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Facultad de Bioanálisis, VeracruzManual de Hematología

HEMOSTASIA: PRACTICA NO.1OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SANGRE

1. INTRODUCCIÓN

Obtención De Sangre Capilar Es el método empleado cuando se necesita tan solo una pequeña cantidad de sangre, ya que los estudios a realizar así lo requieren. El sitio más apropiado para obtener sangre capilar es la yema del dedo. En los niños más pequeños, es más conveniente obtenerla del talón ó del dedo pulgar del pie. Los detalles relativos a los recipientes y portaobjetos que se utilizan, se indican a continuación.

VENTAJAS. Facilidad con que puede obtenerse Especialmente útil en pacientes geriátricos y en niños, en particular, recién

nacidos.

DESVENTAJAS. Sólo logra obtenerse una pequeña cantidad de sangre que puede ser

insuficiente. Es un método por lo general tardado y que tiende a provocar hemólisis de

la muestra En pacientes inmunocomprometidos puede provocar infecciones,

excepto cuando se realiza la punción después de 8 a 10 min. de contacto con la piel con un buen antiséptico.

Obtención De Sangre Venosa. Es el principal método de extracción de sangre en el laboratorio de análisis clínicos, ya que es relativamente fácil de realizar.

VENTAJAS. Nos permite hacer múltiples exámenes y en repetidas veces si se desea,

con la misma muestra. Las alícuotas de plasma y suero pueden congelarse para futura

referencia.

DESVENTAJAS Puede provocar la coagulación de la sangre si el procedimiento lleva

mucho tiempo. Algunos componentes no son estables en sangre anticoagulada. Puede dificultarse en niños, pacientes obesos ó en estado de shock. Puede ocasionarse hemólisis de las muestras afectando ciertas

determinaciones, por las siguientes causas: Por forzar el paso de la sangre al tubo Por agitar el tubo enérgicamente Por extraer sangre de un hematoma


Anticoagulantes Empleados. Estas sustancias impiden la formación de coágulos. El mecanismo por el que se evita la coagulación, varía según el anticoagulante; por ejemplo, EDTA, citrato y oxalato se unen con el calcio, mientras que la heparina impide la conversión de protrombina en trombina.Ejemplos de anticoagulantes son EDTA, citrato de sodio, y heparina en forma de sal de litio, Los tubos deben invertirse varias veces para asegurar la mezcla adecuada después e la recolección, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA.El sitio más práctico para obtener sangre venosa es la flexura anterior del brazo, de preferencia justo por arriba de alguna de las ramas venosas que allí se encuentran. Las venas superficiales de la cara anterior del antebrazo son las más comunes para la veno punción. Las tres venas principales que se utilizan son:1) vena cefálica, ubicada en la parte superior del antebrazo y del lado del pulgar de la mano; 2) vena basílica, ubicada en la parte inferior del antebrazo y del lado del dedo meñique de la mano; y 3) vena cubital mediana, que conecta las venas basílica y cefálica en la fosa antecubital ( flexión del codo) y es la vena de elección. Si el paciente aprieta el puño después de aplicar el torniquete, la vena se tornará más prominente.El torniquete facilita la obtención. En los niños pequeños se pueden utilizar otros sitios; si es así, es mejor que la sangre la obtenga alguna persona con experiencia. Usar una aguja puntiaguda, nunca menor de calibre 21 y una jeringa de 5 ml ó de 10 ml. Tanto la aguja como la jeringa deberán estar limpias, secas y estériles. Con práctica se puede obtener sangre usando sólo una aguja con un tubo de goma por el que se deja correr la sangre hasta los tubos en los que se recoge la muestra. Para esta técnica se utilizan agujas de calibre 19.

3. LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Materiales de Laboratorio

CANTIDAD DESCRIPCIÓN2 Tubos de recogida de muestras con EDTA1 Aguja de Vacutainer1 Contenedor de Vacutainer1 Jeringa1 Lanceta1 Torundas de algodón con alcohol isopropílico1 Ligadura


4. PROCEDIMIENTO.

4.1 Punción Capilar

4.1.1 Indicaciones.

En lactantes, se realiza en la superficie plantar interna ó externa del talón. En niños de más de un año, en la superficie palmar de la última falange del segundo, tercero ó cuarto dedo de la mano. La punción no deberá realizarse en una parte edematosa ó congestionada, ó donde la piel se encuentra fría y cianótica.

