ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

3.1. AMINOÁCIDOS COMO CONSTITUYENTES DE LAS PROTEÍNAS

Las células vivas producen gran variedad de macromoléculas como son las proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos, entre otros. Estas macromoléculas son biopolíme-ros constituidos por unidades monoméricas o estructurales. Para los ácidos nucleicos, las unidades estructurales son los nucleóti-dos; para los polisacáridos son los monosa-cáridos.

En virtud de que las proteínas desempeñan una amplia variedad de funciones esenciales en los organismos, las cuales describiremos más adelante, es evidente que para conocer tanto el funcionamiento normal como pa­tológico de un organismo se requiere un conocimiento claro de la estructura y pro­piedades de las proteínas.

Aunque muchas proteínas contienen otras sustancias, además de los aminoácidos, la estructura y muchas de sus propiedades bio­lógicas están determinadas por las clases de aminoácidos presentes y el orden en el que están dispuestos en la cadena polipeptídica.

Es asombroso que en una célula existan millares de proteínas con estructura y fun­

ción diferentes, pero resulta aún más sor­prendente que todas ellas estén integradas por sólo 20 aminoácidos comunes. Los ami­noácidos comunes son aquéllos para los que existe un codón específico en el código ge­nético del DNA (ver el capítulo Ácidos nu­cleicos). Los aminoácidos derivados son generados después de su incorporación a la molécula proteínica.

Además de ser las unidades estructurales de las proteínas, los aminoácidos tienen otras funciones importantes como la trans­misión de impulsos en el sistema nervioso, como material energético, y otros.

3.1.1. Estructura general

Desde el descubrimiento del primer aminoá­cido, asparagina, en 1806, habrían de pasar más de 130 años para que le llegara el turno a la treonina, con la que se cerró la lista de los 20 aminoácidos.

Un aminoácido es un compuesto que con­tiene dos grupos funcionales: un grupo amino y uno carboxüo. Ambos grupos están unidos al mismo átomo de carbono, designado car­bono a. Al carbono a de cada aminoácido también está unido un átomo de hidrógeno y

del espárrago, alanina de alantoides) o de al­guna propiedad característica (glicina por su sabor dulce). De la denominación trivial ha surgido una abreviatura de tres letras que, da­das las técnicas modernas de secuenciación, han obligado la anotación de los aminoáci­dos por una sola letra mayúscula (tabla 3.1.).

Los aminoácidos presentes en las proteí­nas pueden clasificarse en dos grandes gru­pos dependiendo de la polaridad relativa de sus grupos R (tabla 3.2).

3.1.4.1. Aminoácidos con grupo R no polar

Los aminoácidos más hidrofóbicos (no pola­res) son la fenilalanina, leucina, isoleucina, valina, alanina, metionina y triptofano.

Tabla 3.2. Clasificación de los L-a-aminoácidos presentes en las proteínas con base a las polaridades relati­vas de sus grupos R. Un grupo no polar es aquel que tiene poca o ninguna diferencia de car­ga de una región a otra, en tanto que un grupo polar tiene una diferencia de carga relativamen­te grande en diferentes regiones.

La mayoría de las cadenas laterales de los ca, lejos del agua de solvatación de la super-aminoácidos más hidrofóbicos están orien- ficie. tadas hacia el interior de la molécula protei-

En la prolina el grupo R es único ya que in­corpora el grupo amino en la cadena lateral. Re­almente la prolina es un iminoácido que tiene consecuencias estructurales importantes para las proteínas como veremos más adelante.

La glicina, el más pequeño de los aminoá­cidos, puede encajar en regiones de la es­tructura tridimensional de las proteínas inaccesibles para otros aminoácidos.

3.1.43. Aminoácidos con grupo R polar con carga negativa

En esta categoría se encuentran los ácidos aspártico y glutámico.

3.1.4.4. Aminoácidos con grupo R polar con carga positiva

3.1.4.2. Aminoácidos con grupo R polar sin carga

A este grupo pertenecen aminoácidos cuya cadena lateral tiene naturaleza polar (hidro-fi'licá) como son la serina, treonina, cisteína, asparagina, glutamina y tirosina.

Los aminoácidos que pertenecen a este gru­po son la lisina, arginina e histidina.

Las cadenas laterales de los aminoácidos polares sin carga se encuentran en propor­ciones significativas tanto en el interior co­mo en la interfase de la proteína con el disolvente. Por el contrario, los aminoácidos polares glutamina y asparagina y los que tie-

nen grupos cargados a pH 7.0 como Usina, arginina, histidina, glutamato y aspartato se hallan predominantemente en la superficie de las proteínas globulares donde la carga se encuentra estabilizada por el disolvente acuoso. La colocación poco usual de una ca­dena lateral cargada en el interior de una proteína globular se correlaciona con un pa­pel estructural o funcional esencial.

Los grupos R con carga de los aminoáci­dos básicos y acídicos, tienen un papel clave en la estabilización de la conformación pro-teínica a través de enlaces salinos. Además, funcionan en sistemas enzimáticos que re­quieren de transmisión de cargas. Ya se ha mencionado el lugar importante de la histi­dina en la catálisis enzimática en virtud de la carga de su grupo imidazol que le permite funcionar, a pH 7.0, como base o como áci­do catalítico.

3.1.5. Aminoácidos no proteínicos

Existen aminoácidos que no forman parte de las proteínas pero que realizan importantes funciones en el metabolismo intermediario, o bien, como hormonas, neurotransmisores y otras.

3.1.5.1. Ejemplos de importancia

La omitiría funciona como intermediario en el metabolismo de la treonina, aspartato y metionina; junto con la citrulina, es un inter­mediario en la biosíntesis de la urea.

La DOPA (dihidroxifenilalanina) es un aminoácido neurotransmisor, precursor de la melanina y se encuentra en la vía meta-bólica biosintética de las aminas neuro-transmisoras: dopamina , adrenal ina y noradrenalina.

El ácido gama-aminobutírico (GABA) es un neurotransmisor derivado del glutamato.

H2N-CH2-CH2-CH2-COOH GABA

3.2. ENLACE PEPTÍDICO

La reacción más importante de los aminoá­cidos es el enlace peptídico. Este enlace de­termina la fuerza de unión primaria de una proteína; su estructuración corresponde a una polimerización de aminoácidos, es de­cir, una proteína es un polipéptido complejo.

3.2.1. Definición

El grupo a -carboxilo de un aminoácido (RO puede unirse covalentemente al grupo a ami-no de otro aminoácido (R2) eliminando una

molécula de agua y formando un tipo de en­lace amida conocido como enlace peptídico (fig-3.8)

3.2.2. Formación

El enlace peptídico posee una serie de inte­resantes características estructurales. Dada

la resonancia del grupo carbonilo (-C-), el II o

enlace peptídico tiene naturaleza de doble enlace parcial.

3.2.3. Estructura del etano

Si recordamos la estructura del etano (un enlace C-C) y del etileno (doble enlace C=C) veremos que en el primer caso, los átomos de carbono del etano giran libremen­te teniendo como eje el enlace sencillo; en cambio, el doble enlace del etileno repre­senta una estructura rígida que impide la li­bre rotación.

3.2.4 Estructura coplanar

El enlace peptídico con la característica de ser un doble enlace parcial, determina una estructura rígida entre carbono y nitrógeno y por lo tanto es un enlace coplanar. En un po-lipéptido, los carbonos a de aminoácidos cercanos están en situación trans respecto al enlace peptídico.

3.2.5. Rotación del enlace

Así como en el enlace peptídico no puede haber rotación, sí puede haberla en torno a los enlaces C-N y C-C determinando ángu­los de conformación (y y <fr) que, en las proteínas naturales, presentan poca variabi­lidad en sus valores. Esto trae como conse­cuencia que, en un péptido, los enlaces peptídicos presentan una alternancia que de­termina una secuencia en zig-zag (fig. 3.10).

