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ESTUDIO DEL MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS
ANTIINFLAMMATORIOS NO ESTEROIDEOS EN LA
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER: PAPEL DE LAS RHO-GTPASAS
Investigadores principales:
Dra. Elena Galea Rodríguez de Velasco
Institut de Neurociències UAB
Dra. Agustina Garcia Sanchez
Facultat de Biociències UAB
Dr. Vicente Felipo Orts
Centro de Investigación Príncipe Felipe de Valencia
Duración: 3 años
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1. Resumen
Numerosos estudios epidemiológicos han establecido que el tratamiento con
fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) reduce el riesgo de sufrir la
enfermedad de Alzheimer, pero el mecanismo de acción sigue siendo
controvertido. La hipótesis general de este proyecto ha sido que la familia de
la Rho-GTPasa que controla la dinámica del citoesqueleto es una diana molecular
de los AINEs en el cerebro y que los AINEs protegen de la enfermedad de
Alzheimer a través de las Rho-GTPasas reduciendo la inflamación crónica y
mejorando la plasticidad sináptica. El proyecto presentó como novedades que
las alteraciones del citoesqueleto de actina tienen un papel en las enfermedades
neurodegenerativas, y que los AINEs pueden regular la plasticidad sináptica,
papel independiente de sus efectos antiinflamatorios por acción de la
ciclooxigenasa. El estudio ha representado el esfuerzo conjunto de tres grupos
para analizar el papel de las Rho-GTPasas en la protección por acción de los
AINEs. El subproyecto 1 ha tenido como objetivo caracterizar la interacción
entre los AINEs y las Rho-GTPasas (Rho, Rac, Cdc42) en la reactividad
inflamatoria de los astrocitos y la microglia. Se han modulado las actividades de
Rho-GTPasa en cultivos de forma farmacológica, o de forma molecular a través
de infección con adenovirus que contienen formas “doble negativas” o
“constitutivamente activas” de las Rho-GTPasas. El hallazgo clave de este
subproyecto es que un AINE de uso extendido como el ibuprofeno, y nuevos
derivados de los profenos, como R-flurbiprofeno y CHF5074, alteran la dinámica
del citoesqueleto en astrocitos, y que en la señalización intracelular intervienen
RhoA, Cdc42, PAK y ERK. En el subproyecto 2 hemos examinado si el AINE
ibuprofeno modula la LTP (expresión funcional de la plasticidad sináptica) en
cortes del hipocampo. El hallazgo principal es que el ibuprofeno restablece el
deterioro de la LTP en el hipocampo inducido por el amiloide beta a través de la
activación de la fosforilación dependiente del GMP cíclico de los receptores AMPA
en la sinapsis. El subproyecto 3 ha tenido como objetivo completar el análisis
de la plasticidad sináptica observando la remodelación neuronal en cultivos y
caracterizando la expresión de Rho-GTPasas en cerebros de personas que sufren
la enfermedad de Alzheimer, y en ratones que sobreexpresan la proteína
precursora amiloide (APP). Hemos observado que la RhoA se expresa
principalmente en terminaciones axónicas de las neuronas glutamatérgicas, y
que esta expresión se ve gravemente alterada en los cerebros de modelos
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animales y en los humanos, en los que los ovillos neurofibrilares conteniendo tau
parecen secuestrar a la RhoA. A grandes rasgos, el proyecto confirma la hipótesis
inicial de que los AINES tienen dianas alternativas a las ciclooxigenasas, y amplía
la mencionada hipótesis para concluir que existen diferentes acciones y vías de
señalización en astrocitos y neuronas. En los astrocitos, los AINEs podrían
regular la polaridad celular y el movimiento dirigido, mientras que en las
neuronas los fármacos podrían controlar la plasticidad dependiente de la
actividad. Ello es relevante por el siguiente motivo: según un análisis combinado
de todos los datos epidemiológicos, los AINEs ofrecen una protección media del
58%. Si se traduce esta cifra en número de pacientes, los AINEs se afianzan
como tratamiento preventivo que engloba nuevos mecanismos
multifuncionales y multicelulares en su modus operandi.
