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GENERACIÓN DE CÉLULAS MADRE DE PLURIPOTENCIA
INDUCIDA A PARTIR DE PACIENTES CON ENFERMEDADES
GENÉTICAS CON AFECTACIÓN RENAL: CORRECCIÓN Y
MODELADO DE ENFERMEDADES RENALES IN VITRO
Bernd Kuebler
Center of Regenerative Medicine in Barcelona (CMR[B])
Luis Fernando Quintana
Fundación Privada Clínic per a la Recerca Biomèdica (FCRB)
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1. Resumen del proyecto
Existen intereses sociales y científicos importantes en el campo de las enfermedades
genéticas degenerativas renales: en primer lugar, la generación de un modelo de la
enfermedad in vitro para entender los mecanismos moleculares relacionados con la
misma, y en segundo lugar, la identificación de dianas terapéuticas para el tratamiento
de los pacientes.
Son diferentes enfermedades sistémicas heredadas las que se asocian a una lesión
glomerular de origen inmunológico o metabólico. Entre ellas encontramos las
amiloidosis hereditarias (AH) y el síndrome de Alport (SA). En el caso de las
amiloidosis se trata de enfermedades de transmisión genética que dan lugar a
la producción de proteínas mal plegadas que se organizan como fibrillas de amiloide y
se acumulan en diversos órganos. Dicho acúmulo conlleva el desarrollo de
polineuropatía, disfunción autonómica, insuficiencia renal y cardíaca o desórdenes
gastrointestinales. Su presentación clínica es muy variada, lo que puede dar lugar a
problemas diagnósticos. En el caso del SA, se trata de una enfermedad hereditaria que
afecta a las membranas basales, causada por alteraciones en una de sus proteínas
estructurales: el colágeno tipo IV. La SA se transmite mediante dos patrones de
herencia distintos: la herencia ligada al cromosoma X y la herencia autosómica
recesiva. Los pacientes con SA desarrollan hematuria, proteinuria e insuficiencia renal
progresiva.
En los últimos años se han propuesto diferentes estrategias terapéuticas para evitar la
progresión a enfermedad renal terminal en dichas enfermedades. En este proyecto
proponíamos que la generación de iPSC de pacientes con AH y SA nos permitiría
caracterizar mejor la fisiopatología de estas enfermedades in vitro y establecer
medidas para corregir estos trastornos moleculares. Por ello los objetivos principales
de este proyecto consistieron en: a) el desarrollo de iPSC de pacientes con AH y SA a
partir de células madre mesenquimales procedentes de su propio tejido adiposo (AD-
MSC); b) el desarrollo de un protocolo in vitro de células epiteliales-like a partir de
iPSC que en un futuro pudieran inducir regeneración celular al ser trasplantadas y, por
último, c) establecer modelos in vitro de enfermedades renales que sirvieran para
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generan nuevas dianas terapéuticas y evaluar la respuesta al tratamiento de fármacos
y otros productos con potencial terapéutico.
Desde hace más de 15 años, el Servicio de Nefrología y Trasplante Renal del Hospital
Clínic de Barcelona cuenta con una línea específica de estudio en amiloidosis, en
especial de riñón, pero también en otras formas hereditarias de amiloidosis. Así, el
Servicio es miembro activo de la unidad funcional y multidisciplinar de amiloidosis del
HCB y está participando en varios ensayos clínicos fase II y III, convirtiéndose en un
centro de referencia tanto para los pacientes con estas enfermedades renales raras
como para el sistema sanitario catalán y español. En este contexto, el grupo de
investigación liderado por el Dr. Luis F. Quintana participó en el reclutamiento de una
cohorte de pacientes seleccionados de la base de datos del Hospital Clínic que habían
desarrollado polineuropatía amiloidótica familiar (FAP, una de las amiloidosis
hereditarias) y SA.
El Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona fue fundado en 2004. Es un centro de
referencia de reprogramación y regeneración de tejidos y órganos. Estamos
reprogramando gran cantidad de células somáticas como por ejemplo fibroblastos
derivados de piel, células aisladas de la sangre o de orina, queratinocitos extraídos de
piel humana y pelo utilizando las técnicas de reprogramación de última generación con
infecciones víricas, con Lenti-, Retro- y Sendai virus, transfección de mRNA o
nucleoinfección de plásmidos episomales.