33. PÉPTIDOS

3.3.1. Definición

Cuando los grupos amino y carboxilo de los aminoácidos se combinan para formar un polipéptido. Los aminoácidos constituyen­tes se denominan residuos de aminoácidos. Un péptido consta de dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. En la figura 3.10 se muestra un tripéptido en el que hay que hacer notar que es aquel for­mado con tres residuos, no con tres enlaces peptídicos.

3.3.2. Clasificación

Por convención, las estructuras peptídicas se describen a partir del residuo amino termi­nal (grupo-NH2 libre), que se coloca a la iz­quierda, y termina con el residuo carboxilo

terminal (grupo -COOH libre) que se coloca a la derecha. La repetición de este proceso secuencial genera un polipéptido con una secuencia de aminoácidos específica ( R r

R2-R3-R4... Rp). Aunque existen discrepancias en la litera­

tura, el término oligopéptido se reserva para moléculas con 2 a 20 residuos, polipéptido de 20 a 50 residuos y proteína a las que su­peran esta cifra.

3.3.3. Representación de estructuras

Las estructuras polipeptídicas pueden repre­sentarse colocando el aminoácido inicial (el del extremo amino terminal) y a partir de és­te colocar en zig-zag los residuos en el orden secuencial correspondiente (fig. 3.11).

Como los polipétidos pueden contener un número de residuos muy elevado, es poco práctico usar las fórmulas estructurales con­vencionales. En cambio, puede utilizarse la abreviatura de tres letras (o incluso de una sola) para designar el péptido. En nuestro ejemplo (fig. 3.11) se podría escribir: Ala -Ser - Gli - Tre, o bien, A-S-G-T-.

3.3.4. Péptidos de importancia biológica

En todos los seres vivos se han aislado pép-tidos de interés biológico. Uno de los más sencillos es el tripéptido glutatión (y-gluta-mil-cisteinil-glicina), en el cual el glutamo inicial está unido a la cisteína por medio del carboxilo gama (y) en lugar del alfa ( a ), co­mo ocurre con la gran mayoría de los péptidos. Este tripéptido lleva a cabo funciones oxido-rreductoras por su grupo sulfhídrilo (-SH), se requiere para la actividad de varias enzimas y participa en el transporte de aminoácidos.

Un grupo importante es el de los péptidos cerebrales con actividad de neurotransmiso-res, como la sustancia P (decapéptido) o los analgésicos opiáceos como las endorfinas y encefalinas. Tir-Gli-Gli-Fen-Met Encefali-na (Metionina) Arg-Pro-Lis-Pro-Gln-Fen-Fen-Gli-Leu-Met Sustancia P.

La oxitocina y vasopresina son polipéti­dos cíclicos. Los antibióticos polipeptídicos a menudo contienen D y L-aminoácidos y otros no presentes en proteínas, por ejemplo, la tirocidina y gramicidina S, que contienen D-fenilalanina y ornitina. Estos polipétidos no son sintetizados en los ribosomas.

Otros polipéptidos importantes son las hormonas colecistocinina y gastrina, la insu­lina y glucagón, la hormona liberadora de ti-rotropina y otras.

3.4. PROTEÍNAS

3.4.1. Definición

Las proteínas constituyen sin duda uno de los grupos de moléculas de gran trascenden­cia en los seres vivos. Todas las proteínas son polipéptidos de peso molecular elevado. Arbitrariamente, como se ha señalado antes, se ha establecido como línea divisoria entre polipétidos y proteínas un peso molecular de 8,000 y 10,000. Una proteína simple es aqué­lla que contiene sólo aminoácidos; una proteí­na compleja contiene, además, otras moléculas diferentes como el hemo (de la hemoglobi­na), vitaminas, lípidos, carbohidratos o ele­mentos minerales (metaloenzimas).

3.4.2. Importancia biomédica

Las proteínas desempeñan una amplia varie­dad de funciones que pueden agruparse en dos clases: dinámicas y estructurales. De las funciones dinámicas, la más importante es la función catalítica. De hecho, la mayor parte de las reacciones químicas celulares son catalizadas por enzimas, casi todas ellas de naturaleza proteica. En realidad, estas molé­culas son tan importantes que merecen un capítulo especial dentro de la bioquímica.

Otra función dinámica de las proteínas es el transporte, ejemplos de este grupo son la hemoglobina y mioglobina. Otras proteínas actúan como hormonas. Las proteínas tam­bién pueden funcionar con un papel protector como las inmunoglobulinas y el interferón. Algunas participan en los mecanismos con­tráctiles como la miosina y actina. Otras tie­nen una función de reconocimiento, como es

el caso de los receptores hormonales situa­dos en la membrana celular o en el citosol.

Dentro de las proteínas estructurales se encuentran el colágeno, la elastina y la que-ratina.

Así pues, las proteínas son quizá las macro-moléculas más versátiles, que se responsabili­zan en gran parte de las funciones metabólicas y de la morfología de los seres vivos. No en vano el término proteína deriva del griego proteos que significa "primero", "primoridaT.

3.4.3. Clasificación

En la actualidad no existe un sistema de cla­sificación de las proteínas universalmente aceptado. Durante mucho tiempo se dividie­ron en simples y conjugadas. Sin embargo, en todas las proteínas, aun las más simples, casi siempre están asociadas otras moléculas llamadas grupo prostético. En esto se basa la clasificación propuesta en la tabla 3.3.

3.4.3.1. Basada en su solubilidad

Un sistema de clasificación basado en la so­lubilidad todavía está en uso, en particular en bioquímica clínica (tabla 3.4.).

Sin embargo en esta clasificación, no se puede hacer una distinción entre albúminas y globulinas únicamente en base a sus solu­bilidades en agua o en soluciones salinas. Así, se subdividieron en seudoglobulinas (solubles al agua) y euglobulinas (insolubles en agua exenta de sales).

3.4.3.2. Basada en la forma

Otra clasificación se basa en la forma (rela­ción entre longitud y amplitud) y en ésta se consideran Xas proteínas globulares, de for­ma esférica, solubles en agua, dentro de las cuales se encuentran la insulina, albúmina y

Albúminas Solubles en agua y en soluciones salinas. Sin aminoácidos distintivos Globulinas Escasamente solubles en agua pero solubles en soluciones salinas.

Sin aminoácidos distintivos Protaminas Solubles en etanol a 70-80% pero insolubles en agua y en alcohol etilíco

absoluto. Ricas en arginina Histonas Solubles en soluciones salinas Escleroproteínas Insolubles en agua o en soluciones salinas. Ricas en glicina, alanina y prolina

globulinas plasmáticas y numerosas enzimas. Las proteínas fibrosas, son de forma alarga­da, baja solubilidad en agua, resistentes a la tracción, dentro de las cuales tenemos la queratina, miosina, colágeno y fibrina.

3.43.3. Basada en sus funciones

Las proteínas se pueden clasificar de acuer­do a sus funciones en proteínas estructura­les, catalíticas ( enz imas ) , reguladoras, protectoras (inmunoglobulinas), de trans­porte, etc. (tabla 3.5).

3.4.4. Importancia biológica de las proteínas, Genes y proteínas. Diversidad

Hemos mencionado el papel tan relevante y versátil de las proteínas con sus múltiples funciones. La diversidad de formas y fun­ciones proteicas que existen en una sola cé­lula, formadas a partir de 20 aminoácidos, nos indica que tal variabilidad depende de la combinación casi infinita de aminoácidos en cada una de las proteínas existentes en un ser vivo. ¿Qué determina tal variabilidad?

En los siguientes subcapítulos hablare­mos de los niveles de organización de la es-

una cadena lateral, designada R que es dife­rente para cada uno de los 20 aminoácidos comunes excepto para la glicina (fig. 3.1).

3.1.2. Propiedades generales

3.1.2.1. Asimetría. Estereoisomería

Con excepción de la glicina, para la cual R-H, los cuatro grupos unidos al carbono a de los aminoácidos son diferentes. Esta orientación tetraédrica con cuatro grupos di­ferentes alrededor del carbono a confiere actividad óptica (capacidad de rotar el plano de luz polarizada) a los aminoácidos. En la configuración absoluta, utilizando la pro­yección de Fisher, el COOH está dirigido hacia arriba y atrás del plano de la página, el grupo R de la cadena lateral se dirige hacia abajo y atrás del mismo plano, el grupo H y el grupo -NH2» en el carbono a están dirigidos hacia el lector, si por convención el grupo ex­amino está proyectado hacia la izquierda, el aminoácido tiene la configuración absoluta. Su enantiómero óptico, con el grupo a-amino hacia la derecha tiene la configuración abso­luta denominada D, como en el D-gliceralde-hído (fig. 3.2). En las proteínas de mamífero sólo se encuentran L-a-aminoácidos.

