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EFECTO DE LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS MADRE
MEDIANTE CAMPOS MAGNÉTICOS EN LA RECUPERACIÓN
DEL INFARTO CEREBRAL
Juan Sahuquillo Barris
Hospital Universitari Vall d'Hebron
José Manuel García Verdugo
Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biologia Evolutiva UV
Luis Martí Bonmatí
Hospital Universitari i Politècnic La Fe València
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1. Resumen del proyecto
Este estudio tiene como objetivo analizar el efecto de los campos magnéticos
atrayentes sobre las células madre marcadas con partículas de hierro en un modelo
animal de infarto cerebral. El diseño experimental del proyecto incluirá: 1) el marcaje
con nanopartículas de células madre adultas (de origen animal —roedores— y
humano); 2) la realización de infarto cerebral en roedores; 3) la administración de las
células madre marcadas mediante trasplante o por vía intravenosa; 4) la aplicación de
campos magnéticos a través de imanes externos para guiar las células hacia las
regiones dañadas; 5) el seguimiento de la migración y del destino celular con
resonancia; 6) el estudio histológico y ultraestructural en diferentes momentos
después del infarto, y 7) la realización de test funcionales y de comportamiento.
2. Resultados
Los resultados desglosados por objetivos son los siguientes:
OB1-OB2. Identificación de la célula madre con mejor perfil para conseguir el
marcaje con hierro y la migración mediante campos magnéticos. Optimización
del marcaje celular con partículas de hierro
Las células madre mesenquimales adultas obtenidas de tejido adiposo de rata (rASC)
fueron las células seleccionadas para realizar el marcaje con hierro y la migración
mediante campos magnéticos. Para su validación, se realizó: caracterización
citométrica, estudios de marcaje con hierro y cantidad de hierro captado, migración in
vitro y capacidad de diferenciación, así como viabilidad y morfología fina
(ultraestructural) tras la aplicación de campos magnéticos. Se descartaron los otros
tipos celulares propuestos en la memoria inicial. Principalmente, la utilización de
neuroesferas se descartó debido a dos motivos: i) el bajo rendimiento de las biopsias
obtenidas de la zona subventricular (SVZ) y del filum terminal (FT) de pacientes
adultos sometidos a intervenciones neuroquirúrgicas en el Hospital Universitario Vall
d’Hebron, y ii) la incapacidad de las neuroesferas de ratón para fagocitar el hierro
espontáneamente o con moléculas facilitadoras como la poli-L-lisina o a través de
liposomas.
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Es importante destacar que, durante el desarrollo del proyecto, fuimos capaces de
obtener células madre neurales a partir de biopsias humanas de pacientes adultos. Se
observó que tanto los especímenes procedentes de la SVZ como del FT contenían
precursores neurales multipotentes que podían expandirse como neuroesferas y
diferenciarse in vitro. El aislamiento de células de la SVZ humana adulta resultó en una
tendencia heterogénea en la proliferación. Consideramos que una de las razones
principales es que el suministro de material procedente de biopsias humanas de la SVZ
es limitado y varía de un espécimen a otro (Arsenijević et al., 2001). Los datos
derivados de la obtención de células madre, obtenidas a partir de biopsias humanas,
sugieren que es técnica y clínicamente complicado utilizar NSC derivadas de cerebros
humanos adultos para destinarlas a la terapia celular debido al número limitado de
células aisladas y a la dificultad de su expansión in vitro, de acuerdo con los datos
publicados anteriormente (Johansson et al., 1999; Murrell et al., 2013; Nam, 2015;
Stevanato et al., 2009). Es crucial optimizar la expansión de estas células con el fin de
utilizarlas como potenciales herramientas terapéuticas. Por estas razones se planteó un
estudio alternativo. El estudio consistía en estudiar la capacidad del 4-
hidroxitamoxifeno (4-OHT) para inducir la expresión de c-mycERTAM y sus efectos sobre
el crecimiento y la autorrenovación en neuroesferas derivadas de la SVZ de ratón
adulto. De forma resumida, después de realizar este estudio se observó un incremento
moderado en la proliferación y la autorrenovación, condicionada a la adición de 4-OHT.
Según los resultados obtenidos, podemos concluir que la aplicación de la tecnología c-
mycERTAM a neuroesferas adultas es significativamente menos eficaz que los resultados
previos reportados en células madre embrionarias. Se requiere una mayor optimización
e investigación antes de aplicar la inmortalización de estas células en el ámbito clínico.
OB3. Puesta a punto del modelo animal de infarto cerebral
La oclusión transitoria de la arteria cerebral media en rata Wistar se llevó a cabo
mediante la técnica del filamento intraluminal (Zea Longa et al., 1989). Durante el
procedimiento se monitorizaron las siguientes variables: flujo sanguíneo láser Doppler
cortical (PC), presión arterial sistémica (PAS), temperatura corporal, presión parcial de
oxígeno arterial (PaO2), presión parcial de dióxido de carbono arterial (PaCO2), pH
arterial y glucemia.
