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EVALUACIÓN DE LA CONTRIBUCIÓN DE LAS CÉLULAS NK
AL RECHAZO CRÓNICO DEL TRASPLANTE RENAL
MEDIADO POR LOS ALOANTICUERPOS ANTI-HLA, LA
DISPARIDAD GENÉTICA Y LA INFECCIÓN POR CMV
Marta Crespo Barrio
Institut de Recerca Hospital del Mar
José Miguel López-Botet Arbona
Facultat de Ciències de la Salut i Vida UPF
Blas Carlos Vilches Ruiz
Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda
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1. Resumen
Presentamos aquí la hipótesis, los objetivos, el diseño y los métodos del estudio.
Hipótesis
Objetivos
Objetivo principal:
Realizar un análisis integral detallado de los anticuerpos anti-HLA, el genotipo de
receptores de células NK (NKR), la distribución de sus fenotipos y otros polimorfismos
genéticos que controlan la función de cc. NK en pacientes sometidos a trasplante renal,
con atención especial a la incidencia y el curso clínico de la infección por CMV y el
rechazo crónico.
Objetivos secundarios:
1. Evaluar la presencia, aparición, especificidad, patrón temporal y capacidad para fijar
complemento de anticuerpos anti-HLA en trasplante renal, en relación con la función
renal, los resultados de la biopsia como prueba de referencia, y la pauta de
inmunosupresión.
2. Evaluar la capacidad de anticuerpos anti-HLA específicos del donante para estimular
la actividad ADCC de las cc. NK y su relación con el rechazo. Determinar si variaciones
genéticas que modifican la afinidad del CD16 por la IgG modulan el efecto patogénico
de los anticuerpos anti-HLA.
3. Analizar la relación entre la distribución de NKR relacionados con la infección por
CMV y la susceptibilidad al rechazo renal crónico.
RECHAZO (CRÓNICO) rechazo
mediado por anticuerpos (ABMR)
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4. Analizar la relación entre la incompatibilidad en epítopos reconocidos por KIR y los
anticuerpos específicos del donante con la susceptibilidad al rechazo renal crónico.
Diseño, pacientes:
El proyecto comprende estudios retrospectivos (todos los trasplantes renales seguidos
en el Hospital del Mar) y prospectivos (pacientes trasplantados desde el comienzo del
proyecto), en los que la variable clínica será la disfunción o el rechazo crónicos del
injerto. Evaluaremos la influencia de los anticuerpos específicos del donante (DSA), la
distribución de subpoblaciones de cc. NK inducida por el CMV, la actividad ADCC
mediada por cc. NK, y factores genéticos que controlan la función NK y la
alorreactividad.
Métodos:
- Creación de una base de datos de trasplante e infección por CMV.
- Monitorización anual de anticuerpos anti-HLA pretrasplante y postrasplante de
todos los pacientes del estudio; detección de DSA, y determinación de su isotipo y
capacidad fijadora de complemento.
- Evaluación de la compatibilidad HLA de donante y receptor, tipificación molecular
de epítopos HLA-C en los casos en que haya células criopreservadas del donante.
- Biopsias del injerto en pacientes con DSA y en controles.
- Inmunofenotipado básico leucocitario y de cc. NK, incluyendo NKG2C, NKG2A,
ILT2 y CD16 en todos los casos. El análisis detallado de la distribución de cada KIR se
limitará a los casos en los que se pueda estudiar la disparidad de epítopos KIR-HLA.
Estos estudios se realizarán una vez en todos los pacientes, y de forma prospectiva
longitudinal en los trasplantados desde 2013.
- Detección de linfocitos T alorreactivos.
- Estudios de ADCC en los pacientes que desarrollen DSA y cuando existan células
preservadas del donante; como control se estudiarán pacientes sin anticuerpos y con
anticuerpos no DSA.
- Estudios genéticos: epítopos HLA para los KIR inhibidores en células/DNA del
donante; genotipado y fenotipado KIR; variaciones en el número de copias del gen
NKG2C; alotipos de CD16A con afinidad variable por la IgG.