La dificultad surgida de intentar denominar familias de isómeros ópticos con dos o más centros asimétricos ha dado lugar al estable­cimiento de un método más general de desig¿

nación estereoquímica, el sistema RS, donde los grupos unidos a un orden basado en el nú­mero atómico: SH>OH>NH2>CDOH>CH3>H. En todos los casos el grupo H se encuentra debajo del plano. Si los otros tres grupos se ordenan de mayor a menor prioridad en el sentido de las manecillas del reloj, el centro asimétrico es R (RECTUS en latín) y S (si-nisterenel opuesto) (ver fig. 3.3.).

Dado que los aminoácidos de las proteí­nas son asimétricos, las proteínas también tienen propiedades asimétricas.

3.1.22. Formas iónicas de los aminoácidos

Los grupos amino y carboxilo de un ami­noácido pueden ionizarse. El pK del grupo amino es 9.8 y el del grupo carboxilo es 2.1. Por tanto, dentro de los límites fisiológicos del pH, ambos grupos están cargados (fig. 3.4), constituyendo un ion dipolar o switterion (en alemán, ion híbrido).

Cabe aclarar que la estructura sin carga de un aminoácido indicada en la fig. 3.1 no puede existir a ningún pH, pero es posible usarlo por conveniencia, al describir la quí­mica de los aminoácidos.

Los aminoácidos tienen carácter anfótero, por comportarse como ácidos o bases debi­do a sus grupos ionizables. En los aminoáci­dos neutros, que existen como ion dipolar, es decir, aquella forma en la que la carga po­sitiva es igual a la carga negativa (carga neta

tructura proteica. El primer nivel, o estructu­ra primaria, se refiere al orden de los ami­noácidos en la cadena polipeptídica. Es decir, cada proteína posee un ordenamiento o secuencia de aminoácidos bien definido pe­ro . . . ¿qué determina ese ordenamiento? Aquí debemos detenernos y, quizá adelan­tando un poco, hablar de ese factor particular en cada célula u organismo que determina ese ordenamiento y, por ende, la gran diver­sidad de estructuras y funciones proteicas.

Ese elemento dictador de la secuencia po­lipeptídica es la unidad transmisora de los caracteres hereditarios, el gene o gen; bio­químicamente, el DNA. La información ge­nética contenida en cada célula o individuo se expresa a través de una proteína, muy fre­cuentemente de una enzima. En este sentido, las proteínas vienen a ser las ejecutoras de las ordenes dictadas por los genes. Sobre es­to se tratará más ampliamente en el capítulo de ácidos nucleicos.

3.4.5. Niveles estructurales de una proteína*

3.4.5.1. Es t ructura primaria

La estructura primaria, ya familiar desdé la descripción de los péptidos, se refiere al or­den de los aminoácidos en la cadena poli­peptídica. La fuerza estabilizadora de esta estructura es el enlace covalente (peptídico). En esta estructura se incluye, además de la secuencia de aminoácidos, la localización de los puentes disulfuro (cistina).

La determinación de la estructura prima­ria de una proteína es actualmente una técnica accesible a la mayor parte de los laborato­rios de bioquímica. Esto ha sido posible gra­cias a los esfuerzos de Sanger, quien en 1953 fue el primero en estudiar y determinar la estructura primaria de una proteína, la insu­lina. Ahora se conoce la secuencia completa de más de 2,000 proteínas, gracias a los méto­

dos automáticos en el análisis de aminoáci­dos introducidos por Moore y Stein en 1964.

El analizador automático de aminoácidos (secuenciador) está cediendo lugar actual­mente a sistemas basados en métodos cro-matográficos de alta eficacia, que utilizan la técnica de degradación de Edman, y los mé­todos secuenciales del gen que codifica a la proteína en estudio.

La importancia de la estructura primaria es tal que una variación en un solo aminoá­cido de una cadena polipeptídica puede de­terminar una falta letal en la proteína completa. El ejemplo clásico es el de la he­moglobina S (HbS) que tiene la sexta posi­ción de la cadena P ocupada por valina en lugar de glutámico como la hemoglobina normal (HbAí). Los individuos que tienen este defecto padecen anemia de células fal-ciformes, con una elevada hemolisis y obs­trucción de capilares por los eritrocitos anormales.

3.4.5.2. Estructura secundaria

Si una proteína estuviera constituida por só­lo una disposición polipeptídica lineal, su única conformación posible, fuera la fibrosa. Sin embargo, en virtud de la estructura co-planar del enlace peptídico y los ángulos de rotación § y vy que regularmente toman va­lores de 132 y 123° respectivamente, surge una estructura particularmente estable que es la a-hélice. En este tipo de estructura se­cundaria, la cadena polipeptídica se pliega adoptando una forma helicoidal con giro a la derecha que contiene 3.6 residuos de ami­noácidos por vuelta. Esta estructura fue pro­puesta inicialmente por Pauling y Corey. La máxima estabilidad de la hélice está deter­minada por puentes de hidrógeno que se es­tablecen entre el grupo carbonilo (C-0) de un enlace peptídico y el amino (N-H) pre­sente cuatro residuos más adelante en la ca­dena (fig. 3.12).

Figura 3.12. Representación de un polipéptido en conformación de a-hélice

En la conformación de a-hélice las cadenas laterales R se proyectan en forma perpendi­cular al eje de la hélice y hacia el exterior de la estructura en espiral generada por la cade­na peptídica. Si estos grupos R están próxi­mos y tienen carga del mismo signo o están ramificados (valina, isoleucina), sus interac­ciones desestabilizan la estructura helicoi­dal. Otro factor que rompe la conformación a-helicoidal es la presencia de prolina, ya que el anillo pirrolidina de su cadena lateral interacciona estéricamente con la cadena la­teral del aminoácido precedente y, además,

porque no puede ocurrir rotación del enlace N-C. La presencia de prolina entre dos cade­nas en a-hélice produce una acodadura de la dirección general de la molécula, lo cual es de gran importancia en la configuración general de una proteína. Otro aminoácido que tiende a desestabilizar la a-hélice es la glicina, por tener un grupo R muy pequeño.

Pauling y Corey también propusieron otra estructura secundaria que es la estructura P (P porque fue una segunda estructura, sien­do la a-hélice la primera). La conformación p está formada por dos o más cadenas polipep-

tídicas que pueden ser paralelas (en el mismo sentido) o antiparalelas (en direcciones opues­tas) y se estabilizan también por puentes de hidrógeno (fig. 3.13). En tanto que la hélice es una cadena polipeptídica enrollada, la tira plegada p está extendida y se dispone a la manera de un acordeón con los grupos R pro­yectados por encima y por debajo de los planos generados por las cadenas polipeptídicas. La estabilidad es mayor en la conformación an­tiparalela, la más frecuente en las proteínas naturales, incluso más que la a-hélice.

En general, estas estructuras laminares se dan en las proteínas fibrosas como la quera-tina del pelo y la piel, la fibroma de la seda; la sustancia amiloide que se deposita en condiciones patológicas, es un depósito de proteína en forma de tira plegada.

Es común que en numerosas proteínas ocurran simultáneamente ambas estructuras, la a-hélice y la hoja plegada p, como se ilustra en la fig. 3.14.

Finalmente, dentro de la estructura secun­daria, pueden existir algunas regiones de las proteínas que no son a-hélice ni tira plega­da, sino que son conformaciones enrolladas al azar. En términos de su función biológi­ca, las regiones de enrollamiento aleatorio son de igual importancia que las de a-hélice o tira plegada.