La oclusión se mantuvo durante 60 minutos, tras los cuales se extrajo una muestra de
sangre arterial (muestra de isquemia) y se retiró el filamento permitiendo la
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reperfusión, que se pone de manifiesto por la recuperación de los valores de PC en el
registro Doppler. Después de 30 minutos de reperfusión, se extrajo una nueva muestra
de sangre arterial (muestra de reperfusión). Finalmente, se extrajo el filamento y el
catéter se introdujo en la arteria femoral, se suturaron las heridas quirúrgicas del
cuello y la pata, y el animal pasó al estabulario con libre acceso al agua y la comida. La
complejidad del modelo de infarto condicionó que varios animales se excluyeran del
estudio.
OB4. Identificación del mejor método de administración celular
Durante el desarrollo del proyecto se intentó seleccionar el mejor método de
administración celular, pensando siempre en la posibilidad de la traslación de nuestros
avances al ámbito clínico (método de administración accesible y mínimamente
invasivo). Con este objetivo, se optó por la administración celular por vía intravenosa.
OB5. Ensayos de migración mediante campos magnéticos
Durante el desarrollo de este proyecto se ha estudiado cómo afectaba la aplicación de
un campo magnético in vitro a las células marcadas con hierro tanto en un medio
acuoso como en un medio similar a la densidad del tejido cerebral, a concentraciones
crecientes de agar. Tras analizar las pruebas hechas en agar, se constató que la
migración a través del tejido estaba muy restringida. Por este motivo se modificó el
concepto de migración por retención celular. Se observó que las células respondían a
los campos magnéticos en medio líquido. Por lo tanto, nuestro objetivo, desde ese
momento, fue retener las rASC que llegaban por el torrente sanguíneo en la región del
infarto. Tampoco se realizaron los ensayos de migración en cultivos organotípicos de
tejido humano adulto radiológicamente normal, debido a las características patológicas
que presentaba la muestra obtenida en quirófano, evidencia patológica de edema y/o
isquemia. Por estos motivos se consideró que no se podían realizar cultivos
organotípicos a partir de muestras de tejido cerebral humano adulto “sano”.
Debido a la complejidad del modelo de infarto, varios animales no pudieron ser
incluidos en el estudio por diferentes variables. En base a ello, el porcentaje de
animales que pudieron aprovecharse en el análisis final se ha visto limitado
(aproximadamente un 20%). Los animales incluidos se desglosaron en tres grupos
experimentales: i) animales control a los que se realizó únicamente el infarto; ii)
animales a los que se realizó un infarto y se les administraron células marcadas con
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hierro, y iii) animales a los que se realizó un infarto y durante la administración de
células marcadas con hierro se aplicó un campo magnético determinado.
La administración endovenosa de las rASC marcadas con hierro se llevó al cabo de 1
hora y 30 minutos de la confirmación de la reperfusión del torrente sanguíneo a la zona
isquémica, a través de una cánula del calibre 24G situada en una de las dos venas
laterales de la cola del animal. Las rASC fueron incubadas previamente con las
nanopartículas de hierro y se resuspendieron a una concentración final de 2,5 × 106
células en 1 mL de tampón fosfato y se inyectaron a través de la cánula a una
velocidad de 250 µL/min.
Para la aplicación del campo magnético, inicialmente se diseñó un sistema que
combinaba dos elementos: por un lado, un electroimán, que era el responsable de la
mayor parte de la fuerza magnética ejercida, y, por otro lado, un casco para la cabeza
del animal con un imán estacionario acoplado, con la intención de focalizar el campo
magnético aplicado mediante el electroimán. Este sistema nos permitió calcular la
fuerza magnética necesaria para retener las células marcadas en el tejido diana. Por
limitaciones en las instalaciones del animalario del Instituto de Investigación Sanitaria
del Hospital la Fe, tuvimos que rediseñar el sistema de aplicación del campo
magnético, sustituyendo el electroimán por dos imanes estacionarios de gran potencia,
que hicimos acoplar al imán estacionario cilíndrico, ejerciendo una fuerza magnética
similar a la obtenida con el electroimán.