2. Resultados
Para el desarrollo de iPSC de pacientes, el grupo liderado por el Dr. Luis F. Quintana
conjuntamente con el Dr. Josep M. Campistol generó una lista de pacientes portadores
de las mutaciones Val30Met, Lys89 TTR y ApoIII que desarrollaron FAP y de portadores
de la mutación COL4A5 que desarrollaron SA. Estos pacientes se obtuvieron de la base
de datos del Hospital Clínic. El proyecto se completó con una lista de pacientes
controles.
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Pacientes con FAP:
- Mutación Val30Met: 3 familias, en total 7 pacientes.
- Mutación Lys89: 1 familia, en total 3 pacientes.
- Mutación Apo AIII: 1 familia, en total 3 pacientes.
Pacientes con SA:
- COL4A5: 1 familia, en total 8 pacientes.
Controles:
- 21 controles sanos.
A partir de la extracción del tejido adiposo subcutáneo de dichos pacientes, se llevó a
cabo el aislamiento de AD-MSC y su caracterización tanto por citometría de flujo como
por su diferenciación multilinaje.
Las AD-MSC derivadas de pacientes con FAP fueron enviadas al CMRB para su
reprogramación con la metodología feeder-free no integrativa. Células derivadas de
pacientes con SA fueron reclutadas por la Dra. Roser Torra de la Fundació Puigvert y
reprogramadas de la misma forma.
Células madre pluripotentes inducidas (iPSC) procedentes de pacientes con FAP y SA,
fueron generadas con nucleoinfección con plásmidos no-integrativos episomales.
Se han generado líneas de iPSC de 9 pacientes con FAP y 3 con SA, se han expandido,
caracterizado parcialmente y congelado distintos clones de cada paciente. Se han
caracterizado totalmente, expandido, congelado viales y “banqueado” un clon de cada
uno de los 3 pacientes con FAP y de los 3 pacientes de SA. Las líneas procedentes de
los pacientes con SA se han registrado en el Banco Nacional de Líneas Celulares
(ESi054_A, ESi054_A, ESi056_A) y están en preparación para la publicación en la
revista Stem Cell Research.
Los clones de líneas de iPSC obtenidos a partir de muestras de distintos pacientes con
FAP se han diferenciado a hepatocitos mediante un protocolo que incluye, entre otros,
Activin A, BMP4, HGF e incubaciones en diferentes concentraciones de oxigeno: (4%O2
o 20%O2). La expresión de marcadores hepáticos se evidenció mediante
inmunocitoquímica y qPCR con primeros específicos contra marcadores hepáticos,
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indicando regulación de diferenciación hepática tardía de los marcadores AFP, AFP7B,
SOX17, TDO, CXCR4, HNF4 y FOXA2.
En paralelo, se estableció un protocolo de diferenciación de iPSC en células renales
epiteliales.
Se ha realizado inmunocitoquímica con anticuerpos contra colágeno IV (col IV) para
analizar si se pueden detectar las diferencias morfológicas entre colágeno mutado e
intacto en fibroblastos de paciente con SA y de donantes sanos. Mediante la
inmunocitoquímica no se han detectado diferencias importantes entre el colágeno IV de
donantes y de pacientes, indicando que no se pueden mostrar estos cambios
morfológicos por inmunocitoquímica.
Otro punto a desarrollar a lo largo del proyecto era la caracterización de nuevos
marcadores de células progenitoras renales. Para ello nuestro grupo llevó a cabo el
aislamiento tanto de un conjunto de todas las células del riñón como de las diferentes
fracciones con sus diferentes tipos celulares. Mediante separación celular por citometría
de flujo se aislaron células positivas para marcadores de célula progenitora como CD24
y CD133. Posteriormente se enviaron al CRMB para la determinación de nuevos
marcadores mediante microarrays.
Durante el desarrollo del proyecto, la Dra. María José Ramírez, integrante del grupo del
Dr. Quintana, propuso determinar el efecto renoprotector de las microvesículas (MV)
derivadas de las células progenitoras renales (CD24+/CD133+) para su aplicación en
un modelo in vivo de daño renal agudo (daño mediante glicerol) y un daño renal
crónico (nefrectomía 5/6). Se llevó a cabo la puesta a punto tanto del aislamiento de
las MV como la caracterización de los modelos murinos de daño agudo y crónico.
Durante el desarrollo de dichos modelos observamos que era necesario partir de gran
cantidad de células progenitoras para aplicar dicha terapia con MV y se nos planteó el
inconveniente que durante la expansión del cultivo celular los marcadores progenitores
se perdían progresivamente, con lo cual al final fue imposible aplicar esta terapia en los
modelos in vivo.