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2. Resultados
Objetivo 1. Evaluar la presencia, aparición, especificidad, patrón temporal y capacidad
para fijar complemento de anticuerpos anti-HLA en trasplante renal, en relación con la
función renal, los resultados de la biopsia como prueba de referencia, y la pauta de
inmunosupresión.
En el estudio transversal global:
Pretrasplante: evaluamos el impacto de los anticuerpos preformados en 370
trasplantados renales.
Aunque el mayor riesgo de rechazo mediado por anticuerpos (ABMR) se observaba en
pacientes con DSA desarrollados de novo (HR 22,2 [IC 6,10-81,16]), también estaba
aumentando en receptores con DSA preformados, bien persistentes o aclarados (HR
14,709 [IC6,55-32,98] y HR 7,01 [IC 2,25-21,81]) en comparación con receptores sin
DSA (Redondo et al., manuscrito enviado).
Postrasplante: detectamos DSA a largo y medio plazo después del trasplante en el
9,2% de los pacientes (anualizado: 7,8% en 2010, 9,8% en 2012, 9,4% en 2013 y
9,9% en 2014-2015). Los caracterizamos y los correlacionamos con el inmunofenotipo
de linfocitos de sangre periférica, la función renal, el resultado de la biopsia, la
supervivencia y el tratamiento.
- Dada la implicación del complemento en el daño renal en este tipo de rechazo,
evaluamos la capacidad de los DSA para fijar su fracción C3d, y la comparamos con la
fijación de C1q y el título de anticuerpos en 43 pacientes con DSA frente a HLA de
clase II y seguimiento suficiente como para valorar la supervivencia del injerto (Crespo
et al., manuscrito enviado). Observamos que el C3d identifica mejor que el C1q los
pacientes con DSA y datos de rechazo humoral en la biopsia.
- Observamos que los pacientes con anticuerpos anti-HLA postrasplante tenían
menos cc. NK circulantes, y que aquellos con DSA tenían mayor frecuencia de
expresión de NKG2A, correlacionándose con el rechazo humoral, el principal tipo de
rechazo crónico (Crespo et al., American Journal of Transplantation, 2015).
- Para el estudio histológico, evaluamos el impacto de la nueva clasificación de
Banff 2013 en un grupo de 71 pacientes, frente a la clasificación de 2009, y lo
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correlacionamos con el curso clínico (Nephrology Dialysis and Transplantation, 2016).
Observamos que la nueva clasificación ayuda en el diagnóstico de rechazo humoral
tardío, ya que permite identificar casos, reducir el número de casos de sospecha y
hacer más concluyente el diagnóstico.
-
En resumen, demostramos que la presencia pretrasplante y postrasplante de DSA anti-
HLA disminuye la supervivencia del injerto. No obstante, al analizar el impacto de
anticuerpos menos conocidos, como los anti-HLA-DP, observamos que no modifican
significativamente dicha supervivencia (Redondo et al., J Tr Immunol, 2015).
En el estudio prospectivo, detectamos una tasa baja de aparición de novo de DSA
(4,2%); estos pacientes fueron biopsiados en el primer año postrasplante,
observándose AMR en 6 casos y rechazo celular en 1. De las 78 biopsias realizadas en
el primer año, se diagnosticó AMR en el 6,4%, el 60% de estas con DSA y el 40% sin
ellos. De los pacientes con AMR, solo uno había sufrido reactivación del CMV; mientras
que en todos los pacientes biopsiados en el primer año, la infección había tenido lugar
en el 5,8% de los que tenían una puntuación de Banff 1; el 15,3%, de Banff 2, el
14,3%, de Banff 3, el 20%, de Banff 4, el 16.2%, en la categoría 5, y el 17,5%, en la
6. De los pacientes con infección por CMV en el primer año, el 12,1% tenían AMR en la
biopsia, en comparación con el 15,3% con otros diagnósticos (p = 0,42). Se están
completando las biopsias al tercer año, que aportarán información adicional sobre la
conexión entre CMV, HLA DSA y ABMR.
