la fluorescencia de la clorofila a

LA FLUORESCENCIA DE LA CLOROFILA a COMO

HERRAMIENTA EN LA INVESTIGACIÓN DE

EFECTOS TÓXICOS EN EL APARATO FOTOSINTÉTICO

DE PLANTAS Y ALGAS*

Sergio González Moreno, Hugo Perales Vela, Martha O Salcedo Alvarez

RESUMENEl análisis de la emisión de fluorescencia de la clorofilaa del fotosistema II del aparato fotosintético de plantasterrestres, acuáticas y algas hace posible caracterizar losefectos y modos de acción de diferentes tipos de estrésambiental (temperatura, sequía, alta intensidad luminosa,salinidad, inundación) y diversos contaminantes del aguacomo metales pesados, herbicidas, detergentes, así comode una variedad de compuestos contaminantes del aire.También puede ser de gran ayuda en la identificación decontaminantes tóxicos y sus fuentes. Este método deanálisis puede ser aplicable a las plantas o algas intactasin situ e in vivo, o a cloroplastos aislados, siendo además,no invasivo o destructivo, rápido y sensible.

PALABRAS CLAVE: fotosíntesis, fluorescencia de clo-rofila a, plantas, algas, efectos tóxicos.

ABSTRACTChlorophyll a fluorescence emission analysis ofphotosystem II from the photosynthetic apparatus ofterrestrial and aquatic plants and algae makes possibleto characterize the effects and modes of action ofdifferent kinds of environmental stress (temperature,drought, high irradiance, salinity, flooding), several waterpollutants such as heavy metals, herbicides, detergents,and a variety of air pollutants, as well. It may be of greathelp for identification of toxic pollutants and theirsources. In addition, this method of analysis can to beapplied to plants and algae in situ, and in vivo or toisolated chloroplasts, is not invasive neither destructiveand it is a fast and sensitive technique.

KEY WORDS: photosynthesis, chlorophyll afluorescence, plants, algae, toxic effects.

*Recibido: 29 de febrero de 2008 Aceptado: 11 de noviembre de 2008Laboratorio de Bioquímica, Unidad de Morfofisiología, Facultad de Estudios Superiores Iztacala, Universidad Nacional Autónoma deMéxico, Tlalnepantla, Estado de México, México. CP 54090. Correo E: [email protected]

INTRODUCCIÓNLa fotosíntesis es el proceso por elcual las plantas, algas, cianobacteriasy bacterias fotosintéticas conviertenla energía luminosa en energía quí-mica en forma de enlaces químicos yes la base de todas las cadenas alimen-ticias de las que depende la vida ani-mal y humana.

El proceso fotosintético se iniciacuando la luz es absorbida por lospigmentos fotosintéticos (básicamen-te clorofila a, b y carotenoides) de loscomplejos antena de la membranafotosintética. Parte de la energía ab-

sorbida es transferida como energía deexcitación y atrapada por el centro dereacción, en donde es utilizada parahacer trabajo químicamente útil, y laotra parte es disipada principalmentecomo calor y en menor grado re-emi-tida como energía luminosa de menorenergía (fluorescencia). Esta distribu-ción de la energía en los tres procesosocurre simultáneamente, de tal formaque el incremento en la eficiencia deuno de ellos, resultará en la disminu-ción de los otros dos. Por lo tanto, através de la medición del rendimien-to de la fluorescencia de la clorofila

se puede obtener información de laeficiencia fotoquímica y la disipacióntérmica de la energía absorbida (1).En los complejos antena, la energía deun fotón absorbido se suma a la de lamolécula de pigmento que la absorbe,quedando ésta en un estado excitadoinestable, con marcada tendencia a ce-der este exceso de energía denomina-do energía de excitación o excitón yvolver al estado fundamental de ener-gía mínima. La desexcitación se efec-túa por tres rutas: a) pérdida de energíacomo calor, b) como transferencia deenergía a otras moléculas suficiente-

REB 27(4): 119-129, 2008 119

120 González Moreno S, Perales Vela H, Salcedo Alvarez MO

mente cercanas y c) liberación deenergía radiante como fotón visible demenor energía (fluorescencia) que elque causó la formación del estado ex-citado. La energía transferida entre lasclorofilas de las antenas y canalizadaa las clorofilas del centro de reacciónhace que, en éstas, un electrón pasedel estado basal a un estado excitado.Cuando la molécula de clorofila ex-citada pierde un electrón, se producela separación de carga eléctrica den-tro del centro de reacción (quedandola clorofila a oxidada (Chl a+) y unamolécula de feofitina aceptora delelectrón reducida (Pheo-)). Esto seconoce como evento fotoquímico pri-mario y utiliza alrededor del 97% delos fotones absorbidos, mientras queel 2.5 % son transformados a calor y0.5% son re-emitidos como luz fluo-rescente roja. Si no ocurre la separa-ción de carga, 95-97% de la energíaluminosa absorbida se libera comocalor y 2.5-5.0% como fluorescencia.En las plantas, las moléculas de clo-rofila a asociadas a los fotosistemas Iy II (PSI, PSII) son las responsablesde la emisión de la fluorescencia, sinembargo, a la temperatura de ambien-te (25oC), la contribución del PSI a laemisión total es mínima en compara-ción con el PSII. Las característicascinéticas de la reacción de la fluores-cencia emitida son determinadas porla intensidad luminosa de excitación,la concentración de pigmentos queabsorben la luz, la transferencia de laenergía de excitación, la naturaleza yorientación de los pigmentosfluorescentes, el estado redox deaceptores y donadores del PSII, elapilamiento de los tilacoides y latranslocación de protones, entre otros.En condiciones naturales, in vivo, laemisión de fluorescencia de los siste-mas fotosintéticos cambia continua-mente siguiendo su adaptación al am-biente cambiante. Diversos factoresfísicos o químicos de estrés ambien-tal como temperaturas altas, heladas,

sequía, cambios en la intensidad lu-minosa, salinidad, deficienciasnutricionales, presencia de metalespesados, detergentes, herbicidas y ozo-no entre otros, afectan la función delPSII de manera directa o indirecta locual modifica la emisión de la fluo-rescencia. Por ello, los cambios en laemisión de la fluorescencia, puedenutilizarse para revelar mecanismos derespuesta, cuantificación de respues-tas al estrés e identificación de cier-tos contaminantes y sus fuentes (1-4).