3.4.5.3. Estructura terciaria

Existen razones sobradas para pensar que gran parte de las proteínas tienden a adoptar forma esférica, globular. Esto sólo puede ocurrir si suponemos que, además del plega-miento secundario, existe un superplega-miento de la proteína que da lugar a una estructura compacta. Es la que se conoce co­mo estructura terciaria de las proteínas. Se trata de un arreglo tridimensional que forma diversos repliegues específicos.

Los tipos de enlaces que estabilizan la es­tructura terciaria son: a) atracción electros­

tática de tipo salino entre un grupo carboxi-lato (-COO-) y un grupo amino (-NH3

+) de residuos glutamato o aspartato con Usina o arginina; b) puentes de hidrógeno, entre gru­pos carboxilato, oxhidrilo (-OH) o los pro­pios grupos carbonilo (-C=0) de las uniones peptídicas; c) interacción de cade­nas polares, como los grupos aromáticos de la fenilalanina o los no aromáticos de alani-na e isoleucina, etc; d) fuerzas de Van der Waals, cuando los residuos son idénticos como dos metilos de la alanina, hidroximeti-los de la serina, etc; e) puentes disulfuro, que se establecen entre los grupos sulfhidri-lo (-SH) de la cisteína para dar el enlace co-valente disulfuro (-S-S-) entre cadenas vecinas (fig. 3.15).

El resultado de las distintas uniones des­critas es una estructura terciaria de gran es­tabilidad. El estudio de la estructura terciaria ha sido posible gracias a la cristalografía de rayos X desarrollada por la escuela de Bragg en Cambridge y a la labor pionera de Ken-drew sobre la mioglobina y de Perutz sobre la hemoglobina.

Las estructuras terciarias de las proteínas permiten agruparlas en familias y subfami­lias; por ejemplo, proteínas fibrosas de for­ma alargada y proteínas globulares de forma esferoidal.

3.4.5.4. Estructura cuaternaria

Cuando una proteína se compone de más de una cadena polipeptídica, se dice que posee estructura cuaternaria. Las proteínas que po­seen este grado de organización estructurai se denominan oligoméricas y las cadenas polipep­tídicas individuales que la integran se denomi­nan monómeros, protómeros o subunidades. Cuando una proteína oligomérica contiene dos o cuatro monómeros o subunidades se deno­mina dímero o tetrámero, respectivamente. El mejor ejemplo estudiado es la hemoglobina que es una proteína tetramérica (fig. 3.16).

Figura 3.13. Conformación p de una proteína con disposición paralela (a) antiparalela (b).

Figura 3.14. Representación esquemática del plegamiento de la cadena principal de la ribonucleasa bovina. La región de a-hélice está encerrada en un óvalo y la región p está sombreada. Otras porciones constituyen un enrollamiento al azar.

Figura 3.15. Tipo de uniones que estabilizan el plegamiento de las proteínas. 1. interacción electrostática; 2 puentes de hidrógeno, entre treonina y serina; 3 interacción dipolo-dipolo entre dos serinas; 4 unión de disul-furo, convalente, entre dos cisternas, y 5. interacción hidrofóbica entre leucina e isoleucina.

Figura 3.16. Estructura cuaternaria de ias proteínas. Esquema de la disposición de cuatro subunidades de una molécula de hemoglobina, formada por dos cadenas a en la parte inferior de la figura y dos cadenas p en la parte superior.

Los enlaces que mantienen la estructura cuaternaria son del mismo tipo que los que mantienen la estructura terciaria, excepto enlaces covalentes. Por ejemplo, la ot-qui-motripsina contiene tres cadenas polipeptí-dicas unidas por enlaces disulfuro y no se considera estructura cuaternaria. La mioglo-bina está compuesta por una sola cadena polipeptídica y no posee estructura cuater­naria. Sin embargo, la hemoglobina contie­ne 4 subunidades unidas no covalentemente y, por tanto, tiene estructura cuaternaria. La enzima aspartato transcarbamilasa tiene una estructura cuaternaria formada por 12 subu­nidades. Otros ejemplos incluyen la sintetasa de ácidos grasos, la piruvato deshidrogena-sa, a las cuales se les conoce como complejos multier>zimáticos o estructuras supramole-culares.

La estructura cuaternaria está íntimamen­te ligada a las propiedades reguladoras de las proteínas, particularmente en los siste­mas llamados alostéricos. En estos siste­mas, la respuesta puede estar afectada por la presencia de efectores (inhibidores o activa­dores) que modulan la acción primaria de la proteína (ver capítulo de Enzimas).

Las estructuras secundaria y terciaria de una proteína están determinadas por la es­tructura primaria. Por lo tanto, no es necesario postular un control genético independiente para los niveles de estructuración superiores al nivel primario, puesto que la estructura primaria determina la secundaria, terciaria y (cuando está presente) la cuaternaria.

3.5. RELACIÓN ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIÓN

La actividad biológica de una proteína de­pende del ordenamiento tridimensional apropiado de sus grupos funcionales. De es­te modo, las proteínas sólo funcionan cuan­do están plegadas en su estructura original o conformación nativa. Debido a que las con­

formaciones nativas de la mayor parte de las proteínas están estabilizadas sólo por enla­ces no covalentes, el plegamiento puede ser alterado por condiciones como alta tempera­tura, pH extremo o presencia de solventes orgánicos que debilitan las interacciones no covalentes.

3.5. L Desnaturalización

La alteración de una proteína que modifique su conformación nativa se denomina desna­turalización; este cambio provoca la consi­guiente alteración o desaparición de sus funciones. En una proteína se produce la desnaturalización al perder su estructura se­cundaria, terciaria y cuaternaria, conserván­dose la primaria (covalente). En el estado desnaturalizado los niveles de estructura­ción superior de la conformación nativa se encuentran al azar, es decir la proteína alta­mente ordenada queda reducida a un poli-mero estadístico formado por una cadena de aminoácidos (fig. 3.17). La existencia de en­laces disulfuro en una proteína aumenta su resistencia a la desnaturalización.

3.5.1.1. Agentes desnaturalizantes

Todos aquellos agentes capaces de romper o alterar los enlaces que mantienen las estruc­turas de orden superior de una proteína pue­den desnaturalizarla.

Un agente desnaturalizante muy común es el calor, esto tiene aplicación cotidiana en el laboratorio de bioquímica. Otros agentes fí­sicos (radiaciones, tensoactividad, altas presiones) o químicos (ácidos, álcalis, urea, detergentes) capaces de alterar las interac­ciones débiles pueden llegar a desnaturalizar las proteínas. En proteínas cuya estructura tridimensional está determinada por enlaces disulfuro, pueden ser desnaturalizadas por agentes reductores como el mercaptoetanol

o el ditiotreitol. En ocasiones esta alteración es reversible cuando se elimina el agente agresivo. En otros casos la desnaturaliza­ción es irreversible.

Una consecuencia de la desnaturalización es la pérdida drástica de solubilidad. Otras alteraciones incluyen disminución de la vis­cosidad, velocidad de difusión y facilidad con que cristalizan.

Siendo la conformación de la molécula proteínica la base principal de su función, al desnaturalizarse la proteína, se altera su acti­vidad fisiológica. Por ejemplo, las globuli­nas plasmáticas desnaturalizadas pierden sus funciones de anticuerpos.

3.5.2. Complementarte dad y capacidad de reconocimiento

Existen proteínas capaces de reconocer de­terminado tipo de moléculas que serán objeto de su actividad. Ese sitio de reconocimiento se debe a la presencia en la proteína de una estructura complementaria a la de la molé­cula (llámese sustrato, hormona, antígeno, efector, grupo prostético), que permite a la proteína (sea enzima, anticuerpo, receptor

membranal) reconocer a la molécula en cuestión y asociarse con ella en forma espe­cífica. Para explicar el fenómeno de la espe­cificidad, Emil Fisher propuso en 1894 una analogía similar a la que existe entre llave y cerradura.