2. Resultados
Regulación independiente de la secretasa y dependiente de
RhoGTPasa/PAK/ERK de la dinámica del citoesqueleto
Fundamentos. Los profenos como ibuprofeno, R-flurbiprofeno o CHF5074 son
considerados para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer porque hay
datos epidemiológicos que indican que los AINEs protegen contra la
neurodegeneración. Las RhoGTPasas son proteínas G pequeñas que incluyen
RhoA, Cdc42 y Rac1 y controlan la dinámica del citoesqueleto. Dado que el
ibuprofeno estimula el crecimiento axónico por medio de RhoA en las neuronas,
hemos examinado si los profenos modulan la plasticidad de los astrocitos a
través de RhoGTPasas, en concreto si producen cambios morfológicos llamados
estelación, y movimiento en un corte (ensayo scratch wound) en cultivos
primarios de astrocitos.
Resultados. El ibuprofeno (100-500 µM), R-flurbiprofeno (100-500 µM) y
CHF5074 (10-30 µM) causan estelación en los astrocitos en cultivos primarios,
dependiente de la concentración, y asociada con la reorganización de GFAP y de
filamentos de actina (véase figura 1). La estelación es independiente de COX2
o secretasas si se juzga por la falta de efecto de los inhibidores de estas
enzimas. RhoA, PAK y Cdc42, pero no Rac1, median la estelación, según las
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conclusiones de los análisis conjuntos de actividades y experimentos de
inhibición con manipulaciones farmacológicas o adenovirales. El ibuprofeno
aceleró la migración en un ensayo scratch wound, mientras que R-flurbiprofeno
no tuvo ningún efecto y el CHF5074 causó desaceleración. La regulación de la
polaridad celular por Cdc42 y ERK1/2 puede mediar los efectos paradójicos de los
profenos sobre la migración.
Conclusiones:
• El ibuprofeno y los derivados del ibuprofeno sobre los que se ha
investigado activamente en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer
regulan la dinámica del citoesqueleto en astrocitos, de forma
independiente de secretasas, COX y PPAR y dependiente de RhoGTPasa,
PAK y ERK.
• Mientras que todos los profenos producen
estelación, se han observado diferentes
acciones en la migración: el ibuprofeno (y
otros AINEs de uso habitual, como el
naxopreno o la indometacina) aceleró la
migración, pero el profeno nuevo CHF5074
causó cambios en la polaridad
concomitante con una reducción de la
activación de las ERK.
Figura 1. Los profenos causan estelación y desorganización del citoesqueleto de actina en cultivos de astrocitos. En rojo, los astrocitos están teñidos para la GFAP, y en verde para el citoesqueleto de actina.
Figura 2A. Modelo estelación
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• La figura 2 (A y B) muestra una representación esquemática de posibles
dianas de los profenos en la estelación y la migración. En resumen, para la
estelación proponemos que los profenos inducen desajustes del
citoesqueleto por acciones concertadas sobre RhoA, Cdc42 y PAK, que
convergen en la inhibición de MLCK. Una idea clave respecto a la
migración es que las diferencias entre los profenos pueden proceder del
grado de activación de ERK1/2 que actúa sobre la señalización de las
RhoGTPasas, regulando polaridad y movimiento de forma
compartimentada.
• Puesto que la migración es un
rasgo distintivo de la
respuesta de los astrocitos
durante la inflamación,
proponemos que, además (o
en lugar) de disminuir la Aβ 42
por medio de secretasas,
algunos AINEs pueden
prevenir la enfermedad de
Alzheimer modulando la
reactividad de los astrocitos a
través de una señalización
dependiente de
RhoGTPasa/PAK/ERK. Pendiente de una evaluación in vivo, los datos
ponen en duda el derivado nuevo CHF5074, ya en fase 2, que parece
reducir las capacidades migratorias de los astrocitos.
El ibuprofeno restablece la deficiencia en la potenciación a largo
plazo (long-term potentiation) causada por beta-amiloide
regulando vías dependientes de GMP cíclico.