Las primeras evidencias de la re-lación entre las reacciones primariasde la fotosíntesis y la emisión de fluo-rescencia de la clorofila del PSII setuvieron al exponer a la luz, hojasadaptadas a la oscuridad, donde seobtuvo un registro de emisión de fluo-rescencia roja. La curva de inducciónde fluorescencia (conocida como"cinética de Kautsky", en honor aquien la describió) mostró una fase deincremento rápido de fluorescencia enel primer segundo de iluminación se-guida de una fase lenta de declive defluorescencia durante varios minutos.La "fase rápida", O-I-D-P (cada unadesignada secuencialmente por las le-tras O, J, I, P), también llamada O-J-I-P, está relacionada principalmentecon eventos primarios del PSII. Porotro lado, la "fase lenta" compuestade las fases o inflexiones P-S-M-T,está asociada principalmente coninteracciones entre procesos de lasmembranas de los tilacoides y proce-sos metabólicos en el estroma delcloroplasto, relacionados con un incre-mento en la asimilación de CO

2(Fig.

1). El aumento de fluorescencia en la"fase rápida" O-P se ha explicadocomo una consecuencia de la reduc-ción (ganancia de electrones) del to-tal de aceptores de electrones en elPSII, particularmente la quinona A(Q

A) y la plastoquinona (PQ). Una vez

que el PSII absorbe luz y QA

ha acep-tado un electrón, no es capaz de acep-tar otro hasta que el primero ha pasa-

do al siguiente acarreador de elec-trones, la quinona B (Q

B). Durante

este periodo, el centro de reacciónestá "cerrado" porque está totalmen-te reducido. En cualquier punto en eltiempo, la presencia de una propor-ción de centros de reacción reducidos"cerrados", conduce a una disminu-ción en la eficiencia fotoquímica, conun correspondiente incremento en lafluorescencia. Después de esto, a par-tir de la fase P y hasta la fase T, elnivel de fluorescencia empieza a de-caer en el transcurso de minutos.Aun-que muchos factores pueden modifi-car la fluorescencia de las membra-nas tilacoides, son principalmente doslos que hacen la mayor contribuciónal nivel de fluorescencia durante lafases de decaimiento P-T; el primeroes el estado redox de Q

Ay el segun-

do, la magnitud del gradiente de po-tencial electroquímico protónico(pH) que existe a través de las mem-branas tilacoides. Los cambios en elestado redox de Q

Aocurren como re-

sultado de cambios en la velocidad detransporte de electrones no cíclico yel incremento en el consumo deNADPH por el metabolismo del car-bono lo que resulta en un incrementoen la velocidad de transporte de elec-

trones y oxidación de QA. El decai-

miento de fluorescencia debido a laoxidación de Q

Ase ha denominado

"decaimiento fotoquímico" qP, mien-tras que, el debido a cambios en lamagnitud del gradiente de potencialelectroquímicoprotónico transtilacoidalse denomina "decaimiento no-fotoquímico" (qNP). La magnitud delcoeficiente de decaimiento nofotoquímico (qNP) refleja además delos cambios en el gradiente de pH,inactivación de centros de reacción(fotoinhibición), cambios confor-macionales dentro de los complejosde pigmentos en la membranatilacoide, desconexión de complejoscosechadores de luz móviles del PSII,formación de zeaxantina, disminu-

121REB 27(4): 119-129, 2008 Fluorescencia de clorofila a

ción del rendimiento cuántico efec-tivo de la fotoquímica del PSII(

PSII) y la velocidad de transporte

de electrones fotosintético (ETR).Los cambios en estos dos procesos

se completan en 15-20 minutos (varia-ble entre las especies) en los que se al-canza un estado estacionario (1, 5).

Desde la descripción inicial de losprocesos mencionados a la fecha, el co-

nocimiento de la relación entre reac-ciones primarias de la fotosíntesis yla fluorescencia de la clorofila a seha incrementado notablemente graciasa los avances en la instrumentación

Figura 1. Curva de inducción de fluorescencia de clorofila a (fases rápida y lenta,OIDPSMT) y su correspondencia con las reacciones de lacadena transportadora de electrones. La primera señal registrada se denominó O (Origin) y su intensidad usualmente se expresa como Fo(fluorescencia inicial o basal). En este punto, Q

Aestá en su mayoría oxidada. La fase I (inflexión) corresponde a la reducción de Q

A. La fase D

(declive) es indicativa de la oxidación de QA

en la transferencia de electrones de QA

a QB. El nivel de fluorescencia P corresponde a la reducción

de PQ y su intensidad normalmente se denomina Fm (fluorescencia máxima). La fase S (Estado estacionario) de decaimiento de fluorescenciaestá relacionada con la re-oxidación de Q

A, la energización de la membrana tilacoide debida a translocación de protones (pH) y a transición

de estado1 2. Las fases M (máxima) y T (terminal) corresponden a la disminución de qP e incremento de qN (pH) y están relacionadas conla captación de CO

2, velocidad de liberación de O2 y la disponibilidad de NADP+, ADP y fosfato.