En las proteínas donde más se ha ejempli­ficado el fenómeno de la especificidad de reconocimiento molecular es entre las enzi­mas y su sustrato; de ellas nos ocuparemos más adelante. Otro ejemplo es el de la globi-na que se une específicamente a su grupo prostético, el grupo hemo, debido a que la proteína tiene un hueco molecular con la forma precisa para el hemo y dado que las cadenas laterales de los aminoácidos en con­tacto con el anillo son no polares.

Clásico ejemplo de reconocimiento es la unión de sustancias llamadas antígenos con su anticuerpo específico. El anticuerpo es una molécula proteínica especial pertene­ciente al grupo de las inmunoglobulinas. Los receptores membranales de reconoci­miento de las hormonas, que representan el primer sitio de acción hormonal, son tam­bién proteínas de reconocimiento.

Como regla general, un sitio fijador (de reconocimiento) en una proteína se ajusta al

compuesto que se va a unir en forma, tama­ño y polaridad.

3.5.3. Alosterismo

En algunas enzimas y en la hemoglobina se encuentra, además del sitio activo (para el sustrato), otro sitio de reconocimiento para moléculas llamadas efectores alostéricos; la ocupación de este otro sitio determina una inhibición o una activación de la reacción, mecanismo conocido como alostérico. Un mecanismo alostérico es un proceso común en moléculas proteicas en el que la asocia­ción del sustrato está influenciada por la fi­jación de otras moléculas que no son sustratos directos de la proteína. En un pro­ceso alostérico debe haber en la proteína centros separados de fijación para el sustrato (por ejemplo, O2 en el caso de la hemoglobi­na) y el efector (inhibidor o activador) que ejerce el control alostérico.

3.6. MÉTODOS DE SEPARACIÓN Y ANÁLISIS

3.6.1. Cromatografía

Las experiencias en cromatografía se re­montan a 1850, cuando Runge describió un método para el análisis de mezclas de colo­rantes, aplicando gotas de colorantes en pa­pel y notando la separación en diferentes colores. Sin embargo, el crédito del descu­brimiento de'la cromatografía se le dá al bo­tánico Tswett, quien en 1906 efectuó la separación de mezclas de pigmentos vegeta­les en un tubo conteniendo material adsor­bente só l ido f inamente d iv id ido. La separación cromatográfica se basa en el coe­ficiente de partición líquido-líquido de los compuestos.

La cromatografía en papel, como todas las técnicas simples, ha revolucionado la se­

paración y detección de productos de reac­ción y la determinación e identificación de compuestos. Desarrollada en 1944 por Mar­tin en Inglaterra, consiste en colocar en tiras de papel como soporte de una fase estacio­naria acuosa mientras una fase móvil orgá­nica se desplaza en la tira, gotas de la sustancia a separar cerca del punto donde partirá el desplazamiento de la fase orgánica (fig. 3.18).

La relación de la distancia recorrida por el compuesto entre la distancia que recorre el frente del solvente desde el sitio de aplica­ción se conoce como valor Rf (relación de frentes) del compuesto. Bajo condiciones estrictamente controladas el Rf es una cons­tante importante para propósitos de identifi­cación.

El método descrito es cromatografía uni­dimensional. La cromatografía bidimensio-nal es una variante de considerable poder de separación, ya que se emplean dos diferen­tes solventes aplicados secuencialmente pa­ra desplazar un solo compuesto (fig. 3.19).

La gota del compuesto (generalmente un aminoácido o un péptido) se "revela" como una mancha en el papel. El material usado como revelador es usualmente la ninhidrina mencionada antes.

La cromatografía en capa fina utiliza el mismo principio de la cromatografía en pa­pel (cromatografía de adsorción); el soporte utilizado es sílica gel o celulosa colocadas en una hoja de vidrio o plástico en forma de capas muy finas. En este proceso, la separa­ción cromatográfica es muy rápida (fig. 3.20).

Las dos primeras técnicas descritas se uti­lizan generalmente para separar e identificar aminoácidos o péptidos pequeños. A conti­nuación se describirán técnicas para la sepa­ración e identificación de proteínas.

También utilizando una separación en co­lumna, pero aprovechando las cargas resi­duales de las proteínas como carácter diferencial, se describe la cromatografía de

Figura 3.18 Cromatografía en papel.

intercambio iónico. Las resinas de intercam­bio iónico para preparar la columna croma-tográfica, se preparan a partir de materiales insolubles (agarosa, poliacrilamina, celulosa, etc.) que contienen ligandos cargados negati­vamente (R-CH3-COO--SO5) o ligandos cargados positivamente (dietilamino) uni­dos a la resina insoluole.

Las resinas cargadas negativamente fijan cationes conociéndose como resinas de in­tercambio catiónico. Igualmente, las resinas cargadas positivamente fijan aniones y se denominan resinas de intercambio aniónico. El grado de retención o retardo de una pro­teína (o aminoácido) por una resina depen­derá del número de cargas (positivas o negativas) de la proteína al pH del experi­mento (revisar pl de una proteína). Aquellas moléculas proteicas con la misma carga que la resina se eliminarán primero, seguidas por proteínas de carga opuesta, que por atrac­ción de cargas, se retendrán más tiempo en la columna. Cuando es difícil eliminar una molécula fuertemente atraída por la resina, se utilizan cambios de pH o fuerza iónica para debilitar la interacción.

Los derivados de celulosa como carboxi-metil celulosa (CMC) y dietilaminoetil celu-

cero), no se desplazan ni hacia el cátodo ni hacia el ánodo en un campo eléctrico. El punto isoeléctrico (pl) de un aminoácido se define como el pH en el cual no tiene carga eléctrica neta; en el caso de los aminoácidos con sólo un grupo amino y uno carboxilo co­rresponde a la siguiente ecuación:

pl = | (PK1+ pK2)

Si consideramos la curva de titulación de un aminoácido sencillo como la glicina, su equilibrio de ionización corresponde a:

A pH de 1 la forma iónica predominante tiene una carga de +1 (forma catiónica) y se desplazará hacia el cátodo en un campo eléctrico. La adición de base hasta alcanzar la forma de zwitterión, corresponde al punto isoeléctrico (pl=5.97).

La adición de base a la forma dipolar de la glicina, completa la titulación del grupo -NH 3, el pH de la solución es superior a 11.5 y la especie predominante tiene una carga formal de -1 (forma aniónica).

Como puede verse en la fíg. 3.5, la glicina y otros aminoácidos con cadena lateral no ionizable y valores de pKi próximos a 2.5 y de pK2 próximos a 9.5, pueden actuar como amortiguadores en dos zonas de pH, donde ninguna les permite actuar como amortigua­dores al pH fisiológico del plasma.

Precisamente, el pH de 7.4 es un valor cercano al pl de dichos aminoácidos, y éste es el punto de menor solubilidad de aminoá­cidos y proteínas.

Un caso más complejo lo constituyen los aminoácidos con un grupo ionizable en su cadena lateral. Tal es el caso del ácido glutá-mico y del aspártico que poseen un grupo

losa (DEAE) se han utilizado con éxito en la identificar se pasa a través de una columna purificación de proteínas. empaquetada con pequeñas esferas de resina

En la cromatografía líquida de alta reso- insoluble. Como en esta técnica la resina es-lución, la mezcla de proteínas a separar e tá tan densamente empaquetada se requiere

de bombeo a elevada presión para forzar el paso de la proteína. En esta técnica la co­lumna es metálica y no de vidrio como la cromatografía a presión normal. Las esferas de resina pueden cubrirse con grupos carga­dos, como en la cromatografía de intercam­bio iónico, o con residuos hidrofóbicos con lo que las moléculas no polares se retrasarán al paso por la resina. Las esferas pueden ser porosas y actuar con el mismo principio de la cromatografía de exclusión molecular, se­parando moléculas grandes de las pequeñas.

La cromatografía de afinidad se basa en la alta afinidad que tienen las proteínas por sus sustratos, grupos prostéticos, receptores de membrana, inhibidores no covalentes es­pecíficos y anticuerpos específicos. Estos compuestos de alta afinidad se pueden unir en forma covalente a una resina insoluble y utilizarse para purificar una proteína me­diante cromatografía en columna.