Fundamentos. El amiloide rápidamente daña a la LTP y las funciones cognitivas
en ratas. Los objetivos de este estudio eran evaluar si el ibuprofeno previene y/o
restablece las deficiencias inducidas por el amiloide en cortes del hipocampo y
analizar el papel de la vía del NO y de la proteína GMP cíclica cinasa G, que
estudios previos llevados a cabo por el grupo del Dr. Felipo implicaban en la LTP,
Figura 2B. Modelo migración
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así como las fosforilaciones del receptor AMPA como nuevo mecanismo asociado
a la LTP.
Resultados. El amiloide reduce la activación de la guanilato ciclasa inducida por
tétanos y el aumento del GMP cíclico, previniendo la activación de la proteína
cinasa G, la fosforilación de GluR1 en Ser845 y la translocación de receptores en
las membranas sinápticas, responsable de la deficiencia de la LTP causada por el
amiloide. El ibuprofeno previene la deficiencia en la LTP (véase la figura 3),
restableciendo la activación y el aumento de la guanilato ciclasa dependiente de
GMP cíclico y, por tanto, la activación de la proteína cinasa G, la fosforilación de
GluR1 en Ser845 y la expresión sináptica de los receptores AMPA. El análogo de
GMP cíclico, 8BrcGMP, imitó el efecto del ibuprofeno y restableció la LTP. Medidas
de la activación de RhoA evaluando la translocación a membrana revelaron
cambios posteriores de la enzima, lo cual indica que la implicación de RhoA, de
existir, tiene lugar durante el mantenimiento y no en el origen de los efectos
reconstituyentes.
Conclusiones:
• La fosforilación de los AMPA es una diana downstream de vías
dependientes de GMP cíclico y NO, estimuladas por la LTP.
• La fosforilación alterada de receptores AMPA es la base del daño a la LTP
causado por amiloide beta, lo cual es coherente con deficiencias generales
en vías de GMP cíclico.
• El ibuprofeno invierte el efecto centrándose en la señalización dependiente
del GMP cíclico. El mecanismo exacto de actuación parece ser muy
upstream, dado que la exposición a AINEs restablece el daño del amiloide
en todos los pasos estudiados, desde la activación de la proteína cinasa G
hasta la activación de la fosforilación de los AMPA.
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Figura 3. El ibuprofeno restablece la bajada de la LTP ocasionada por la proteína amiloide.
Distribución alterada de la RhoA en la enfermedad de Alzheimer
Fundamentos. Las RhoGTPasas controlan la dinámica del citoesqueleto, y por lo
tanto modulan la plasticidad sináptica. Puesto que la enfermedad de Alzheimer
se caracteriza por una disfunción sináptica, hemos determinado si la expresión,
la actividad o la localización de las GTPasas RhoA, Rac1 y Cdc42, así como de
p21-PAK, una diana downstream de Rac1/Cdc42, estaban alteradas en ratones
AbetaPP Tg2576 de 18 meses (mutación sueca) o en cerebros de pacientes con
la enfermedad de Alzheimer. El análisis se amplió a cerebros con la enfermedad
de Pick, trastorno neurodegenerativo caracterizado por la acumulación de la
proteína tau hiperfosforilada. Las técnicas usadas fueron inmunohistoquímica
simple, inmunofluorescencia doble y microscopía confocal, microscopía
electrónica y análisis de transferencia de proteínas entre fracciones citosólicas y
de membrana para evaluar la translocación como indicio de cambios en la
actividad de las GTPasas.
Resultados. Análisis
inmuno-histoquímicos con
marcadores subcelulares
revelaron una localización
definida de cada
RhoGTPasa. Se detectó
RhoA en terminaciones
axónicas glutamatérgicas
y en espinas dendríticas
Figura 4. Tinción de RhoA en hipocampo de cerebros con Alzheimer (AD) o la enfermedad de Pick (PiD) mostrando colocalización con los ovillos neurofibrilares.