4.1.2 Identificación del Paciente

Asegurarse de que el paciente llegue en condiciones óptimas y tranquilizarlo.

Colocar al paciente adecuadamente. Checar el material para la extracción:

4.1.3 Técnica.

4.1.3.1 Limpiar cuidadosamente la piel en el sitio de punción y a su alrededor con algodón mojado en algún desinfectante, como alcohol de 70%.

4.1.3.2 Secar el área con gasa estéril seca.4.1.3.3 Puncionar con una lanceta estéril ó aguja desechable. El

movimiento debe ser rápido y la punción suficientemente profunda para asegurar que la sangre fluya libremente. La salida de la sangre puede facilitarse ejerciendo una suave presión en la cara lateral del dedo. A corta distancia del sitio de punción.

4.1.3.4 La sangre deberá fluir libremente. Si se ejerce demasiada presión, se diluirá con los líquidos tisulares, lo que la puede hacer inapropiada para estudio.

4.1.3.5 Descartar siempre la primera gota de sangre, limpiándola con una gasa seca y dejar el sitio de punción limpio y seco.

4.3.1.6 Obtener la cantidad requerida de muestra, aspirando la sangre con pipeta ó colocándola en un portaobjetos.

4.2 Punción Venosa

4.2.1 Indicaciones.

Debe indicarse al paciente la posición correcta, que puede ser sentado ó recostado, apoyando bien el brazo en posición horizontal.Elegir la vena adecuada, prefiriéndose la cubital mediana, la vena basílica, la cefálica, las venas de la muñeca, tobillo y mano, ya que resultan fáciles de palpar.


4.2.2 Técnica

1. Desinfectar la piel en el sitio de punción con algodón mojado en un desinfectante apropiado como alcohol de 70%.

2. Preparar la jeringa y la aguja, ó en su defecto la aguja con el contenedor en el caso del sistema de tubos al vacío, cuidando que la técnica sea aséptica.

3. Aplicar un torniquete en el brazo ( por arriba del sitio de punción), suficientemente apretado para que restrinja el flujo de la sangre venosa.

4. Desinfectar nuevamente el sitio de punción, y secar la piel con algodón ó gasa limpios, secos y estériles.

5. Asegurarse de que el émbolo de la jeringa esté hasta el fondo , es decir, que la jeringa no contenga aire. Insertar la aguja de la jeringa en una vena con un movimiento preciso.

6. Jalar lentamente el émbolo y obtener 2 a 3 ml de sangre.7. Retirar la jeringa de la aguja y sustituirla por otra jeringa que contenga

la solución anticoagulante de citrato de sodio. O directamente introducir el tubo del sistema de vacío.

8. Obtener el volumen de sangre deseado jalando el émbolo muy despacio.

9. Soltar el torniquete y colocar una gasa seca sobre el sitio de la punción, retirando después la aguja con un solo movimiento.

10. Presionar ligeramente la gasa sobre el sitio de punción durante algunos momentos y después pedir al paciente que continúe aplicando la presión durante unos minutos.

11.Cuando la sangre se obtiene empleando sólo una aguja sin jeringa, se emplea el mismo procedimiento y cantidad de anticoagulante. Deben usarse tubos graduados para obtener la proporción adecuada de anticoagulante y sangre.

Actividades:- Practicar la toma de sangre capilar.- Practicar la toma de sangre venosa.

-Realizar esquemas de punción capilar.


Muestra capilar

La muestra capilar de sangre se obtiene al pinchar la superficie de la piel para obtener una o varias gotas de sangre y realizar un examen de laboratorio. El lugar más frecuente para obtener esta muestra es la piel de un dedo o del talón.

-Realizar esquemas de punción venosa y de las principales venas empleadas.

Principales venas empleadas Para la veno punció

-Realizar esquema de los diferentes sistemas de extracción: jeringa y sus partes; sistema vacutainer y sus partes; tipos de tubos y colores de tapones


empleados en el sistema vacutainer, de acuerdo con el anticoagulante empleado.

JERINGAlas partes de la jeringa son: el tapón de seguridad las alas (partes inferiores) el cuerpo, con marcas para medir el número de unidades contenidas en el cuerpo de la jeringa las marcas de medición impresas por cada 1, 2, 5 ó más unidades; las jeringas tienen marcas o números negros en el cuerpo de la jeringa y una tapa-aguja protectora de color naranja el jala-émbolo blanco cubierto del tapón de seguridad (que se quita) el émbolo (parte negra de hule en la punta del jala-émbolo más cerca de la aguja) la aguja la tapa-aguja.