QAreducido

QBreducido

Estado estacionario

PQ reducido

Complejofotosistema II Complejo

fotosistema I

Gra

die

nte

elec

troq

uím

ico

pro

tón

ico

Co

mp

lejo

FoF

1

Co

mp

lejo

an

ten

a

Co

mp

lejo

an

ten

a

Plastoquinina

Plastocianina

0.5 ms 0.5 - 2 s 180 - 300 s

Flu

ore

scen

cia

QB

QA

lumen

Cit

b6/f

FB

FA

FX

A1

A0

Complejo citocromob

6-f

D

S M

T

Fase rápida Fase lenta

P

Estroma

Lumen

Estado estacionario

H2O

Complejo liberadorde O

2

O2

Ferredoxina

ATP

CiclodeCalvin

NADP+

NADPH

ADP + Pi

Luz

Grana

Tilacoides

Cloroplasto

Mn PC PC

PQ

O


La interpretación de estas señalesexperimentales con los cambios en loscomponentes moleculares de las re-acciones se ha establecido sobre unmodelo que supone que los comple-jos cosechadores de luz (LHC-PSII)donde se encuentran los pigmentosantena y los centros de reacción (RC-PSII) son sistemas individuales. Elmodelo permite un análisis simple delflujo de energía a través del PSII (2,6). El flujo de energía puede ser en-tendido por varios parámetros: Flujoabsorbido (flujo de fotones absorbi-do por pigmentos de la antena (ABS),flujo atrapado (flujo de energía trans-ferida al centro de reacción que seráconvertida en energía redox reducien-do Q

Aa Q

A- (TR), flujo de transporte

electrónico (al oxidarse QA

- se iniciael transporte de electrones que con-duce a la fijación de CO

2)(ET) y el

flujo de disipación de energía no atra-

pada como calor o transferida a otrossistemas no fluorescentes (DI) (Fig.3). Como puede observarse en el mo-delo, la eficiencia cuántica máxima dela reacción fotoquímica primaria TRo/ABS =

Po, la eficiencia con la que

un excitón atrapado puede mover unelectrón mas allá de Q

A- en la cadena

transportadora de electrones ETo/TRo=

o, y la probabilidad de que un fo-

tón absorbido mueva un electrón enla cadena transportadora de electro-nes ETo/ABS =

Eoestán directamen-

te relacionados a los tres flujos comococientes de 2 de ellos.

Eose deriva

de la multiplicación de Po

y o. El

producto cuántico máximo de lafotoquímica primaria (

Po) es también

denominado como fase luminosa, de-bido a que su valor puede ser modifi-cado por la intensidad lumínica. Porotro lado, la eficiencia con la que unexcitón atrapado mueve un electrón

Figura 2. Cinética de emisión de fluorescencia de la clorofila a del fotosistema II en la faserápida y su relación con las reacciones en la cadena transportadora de electrones. O, es elvalor mínimo de la fluorescencia (Fo). Aparece alrededor de los 50 s y en ese momento todoslos centros de reacción están oxidados "abiertos". J, se desarrolla a los 2 ms (F

J= F

2ms) y está

relacionada con la reducción parcial de la QA. I, se desarrolla a los 20 ms (F

I= F20

ms) y está

relacionada con la reducción parcial de QA

y QB. P, es el valor máximo de la fluorescencia

(Fm). El tiempo en el que se alcanza depende del protocolo experimental. En este momentotodos los centros de reacción están reducidos "cerrados".

Em

(vo

ltio

s)

Tiempo (s)

para medir la fluorescencia con tiem-pos de resolución altos (10 s) y a lacapacidad de adquisición de datosmisma que se ha mejorado en variosórdenes de magnitud.

Relación entre la emisión de fluo-rescencia registrada y los eventosfotoquímicos primariosCuando una muestra preacondi-cionada a la oscuridad es iluminada,la fluorescencia de la clorofila a seincrementa rápidamente. Este incre-mento es un reflejo de la reducción"cierre" de los centros de reaccióndel PSII y por lo tanto provee infor-mación de la actividad fotoquímicadel PSII y la reducción "llenado" dela poza de plastoquinona. La cinéticade la fluorescencia de la clorofila pre-senta cuatro inflexiones nombradasOJIP cuando se grafica el tiempo enlogaritmo (Fig. 2):(1)O, es el valor mínimo de la fluo-rescencia (Fo). Aparece alrededor delos 50 s y en ese momento todoslos centros de reacción están oxida-dos "abiertos", qP = 1 y qNP = 0.(2)J, se desarrolla a los 2 ms (F

J=

F2ms

) y está relacionada con la reduc-ción parcial de la Q

A.

(3) I, se desarrolla a los 20 ms (FI

=F

20ms) y está relacionada con la reduc-

ción parcial de QA

y QB.

(4)P, es el valor máximo de la fluo-rescencia (Fm). El tiempo en el quese alcanza depende del protocolo ex-perimental aunque en condiciones fi-siológicas normales se alcanza en al-rededor de 1s. En este momento to-dos los centros de reacción están re-ducidos "cerrados", qP = 0 y qNP = 1.P es el punto de fluorescencia máxi-ma debido a que el flujo de electro-nes desde PQ a través del complejob/f es el paso más lento de la cadena.Por otra parte, el tiempo para llegardesde las fases I (o J) a P no es máscorto debido a que hay mucha más PQque Q

A.

