ANEXINA 6 ES NECESARIA PARA LA REGENERACIÓN

HEPÁTICA

Carlos Enrich Bastus

Institut d'Investigació Biomèdica August Pi i Sunyer

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1. Resumen del proyecto

Antecedentes. El hígado tiene un papel central en la homeostasis metabólica de la

glucosa y los lípidos en todo el cuerpo. El trasplante de hepatocitos, una alternativa

clínica menos invasiva y menos exigente para el trasplante de hígado, se está

convirtiendo en un procedimiento factible para la insuficiencia hepática aguda o crónica

y enfermedades metabólicas hereditarias del hígado. El trasplante de hepatocitos

requiere no solo la proliferación de estos hepatocitos para restaurar la masa del hígado

dañado, sino también que mantengan sus funciones fisiológicas. Los claros datos

preliminares que apoyan esta propuesta de investigación demuestran que Anexina A6

(AnxA6), proteína relacionada con la señalización y el transporte de colesterol

intracelular, es una proteína necesaria para la regeneración del hígado, ya que la

supervivencia de ratones AnxA6-/- después de una hepatectomía parcial se reduce

drásticamente.

Objetivos. El objetivo principal de este proyecto es entender las bases moleculares y

celulares de AnxA6 en la regeneración del hígado para mejorar el proceso de trasplante

de hepatocitos a través de la ventaja terapéutica potencial de la expresión temporal de

AnxA6.

Metodología. Hepatectomía parcial en ratones, estudios lipidómicos y proteómicos,

análisis de la expresión génica, microscopía confocal intravital y microscopía electrónica

de barrido con tomografía por field-emission (FE-SEM), estrategias con virus de diseño,

trasplante de hepatocitos de ratón.

Resultados esperados. En las dos últimas décadas la medicina regenerativa ha

demostrado el potencial para la investigación traslacional en entornos clínicos

específicos. Anexina A6 puede desempeñar un papel crucial en el metabolismo del

colesterol y en la respuesta de la proliferación hepática. El impacto potencial que se

espera de esta investigación es aclarar los mecanismos celulares que conducen a la

regeneración del hígado en el trasplante hepático a partir de donante vivo, para

aportar nuevos conceptos y procedimientos para mejorar la expectativa de vida y

evitar complicaciones clínicas.

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2. Resultados

El presente proyecto intenta entender la base molecular y la función celular de Anexina

A6 (AnxA6) in vivo en el proceso de regeneración hepática para mejorar el

procedimiento de trasplante de hepatocitos gracias a la potencial ventaja terapéutica

de la sobreexpresión temporal de AnxA6.

Este proyecto se dividió en dos secciones con objetivos y aproximaciones específicos.

En primer lugar nos propusimos estudiar el mecanismo de acción de AnxA6 en el

hígado, analizando tanto la regeneración hepática y la progresión en el ciclo celular, y

el mantenimiento del metabolismo hepático mediante la hepatectomía parcial en

animales salvajes (wild type o WT) y animales genoanulados para AnxA6 (AnxA6-/-). En

segundo lugar, y basándonos en el conocimiento obtenido en el primer objetivo,

propusimos expresar AnxA6 recombinante utilizando partículas víricas adenoasociadas

(rAAV) como potencial ventaja terapéutica en el trasplante hepático o de hepatocitos.

Los resultados obtenidos durante el desarrollo del proyecto (véase más adelante) han

inducido cambios en la lógica de los objetivos del proyecto que fueron aprobados

posteriormente por La Marató.

Los ratones genoanulados para AnxA6 mueren tras la hepatectomía parcial

Para estudiar el papel de AnxA6 en el hígado realizamos la resección (hepatectomía

parcial, PHx) del 70% de la masa hepática para inducir un estrés hepático agudo de

tipo proliferativo y metabólico. Curiosamente, y a diferencia de lo que ocurre con los

ratones WT, los ratones AnxA6-/- presentan una alta mortalidad y solo el 22% de los

animales sobreviven 72 horas después de la PHx (figura 1A).