VACUTAINER


Aguja y camisa en el sistema vacutainer.

El rojo es para serología, no lleva anticoagulante y sirve para obtener suero. El de color celeste se usan para estudios de la coagulación ( como APP y KPTT) y contienen como anticoagulante es estado líquido al citrato de sodio

El de color lila se usan para estudios hematimétricos (como hemogramas o citológicos completos) y tienen como anticoagulante, en estado líquido, al EDTA disódico y monopotásico. El de color lacre no contienen anticoagulante y son para que la sangre coagule.

- Reporte de resultados:La punción se realizó de manera adecuada,

HEMOSTASIA: PRÁCTICA No. 2


“EXTENDIDOS DE SANGRE”1. INTRODUCCIÓN.

Los extendidos de sangre se realizan dentro del estudio del hemograma completo, ó bien de manera aislada .En ellos se pueden estudiar los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas, y el propósito de ello es determinar las características morfológicas de cada tipo celular y evaluar la frecuencia relativa de los distintos tipos de leucocitos.Se deben teñir con una de las tinciones de Romanowsky las cuales varían en sus propiedades de tinción, y por lo tanto, es importante seleccionar una y familiarizarse con ella. La coloración de Wright es muy confiable y sencilla, pero otras también lo son, tales como la de Giemsa. Leishman ó May-Grünwald, las cuales son igualmente satisfactorias, aunque puede variar la tinción de un lote a otro de colorante.

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA.

Los frotis de sangre deben confeccionarse con láminas portaobjetos de vidrio que previamente se hayan lavado y secado de manera conveniente, con la finalidad de eliminar cualquier resto de grasa que pudiera quedar en ellos y evitar así una mala calidad en la tinción. Los frotis de sangre son esenciales para el estudio morfológico y cuantitativo de las células sanguíneas. Cuando un frotis se encuentra bien realizado, se podrán distinguir en él tres áreas importantes: la cabeza ó zona de inicio, el cuerpo ó zona media y la cola ó área final del mismo. Un frotis no deberá ser ni grueso ni delgado, pues en ninguno de ellos se podrán apreciar bien las áreas antes mencionadas. En un frotis bien realizado, la tinción será de mejor calidad.


3.1 Materiales de Laboratorio

NÚMERO DESCRIPCIÓN2 Tubos de recogida de muestras1 Aguja de Vacutainer1 Contenedor de Vacutainer1 Jeringa1 Torundas de algodón con alcohol isopropílico1 Ligadura1 Caja de portaobjetos limpios

4. PROCEDIMIENTO.


Técnica de los dos Portaobjetos.

1. Colocar a una distancia de 1.5-1.9 cm del extremo derecho de un portaobjetos, una pequeña gota desangre ( del tamaño de 3 cabezas de alfiler) obtenida por punción capilar del talón, del lóbulo de la oreja ó por extracción venosa.

2. Si se emplea sangre venosa mezclada con anticoagulante, el frotis deberá realizarse lo más pronto posible, debido a que el contacto prolongado con éste altera la morfología celular.

3. Aproximar el portaobjetos extensor a la gora, dejando que hagan contacto y que por capilaridad éste se extienda a lo largo del borde.

4. Se desliza el portaobjetos extensor hacia el extremo contrario, para lograr una película delgada de sangre.

5. dejar secar y teñir.

ACTIVIDADES:-Realizar 10 frotis correctamente confeccionados.

-Realizar esquema que muestra las partes de un frotis.

Cola cuerpo cabeza

-Realizar esquema de tres frotis: demasiado grueso, demasiado delgado y correctamente realizado.


Ejemplos de frotis mal hechos.

- Reporte de resultados.Los frotis se realizaron exitosamente, después de constante practica, ya que en ocasiones quedaban delgados, flagelados, etc.

HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 3


“TINCIÓN DE WRIGHT Y REACTIVOS COMUNMENTE EMPLEADOS EN HEMATOLOGIA

“

1. INTRODUCCIÓN La finalidad de la tinción de Wright es lograr que el alumno se sienta capacitado para preparar adecuadamente algunos de los reactivos y colorantes más comúnmente empleados en las áreas de hematología y microbiología, que como químico clínico tiene la obligación de conocer y dominar.

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA.