Feofitina

calor

H2O

O2

MnTir


después de QA

- en la cadena transpor-tadora de electrones (

o), es denomi-

nada fase térmica, ya que ésta no esmodificada por la intensidad lumínica,pero sí por la temperatura. Lo ante-rior ha sido de mucho valor, ya queen condiciones de estrés se puede de-finir de manera específica la fase queestá afectando la condición a la cualha sido expuesto el organismo (Fig. 5y tabla anexa 5B).

El análisis cuantitativo de lacinética de la reacción de producciónde la de fluorescencia, llamada "prue-ba OJIP", puede usarse para explicarel flujo de energía a través del PSIIcomo el flujo de energía por área deemisión (CS), y también por centro dereacción (RC). La relación entre losdatos experimentales y la formulaciónplanteada, estuvo basada en la consi-deración y los siguientes experimen-tos (2): en tiempo cero, (después deun periodo de oscuridad), todos los

centros de reacción están oxidados"abiertos", la velocidad deatrapamiento TRo/CR que conducea la reducción de Q

Aa Q

A- , debe ser

máxima; al bloquear la reoxidación deQ

A- con DCMU 3-(3,4-Diclorofenil)-

dimetilurea (inhibidor del paso deelectrones de Q

Aa Q

B), TRo/RC esta-

rá dada por la pendiente inicial nor-

malizada (MoDCMU

) de la curva de in-ducción de fluorescencia (entre 50 y300 µs) en la fluorescencia variablemáxima Fv = Fm-Fo. Si no se bloqueala reoxidación de Q

A-, el valor norma-

lizado de la pendiente inicial, Mo, in-dica la velocidad neta de cierre de loscentros de reacción RCs, donde el pro-ceso de atrapamiento incrementa elnúmero de centros reducidos y eltransporte de electrones lo disminuye(Mo = TRo/RC-ETo/RC). Mo en lasmuestras tratadas con DCMU puedesimularse por la amplificación de Momedida en muestras sin DCMU por

un factor recíproco a Vj (Vj =(F2ms

-Fo)/(Fm-Fo)) y entonces, TRo/CR= Mo

DCMU= Mo/Vj . A partir de

estas ecuaciones se definieron otrasque permiten el análisis cuantitativode los flujos específicos en relaciónal área de emisión (utilizando los va-lores de Fo y Fm) o al centro de reac-ción (utilizando los valores de Mo yVj y de las eficiencias cuánticas orelaciones de flujo) (Tabla 1).

Medición de la emisión de fluores-cencia de la clorofila del fotosistemaIIEn la actualidad se utilizan principal-mente 2 técnicas fluorométricas, unaque mide la fluorescencia directa, in-ducida por excitación continua y otra,la fluorescencia modulada, inducidapor excitación modulada. En el pri-mer caso, la hoja se adapta previamen-te a la oscuridad por 10-30 minutos,posteriormente se expone a luz de 650nm con una intensidad de alrededorde 3000 moles.m-2.s-1 durante 1-10segundos y simultáneamente se mideny almacenan los valores de la fluo-rescencia emitida únicamente por laclorofila del PSII, desde los 10 s has-ta los segundos programados. Así seobtiene la cinética de emisión de fluo-rescencia, y los valores de algunosparámetros como Fo, Fm, Fv, Fv/Fm(eficiencia fotoquímica del PSII) y

tFmax

(tiempo (ms) en el que se alcan-za la fluorescencia máxima); a partirde los valores registrados, se calcu-lan otros parámetros que expresan elfuncionamiento de diversos compo-nentes del PSII (2).

Para medir la fluorescencia modu-lada se utiliza un fluorómetro que con-siste básicamente de 4 fuentes de luzcualitativa y cuantitativamente dife-rentes: a) luz roja modulada de bajaintensidad (2 moles.m-2.s-1, 583 nm),b) pulsos de luz actínica de alta inten-sidad ( 5-20,000 moles.m-2.s-1), c) luzactínica blanca continua de 300-600moles.m-2.s-1, d) luz rojo lejano

Figura 3. Modelo simplificado de los flujos de energía en el aparato fotosintético. ABS serefiere a el flujo de fotones absorbido por los pigmentos de la antena (Chl*). Parte de estaenergía de excitación se disipa como calor y en menor grado como emisión de fluorescencia yla otra parte es canalizada como flujo atrapado TR al centro de reacción y es convertido aenergía redox reduciendo al aceptor de electrones QA a QA- el cual se oxida creando transpor-te de electrones ET. La figura derecha ilustra la derivación de: rendimiento cuántico máximode la fotoquímica primaria ( Po), la eficiencia con la que un excitón atrapado puede mover unelectrón más allá de QA- en la cadena transportadora de electrones ( o) y la probabilidad de deque un fotón absorbido mueva un electrón en la cadena transportadora de electrones ( Eo); apartir de las relaciones de flujo de energía específicos.