El análisis de la expresión génica de cJun y cFos en el hígado tras la PHx, genes

activados durante la fase de activación de los hepatocitos tras la lesión del hígado, no

mostró diferencias entre ratones WT y AnxA6-/- (figura 1B). La incorporación de 3H-

timidina al DNA hepático no mostró diferencias en la cinética de la síntesis de DNA

entre ratones WT y AnxA6-/- (figura 1C). Estos datos sugieren que, aunque casi el 80%

de los ratones AnxA6-/- mueren tras la PHx, esta baja supervivencia no se debe a un

proceso de proliferación deficiente post-PHx, sino a una disfunción relacionada con el

metabolismo.

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La función metabólica del hígado comprende la regulación de diferentes procesos, tales

como la homeostasis del colesterol, de lípidos y de glucosa, la síntesis de bilis..., entre

otros. Para evaluar la función de AnxA6 en el metabolismo del hígado se midieron los

niveles de glucosa en sangre en ratones WT y AnxA6-/- tras la PHx (figura 2A). Durante

las primeras 24 horas de regeneración, los niveles de glucosa en sangre caen

rápidamente debido a la pérdida de la masa hepática funcional. Sin embargo, durante

las siguientes 48 horas los hepatocitos remanentes restauran eficazmente la glucemia

para permitir la supervivencia de los animales y la regeneración de la masa hepática

original en 7 días.

Figura 1. (A) Supervivencia de ratones WT y AnxA6-/- post-PHx. (B) Expresión hepática de los genes

cJun y cFos a 0, 1 y 6 horas post-PHx en ratones WT y AnxA6-/-. (C) Incorporación de 3H-timidina en

DNA hepático de ratones WT i AnxA6-/- post-PHx.

En ratones AnxA6-/-, sin embargo, los hepatocitos remanentes no pueden restaurar los

niveles de glucosa en sangre y probablemente esto causa su muerte. Para averiguar la

dependencia a la glucosa de la supervivencia de los ratones tras la PHx, tanto ratones

WT como AnxA6-/- fueron alimentados con agua suplementada con 10% de glucosa 24

horas antes y durante la recuperación de la hepatectomía. Curiosamente, la

suplementación con glucosa rescató completamente la supervivencia de los ratones

AnxA6-/- tras la PHx (figura 2B). Aunque la glucosa circulante en sangre fue

significativamente menor en ratones AnxA6-/- durante las primeras 12 horas, a partir

de este punto la glucemia aumentó paulatinamente hasta niveles similares a los

animales WT después de 24 horas (figura 2C).

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Figura 2. (A) Niveles de glucosa en sangre en ratones WT y AnxA6-/- tras la PHx. (B) Supervivencia

de ratones WT y AnxA6-/- alimentados con agua suplementada con glucosa tras la PHx. (C) Niveles de

glucosa en sangre en ratones WT y AnxA6-/- alimentados con agua suplementada con glucosa tras la

PHx.

La expresión de AnxA6 recombinante en el hígado restaura la supervivencia

de ratones AnxA6-/-

Este proyecto tuvo como objetivo mejorar el procedimiento de trasplante de

hepatocitos mediante el uso de la potencial ventaja terapéutica de la sobreexpresión

temporal de AnxA6 en hígado. Para conseguir este objetivo, producimos partículas

virales adenoasociadas recombinantes (rAAV) del serotipo hepático-específico 8 y

expresando AnxA6 (rAAV8-AnxA6), o la proteína fluorescente verde (rAAV8-GFP) como

control, bajo la regulación del promotor de la albúmina, específico de hígado. Se

observó la expresión de ambas proteínas en hígado de ratón, consiguiendo niveles

fisiológicos de AnxA6 recombinante en hígados de ratones AnxA6-/- (figura3A).

Figura 3. (A) Expresión hepática de GFP o AnxA6 recombinantes en ratones WT o AnxA6-/- usando

partículas rAAV8. (B) Supervivencia de ratones WT y AnxA6-/- tras la PHx al utilizar rAAV8-GFP o

rAAV8-AnxA6.