COLORANTES.A los colorantes de les puede clasificar en tres grupos:1) Ácidos. Son aquellos constituídos por sales cuya base es incolora y

cuyo ácido es coloreado. A este grupo pertenecen las eosinas. Estas soluciones se usan para la coloración citoplasmática ó coloración de fondo.

2) Básicos. Son aquellas sales de ácido incoloro y base coloreada como el clorhidrato de azul de metileno. Estos colorantes tiñen por lo general algunos elementos del núcleo.

3) Neutros. Son aquellas sales con el ácido y la base coloreados, por ejemplo, los eosinatos de azul y azur de metileno. los más empleados en hematología. El método de Romanowsky, que emplea estos colorantes, ha sido la base de las coloraciones panópticas utilizadas en la actualidad ya que ha tenido un gran éxito en la tinción diferencial de la mayoría de las estructuras normales y anormales de la sangre. La mayor parte de estos colorantes policromos derivados del método de Romanowsky, se disuelven en alcohol metílico, combinando así, la fijación con la tinción. Los más conocidos de todos ellos, son los de Giemsa y de Wright.

Tipo de Error Causas Como se CorrigeTinción demasiado azul Tiempo excesivo de tinción

Lavado deficientePh muy alcalino

Disminuir el tiempo de tinciónLavar adecuadamenteAcidificar el pH

Tinción demasiado rosa Tiempo insuficiente de tinciónLavado excesivopH muy ácido

Aumentar el tiempo de tinciónLavar adecuadamenteElevar el pH

Precipitación de colorante Colorante no filtradoSecado de la laminilla durante la tinción.

Filtrado de coloranteProcurar que siempre haya un buen menisco de colorante durante la tinción.

ANTICOAGULANTES.


Los 4 anticoagulantes más usados son: mezcla de oxalato amónico y de potasio ( ó simplemente oxalato amónico ), citrato trisódico, sequestrene ( EDTA ), y heparina.

Los 3 primeros impiden la coagulación sustrayendo el calcio del plasma sanguíneo por precipitación ó fijación en forma no ionizada. La heparina neutraliza la trombina y otras fases de la activación de los factores de coagulación.

El citrato trisódico, el EDTA y la heparina, pueden emplearse para impedir la coagulación de la sangre destinada a transfusiones, sin embargo, la mezcla de oxalatos, no, por ser tóxica.

Los oxalatos pueden usarse para determinaciones como hemoglobina, hematocrito y recuentos globulares, aunque para extensiones sanguíneas puede usarse tan sólo en los primeros minutos, pues más tarde pueden desarrollarse alteraciones de las células sanguíneas como formas dentadas de los hematíes, vacuolización en el citoplasma de los granulocitos, fagocitosis de los cristales de oxalato, artefactos en los núcleos de los linfocitos y monocitos, etc.Además no deben emplearse para determinaciones químicas de nitrógeno y potasio. Para investigaciones de coagulación, es muy útil el citrato trisódico.

El EDTA ó sequestrene es tal vez el anticoagulante más usado para el recuento de células sanguíneas. Se le compara con el oxalato para el estudio del hematocrito y hemoglobina, pero para estudios morfológicos, es todavía mejor, pues con él, no se forman alteraciones ni artefactos en las células sanguíneas, aún después de un buen tiempo de estar hecha la mezcla, si la sangre se refrigera ( 2 horas a 24 horas ).

La heparina también puede usarse para determinaciones como hematocrito y hemoglobina, pero no de óptimos resultados en las extensiones sanguíneas, ya que produce un fondo azul en aquéllas que son teñidas con el colorante de Wright.


3.1 Reactivos.NUM. NOMBRE DEL REACTIVO CANTIDAD

1 Colorante de Wright 0.1 g2 Metanol 60 ml3 Na2HPO4 2.56 g4 KH2PO4 6.66 g5 EDTA 3g6 Oxalato de amonio 0.8g7 Agua destilada 1.5L


3.2 Equipo de Laboratorio

Balanza GranatariaBalanza Analítica

3.3 Materiales de LaboratorioCANTIDAD DESCRIPCIÓN

1 Mortero2 Probetas de 100 ml1 Matraz Volumétrico de 100 ml4 Varillas de vidrio1 Frasco de vidrio color ambar de 1L de capacidad3 Frascos de vidrio color ámbar de 150 ml de capacidad1 Jeringa ó sistema vacutainer para toma de muestra1 Ligadura10 Portaobjetos

3.4 Preparación de los reactivos

3.4.1Colorante de Wright: Colorante de Wright: 0.1 g Metanol: 60 ml

Se tritura el colorante con el alcohol en un mortero; ésto se hace poco a poco. Esta operación debe durar 30 min. hasta completar disolución. Se deja reposar dos días y se filtra.