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A fin de superar estas dificultades, el Dr. Quintana y la Dra. Ramírez pensaron que
sería útil, a nivel clínico, determinar mediante inmunohistoquímica la presencia de
marcadores progenitores en las biopsias renales de los pacientes con amiloidosis. El
objetivo de dicho estudio sería establecer nuevos marcadores predictivos de la
evolución del desarrollo de la insuficiencia renal crónica. Así, el Dr. Quintana y la Dra.
Adriana García (nefropatóloga) llevaron a cabo la selección de 37 casos clínicos de
pacientes con amiloidosis renal que presentaban biopsias renales incluidas en parafina
y posteriormente se puso a punto la inmunohistoquímica de los diferentes marcadores
en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Clínic. En estos momentos, la
evaluación de las biopsias está siendo llevada a cabo por el Dr. Manel Solé Arqués que
cuenta con una gran experiencia en la evaluación de biopsias de pacientes con
amiloidosis.
No se pudo realizar este análisis en biopsias de pacientes con SA, debido a que la
mayoría de los pacientes son diagnosticados cuando ya están en un estadio muy
avanzado de la enfermedad renal.
3. Relevancia y posibles aplicaciones
Las amiloidosis son un grupo de enfermedades raras que tienen su origen en el
depósito extracelular de amiloide, un material fibrilar que deriva de varios precursores
proteicos y que se agrega debido a una anormal conformación de la hoja β. El acúmulo
de amiloide ocurre como consecuencia de una proteína mutada en el caso de
amiloidosis hereditarias.
En la actualidad varias terapias con potencial están desarrollándose para algunas
formas de amiloidosis, como la generación de iPSC a partir de la reprogramación de
células somáticas de pacientes.
La combinación de análisis clínicos y modelado in vivo con la tecnología de iPSC podría
ser muy útil, evitando test innecesarios y definiendo el mejor momento para el
trasplante de hígado o riñón en pacientes presintomáticos. La tecnología iPSC ofrece un
escenario único para la identificación de vías moleculares y/o genes responsables de la
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enfermedad y para definir nuevos agentes terapéuticos causantes del bloqueo del
proceso de amiloidogénesis en casos de polineuropatía amiloide familiar y para
descubrir vías moleculares del síndrome de Alport. Así, la contribución del conocimiento
molecular y biológico que ofrece la tecnología iPSC será importante no solo para
confirmar el diagnóstico en estadios tempranos de la enfermedad, sino también para
mejorar la calidad de vida de los pacientes evitando el trasplante.
Las líneas de iPSC de pacientes que sufren amiloidosis polineuropatía familiar y
síndrome de Alport se han generado y caracterizado completamente. Además las iPSC
con Síndrome de Alport están registradas y líneas de iPSC de ambas enfermedades
están listas para ser usadas como modelo.
Disponer de marcadores predictivos de la respuesta al tratamiento es un primer paso
hacia terapia individualizada en los pacientes con amiloidosis renal. Siguiendo esta
línea, la determinación de la presencia de marcadores de células progenitoras en la
biopsia renal de dichos pacientes podría establecer una correlación clínica con la
función renal y la proteinuria. Además de establecer la importancia de dichos
marcadores en la estratificación del riesgo de desarrollo de insuficiencia renal crónica.
4. Bibliografía científica generada
Xia Y, Nivet E, Sancho-Martinez I, Gallegos T, Suzuki K, Okamura D, Wu MZ, Dubova I,
Esteban CR, Montserrat N, Campistol JM, Izpisua Belmonte JC. Directed differentiation
of human pluripotent cells to ureteric bud kidney progenitor-like cells.
Nat Cell Biol. 2013 Dec;15(12):1507-15.
Kuebler B., Aran B., Miquel-Serra L., Muñoz Y., Ars Criach E., Bullich G., Furlano M.,
Torra Balcel R., Marti M., Veiga A., Raya A.
Integration-free induced pluripotent stem cells derived from a patient with autosomal
recessive Alport Syndrome (ARAS)
Stem Cell Research (en preparación).
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Kuebler B., Aran B., Miquel-Serra L., Muñoz Y., Ars Criach E., Bullich G., Furlano M.,
Torra Balcel R., Marti M., Veiga A., Raya A.
Generation of integration-free induced pluripotent stem cell lines derived from two
patients with X-linked Alport Syndrome.
Stem Cell Research (en preparación).