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de neuronas piramidales. Rac 1 se encontró mayoritariamente en astrocitos,
mientras que Cdc42 se localizó en sinapsis altamente concentradas en cuerpos
neuronales del córtex y del hipocampo. La asociación de la RhoA con sinápsis y
microtúbulos dendríticos se confirmó por medio de microscopia electrónica. En
ratones AbetaPP, la expresión de la RhoA disminuyó en las sinapsis y aumentó
en los axones distróficos, lo que podría sugerir una distribución subcelular
alterada para la RhoA. En cerebros post mortem con la enfermedad de
Alzheimer, la inmunotinción de RhoA disminuyó en el neuropilo, y aumentó
considerablemente en neuronas, colocalizando con inclusiones de tau
hiperfosforilada, como si los ovillos neurofibrilares secuestraran a la RhoA
(Figura 4). Además, la proteína RhoA disminuyó en el hipocampo cerebral de
cerebros con Alzheimer, reflejando una pérdida de la GTPasa en la forma de
membrana, presumiblemente activa. La RhoA colocalizó con la tau
hiperfosforilada en la enfermedad de Pick, sugiriendo de nuevo que la
distribución subcelular alterada de la RhoA es un rasgo de la neurodegeneración.
No se observaron cambios inmunohistoquímicos importantes para Rac1, Cdc42, o
p21-PAK.
Conclusiones:
• Este estudio aporta nueva información sobre la distribución celular e
intracelular de Rho, Rac1 y Cdc42. A pesar de la existencia de pruebas de
que las Rho-GTPasa regulan la plasticidad sináptica in vitro, no se han
realizado estudios que traten de la localización celular in vivo. La presencia
de RhoA en elementos postsinápticos es coherente con la visión
predominante de que la RhoA induce la estabilidad de las espinas
dendríticas. Por el contrario, la presencia de RhoA en terminaciones
excitatorias presinápticas sugiere el nuevo concepto de que la RhoA puede
regular la secreción de glutamato en el cerebro de los mamíferos. También
es una novedad la localización de la RhoA en las dendritas, asociada a los
microtúbulos, confirmada en el microscopio electrónico. A grandes rasgos,
parece que la señalización dependiente de la RhoA es un regulador
negativo de la polimerización de los microtúbulos, lo que concuerda con la
capacidad documentada de la RhoA de suspender el crecimiento de los
axones. Finalmente, a través del microscopio electrónico se ha hallado
RhoA en cuerpos nucleares y membranas mitocondriales, circunstancia
que sugiere papeles independientes del citoesqueleto de la GTPasa
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pequeña en el cerebro. Por el contrario, Rac1 o Cdc42 no colocalizaron con
marcadores de terminaciones axónicas. Rac1 se extiende por todas partes
en un patrón de grano fino en astrocitos, como si tuvieran un papel
general en esas células, quizás relacionado con el control del estrés
oxidativo. La localización de Cdc42, finalmente, sugirió el control de las
sinapsis inhibitorias.
• Los resultados combinados obtenidos en cerebros de humanos y de
ratones conducen a la conclusión de que la RhoA cambia de las sinapsis a
los microtúbulos, consideración que concuerda con la noción de que la
distribución subcelular de esta proteína está alterada en la patología de
Alzheimer.
3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales
obtenidos
Un hecho muy preocupante de la enfermedad de Alzheimer es que todos
los ensayos clínicos (hasta 20) con fármacos que modifican la enfermedad
han fracasado en los últimos años. La explicación más aceptada es que
ese fracaso se debe a que los fármacos se han administrado demasiado
tarde, cuando el daño cerebral está muy avanzado y es, quizás,
irreversible. Así pues, cada vez hay mayor consenso relativo al hecho de
que la enfermedad de Alzheimer va progresando durante muchos años sin
manifestaciones clínicas (algunos autores indican que puede llegar a ser
durante 20 años) antes de que se manifieste la demencia. Esto refuerza la
opinión de que los tratamientos se tendrían que aplicar de forma
preventiva a personas que están en camino de contraer la enfermedad de
Alzheimer.