3.4.2 - Amortiguador ó Buffer de fosfatos

Na2HPO4 2.56 g KH2PO4 6.66 g Agua destilada para aforar a 1 L


Mezclar las sales con poca cantidad de agua destilada, e ir agregando poco a poco más agua, hasta aforar a 1 L. Guardar en un frasco ámbar de 1 L.

3.4.3- EDTA. EDTA 3 g Agua destilada 100 ml

Mezclar el EDTA poco a poco con el agua destilada.

3.4.4 -Solución de Oxalato de amonio.

Oxalato de amonio 0.8 g Agua destilada 80 ml

Mezclar poco a poco el oxalato de amonio con el agua destilada. En ambos, se utiliza 1 gota de solución por ml de sangre.

4. PROCEDIMIENTO.

4.1 Técnica: Tinción de Wright.

4.1.1. Seleccionar un portaobjetos nuevo de 25 X 75 mm para hacer extendidos, que tenga la orilla relativamente lisa.

4.1.2 Obtener una pequeña cantidad de muestra de sangre periférica.4.1.3Colocar una pequeña gota de sangre a 2 ó 3 mm de la orilla de un

portaobjetos limpio y seco. Colocar el portaobjetos para hacer extendido en un ángulo de 30 a 45 grados con respecto al portaobjetos que tiene la muestra y hacer contacto cn la gota. Esta debe extenderse rápidamente a lo largo de la orilla del portaobjetos para hacer los extendidos. Deslizar el portaobjetos de extensión sobre la superficie dispersando la muestra de sangre. El extendido de sangre debe medir aproximadamente 30 mm de largo . El portaobjetos de extensión no se despegará hasta haber extendido toda la sangre. El grueso del extendido de sangre puede regularse modificando el ángulo del portaobjetos de extensión, variando el tamaño de la gota de sangre, la presión ó la velocidad de extensión.

4.1.4 El extendido de sangre se seca con el aire. Una vez seco, se escribe con lápiz el nombre del paciente en una orilla del portaobjetos.

4.1.5 Fijar el extendido de sangre en alcohol metílico absoluto durante 2 a 3 minutos. El color del extendido de sangre cambiará de rojo a café claro. Esta fijación es recomendable aunque el colorante que se vaya a emplear se encuentre diluído en alcohol metílico absoluto.


4.1.6 Cubrir el portaobjetos completamente con el colorante. Después de 3 minutos añadir un volumen igual de amortiguador. Soplar ligeramente para mezclar uniformemente. Aparecerá un brillo metálico verde.

4.1.7 Después de 5 minutos enjuagar cuidadosamente con agua de la llave ó amortiguador de fosfatos, al principio con chorro delgado y suavemente y después con el chorro fuerte para eliminar todo exceso de colorante. Limpiar el reverso del portaobjetos en posición erecta. Cuando se haya secado, cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos rectangular y fijarlo con una gota de líquido de montaje. Se puede usar sólo aceite de inmersión en una preparación temporal.

El alumno deberá ensayar tiempos hasta ajustar aquellos que más convengan para una óptima coloración. Así, con tres frotis más deberá ensayar: 2 minutos de colorante y 4 de amortiguador; 6 minutos de colorante y 6 minutos de amortiguador; 6 minutos de colorante y 11 minutos de amortiguador.

4.2 Resultados Esperados. Los resultados esperados en la tinción serán los siguientes:

Hematíes en color rosa.Núcleos de los leucocitos de azul púrpura, con la cromatina y paracromatina netamente diferenciadas.Gránulos neutrófilos del citoplasma, lila ó violetaGránulos eosinófilos, rojo tirando a naranja.Gránulos basófilos, púrpura tirando a azul oscuro.Plaquetas, color lila oscuro.Citoplasma de los linfocitos, azul claro.Citoplasma de los monocitos, ligero azul.

Actividades:-Practicar la tinción de Wright con frotis de sangre periférica.-Corregir de acuerdo al recuadro, errores encontrados en la tinción.

- Reporte de resultados La tinción de Wright se llevo a cabo de manera exitosa, cuidando los tiempos de cada una de los reactivos utilizados.

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