La infección de ratones AnxA6-/- con partículas virales rAAV8-AnxA6 restaura su

supervivencia tras la PHx, mientras que la expresión de GFP (rAAV8-GFP) es incapaz

de hacerlo (figura 3B), mostrando el rescate del fenotipo AnxA6-/- durante la

regeneración hepática.

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A pesar de que el beneficio terapéutico de la expresión hepática de AnxA6 durante los

procesos de regeneración del hígado es factible, la suplementación del agua de bebida

con glucosa representa una mejora sencilla y menos invasiva que la infección viral. Así,

se trató de averiguar la función de AnxA6 relacionada con el metabolismo de la glucosa

en el hígado.

Metabolismo de la glucosa en ratones AnxA6-/-

A continuación caracterizamos el metabolismo de la glucosa en ratones AnxA6-/-.

Ratones WT y AnxA6-/- fueron privados de comida y la concentración de glucosa en

sangre se midió a diferentes tiempos. Curiosamente, a diferencia de los ratones WT,

que mostraron una glucemia relativamente constante durante las primeras 12 horas de

ayuno, los ratones AnxA6-/- mostraron una rápida y marcada hipoglucemia (figura 4A).

Para descartar un fenotipo de diabetes en estos ratones, se realizaron test de

tolerancia a la glucosa (figura 4B) y a la insulina (figura 4C). Los ratones AnxA6-/-

presentaron una respuesta idéntica a los animales WT, lo que demuestra que los

mecanismos que regulan la absorción sistémica de glucosa y la señalización de la

insulina no se ven afectados en los ratones AnxA6-/-.

Figura 4. (A) Niveles de glucosa en sangre en ratones WT y AnxA6-/- durante el ayuno. (B) Test de

tolerancia a la glucosa en ratones WT y AnxA6-/-. (C) Test de tolerancia a la insulina en ratones WT y

AnxA6-/-. (D) RER durante el ciclo diario de luz-oscuridad en ratones WT y AnxA6-/-. (E) Oxidación de

la glucosa durante el ciclo diario de luz-oscuridad en ratones WT y AnxA6-/-. (F) Oxidación de los

lípidos durante el ciclo diario de luz-oscuridad en ratones WT y AnxA6-/-.

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Para caracterizar mejor el metabolismo de la glucosa in vivo, ratones WT y AnxA6-/-

fueron analizados individualmente en jaulas metabólicas durante 30 horas y la tasa de

intercambio respiratorio (respiratory exchange ratio, RER), que refleja la tasa de gasto

de energía, se midió cada 20 min (figura 4D). Curiosamente, durante las últimas 6

horas del ciclo de luz, cuando los animales están predominantemente en un estado de

ayuno, los ratones AnxA6-/- mostraron una RER reducida. Conforme a un fenotipo de

hipoglucemia, durante este periodo de ayuno voluntario los ratones AnxA6-/-

demostraron un consumo de glucosa reducido (figura 4E). En cambio, durante el

mismo periodo el consumo de lípidos fue significativamente mayor en los ratones

AnxA6-/- (figura 4F), reflejando la activación de mecanismos alternativos de producción

de energía como respuesta a la hipoglucemia.

En resumen, estos datos muestran que los ratones AnxA6-/- tienen dificultades para

mantener los niveles de glucosa en la sangre durante el ayuno, que son más bajos

incluso en su ayuno diario voluntario, y sugieren que la glucogenólisis o la

gluconeogénesis están afectadas en estos ratones. Curiosamente, los ratones AnxA6-/-

queman lípidos eficientemente cuando se requiere energía.