OB6. Realización de estudios de resonancia magnética nuclear para detectar
las células administradas y analizar el volumen de las lesiones
Un día después de la reperfusión cerebral de los animales infartados se llevó a cabo el
registro de imagen mediante resonancia magnética (RM) en las instalaciones de la
Plataforma de Imagen Experimental del Instituto de Investigación Sanitaria del
Hospital la Fe. Antes de proceder a la anestesia del animal, se procedió al examen
neurológico. Durante el desarrollo del proyecto se logró optimizar el método de
procesamiento de imagen para la segmentación y extracción automatizada del cerebro
de rata. El registro de imagen incluyó las secuencias T1, T2 y la modalidad ponderada
en T2 (R2*) susceptible a variaciones en la concentración del hierro presente en el
volumen cerebral. Con secuencias anatómicas (T1) y ponderadas en T2 para el estudio
de la sustancia blanca, pudimos detectar el volumen del infarto cerebral y su
localización, conocer el volumen cerebral total y, gracias a ello, calcular el porcentaje
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dentro del volumen cerebral total que suponía la zona lesionada. La modalidad R2* nos
permitió obtener información sobre la distribución del hierro dentro del volumen
cerebral, mediante el estudio del umbral óptimo. Inicialmente se analizó el cerebro
entero, pero estamos en proceso de analizar regiones más delimitadas de la corteza
cerebral para aumentar la sensibilidad y la especificidad de la detección de hierro.
Además, la optimización de esta plataforma para el desarrollo del proyecto ha
permitido la creación de un pipeline que permite insertar el método en una plataforma
de análisis de biomarcadores de imagen establecida en el centro y disponible para
poder ser utilizada por otros de grupos de investigación.
OB7. Análisis histológico
Para cuantificar las células marcadas con hierro alojadas en el tejido cerebral y poder
valorar el efecto de los campos magnéticos durante su administración, se realizó la
tinción de Perls en una serie completa de cada animal. Con una cámara acoplada a una
lupa se fueron tomando fotografías de las secciones y, con la ayuda del programa de
análisis Image J, pudimos calcular el área y el volumen total analizado y la densidad
celular.
Los resultados obtenidos mostraban una clara tendencia, aunque no significativa, al
incremento de la densidad celular en los animales a los que se aplicó el imán durante la
administración de células (test Kruskal-Wallis, p = 0,157).
La falta de significación estadística podía depender de varios factores. Una posibilidad
que contemplamos fue que la heterogeneidad de los volúmenes de infarto entre
individuos dentro de los diferentes grupos podría influir en la cantidad de células que
accedían al tejido a través de la barrera hematoencefálica (BHE). Para probar esta
hipótesis, analizamos la densidad celular y la relación con el porcentaje del volumen
correspondiente al infarto. A igualdad de volúmenes, el imán producía un efecto
amplificador de la llegada de células a la región de interés. Sugiriendo un efecto del
imán no lineal, sino exponencial, debido a que se trataba de un volumen creciente y,
por tanto, la superficie de BHE expuesta aumentaba de manera exponencial.
Paralelamente, se analizó la morfología de las células. Como gold standard morfológico
utilizamos las muestras in vitro y la inyección intracerebral in vivo, que mostraba las
células que no habían estado en contacto con el torrente sanguíneo, ni salido por los
capilares o contactado con el sistema inmunitario. Sin embargo, cuando analizamos las
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células con hierro que provenían de la vía venosa, la morfología se veía gravemente
afectada. El hierro se concentraba en una gran vacuola citoplasmática, y los orgánulos
celulares, incluyendo las membranas citoplasmática y nuclear, parecían ser objeto de
lisis. Curiosamente, rodeando las rASC se encontraba una célula con grandes
expansiones y prominente retículo endoplasmático, típico de células fagocitarias.
Frente a este hallazgo, contemplamos diferentes hipótesis, entre las que se
consideraron: a) la posibilidad del rechazo inmunitario; b) la pérdida de elasticidad del
citoesqueleto por el acúmulo de hierro, o c) la autodestrucción de la rASC en un medio
hostil.
OB8. Estudio clínico y de comportamiento de los animales tratados
Para la valoración neurológica de los animales, se llevó a cabo un examen clínico,
previo al registro de imagen mediante RM, atendiendo los siguientes puntos: 1)
desplazamiento/exploración (0. Normal, 1. Desplazamiento al estimular o no
desplaza); 2) deriva a la izquierda (0. Nunca, 1. Al elevar por la cola, 2. No desplaza);
3) reflejo paracaídas (0. Simétrico, 1. Asimétrico), y 4) sujeción de la pata izquierda
(0. No permite, 1. Permite). Dependiendo de la reacción de los animales en cada
apartado, se asignó una puntuación a cada animal que reflejara el grado de afectación
a nivel motor.
Finalmente, solo se llevó a cabo el análisis de los animales un día después de la
reperfusión cerebral, no se pudo hacer una valoración clínica real de la recuperación
neurológica de los animales en función del grupo experimental. Además, la
considerable variabilidad entre los volúmenes de infarto de los diferentes animales y de
las regiones cerebrales afectadas imposibilitaba establecer una relación directa entre
estos parámetros y el estado clínico del animal.