3.6.2. Filtración en gel

La separación de proteínas de diferente ta­maño haciéndolas pasar a través de una co­lumna empaquetada con un gel poroso en forma de pequeñas esferas insoluoles se de­nomina filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular. El polisacárido dextra-na es tratado químicamente para que se for­men enlaces cruzados que den un retículo o malla por la cual pueden pasar moléculas pequeñas. Esta sustancia queda como pe­queñas esferas hidrofílicas, pero insolubles, que al colocarlas en agua se hinchan para formar un gel insoluble. El nombre comer­cial de este gel es sephadex.

Las proteínas pequeñas pueden penetrar por los poros del gel, por lo que tendrán que desplazarse por espacios sinuosos y viajar más a través de la columna, que las proteí­nas grandes, las cuales, al no poder penetrar por el retículo del gel, son excluidas por mo­tivos estéticos. En consecuencia, una mez­

cla de proteínas se separa en función del ta­maño saliendo primero las proteínas más grandes y a continuación las más pequeñas, las cuales se retardan por tener que viajar por el retículo del gel (fig. 3.21).

Figura 3.21 Filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular en columna

El bioquímico tiene para elegir varios ti­pos de sephadex para preparar columnas. Así, el sephadex G-25 excluye compuestos de peso molecular de 3,500-4,500, sephadex G-50 para PM de 8-10,000 y sephadex G-75 para 40-50,000 de PM. Los geles de sepha­dex G-100 y G-200 se utilizan para separar proteínas de alto peso molecular.

3.6.3. Electroforesis

El movimiento de una partícula cargada en un campo eléctrico externo, hacia el electro­do de carga opuesta se denomina electrofo­resis. La electroforesis de proteínas se ha llevado a cabo de acuerdo al principio desa­rrollado por el sueco Tiselius en 1937. Se­gún esta técnica, se hace pasar durante un cierto tiempo, una corriente eléctrica a tra-

vés de un tubo en U (un electrodo en cada extremo) lleno con una proteína disuelta en un amortiguador con la misma fuerza ióni­ca, pH y conductividad. Durante la electro-foresis, las diferentes proteínas migran hacia el electrodo de carga opuesta. El grado de migración depende de las cargas de la pro­teínas, del P.M. y de la forma. El sitio donde se concentra la proteína en el tubo puede ser determinado por un proceso óptico. La luz refractada nos da un patrón de picos, cada pico representa la separación entre la molé­cula proteica y el amortiguador (fig. 3.22).

El aparato de Tiselius se utilizó para de­terminar el punto isoeléctrico y la movilidad electroforética de las proteínas. Una modifi­cación altamente simplificada de la técnica electroforética de Tiselius es la llamada eléctroforesis de zona. En ésta, la separa­ción electroforética se realiza sobre un so­porte inerte como papel, almidón, agar, acetato de celulosa y, el más reciente gel de poliacrilamida. La medida de la concentra­ción de cada proteína separada se hace por revelado y lectura en un densitómetro.

Variantes más desarrolladas de la eléctro­foresis simple son la inmunoelectroforesis y el isoelectroenfoque. La primera combina la separación electroforética con la especifici­dad de las reacciones inmunológicas. Es es­pecialmente útil para separar proteínas y otras sustancias antigénicas con carga, particularmente las proteínas plasmáticas (fig. 3.23). El isoelectroenfoque ofrece una resolución sumamente elevada. En esta téc­nica se utilizan mezclas de anfolitos formados por ácidos poliamino-policarboxílicos con un intervalo de pl definido para establecer un gradiente de pH a través del campo eléctrico aplicado. Una proteína cargada se desplaza­rá a través del gradiente de pH en el campo eléctrico hasta que alcance una región de pH en el gradiente igual al valor de su pl. En es­te punto la proteína se mantiene estacionaria en el campo eléctrico y puede visualizarse o eliminarse de la columna (fig. 3.24).

3.7. PROTEÍNAS DE IMPORTANCIA MÉDICA

En esta sección, se estudiarán algunas pro­teínas con importantes funciones biomédi-cas. Se han escogido las proteínas de transporte, hemoglobina y mioglobina, pro­teínas protectoras como las inmunoglobuli-nas, las proteínas plasmáticas, proteínas estructurales como el colágeno y proteínas contráctiles como la tropomiosina, como ejemplo de proteínas cuya estructura y fun­ción es esencial estudiar para una correcta comprensión de sus procesos bioquímicos normales y de su mal funcionamiento en las enfermedades.

3.7.1. Hemoglobina y mioglobina-

Las hemoglobinas son proteínas globulares, presentes en los glóbulos rojos, que fijan oxígeno en los pulmones y lo transportan por la sangre hacia los tejidos; al volver a los pulmones desde los capilares, actúan como transporte de CO2 y de iones hidrógeno.

La hemoglobina (Hb) está formada por la proteína globina (una histona) y el grupo prostético hemo. La proteína globina desde el punto de vista de su estructura cuaternaria es un tetrámero, es decir, la constituyen 4 subunidades, cada una de ellas formada por cadenas polipeptídicas con dos estructuras primarias diferentes y cada subunidad con su grupo hemo. En la forma más común de hemoglobina humana adulta, HbAí, las dos subunidades de una clase se denominan ca­denas a y los otros dos monómeros de la misma clase se designan como cadenas p. Así, la fórmula tetramérica de la HbAí es 0^2- La hemoglobina fetal (HbF) es 0,272» la hemoglobina de las células falciformes (HbS) es ct2£2 y la hemoglobina menor del adulto (HbA2) es a252- Se conoce la secuen­cia completa de aminoácidos de las cadenas a(141 aminoácidos) y de las cadenas p ,yy 6

(146) aminoácidos). El PM de la hemoglobi­na, incluyendo el grupo hemo, es de aproxi­madamente 67,000. La hemoglobina fue la primera proteína analizada por difracción de rayos X, identificada como una molécula ca­si esférica con un diámetro de 5.5 nm (fig. 3.25). Su concentración en la sangre huma­na es de 16 g por 100 mi.

La mioglobina (Mb) es una proteína que almacena 02 en el tejido muscular rojo. A diferencia de la hemoglobina, la mioglobina está compuesta por una sola cadena polipep-tídica (monómero) y un solo centro de fija­ción de 02 (hemo). La cadena polipeptídica consta de 153 aminoácidos y tiene un PM de 17,000. El polipéptido P de la Hb es muy se­mejante a la mioglobina. Su distribución es­pecial es el de una superficie polar y el interior no polar, patrón característico de las proteínas globulares.

El grupo prostético hemo es una molécula de porfirina, un tetrapirrol cíclico, que con­tiene un átomo de hierro en su centro. El tipo de porfirina de la hemoglobina y la mioglo­bina corresponde a la protoporfirina IX con dos propionilos, dos vinilos y cuatro metilos como cadenas laterales unidos a los grupos pirrólicos (fig. 3.26). El átomo de hierro, tanto en la hemoglobina como en la mioglo­bina, se encuentra en estado ferroso (Fe2*).

El quinto enlace de coordinación del áto­mo ferroso de los hemos es con el nitrógeno imidazólico de una histidina {histidina pro-ximal de la apoproteína). En las cadenas po-lipeptídicas con 02 ligado, esta molécula

Figura 3.25 Estructura cuaternaria de la hemoglobina.

forma un sexto enlace coordinado con el Fe2+ y el segundo imidazol de una histidina distal de la globina. El hemo se sitúa dentro de un espacio hidrofóbico en cada una de las subunidades de globina. De esta manera, las 4 subunidades se disponen en un arreglo es­pacial tetraédrico preciso, con las cadenas en contacto con las P; los grupos hemo se lo­calizan en la periferia.

Cinética de oxigenación de hemoglobina y mioglobina

La hemoglobina se combina con el oxígeno y se transforma en oxihemoglobina (Hb02); en realidad fija ocho átomos de oxígeno por tetrámero (dos por cada subunidad). Esta combinación se lleva a cabo sin alterar la va­lencia del hierro que sigue como ferroso, es

decir, no es una oxidación sino una oxigena­ción. Cuando la hemoglobina se oxida quí­micamente, el hierro pasa de ferroso a férrico (Fe2+ —• Fe3+) y se denomina me-tahemoglobina (MHb); en estas condiciones no transporta oxígeno. Normalmente se forma menos del 1 % de MHb, pero puede produ­cirse un exceso si se ingieren sulfonamidas, nitritos, fenacetina u otros oxidantes.