AnxA6 es esencial para la gluconeogénesis hepática dependiente de alanina

A continuación se investigaron los mecanismos celulares afectados por la ausencia de

AnxA6 responsables de causar la hipoglucemia en ratones AnxA6-/-. Se analizó el

metabolismo del glucógeno; la fuente hepática de glucosa rápidamente movilizada

durante la hipoglucemia. Sorprendentemente, la cantidad de glucógeno almacenado en

animales alimentados fue significativamente mayor en los ratones AnxA6-/- que en los

WT (figura 5A), sugiriendo la probable existencia de mecanismos compensatorios en el

fondo genéticos de los ratones AnxA6-/-. Sin embargo, durante el ayuno los ratones WT

y AnxA6-/- movilizan rápidamente sus reservas de glucógeno (figura 5A),

demostrándose que la glucogenólisis se produce de manera eficiente en los ratones

AnxA6-/- y sugiere que la hipoglucemia es causada por deficiencias en fuentes de

glucosa alternativas al glucógeno.

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Figura 5. (A) Niveles de glucógeno hepático en ratones WT y AnxA6-/- durante el ayuno. (B) Test de

tolerancia al piruvato en ratones WT y AnxA6-/-. (C) Test de tolerancia a la alanina en ratones WT y

AnxA6-/-. (D) Producción de glucosa por hepatocitos primarios aislados de ratones WT y AnxA6-/-. (E)

Niveles de alanina hepática en ratones WT y AnxA6-/- alimentados y en ayuno. (F) Niveles de alanina

en plasma en ratones WT y AnxA6-/- alimentados y en ayuno. (G) Niveles de glutamina en hígado en

ratones WT y AnxA6-/- alimentados y en ayuno.

Además de la glucogenólisis, en respuesta a la hipoglucemia el hígado activa la

producción de glucosa de novo (gluconeogénesis, GNG) a partir de la conversión de

sustratos de carbono no-carbohidrato como piruvato, glutamina y alanina. Para

analizar si la GNG hepática no es funcional en ausencia de AnxA6, cuantificamos los

niveles de glucosa en sangre durante tests de tolerancia al piruvato (figura 5B),

glutamina (datos no mostrados) o alanina (figura 5C) in vivo. No se observaron

diferencias significativas en la producción de glucosa cuando el piruvato o la glutamina

fueron administrados como sustrato gluconeogénico. Sin embargo, los ratones AnxA6-/-

fueron incapaces de sintetizar glucosa a partir de alanina (figura 5C), sugiriendo un

deterioro del ciclo glucosa-alanina (ciclo de Cahill).

El ciclo de la glucosa-alanina supone una serie de reacciones en las que la alanina

producida en el músculo por la necesidad de energía del organismo es transportada al

hígado para ser convertida en piruvato, donde pasa a glucosa a través de la GNG. Por

lo tanto, analizamos si la reducida GNG dependiente de alanina observada en ratones

AnxA6-/- es producida por un defecto hepático. Hepatocitos primarios fueron aislados

de hígados de ratones WT y AnxA6-/-, que ayunaron durante 6 horas para agotar sus

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reservas de glucógeno. El producto de la GNG hepática se midió como la concentración

de glucosa liberada al medio en respuesta a la incubación con piruvato, glutamina,

lactato o alanina (figura 5D). De forma idéntica a los resultados apreciados in vivo, no

se observaron diferencias significativas en los niveles de glucosa secretada con

piruvato, lactato o glutamina como sustratos. No obstante, los hepatocitos AnxA6-/-

eran incapaces de producir glucosa a partir de alanina (figura 5D), confirmando así que

AnxA6 es esencial para la GNG dependiente de alanina que se da en hepatocitos.

Al analizarse los niveles de alanina y glutamina en plasma y en extractos de hígado

(figura 5E-5G), se observó una reducción de los niveles de glutamina debido a su

consumo como sustrato para la GNG, tanto en ratones WT como AnxA6-/-. En cambio,

la alanina hepática no se reducía durante el ayuno en ratones AnxA6-/-.

