tenue se prefieren las lámparas de vapor de mercurio.


Instrumentación: Filtros5. Microscopía de fluorescencia

Filtro deexcitación

Filtrobarrera

Instrumentación: Filtros● Con el filtro de excitación seleccionamos la parte del espectro

que utilizaremos para excitar la muestra.● La muestra emite fluorescencia en un espectro distinto al de

excitación y al mismo tiempo refleja parte del espectro utilizado para la excitación.

● El filtro barrera se encarga de eliminar la parte del espectro reflejado y nos permite visualizar el espectro de emisión correspondiente al fluorocromo.



Filtrobarrera

Instrumentación: Filtros● Filtro de excitación: Selecciona el espectro de excitación.● Espejo dicroico: Refleja la parte del espectro necesaria para

la excitación y transmite el resto.● Filtro barrera: Deja pasar la parte de la emisión de la muestra

que nos interesa.


Filtro de excitación

Filtro barrera

Espejo dicroico

Muestra

Instrumentación: Filtros● Los fabricantes suelen proporcionar bloques de filtros que

son combinaciones de filtros de excitación y de emisión con los apropiados espejos dicroicos.

● Los filtros se describen utilizando letras y números: BP600/30, LP490, DD488/543, ...


Instrumentación: Filtros● Filtros de excitación y barrera:

BPxxx - Filtro Pasa Banda (Band Pass): Deja pasar una banda determinada del espectro y bloquea el resto.

BP460-580: BP significa filtro pasa banda y los números indican la luz que bloquea por debajo, 460 nm, y la que bloquea por encima, 580 nm.


460 580


BPxxx - Filtro Pasa Banda (Band Pass): Deja pasar una banda determinada del espectro y bloquea el resto.

BP600/30: Deja pasar una banda cuyo máximo es 600 nm con una anchura de 30 nm.


30nm

600


SP600: SP significa filtro pasa bajos (short pass).

Deja pasar el espectro por debajo de un valor determinado, en este caso 600 nm, y bloquea lo que está por encima de ese valor.


600 nm


LP490: LP significa filtro pasa altos (long pass).

Deja pasar el espectro por encima de un valor determinado, en este caso 490 nm, y bloquea lo que está por debajo de ese valor.


490 nm


La combinación de filtros SP y LP permite recortar el espectro por debajo del valor de SP y por encima del valor de LP consiguiendo bandas muy estrechas.


Instrumentación: Filtros● Espejos dicroicos:

También se describen con números y letras:● RSPxxx: Espejo dicroico Reflexión Pasa Bajos, refleja por

debajo del valor indicado (xxx) y transmite el resto.

● DDxxx/yyy: Espejo doble dicroico, tiene dos picos en los que refleja (xxx, yyy) y en el resto transmite.

● TDxxx/yyy/zzz: Espejo triple dicroico, refleja la luz en tres picos (xxx, yyy, zzz) y transmite en el resto


Instrumentación: Filtros● Espejos dicroicos:

RSP490: refleja por debajo de 490 nm y transmite el resto.


490

Instrumentación: Filtros


Fuentede

emisión


Filtrobarrera

Espejodicroico

Muestra

Instrumentación: Filtros1.La lámpara emite luz en todo el espectro.2.El filtro de excitación sólo deja pasar la parte del

espectro necesaria para excitar la muestra.3.El espejo dicroico refleja hacia la muestra la

excitación correspondiente.4.La muestra se excita con la luz que le llega y emite

en un espectro superior al de la excitación.5.El espejo dicroico transmite la emisión de la

muestra.6.El filtro barrera hace una selección exacta del

espectro de emisión que nos interesa.


Instrumentación: Filtros


Fuentede

emisión


Filtrobarrera

Espejodicroico

Muestra

Instrumentación: Objetivos● Casi las mismas consideraciones se aplican a la

evaluación de los objetivos cuando se requieren

para microscopía de fluorescencia o de campo claro.

● La capacidad del objetivo para captar la luz juega un

papel esencial en la microscopía de fluorescencia.

● Para obtener una intensidad de la señal óptima se

debe emplear una apertura numérica elevada y el

menor aumento posible.


Instrumentación: Objetivos● Por otro lado, el tipo de vidrio que se utilice requiere

una buena transmisión de la longitud de onda que se

use, por eso, los más utilizados son los de fluorita o

los apocromáticos.

● También se deben utilizar objetivos con

autofluorescencia extremadamente baja.


Instrumentación: Objetivos● Puede ocurrir que aunque estén todos los factores

anteriores optimizados exista un ruido de fondo.

Éste se debería a la propia muestra debido a la

fijación, la autofluorescencia o a un proceso de

tinción inadecuado.


Luz transmitida vs luz incidente● Luz transmitida:

Los microscopios de fluorescencia antiguos eran

poco eficaces en luz transmitida.

Los lugares de fluorescencia débil eran difíciles de

observar entre la radiación que no era específica de

la fluorescencia.



El problema se solventó parcialmente utilizando

condensadoras de fondo oscuro.

La luz incidente sobre la muestra queda restringida a

un área que no entra en el objetivo.

Consecuentemente sólo la radiación que surge de la

dispersión o de la fluorescencia se recoge en la

lente objetivo. Los lugares de fluorescencia débil se

observan sobre un fondo oscuro.



Este sistema es más útil en aumentos bajos de

aproximadamente 40X y tiene la ventaja de que el

contraste es alto.

Una desventaja es que se requiere aceite de

inmersión no fluorescente o glicerol entre la parte

superior de la lente condensadora y la lente objetivo

para evitar pérdidas de luz de excitación.


Luz transmitida vs luz incidente● Luz incidente:

Con el desarrollo del espejo dicroico aumentó el

número de aplicaciones de la microscopía de

fluorescencia ya que hay muchas muestras que no

se pueden observar por transmisión.

El espejo dicroico lleva la radiación a través del

objetivo para la excitación y se usa de nuevo para

permitir la observación de la radiación fluorescente.



De esta manera el objetivo funciona también como

condensadora y la intensidad de la fluorescencia es

inversamente proporcional a la cuarta potencia de

los aumentos.

El brillo máximo se obtiene con un ocular de

aumento mínimo y el objetivo de apertura numérica

máxima.



Las ventajas son que la luz de excitación pasa a

través de menos superficies de vidrio y así se pierde

menos luz en el camino debido a absorción interna.

Como la lente objetivo también es condensadora el

área observada es la misma que el área iluminada.

Además no hace falta aceite de inmersión en la

condensadora.


Aplicaciones● Se aplica a la determinación cuantitativa de

aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y muchos

fluorocromos celulares (para ello se utiliza un

fotómetro que mide la intensidad de la fluorescencia

de una región específica de la muestra).


Aplicaciones● También es útil en el estudio de diferentes clases de

celulosa, tejidos vegetales, alimentos y

medicamentos, fibras animales, minerales en polvo,

detección de impurezas en mezclas homogéneas y

heterogéneas, polímeros, resinas, cristales líquidos,

telas, fibras, madera, papel, carbón mineral,

petróleo, cemento, vidrio, cerámica,

semiconductores, ciencia forense, farmacia,

restauración de arte, biología y medicina.


5. microscopía de fluorescencia y epifluorescencia

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