Objetivo 2. Evaluar la capacidad de anticuerpos anti-HLA específicos del donante para
estimular la actividad ADCC de las cc. NK y su relación con el rechazo. Determinar si
variaciones genéticas que modifican la afinidad del CD16 por la IgG modulan el efecto
patogénico de los anticuerpos anti-HLA.
Como hemos indicado sobre la relación entre anticuerpos anti-HLA (DSA y no DSA) y
distribución de subpoblaciones NK en trasplantados renales, vimos asociaciones entre
el número de cc. NK, especialmente su subpoblación NKG2A+, y la presencia de DSA
anti-HLA (Crespo et al., Am J Transplant, 2015).
En el contexto de las explicaciones mecanísticas de la observación anterior, evaluamos
in vitro el efecto de la actividad ADCC sobre las propias cc. NK. Esta inducía una
marcada unión de anexina-V, disociada, llamativamente, de la apoptosis medida por
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activación de caspasa-3, lo que revelaba la traslocación de fosfatidilserina a la
membrana plasmática tras la degranulación de las cc. NK. El efecto se asociaba a un
aumento de la fagocitosis por macrófagos. Estos resultados coinciden con nuestra
interpretación de que un aumento de su recambio inducido por ADCC subyace a la
reducción de algunas subpoblaciones de cc. NK circulantes en pacientes con DSA.
Genotipamos el CD16 en 85 pacientes con DSA o AMR, de los que 49 tenían DSA
postransplante, 17 tenían DSA pretransplante, y 19 tenían sospechas de DSA que no
se confirmaron. Trece pacientes eran homocigóticos para valina (V/V), 41 eran
heterocigóticos (V/F) y 30 eran homocigóticos para fenilalanina (F/F). Dado que valina
aumenta la afinidad por la IgG, hicimos un análisis preliminar del impacto potencial del
genotipo mediante el estudio de la evolución de 49 pacientes con DSA postrasplante:
aquellos con genotipos V/V o V/F no mostraron aumento de AMR (63,6% frente a
66,6%, p = 0,58) ni pérdida del injerto (13,8% frente a 22,2%, p = 0,35). Están en
curso análisis adicionales.
Objetivo 3. Analizar la relación entre la distribución de NKR relacionados con la
infección por CMV y la susceptibilidad al rechazo renal crónico.
Analizamos transversalmente la expresión de NKR (en concreto, NKG2C, NKG2A, KIR,
CD161 e ILT2) en pacientes trasplantados, demostrando en ellos aumentos
significativos de cc. NKG2C+ en comparación con controles sanos, lo que sería
consistente con la reactivación o infección por HCMV. El efecto se acentuaba en los
pacientes con enfermedad por HCMV, y en aquellos con genotipo NKG2C+/+ frente a
NKG2C+/del, de acuerdo con el efecto de la dosis génica sobre la diferenciación y
expansión de dicha subpoblación que hemos publicado anteriormente; no había
asociaciones significativas con otras variables clínicas. Por otra parte, el número de
copias del gen NKG2C parecía asociarse con la supervivencia del injerto, pero sin
alcanzar la significación estadística, por lo que se requieren estudios con muestras más
grandes para confirmar la observación (Redondo-Pachón et al., J Immunol, 2017).
Una limitación importante del estudio retrospectivo es la falta de datos basales de
células NKG2C+ y de incidencia de la viremia HCMV subclínica, variables que sí que se
recogieron en el estudio prospectivo. No obstante, a lo largo del seguimiento
prospectivo (a 3, 6, 12, y 24 meses), las expansiones postrasplante de cc. NKG2C+ no
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fueron generalizadas en todos los pacientes con viremia que recibieron tratamiento
antiviral anticipado, lo que sugiere que la respuesta NK adaptativa descrita puede
correlacionarse inversamente con el grado de control del CMV. Significativamente, la
incidencia de viremia postrasplante se redujo en los pacientes con más células
NKG2C+ pretrasplante. Las frecuencias de los genotipos NKG2C en pacientes
trasplantados eran comparables a las de los sanos y, como demostramos en estos
(Muntasell et al., Eur J Immunol, 2013b), los pacientes NKG2C+/+ tenían más células
NKG2C+ que los NKG2C+/del. Se observó una tendencia, tanto en el estudio
retrospectivo como en el prospectivo, que sugería mayor frecuencia de pacientes
NKG2C+/del, y menor de NKG2C+/+ en los casos con infección sintomática. En
conjunto, nuestros resultados apoyan indirectamente que las cc. NK NKG2C+
adaptativas están implicadas en el control del CMV en los trasplantados renales
(Redondo et al., J Immunol, 2017).