3. Relevancia y posibles implicaciones
Este proyecto representa una alternativa innovadora en el tratamiento de pacientes
con accidente cerebrovascular con potenciales implicaciones socioeconómicas. Nuestros
resultados pueden contribuir a un mejor conocimiento del comportamiento de las
células madre mesenquimales en el accidente cerebrovascular y en la utilización de
nanopartículas paramagnéticas intracelulares en combinación con los campos
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magnéticos para su captación dentro del tejido cerebral.
La terapia celular se ha utilizado anteriormente para reparar la zona infartada con
resultados alentadores, pero el bajo número de células en llegar y sobrevivir en la zona
afectada ha limitado el éxito de estas aproximaciones. Por estos motivos, nuestro
proyecto resulta una estrategia innovadora basada en terapia celular para guiar las
células madre mesenquimales, consiguiendo que finalmente sean retenidas y
permanezcan alojadas dentro del tejido cerebral, cercanas a la región lesionada.
El trasplante de células madre en modelos de accidente cerebrovascular demuestra que
la traslación de los resultados de la investigación básica al ámbito clínico es una
realidad. Así, nuestros resultados pueden ser utilizados como una herramienta para
futuros ensayos. Por lo tanto, los datos expuestos suponen un paso hacia adelante en
el conocimiento de la terapia celular, un campo con potenciales aplicaciones múltiples
en el ámbito clínico.
4. Bibliografía científica generada
Las publicaciones realizadas derivadas del proyecto financiado se describen a
continuación:
• Durante la última etapa del proyecto se solicitó, a través de la Universidad de
Valencia, una patente con el título Sistema para el direccionamiento de células
hacia regiones internas objetivo de un cuerpo humano o animal, y programa
de ordenador, la cual ha sido aceptada por el Ministerio de Industria, Energía y
Turismo.
• Se ha redactado un manuscrito y enviado a la revista Stem Cell Research
Journal, titulado C-MycERTAM technology fails to expand SVZ-derived mouse
adult neural stem cells, de Marian Vidal-Jorge et al.
• Actualmente se están preparando, para su publicación, 4 artículos científicos:
o Ultrastructural characterization of human adipose-derived mesenchymal
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stem cells upon in vitro expansion: a good practice assessment for future
trials. Manuscrito centrado en la ultraestructura de las células madre mesenquimales
adultas humanas durante su diferenciación a distintos linajes celulares.
o Tailored stereotactic magnetic stem cell targeting into the brain for
neural repair after stroke. Artículo que integra todos los elementos de los que se
compone la terapia celular guiada con campos magnéticos.
o Quality-control of surgically-explanted and postmortem human brain
tissue. A proposal for a core of quality biomarkers for standardization of
normal human brain tissue. Estudio motivado por el bajo éxito en la generación de
cultivos organotípicos de tejido cerebral radiológicamente normal (OB5). El objetivo del
estudio fue evaluar la calidad del tejido cerebral de explantes en una cohorte de
muestras de tejido cerebral humano obtenidos durante determinados procedimientos
neuroquirúrgicos o post mortem de las autopsias clínicas, y proponer un conjunto
básico de indicadores de calidad para optimizar los protocolos metodológicos que
pueden ayudar en la disminución de la variabilidad entre las muestras de cerebro
humano utilizadas para la investigación neurológica.
o Low proliferation dynamics on adult human NSCs. En este trabajo se
resumen los resultados derivados de la expansión in vitro de muestras intraquirúrgicas
de pacientes adultos.
• El proyecto forma parte de las tesis doctorales de las doctorandas Paula García
Belda y Marian Vidal-Jorge. Se prevé el depósito de las tesis doctorales durante el mes
de mayo de este año (2017).
Paralelamente, el desarrollo de este proyecto ha permitido la formación de parte de
nuestro personal de laboratorio implicado en el proyecto en el desarrollo de técnicas de
ingeniería genética, microscopía electrónica de transmisión y cultivo celular primario.
Actualmente, y para el correcto desarrollo del grupo de investigación, la instauración
de estas técnicas es esencial.
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Arsenijevic Y et al.
Isolation of Multipotent Neural Precursors Residing in the Cortex of the Adult Human
Brain.
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Johansson CB et al.
Neural Stem Cells in the Adult Human Brain.
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citat
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Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, Cummins R.
Reversible Middle Cerebral Artery Occlusion without Craniectomy in Rats.
Stroke. 1989: 20(February 1989): 84–91.
Murrell W et al.
Expansion of Multipotent Stem Cells from the Adult Human Brain.
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Adult Human Neural Stem Cell Therapeutics: Current Developmental Status and
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World Journal of Stem Cells. 2015: 7(1): 126.
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Stevanato L et al.
C-MycERTAM Transgene Silencing in a Genetically Modified Human Neural Stem Cell
Line Implanted into MCAo Rodent Brain.
BMC Neuroscience. 2009: 10: 86.