LHC-PSII

RC

ABS

TR

ET

ABS

TRo

ETo

RC

RC

RC

TRo

ETo

ABS

TRo

Po

o

=

=

Eo=ETo

ABS

QA QA-

DIo

ABS

Do =

LUZ

Flujo atrapado

Flujo de transporteelectrónico

Flujo absorbido


(moles.m-2.s-1, de 735 nm) y un de-tector de fluorescencia que registrasolamente la fluorescencia emitida enla frecuencia y la fase de luz modula-da. La hoja se expone a la luz modu-lada de baja intensidad para determi-nar Fo, luego se sobrepone un pulsode luz de alta intensidad para deter-minar Fm, y enseguida, también so-brepuesta a la luz modulada, se apli-ca luz actínica blanca continua duran-te algunos minutos para llevar al es-

tado estacionario; nuevamente, seaplica un pulso de luz saturante paradeterminar Fm' y al final se aplica luzrojo lejano para promover lareoxidación de plastoquinona y deter-minar Fo'. (Fig. 5D). A partir de es-tos parámetros se calculan los valo-res de rendimiento fotoquímico ope-

racional del PSII (PSII

), decaimientofotoquímico (qP), decaimiento no-fotoquímico (qNP) y transporte deelectrones (ETR) (1, 5). Ambos mé-

todos pueden dar información noidéntica totalmente, pero tampococontradictoria. En la actualidad losfluorómetros de mayor uso a nivelmundial son los de las marcas alema-na (Walz) e inglesa (Hansatech). Lafigura 4 muestra 2 de los equiposHansatech para la medición de fluo-rescencia directa o fluorescencia mo-dulada en plantas y algas.

Información que se obtiene median-te el análisis de emisión de fluores-cencia de la clorofila a delfotosistema IIDe acuerdo al análisis de la fase rápi-da OJIP y las ecuaciones planteadaspara la cuantificación del comporta-miento del PSII (3, 5), se puede tenerinformación sobre: a) los flujos deenergía específicos para absorción(ABS), atrapamiento, (TRo), transpor-te de electrones (ETo) y disipación(DIo) por centro de reacción o por áreaactiva de la hoja; b) eficienciacuántica o relación de flujos como elrendimiento cuántico de lafotoquímica primaria (

po), la eficien-

cia con la cual un excitón atrapadopuede mover un electrón en la cadenatransportadora de electrones mas alláde Q

A- (

o), y el rendimiento cuántico

de transporte de electrones (Eo

); c)la cantidad de centros de reacción ac-tivos por área de emisión; índice defuncionamiento (PI) el cual combinacriterios estructurales y funcionalesdel PSII; d) el número de centros dereacción de reapertura muy lenta o

centros de reacción que no unen QB;

e) estimación del número de centrosliberadores de oxígeno (OEC); f) el

número de veces que QA

se reducedesde el tiempo 0 to al tiempo en elque se alcanza al máximo de fluores-

cencia tFmax

(N); g) la fracción pro-medio de centros de reacción abier-tos durante el tiempo necesario paracompletar la reducción de todos loscentros de reacción (Tabla 1). Encuanto al análisis de la fase lenta de

TABLA 1

Formulación del análisis JIP usando los datos de la fase rápida deemisión de fluorescencia.

Parámetros Técnicos

Flujos específicos expresados por centros de reacción (RC)

Flujos específicos expresados por área (cross section) (CS)

Eficiencias cuánticas (o relaciones de flujo)

Índices vitales

Fluorescencia a 50 s

Fluorescencia máxima

Fo

Fm

Fv

Mo

VjFluorescencia variable a 2ms

Pendiente desde el origen de lafluorescencia

= Fm-Fo

= (F300s-Fo)/(Fm-Fo)

= (F2ms-Fo)/(Fm-Fo)

Absorción por RC

Atrapamiento a tiempo 0 por RC

Disipación a tiempo 0 por RC

Transporte electrónico a tiempo 0 por RC

Absorción por CS

Atrapamiento a tiempo 0 por CS

Disipación a tiempo 0 por CS

Transporte electrónico a tiempo 0 por CS

Densidad de RC por CS

ABS/RC

TRo/RC

DIo/RC

= (Mo/Vj)/(1-Fo/Fm)

= Mo/Vj = (ABS/RC) Po

= (ABS/RC) - (TRo/RC)

ETo/RC = (TRo/RC) o

ABS/CS

TRo/CS

DIo/CS

= Fo o Fm

= (TRo/ABS)/(ABS/CS)

= (ABS/CS) - (TRo/CS)

ETo/CS = (ETo/RC)(RC/ABS)

= (ABS/CS)(RC/ABS)RC/CS

Producto cuántico máximo de lafotoquímica primaria

Producto cuántico máximo de disminuciónde excitación fotoquímica

Eficiencia con la que un excitón atrapadopuede mover un electrón después de QA-

Probabilidad de un excitón absorbidomueva un electrón después de QA-

Índice de funcionamiento

Fuerza impulsora de la fotosíntesis

Po

Do

o

Eo

= DIo/ABS =1- Po

= Fo/Fm

= Po

-o= (TRo/ABS)/(ETo/TRo)=

ETo/ABS = (1-Fo/Fm)(1-Vj)

= TRo/ABS = (Fm-Fo)/(Fm = (1-(Fo/Fm) = Fv/Fm

= ETo/TRo = 1-Vj

= [RC/ABS][Po

Po)][

o

o]PI

ABS

= Log [PIABS

]DFABS

Fluorescencia variable a 2ms


la cinética de inducción de fluorescen-cia (7) se puede obtener informaciónimportante en relación a los procesosfotoquímicos y no fotoquímicos aso-ciados con la conversión de energíaen los cloroplastos. Varios parámetrosde la fluorescencia de la clorofila aproporcionan información sobre elproceso de fotosíntesis en las plantaso algas bajo diferentes condicionesexternas o internas. Los valores nu-méricos de los parámetros de fluores-cencia reflejan la interacción de lasplantas con su medio, el metabolismode cloroplastos, los mecanismosregulatorios en la membrana tilacoide,y la transferencia de energía de exci-tación.