La curva de saturación de oxígeno con he­moglobina es sigmoidea. Esto se debe a que una vez fijado el primer átomo de 02 facilita la unión del siguiente. Así, la hemoglobina muestra una cinética cooperativa de fija­ción. En cambio, la mioglobina muestra una curva de saturación de oxígeno de tipo hi­perbólica (fig. 3.27), lo que indica que la mioglobina tiene mayor afinidad por el 02

que la hemoglobina y es una molécula ina­decuada como transportadora de 02 pero efi­caz para almacenarlo. Bajo condiciones de escasez de oxígeno (como en el ejercicio in­tenso), la p 0 2 del tejido muscular puede dis­minuir hasta 5 mm Hg. A esta presión, la mioglobina cede con facilidad su oxígeno para apoyar la síntesis oxidativa de ATP en las mitocondrias musculares.

La cooperatividad positiva de la hemo­globina depende de la integridad de la es­tructura cuaternaria; si el tetrámero se disgrega en monómeros, la cooperatividad desaparece y la curva de saturación de oxí­geno adquiere forma hiperbólica. Los datos de cristalografía con rayos X indican que la hemoglobina tiene dos estructuras cuaterna­rias. Las dos formas son de conformación desoxi, llamada "tensa" o estado conforma-cional T; al fijarse el oxígeno a las subunida-des, la conformación pasa del estado T al R ("relajado"). La constante de afinidad del 02

es mayor en el estado R que en el estado T (fig. 3.28). T y R se emplean también para describir las estructuras cuaternarias de las enzimas alostéricas, donde el estado T tiene afinidad menor por el sustrato. En la unidad II, sobre equilibrio ácido base, ya habíamos señalado la influencia del oxígeno sobre el pKa de la hemoglobina:

HHb+40 2 — Hb(02)4+H+ ; es decir, la forma T es más acida. Por tanto, cuando la Hb oxigenada se encuentra a pH bajo (ácido) y C 0 2 alto, tiende a liberar su oxígeno y repre­senta un aumento de oxigenación en tejidos metabólicamente activos. La reducción de la afinidad oxígeno-hemoglobina en un pH ba­jo se denomina efecto Bohr (fig. 3.29).

El efecto Bohr puede encajar en la defini­ción de un mecanismo alostérico, según el cual, en la proteína existe un sitio de fijación para el sustrato y otro para el efector alosté­rico (positivo o negativo). La fijación del efector en el sitio alostérico influye sobre la conformación del sitio del sustrato (sitio ac­tivo). En la hemoglobina el sitio activo es ocupado por el oxígeno y el sitio alostérico es ocupado por el hidrogenión. Al ocupar su sitio el ion H, desplaza a la Hb a la forma T, de afinidad más baja por el oxígeno.

El efecto Bohr, por lo tanto, tiene conse­cuencias fisiológicas importantes. Las células con metabolismo rápido y con requerimien­tos elevados de 0 2 , producen ácido carbónico y ácido láctico que incrementan la concen-

tración de H+ en la célula. Dado que el H+

fuerza alostéricamente hacia la conforma­ción T de la hemoglobina, disminuye la afi­nidad C>2-Hb y se disocia una mayor cantidad de O2 hacia los tejidos. En los pul­mones, la concentración de H+ disminuye, el pH sube, los protones son liberados de la hemoglobina favoreciendo la forma R y la captación de oxígeno. La mioglobina no presenta efecto Bohr.

En resumen, un incremento de hidroge-niones provoca liberación de oxígeno, en tanto que un incremento en el oxígeno causa la liberación de hidrogeniones.

La hemoglobina fetal (HbF) tiene mayor afinidad por el oxígeno que la adulta (Hb A) lo que le permite extraer O2 de la HbA de la sangre placentaria. Después del parto, la HbF es inadecuada, ya que su elevada afini­dad por el oxígeno la haría ceder menos O2 a los tejidos.

En los tejidos periféricos, una disminu­ción de O2 hace que se acumule el 2, 3-di-fosfoglicerato (2,3-DPG), el cual es un efector alostérico de la hemoglobina cuando ésta se encuentra en la forma T. Cuando la liberación de oxígeno está alterada como en

el ascenso a grandes alturas o en la enferme­dad pulmonar crónica, el eritrocito aumenta la producción de 2,3-DPG el cual se une a la forma T de Hb, la estabiliza, y reduce su afi­nidad por el oxígeno. Por lo tanto, un au­mento en el contenido de 2,3-DPG de los eritrocitos hace que la hemoglobina ceda una porción mayor de su oxígeno a los teji­dos.

La hemoglobina se combina con el monó-xido de carbono (CO) para formar carboxi-hemoglobina. En virtud de la mayor afinidad de la hemoglobina por el CO (210 veces), a tensiones iguales de O2 y CO, la fi­jación del CO a la Hb excede con mucho a la del oxígeno. La carboxihemoglobina (Hb-C0) tiene un color rojo brillante característi­co. Para desplazar el CO de la Hb-CO en las personas intoxicadas con este gas se requie­re el uso de la oxigenoterapia hiperbárica (O2 puro a 3 o más atmósferas de presión) para forzar la expulsión del monóxido de carbono.

Además de transportar el oxígeno de los pulmones a los tejidos, la hemoglobina faci­lita el transporte de CO2 de los tejidos a los pulmones. Aproximadamente el 15% del CO2 es transportado como carbodioxihemo-globina o carbaminohemoglobina (Hb-CO2). La interacción del CO2 con la hemoglobina afecta también la transición del estado T al R. El CO2 forma radicales carbamilados reversiblemente con los extre­mos amino de las cadenas polipeptídicas de hemoglobina cuando ésta cede su O2.

Hb-NH2+C02 -* Hb-NH-COO-+H+

Cuando están carbamilados, los extremos tienen carga negativa y pueden formar enla­ces iónicos que estabilizan la estructura cua­ternaria. Los H+ son captados por la Hb que actúa como amortiguadora.

En los pulmones el proceso descrito se in­vierte y conforme el oxígeno se une a la he­moglobina, los H+ se liberan y se unen al HCO3 para formar H2CO3. Por tanto, la fija­ción del O2 obliga a la expulsión del CO2 de acuerdo al efecto de Bohr que ya revisamos.

Hemoglobinas humanas mulantes

Las mutaciones en los genes que codifican las cadenas a y P pueden afectar la función

transportadora de la hemoglobina; cuando esto ocurre, el trastorno se conoce como una hemoglobinopatía. Muchas de las imitantes pueden ser asignadas a una de las cuatro cla­ses siguientes:

Hemoglobina M. Hemos mencionado que en la hemoglobina normal, el grupo hemo funciona con Fe2+ pero pequeñas cantidades se oxidan a férrico (Fe3+)y se transforma en metahemoglobina. En las variantes de he­moglobina M, los residuos His proximal y distal son reemplazados por Tir la cual esta­biliza el Fe en forma oxidada, férrica. En consecuencia se presenta metahemoglobine-mia, la afinidad por el oxígeno está dismi­nuida y puede faltar el efecto Bohr.

Hemoglobinas mutantes con afinidad ma­yor de lo normal por el oxígeno. En estas mutantes se favorece la forma R, por tanto, no cederá suficiente oxígeno a los tejidos. La hipoxia producida conduce a policitemia. Las proteínas mutantes no muestran coope-ratividad en la fijación del oxígeno ni efecto Bohr.