Según los datos epidemiológicos, y un reciente ensayo de prevención
primaria (ADAPT), los AINEs ofrecen un alto grado de protección contra la
enfermedad de Alzheimer. De hecho, son el único tratamiento que ha
mostrado beneficios preventivos. Por lo tanto, hay que prestar atención a
los AINEs mediante la adopción de dos medidas: 1) se tienen que llevar a
cabo más ensayos de prevención primaria para apoyar las conclusiones de
los datos epidemiológicos, y 2) se tiene que descubrir el mecanismo de
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acción de los AINEs, ya que hay indicios acumulativos que indican que la
diana convencional de los AINEs, la ciclooxigenasa, no está implicada.
El proyecto financiado por la Fundació La Marató de TV3 ha potenciado el
conocimiento sobre el uso de los AINEs para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer y ha revelado nuevas dianas funcionales y
moleculares. A grandes rasgos, los resultados indican que los AINEs
pueden modular la migración de los astrocitos y la plasticidad sináptica, y
que la señalización incluye Rho-GTPasas y/o vías dependientes de GMP
cíclico.
Es digno de mención que algunos de los conceptos y los resultados
mencionados previamente han sido confirmados por otros laboratorios o
por investigación paralela de grupos de La Marató de TV3.
o La evidencia de que los AINEs pueden fomentar la regeneración
axónica a través de la inhibición de la RhoA (Fu et al., J Neuroscience
27:4154-4164) apoya nuestras observaciones de que la RhoA está
asociada físicamente con los microtúbulos y, además, que el secuestro
por parte de ovillos neurofibrilares es un rasgo distintivo de la
enfermedad de Alzheimer.
o La evidencia de que el ibuprofeno invierte la LTP (Kotilinek et al., Brain
131, 651-664, 2008) es perfectamente coherente con nuestras
observaciones, que muestran, además, la implicación del GMP cíclico.
o El grupo de la Dra. Agustina García ha mostrado los beneficios
terapéuticos de aumentar los niveles de GMP cíclico en la
neurodegeneración (Pifarré P, et al. Cyclic GMP phosphodiesterase
inhibition alters the glial inflammatory response, reduces oxidative
stress and cell death and increases angiogenesis following focal brain
injury. J Neurochem. 112:807-17, 2010; Pifarré et al., Sildenafil
(Viagra) ameliorates clinical symptoms and neuropathology in a mouse
model of multiple sclerosis. Acta Neuropathol. 2011 Jan 15. [en
prensa]).
o El grupo del Dr. Felipo ha mostrado los beneficios terapéuticos del
ibuprofeno en la encefalopatía hepática (Cauli et al., Hepatology.
200746:514-9, 2007).
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4. Publicaciones
Huesa G, Baltrons MA, Gómez-Ramos P, Morán A, García A, Hidalgo J, Francés S,
Santpere G, Ferrer I, Galea E.
Altered distribution of RhoA in Alzheimer's disease and AbetaPP overexpressing
mice.
J Alzheimers Dis. 19:37-56, 2010. IF 3,83 5-year IF 4,81
Monfort P, Felipo V.
Amyloid-β impairs, and ibuprofen restores, the cGMP pathway, synaptic
expression of AMPA receptors and long-term potentiation in the hippocampus.
J Alzheimers Dis. 22:795-809, 2010. IF 3,83 5-year IF 4,81
Lichtenstein MP, Carriba P, Baltrons MA, Wojciak-Stothard B, Peterson JR, García
A, Galea E.
Secretase-independent and RhoGTPase/PAK/ERK-dependent regulation of
cytoskeleton dynamics in astrocytes by NSAIDs and derivatives.
J Alzheimers Dis. 22:1135-55, 2010. IF 3,83 5-year IF 4,81
Lichtenstein MP, Carriba P, Masgrau R, Pujol A, and Galea E.
Staging anti-inflammatory therapy in Alzheimer's disease.
Frontiers in Aging Neuroscience, 25: 2-142, 2010.