Medición de la emisión de fluores-cencia de la clorofila a en algasPara tener información de la activi-dad fotosintética de un alga a travésde la medición de la emisión de lafluorescencia de la clorofila a, es ne-cesario el poder distinguir entre la li-

beración de la energía absorbida porprocesos fotoquímicos (qP) y los No-fotoquímicos (qNP). La manera usualde hacerlo, es a través del "apagado"de una de las dos vías, de tal maneraque se puede medir el producto de laotra. Generalmente se "apaga" la víafotoquímica a través de la técnica dedos pulsos, la cual permite que mo-mentáneamente la contribución de losprocesos fotoquímicos sean igual acero. Por medio de esta técnica sepuede calcular el decaimientofotoquímico (qP), el cual representala proporción de la energía de excita-ción atrapada por los centros de reac-ción abiertos y que ha sido usada parael transporte electrónico.

qP = (Fm'-Fs)/(Fm'-Fo')

Otro término relacionado con elanterior es el rendimiento fotoquímico

operacional del PSII (PSII

). Éste midela proporción de energía absorbidaque está siendo usada para impulsar

el proceso fotoquímico. De modo que,es una medida de la eficiencia deltransporte electrónico lineal.

PSII

= (Fm'-Fs)/Fm'

El parámetro anterior puede serusado para calcular la tasa de trans-porte electrónico (ETR).

ETR = ((Fm' - Fs)/ Fm') x 0.84 x 0.5x PAR (m-2s-1)

Donde el valor de 0.84 en la fór-mula, equivale a la proporción de luzque es absorbida por el alga y el de0.5 a la proporción de luz que es trans-ferida al sistema a cada uno de losfotosistemas (PSII y PSI) y la radia-ción fotosintéticamente activa (PAR)utilizada en µmoles.m-2.s-1 (1)

Por otro lado, el decaimiento nofotoquímico (qNP o NPQ) representala proporción de energía disipadatérmicamente y puede ser calculadode dos maneras:

qNP = Fm-Fm'/Fm-Fo'NPQ = Fm - Fm'/Fm'

El término qNP o NPQ refleja lainfluencia de procesos nofotoquímicos en la emisión de fluo-rescencia de la clorofila durante latransición de una muestra del estadoadaptado a la oscuridad al estadoadaptado a la luz, como cambios enel gradiente de pH transtilacoidal,inactivación de centros de reacción(fotoinhibición) y cambios confor-macionales dentro de los complejosde pigmentos en la membranatilacoide, desconexión de complejoscosechadores de luz móviles del PSIIy formación de zeaxantina. Elparámetro más usado en la emisión dela fluorescencia es el rendimientocuántico máximo para la fotoquímicaprimaria cuando todos los centros dereacción del PSII están oxidados o"abiertos" (Fv/Fm) (9).

Figura 4. Fluorómetros Hansatech para el registro de fluorescencia directa o modulada enplantas y algas.

Fluorómetro de fluorescencia continuaHandy PEA Hansatech

Fluorómetro de fluorescencia modu-lada FMS2 Hansatech


Fv/Fm = (Fm-Fo/Fm)

Es importante señalar que mientras

PSII

está relacionado con la eficien-cia cuántica alcanzada por el PSII, qPy Fv/Fm proveen información sobrelos procesos que pueden modificaresta eficiencia. Por lo tanto, una dis-minución en qP está dada por la re-ducción o "cierre" de los centros dereacción, como resultado de una sa-turación lumínica o de una inhibicióndel transporte electrónico. Por otro,lado una disminución en Fv/Fm estádada por un aumento en qNP (1).

Aplicaciones del análisis de la emi-sión de fluorescencia de la clorofi-la aPor el análisis de la cinética de emi-sión de fluorescencia directa y losparámetros registrados y calculados,podemos saber si determinado factorde estrés tiene efecto en los eventosfotoquímicos del PSII o en eventos nodependientes de luz. Cuando los even-tos fotoquímicos son los afectados porun factor de estrés de manera directao indirecta, podemos conocer si laalteración se produjo en alguno de lossiguientes componentes o reacciones:a) el complejo antena (LHC), porejemplo, reduciéndose la captación deenergía o incrementándose la disipa-ción de la energía captada; b) la trans-ferencia de energía de la antena alcentro de reacción (RC), la cual po-dría ser reducida o disipada al momen-to de transferirse por desconexión conel centro de reacción; c) el centro dereacción, que no "atrape" la energíatransferida y ésta sea disipada; d) la

velocidad de reducción de QA

o alte-

ración de los niveles de QA, la velo-

cidad de reducción de QB

o la altera-

ción de los niveles de QB; e) el blo-

queo de la transferencia de electrones

entre QA

y QB; f) disminución de la

velocidad de reducción de PQ; g) elcomplejo liberador de oxígeno, dis-minuyendo su actividad y como con-

secuencia limitando el aporte de elec-trones al centro de reacción del PSII.Por el análisis de la fluorescenciamodulada podemos conocer si deter-minado factor ambiental tuvo efectosen la fotoquímica del PSII y en la di-sipación no fotoquímica, como calory el gradiente de pH. Estas técnicastienen aplicación en las prueba de pro-

ductividad agrícola en función de tra-tamientos con fertilizantes, hormonas,pesticidas y herbicidas; en ensayos deselección de cultivos tolerantes a di-ferentes factores de estrés (incluyen-do cultivos transgénicos); en experi-mentación sobre respuesta a cambiosde intensidad y calidad de luz, tem-peratura etc., y a la combinación de

Figura 5. (A) Efecto del DCMU [3-(3,4-Diclorofenil)-dimetilurea] y del cobre (Cu2+) en laemisión del fluorescencia de la clorofila a del fotosistema II y (B) los rendimientos cuánticosoperacionales de Scenedesmus incrassatulus. Los datos mostrados fueron obtenidos en el la-boratorio para ilustrar este caso.