Como se explica en nuestras revisiones recientes (Muntasell et al., Eur J Immunol,
2013a; López-Botet et al., Sem Immunol, 2014), la infección por HCMV induce una
expansión variable y persistente de cc. NK funcionalmente maduras NKG2Cbright.
Analizamos la respuesta de estas inducida por fibroblastos MRC-5 infectados por HCMV
y opsonizados con suero inmune frente al virus. Los anticuerpos específicos inducían la
degranulación (expresión de CD107a) y la producción de citoquinas por un porcentaje
significativo de cc. NK, que excedía la baja citotoxicidad natural que se observaba
frente a células infectadas por HCMV. La actividad ADCC de las cc. NK estaba limitada
por la disponibilidad de antígenos virales y por las moléculas HLA de clase I en las
dianas infectadas en las fases tempranas de la infección, y aumentaba en las tardías
superando los mecanismos de inmunoevasión del virus. La presencia de IgG específica
era capaz incluso de activar las cc. NK frente a viriones opsonizados con anticuerpos en
ausencia de células diana (Costa-García et al., J Immunol, 2015). En comparación con
las cc. NK NKG2A+, un porcentaje de células NKG2Cbright no expresaban la cadena
FcεRγ y tenían una respuesta alta a la activación por anticuerpos, siendo
particularmente efectivas en la producción de citoquinas antivirales, especialmente
TNFα. De modo destacable, la expansión de cc. NK NKG2Cbright se correlacionaba en los
individuos HCMV+ con la magnitud de la producción de TNFα e IFNγ tras la activación
mediada por anticuerpos. Nuestros resultados muestran la potencia y la sensibilidad de
la respuesta anti-HCMV que se deriva de la colaboración entre los anticuerpos
específicos y la subpoblación NK NKG2Cbright. Además, descubrimos el potencial
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inflamatorio de estas células al activarse por anticuerpos, una variable que podría
influir sobre las respuestas individuales a otros patógenos y a los tumores, además de
sobre el efecto de los DSA anti-HLA en los receptores renales.
Recientemente, se ha asociado la disminución de la expresión de la cadena FcεRγ con
la diferenciación de cc. NK con rasgos de tipo “memoria” en respuesta al HCMV. Por
otro lado, hay datos en algunos individuos sobre la expansión de células NKG2C en
respuesta al HCMV. Estos hallazgos son de interés para definir de modo más preciso el
impacto de la infección por HCMV sobre las cc. NK en el trasplante renal. Para
establecer el protocolo de análisis más adecuado en muestras clínicas, hemos realizado
un estudio piloto en donantes sanos, evaluando la expresión de FcεRγ en distintas
subpoblaciones NK y su relación con la variación del número de copias del gen NKG2C
(Muntasell et al., J Immunol, 2016).
Objetivo 4. Analizar la relación entre la incompatibilidad en epítopos reconocidos por
KIR y los anticuerpos específicos del donante con la susceptibilidad al rechazo renal
crónico.
Hemos purificado muestras procedentes de receptores y donantes renales
seleccionados por el grupo coordinador y se han determinado en todos ellos los
epítopos reconocidos por los KIR inhibidores 3DL1, 3DL2, 2DL1 y 2DL2/L3.