Captación de alanina hepática en ratones AnxA6-/-

A continuación se estudiaron los mecanismos moleculares regulados por AnxA6 y

esenciales para la metabolización hepática de la alanina. Dado que la expresión de las

dos isoformas de alanina aminotransferasa hepática, enzimas que metabolizan la

alanina captada a piruvato en respuesta al ayuno, se expresan igualmente en hígados

de ratones WT y AnxA6-/- (datos no mostrados), hipotetizamos que la explicación más

plausible para el problema gluconeogénico inducido por la falta de alanina dependiente

de AnxA6 era por una reducción en la captación hepática de este aminoácido. Para

comprobarlo, hepatocitos primarios aislados de hígado de ratones WT y AnxA6-/- fueron

incubados con alanina marcada radiactivamente y se midió la captación celular de este

aminoácido (figura 6A). En fuerte contraste con los hepatocitos WT, los hepatocitos

AnxA6-/- eran incapaces de internalizar alanina. Además, a nivel fisiológico los ratones

AnxA6-/-, en contraste con los ratones WT, no reducen los niveles circulantes de alanina

durante el ayuno, sugiriendo una menor utilización de la alanina después del ayuno

(figura 5F). Estos resultados demuestran que en ratones AnxA6-/- la deficiente

captación hepática de alanina causa una reducción concomitante de la GNG y una

hipoglucemia sostenida.

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Figura 6. (A) Captación de 14C-L-alanina en hepatocitos primarios de ratones WT y AnxA6-/-. (B)

Expresión de SNAT2 en membrana plasmática sinusoidal hepática aislada de ratones WT y AnxA6-/-

alimentados y en ayuno.

La alanina es internalizada por las células a través de transportadores de aminoácidos

neutros acoplados a sodio (sodio-coupled neutral amino acid transporters o SNAT), y

SNAT2 es la isoforma más abundante en hígado. La expresión relativa del mRNA de

SNAT2 incrementa durante el ayuno de forma similar en hígado de ratones WT y

AnxA6-/- (datos no mostrados). Además, análisis de western blot utilizando anticuerpos

específicos mostraron que los niveles de proteína también eran similares en hígado de

ratones WT y AnxA6-/- alimentados y en ayuno (figura 6B). No obstante, cuando la

membrana hepática sinusoidal fue aislada de hígado de ratones WT y AnxA6-/-

alimentados y en ayuno, una menor cantidad del transportador SNAT2 se traslocaba a

la membrana plasmática sinusoidal de ratones AnxA6-/- en ayuno (figura 6B). Estas

evidencias sugieren que AnxA6 no afecta a la captación de alanina a niveles de

expresión de su transportador, sino en la traslocación de SNAT2 a la membrana

sinusoidal.

3. Relevancia y posibles implicaciones

Los resultados producidos en este proyecto demuestran que AnxA6 es una proteína

esencial para la regeneración hepática y para la gluconeogénesis dependiente de

alanina. Hemos mostrado que AnxA6 regula el tráfico intracelular (y quizás también la

actividad) de al menos el transportador SNAT2. Cuando AnxA6 es deplecionada, hay

menos traslocación de SNAT2 en la membrana plasmática sinusoidal hepática, lo que

induce un déficit energético al individuo. Esta marcada bajada en las cantidades de

SNAT2 en la membrana plasmática sinusoidal conlleva una reducción de la captación

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de alanina en el hígado, produciéndose así una bajada de la GNG hepática durante la

regeneración hepática o durante la adaptación al ayuno.

Los datos obtenidos en este estudio señalan la importancia del metabolismo de la

glucosa durante la regeneración del hígado, enfatizando la necesidad de cuidar el

estado energético del paciente después de una resección del hígado o de un daño

hepático grave. Así, la administración oral de glucosa podría representar una clara

mejora en la recuperación de un daño hepático grave, al mantener los niveles de

glucosa en sangre con independencia de la función hepática.

Este proyecto ha permitido producir nuevo conocimiento en la función de AnxA6 y de

su papel en la regeneración hepática y en el metabolismo hepático de la glucosa.

Además, nos ha permitido el desarrollo de nueva tecnología como la expresión no

estable de proteínas recombinantes inducidas por un virus en el hígado, y la formación

de dos estudiantes de doctorado en nuestro laboratorio. Los resultados de este

proyecto de investigación están en proceso de publicación en revistas científicas de alto

impacto.

4. Bibliografía científica generada

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