Control DCMU Cu2+

Producto cuántico

0.710 0.495 0.616

0.521 0.042 0.517

0.369 0.020 0.318

Producto cuántico máximo dela fotoquímica primaria (

po)

Eficiencia con la que un excitónatrapado puede mover unelectrón después de Q

A(

o)

Probabilidad de que un fotónabsorbido mueva un electróndespués de Q

A- (

o)

0 .001 0 .01 0 .1 1 10 100 1000 10000

Flu

ore

scen

cia

(mV

)

0

1 0 00

2 0 00

3 0 00

4 0 00

5 0 00

0 .0 0 m M C u 2+

3.1 4 m M C u 2+

D C M U

O

J

I

P

A

T iem p o (m s)

0 .0 0 1 0 .0 1 0 .1 1 1 0 1 0 0 10 0 0 1 00 0 0Flu

ores

cen

cia

vari

ab

le[V

t=(F

t-F

o)/

(Fm

-Fo)

]

-0 .2

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

O

J

I

P

B

0 .0 0 m M C u 2+

3.1 4 m M C u 2+

D C M UF

luo

rescen

cia

vari

ab

le[V

t=(F

t-F

o)/

(Fm

-Fo

)]F

luo

rescen

cia

(mV

)

Tiempo (ms)


factores de estreses físicos y quími-cos; en la optimización del estableci-miento de condiciones de luz, tempe-ratura, humedad en invernaderos, asícomo en los estudios de productoscomercializados como flores y frutosen relación a condiciones de almace-namiento y factores que retardan oaceleran la maduración o senescencia.Las mencionadas técnicas del estudiode la emisión de la fluorescencia dela clorofila a también tienen aplica-ción en el estudio de la conducta deecosistemas ante cambios globales, enla ecodinámica de sistemas hortícolasy forestales y en la utilización de al-gas y plantas como biorremediadoresde aguas y suelos contaminados conmetales pesados.

Algunos ejemplos de la utilizacióndel análisis JIP en el estudio de losefectos de varios tipos de estrés en lafotosíntesis de plantas y microalgasse presentan en las figuras 5-6

La figura 5A muestra el efecto delDCMU y del cobre (Cu2+) en lacinética de emisión de fluorescenciadel alga verde Scenedesmusincrassatulus. El DCMU es un cono-cido herbicida cuyo efecto es bloquearel flujo de electrones entre Q

Ay Q

B,

lo que se puede evidenciar en la grá-fica como un incremento rápido de lafluorescencia hasta alcanzar un valormáximo (Fm) en la fase J, la cual estárelacionada con la reducción de Q

A.

Por otro lado, se puede observa en lamisma figura que la exposición du-rante 168 h a 3.14 µM de Cu2+ dismi-nuye los valores de fluorescenciamáxima y mínima. La figura 5B mues-tra los valores de fluorescenciagraficados como fluorescencia relati-va en el tiempo [Vt = (Ft-Fo)/(Fm-Fo)]. Esta expresión experimentalpermite visualizar de manera dinámi-

ca la reducción de QA

QA

-. Se pue-de observar en esta figura que laincubación con DCMU o Cu2+

incrementa la velocidad inicial de lafluorescencia (Mo), lo que se explica

Figura 6. (A) Efecto de la temperatura en la cinética de emisión de fluorescencia de la cloro-

fila a del PSII de plantas de P. vulgaris (obtenida con el fluorómetro Handy PEA, Hansatech);

(B) "Gráfica de araña" que muestra los efectos de la temperatura en las actividades aparentes

ABS/CS, TRo/CS, ETo/CS, DIo/CS; eficiencias cuánticas Po

, Po

, Eo

e índice de vitalidad

PIABS

en plantas de P. vulgaris. Los datos presentados fueron calculados usando las ecuaciones

indicadas en la tabla 1 y los valores de fluorescencia registrados con el fluorómetro Handy

PEA, mediante el programa "Biolyzer", diseñado específicamente para éste propósito por el

grupo de Strasser en la Universidad de Ginebra). Los valores fueron normalizados sobre el

control (25ºC). (C) Modelo de hoja obtenido con el programa Biolyzer, que ilustra los efectos

de la temperatura en los flujos de energía (por área de absorción de la hoja, (CS)) del PSII de

P. vulgaris. Las flechas indican los flujos de absorción de luz (ABS), energía de excitación

atrapada (TRo), energía de disipación (DIo), y transporte de electrones (ETo) mas allá de QA

-

. El ancho de cada flecha representa la intensidad de flujo de energía respectivo. Cada círculo

blanco indica centro de reacción activo y cada círculo negro representa centro de reacción

inactivo. (D) Efecto de la temperatura en la actividad del fotosistema II de P. vulgaris medida

por emisión de fluorescencia modulada. (Los registros se obtuvieron utilizando un medidor de

fluorescencia modulada FMS2, Hansatech). Todos los datos presentados fueron obtenidos por

los autores para ilustrar este caso específico.