Identificamos las incompatibilidades donante-receptor en dichos ligandos, y verificamos
la presencia en el genoma del receptor del gen KIR relevante en cada caso. Calculamos
la frecuencia de incompatibilidad para cada pareja KIR-ligando, y estudiamos su
posible asociación con el curso clínico del trasplante. Observamos que el 51,8% de los
casos tenía, al menos, una incompatibilidad KIR. La supervivencia del injerto (mediana
de 45 meses postrasplante, IQR 26,7-64) fue del 83% en los casos con alguna
incompatibilidad, y del 91% en los trasplantes sin ellas (logrank = 0,91), siendo
también similares las frecuencias de ACR (28,1% frente a 34,3%, p = 0,44) y de AMR
(14,3% frente a 15,6%, p = 0,61).
Analizamos también la influencia del número de incompatibilidades KIR, según se
desglosa en la tabla siguiente:
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3. Relevancia e impacto clínico potencial
Hemos conseguido los siguientes objetivos:
I. Nuestro estudio confirma el impacto de los DSA pretrasplante y postrasplante
sobre la incidencia de AMR y la pérdida del injerto. Confirmamos que algunas
características de los DSA se correlacionan mejor con la evolución (clase en los
pretrasplantes y título en los postrasplantes), pero observamos que los DSA no
fijadores de complemento se han minusvalorado y tienen repercusión sobre AMR y
pérdida del injerto, como sugiere la aceptación del AMR C4d-negativo, lo que apoya la
existencia de mecanismos alternativos de daño mediado por DSA en el trasplante de
órganos. Por primera vez, hemos comparado la repercusión de los recientes cambios
en la clasificación de Banff en el diagnóstico de AMR, y reconocemos el impacto
potencial en el manejo del trasplante renal. Estos datos son relevantes en la práctica
clínica para seleccionar las mejores opciones en pacientes sensibilizados antes del
trasplante, y para ajustar después el tratamiento inmunosupresor.
II. Nuestro estudio aporta la primera prueba indirecta de la implicación de las
células NK adaptativas NKG2C+ en el control del HCMV en el trasplante renal. La
confirmación de estos resultados en estudios multicéntricos más amplios tendría
implicaciones clínicas relevantes en el trasplante renal (véase Redondo-Pachón et al., J
Immunol, 2017).
0
incompat.
1
incompat.
2
incompat.
3
incompat.
P
N 53
(48,2%)
43
(39,1%)
13
(11,8%)
1 (0,9%)
Pérdida de injerto 9,4% 11,9% 0% 100%* 0,43
ABMR en biopsia
(N=53)
15,6% 15,8% 12,5% -- 0,97
Biopsia con rechazo
agudo
34,3% 23,1% 37,5% -- 0,72
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Por otra parte, las cc. NK adaptativas NKG2C+ son particularmente efectivas en realizar
citotoxicidad dependiente de anticuerpos y secretar citoquinas, como se muestra en los
subproyectos 2 y 3. Aunque esta característica puede ser ventajosa para el control de
patógenos, la expansión de estas células podría agravar el daño al injerto renal en los
pacientes con anticuerpos específicos del donante.
III. El periodo de seguimiento puede haber resultado limitante para confirmar o
descartar completamente el impacto del polimorfismo de CD16A o las
incompatibilidades en epítopos reconocidos por KIR sobre el curso clínico del
trasplante. De manera similar, la implicación de la infección por CMV en el AMR tardío
(debida a la expansión de cc. NKG2C+ o a otros mecanismos) como causa principal de
pérdida del injerto debe analizarse con seguimientos más largos.
4. Publicaciones derivadas de la investigación
Publicaciones
1: López-Botet M, Vilches C, Redondo-Pachón D, Muntasell A, Pupuleku A, Yélamos J,
Pascual J, Crespo M.
Dual Role of Natural Killer Cells on Graft Rejection and Control of Cytomegalovirus
Infection in Renal Transplantation.
Front Immunol. 2017. 8:166.
2: Redondo-Pachón D, Crespo M, Yélamos J, Muntasell A, Pérez-Sáez MJ, Pérez-
Fernández S, Vila J, Vilches C, Pascual J, López-Botet M.
Adaptive NKG2C+ NK Cell Response and the Risk of Cytomegalovirus Infection in
Kidney Transplant Recipients.
J Immunol. 2017. 198:94-101.