P. vulgaris JamapaTemp. (°C)

FoFmFvFv/FmFsFm´Fo´Fv´Fv´/Fm´PSIIqPqNPETR

25

22411699450.8083665332442890.5420.3130.5780.6880.724

45

2586133550.5793043582381200.3350.1510.4500.6800.348

Tiempo (s)

0 100 200 300 400

Flu

ore

scen

cia

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

25 ºC45 ºC

P. vulgaris Jamapa

Tiempo(s)

0 100 200 300 400

Flu

ore

scen

cia

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

25ºC

45ºC

P. vulgaris Jamapa

D

Fm

Fo

Fm’

Fo’

Fs

Tiempo(ms)

0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

Flu

ore

scen

cia

0

1000

2000

3000

4000

P. vulgaris

A

45ºC

40ºC

25ºC

35ºC

O

J

I

P

K

ETo/CSo

DIo/CSo

TRo/CSo

ABS/CSo

ETo/CSo

DIo/CSo

TRo/CSo

ABS/CSo

ETo/CSo

DIo/CSo

TRo/CSo

ABS/CSo

ETo/CSo

DIo/CSo

TRo/CSo

ABS/CSo

C

25ºC 35ºC 40ºC 45ºC

1.00

2.00 Fo

Fm

dV/dto

Po

oEoRC/CSo

ABS/CSo

TRo/CSo

ETo/CSo

DIo/CSoPIABS

25ºC 35ºC 40ºC 45ºC

B

Tiempo (ms)

Tiempo (s)

Flu

ore

scen

cia

Flu

ore

scen

cia


como un incremento en la velocidadde reducción de los centros de reac-ción del PSII. Esto se explica debidoa que en caso de la inhibición com-pleta del PSII con DCMU, los cen-tros de reacción son reducidos con laentrada de un sólo electrón. El efectodel cobre podría ser similar, es decirinhibiendo el paso de electrones en-tre Q

Ay Q

B, sin embargo, es posible

que algunos centros de reacción nopuedan llevar a cabo la separación decargas, lo cual aumentaría la veloci-dad del cierre de total de los centrosde reacción. Por otro lado, el valor defluorescencia después de la fase "J"es el máximo para el caso de laincubación con DCMU, sin embargo,comparado con el control, la exposi-ción a cobre no modifica la dinámicade reducción de Q

Aentre las fases de

J a P. Cuando se analiza la cinética dela figura 4A y la tabla anexa (4B) conbase en el modelo de la prueba OJIPpara obtener los productos oeficiencias cuánticas, se puede obser-var que la eficiencia con la cual semueven los electrones a través delPSII (

Eo) disminuye en un 94% y

14% por efecto del DCMU y Cu2+ res-pectivamente comparado con el con-trol. Esta disminución, en caso delDCMU, se debe principalmente a ladisminución del flujo de electronesdespués de Q

A(

o), fase térmica y en

menor proporción a la fase lumínica(

Po). Por otro lado, en el caso del Cu2+

a concentraciones no letales para esteorganismo (0.2 ppm), el efecto apa-rentemente está más relacionado conla salida de electrones del centro dereacción del PSII, es decir a la faselumínica (

Po), ya que el movimiento

de electrones después de QA

(o),

prácticamente no es afectado.La figura 6 muestra los efectos de

la temperatura en la cinética de emi-sión de fluorescencia y en algunosparámetros de fluorescencia de plan-tas de frijol común (Phaseolusvulgaris) obtenidos por la mediciónde fluorescencia directa y fluorescen-cia modulada respectivamente. En lafigura 6A se observa que el incremen-to de la temperatura hasta 40ºC dis-minuye gradualmente la intensidad defluorescencia mientras que a 45 ºCse produce una disminución abruptay la cinética de emisión de fluores-cencia muestra una fase (K) entre Foy J (alrededor de los 300 s), lo querefleja una limitación de la donaciónde electrones por el complejo libera-dor de oxígeno y cambios en la arqui-tectura de la antena del PSII con laconsecuente alteración de la distribu-ción de energía. Después del incre-mento rápido inicial de fluorescenciadebido a la reducción de Q

A, la

reoxidación de QA

- continúa, transfi-riéndose los electrones a Q

B, pero de-

bido a la carencia de electrones pro-cedentes del complejo liberador deoxígeno, la intensidad de la fluores-cencia decrece formandose el pico K.La figura 6B muestra el efecto de latemperatura en diversos parámetros defluorescencia entre los cuales desta-can el fuerte decremento en el rendi-miento cuántico máximo para lafotoquímica del PSII (

Po), y el índi-

ce de funcionamiento PIABS

. La figu-ra 6C muestra el efecto de la tempe-ratura en los flujos de energía por áreade emisión, en hojas de frijol común,visualizado en un modelo de hoja endonde la magnitud del cambio estáajustada al ancho de la flecha corres-

pondiente y los centros de reacciónactivos están indicados por círculosclaros y los inactivos por círculos os-curos. Se observan: a) disminución enel transporte de electrones debido ala inactivación de los centros de reac-ción (causado por una inactivación delcomplejo liberador de oxígeno); b)disminución en la densidad de los cen-tros de reacción activos; c) incremen-to en la disipación de energía por áreade emisión y d) disminución en laenergía absorbida por área de emisión.La figura 6D ilustra el efecto de latemperatura alta en el fotosistema II,registrado mediante la medición defluorescencia modulada. Destaca ladisminución en los valores del rendi-miento cuántico máximo para lafotoquímica primaria (Fv/Fm), en elrendimiento fotoquímico operacionaldel PSII (

PSII), en el decaimiento

fotoquímico de la fluorescencia (qP)y en la tasa de transporte electrónico(ETR). Estos resultados son con-gruentes con los observados por elanálisis basado en la medición direc-ta de fluorescencia.

En resumen, ya que la fotosíntesises una función esencial en los orga-nismos fotoautotróficos, resulta evi-dente que la evaluación de su funcio-namiento es de la mayor importanciaen un gran número de situaciones deinterés práctico. La determinacióncuantitativa de la emisión de la fluo-rescencia de la clorofila a, su análisisy la obtención de los parámetros co-rrespondientes, constituyen una for-ma precisa, confiable y rápida, de ob-tener información molecular que tie-ne una expresión fisiológica y quepuede tener múltiples aplicacionesprácticas.


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