3: López-Botet M, Muntasell A, Martínez-Rodríguez JE, López-Montañés M, Costa-
García M, Pupuleku A.
Development of the adaptive NK cell response to human cytomegalovirus in the
context of aging.
Mech Ageing Dev. 2016. 158:23-6.
12
4: Muntasell A, Pupuleku A, Cisneros E, Vera A, Moraru M, Vilches C, López-Botet M.
Relationship of NKG2C copy number with the distribution of distinct cytomegalovirus-
induced adaptive NK cell subsets.
J Immunol. 2016. 196:3818-27.
5: Redondo-Pachón D, Pascual J, Pérez-Sáez MJ, García C, Hernández JJ, Gimeno J, Mir
M, Crespo M.
Impact of preformed and de novo anti-HLA DP antibodies in renal allograft survival.
Transpl Immunol. 2016;34:1-7.
6: Latorre I, Esteve-Sole A, Redondo D, Giest S, Argilaguet J, Alvarez S, Peligero C,
Forstmann I, Crespo M, Pascual J, Meyerhans A.
Calcineurin and mTOR inhibitors have opposing effects on regulatory T cells while
reducing regulatory B cell populations in kidney transplant recipients.
Transpl Immunol. 2016; 35:1-6.
7: Gimeno J, Redondo D, Pérez-Sáez MJ, Naranjo-Hansa D, Pascual J, Crespo M.
Impact of the Banff 2013 classification on the diagnosis of suspicious vs conclusive late
antibody-mediated rejection.
Nephrology Dialysis and Transplantation. 2016, 31(11):1938-1946.
8: Arias Cabrales CE, Redondo-Pachón D, Pérez-Sáez MJ, Gimeno J, Sánchez-Gu ̈erri I,
Bermejo S, Sierra A, Burballa C, Mir M, Crespo M, Pascual J.
Supervivencia del injerto renal según la categoría de Banff 2013 en biopsia por
indicación.
Nefrología. 2016; 36(6):660-666.
9: Moraru M, Black LE, Muntasell A, Portero F, López-Botet M, Reyburn HT, Pandey JP,
Vilches C.
NK cell and Ig interplay in defense against Herpes Simplex Virus Type 1: Epistatic
interaction of CD16A and IgG1 allotypes of variable affinities modulates antibody-
dependent cellular cytotoxicity and susceptibility to clinical reactivation.
J Immunol. 2015. 195:1676-84.
13
10: Costa-García M, Vera A, Moraru M, Vilches C, López-Botet M, Muntasell A.
Antibody-mediated response of NKG2Cbright NK cells against human cytomegalovirus.
J Immunol. 2015. 194:2715-24.
11: Crespo M, Yélamos J, Redondo D, Muntasell A, Pérez-Saéz MJ, López-Montañés M,
García C, Torio A, Mir M, Hernández JJ, López-Botet M, Pascual J.
Circulating NK-cell subsets in renal allograft recipients with anti-HLA donor-specific
antibodies.
Am J Transplant. 2015. 15:806-14.
12: Crespo M, Heidt S, Redondo D, Pascual J.
Monitoring B cell subsets and alloreactivity in kidney transplantation.
Transplant Rev. 2015; 29(2):45-52.
13: López-Botet M, Muntasell A, Vilches C.
The CD94/NKG2C+ NK-cell subset on the edge of innate and adaptive immunity to
human cytomegalovirus infection.
Semin Immunol. 2014. 26:145-51.
14: Muntasell A, López-Montañés M, Vera A, Heredia G, Romo N, Peñafiel J, Moraru M,
Vila J, Vilches C, López-Botet M.
NKG2C zygosity influences CD94/NKG2C receptor function and the NK-cell
compartment redistribution in response to human cytomegalovirus.
Eur J Immunol. 2013. 43:3268-78.
15: Muntasell A, Vilches C, Angulo A, López-Botet M.
Adaptive reconfiguration of the human NK-cell compartment in response to
cytomegalovirus: a different perspective of the host-pathogen interaction.
Eur J Immunol. 2013. 43:1133-41.