Hemoglobina S (hemoglobina falcifor-me). La sustitución de un solo aminoácido de la cadena P (Glu por Val) produce una hemoglobina que, al cambiar un aminoácido polar (Glu) por uno no polar (Val) se genera en la superficie de la cadena p una zona ad-herente. Esta zona, que se presenta en la HbS desoxigenada, tiene una zona comple­mentaria en la forma oxigenada de la HbA. La unión de zonas complementarias y adhe-rentes hace que la HbS desoxigenada se po-limerice y forme precipitados fibrosos largos que distorsionan mecánica y física­mente al eritrocito, causando lisís. Los eri­trocitos deformados se denominan células falciformes (forma de hoz) y su lisis al pasar por las sinuosidades esplénicas produce anemia. Así, esta enfermedad hereditaria se conoce también como anemia de células fal­ciformes. Los individuos homocígotos (ge­notipo S/S) presentan anemia pero los heterocigotos (genotipo A/S) tienen el rasgo

En el caso de la histidina, las formas iónicas posibles son las observadas en la fig. 3.7.

Obsérvese que la histidina con un pKR= 6.0, muy próximo al pH fisiológico, es el único aminoácido que puede actuar como amorti­guador en los líquidos corporales. Precisa­mente, la hemoglobina contiene una elevada proporción de histidina y posee así un alto po­der amortiguador en los eritrocitos. Por otro lado, este comportamiento excepcional de la histidina le confiere un papel único en las pro­teínas enzimáticas como activador fisiológico. Por ejemplo, una enzima puede requerir un imidazol de una histidina que es esencial en su forma básica para que exista actividad catalíti­ca. A pH 6.0, la mitad de las enzimas estarán en forma básica (imidazol) activa y la mitad en forma acida (imidazolio) inactiva.

A pH 7.0 , el pH es una unidad (10 veces) por encima del pK del imidazolio y el co­ciente imidazol/imidazolio es 10:1; debido a esta proporción la enzima mostrará el 91% de su actividad potencial máxima.

aunque en general no están anémicos. El gene para la HbS manifiesta elevada incidencia en poblaciones expuestas endémicamente al paludismo; esto proporciona cierta protec­ción contra el parásito, que se desarrolla dentro del eritrocito, debido a que las células infectadas requieren más oxígeno que las no infectadas y al adquirir la forma semilunar (de hoz) son eliminadas de la circulación.

Hemoglobinas inestables. En estas mu-tantes, la sustitución de un aminoácido den­tro del espacio para el hemo reduce la afinidad de la subunidad con el grupo pros­tético. Las hemoglobinas mutantes son ines­tables y destruidas porque el hemo que normalmente estabiliza la conformación proteínica no puede unirse a la apoproteína.

Talasemias

Normalmente, las cadenas a y p se produ­cen en una proporción de 1:1. En estas en­fermedades, la síntesis de las cadenas a-o las p de la hemoglobina está disminuida. En consecuencia, se presenta aumento de pro­ducción de la cadena complementaria que precipita intracelularmente y da lugar a la destrucción prematura del eritrocito; esto conduce a formas severas de anemia.

3.7.2. Estructura y función de los anticuerpos

La inmunología estudia todos los fenóme­nos bioquímicos y fisiológicos de defensa gracias a los cuales el organismos distingue lo propio (nuestros tejidos y células) de lo no propio (bacterias, virus, hongos, parási­tos, células tumorales, trasplantes, etc.) y es capaz de destruir a las sustancias extrañas.

Todas las acciones de respuesta a material extraño se denominan respuesta inmune. Esta respuesta puede ser de tipo celular y de tipo humoral. En la respuesta celular inter­

vienen células sanguíneas denominadas lin­focitos T (que maduran en el timo), que ac­túan directamente o bien a través de sustancias por ellas liberadas llamadas linfo-cinas. En la respuesta humoral intervienen los linfocitos B (de bursa o bolsa de Fabricio de las aves), y su acción se ejerce a través de los anticuerpos (inmunoglobulinas) que cé­lulas derivadas de estos linfocitos B segre­gan.

Las moléculas de anticuerpos (Ab) son proteínas que pertenecen a las inmunoglo­bulinas. Cuando se introduce al organismo una sustancia extraña como una proteína, un polisacárido o un ácido nucleico, las células plasmáticas, derivadas de un linfocito B, producen anticuerpos. La molécula de anti­cuerpo se asocia de forma no covalente con la sustancia extraña y la elimina del organis­mo. Las sustancias que inducen la produc­ción de anticuerpos en un organismo se denominan antígenos (Ag).

Para que una sustancia actúe como antíge-no en un organismo debe poseer una estruc­tura química distinta de los constituyentes propios de ese organismo. Por ejemplo, la albúmina de cualquier mamífero, excepto la humana, es antigénica para el hombre cuando se la introduce parenteralmente. Un antíge-no puede contener múltiples determinantes antige'nicos, que son pequeñas regiones de la molécula de antígeno que inducen especí­ficamente la producción de un anticuerpo. En las proteínas, por ejemplo, un determi­nante antigénico puede comprender sólo seis o siete aminoácidos en total de la proteí­na. Un antígeno puede poseer decenas o mi­les de estos grupos determinantes, de tal manera que inducirán múltiples tipos de an­ticuerpos, cada uno de ellos capaz de reco­noce r y u n i r s e a cada u n o de los determinantes (fig. 3.30).

En general, un determinante antigénico solo o una molécula pequeña, no determinan la formación de anticuerpos pero, al unirse covalentemente a moléculas grandes, facili-

Cada anticuerpo se une al determinante antigénico frente al que se ha formado.

ANTICUERPOS (Igs)

Figura 3.30 Esquema de un antigeno, que puede ser una proteína y donde se muestran distintos e hipotéticos determinantes antigénicos y cómo a ellos se pueden unir diferentes anticuerpos de manera especifica.

tan la génesis de anticuerpos dirigidos espe­cíficamente contra la molécula pequeña. A estas moléculas pequeñas se les conoce co­mo haptenos. Es el caso, por ejemplo, de péptidos sintéticos o el 2, 4-dinitrofenol, DNP-glicina, etc. Al tiempo que un hapteno requiere la unión a una molécula grande pa­ra producir anticuerpos, una vez separado de

su portador, el hapteno conserva su capaci­dad de unirse al anticuerpo.

Al estimularse los linfocitos B con un an-tígeno se induce una serie de cambios que los hace transformarse en células plasmáti­cas. Estas poseen la función de sintetizar y secretar inmunoglobulinas a las cuales en un principio, se les denominó anticuerpos; lúe-

go, al descubrirse la electroforesis, y ver que emigraban en la fracción gamma, se les dio el nombre de gammaglobulinas. Sin embar­go, al conocerse con precisión su estructura y función en 1965, se le denominó inmuno-globulinas (Ig).

Estructura de ¡nmunoglobulinas

La heterogeneidad de las inmunoglobulinas fue durante años un serio obstáculo para es­tudiarlas químicamente. Al aislar anticuer­pos contra un solo antígeno, se obtenía una pequeña cantidad de una mezcla de globuli­nas. El conocimiento cada vez más avanzado de ios mielomas y la cantidad anormalmente alta de una proteína presente en la orina de estos pacientes, la proteína de Bence-Jones, contribuyeron a vencer el obstáculo.

El mieloma múltiple es un tipo de cáncer en que se presenta la multiplicación descon­trolada de multitud de células provenientes de una sola célula productora de anticuerpos. Todas las células del tumor son idénticas,

constituyen una clona (células provenientes de una misma estirpe) y por tanto, los anti­cuerpos producidos son idénticos, homogé­neos. En realidad, las proteínas de Bence-Jones son las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que, por su bajo PM, apa­recen fácilmente en la orina. La proteína de Bence-Jones es homogénea para cada indi­viduo con mieloma, aunque es diferente cuando se comparan entre sí las proteínas de diferentes enfermos de mieloma.

Cada inmunoglobulina está formada por una "unidad básica" tetramérica construida por cuatro cadenas polipeptídicas unidas por puentes disulfuro (fig. 3.31). Dos de estas cadenas son de bajo peso molecular y se les denomina cadenas ligeras, L (del inglés light); las de mayor PM se denominan cade­nas pesadas, H (del inglés heavy). En la in­munoglobulina más común, la IgG, su cadena pesada tiene aproximadamente 440 aminoácidos (PM 50,000) y sus cadenas li­geras contienen la mitad de aminoácidos (PM 25,000). En la estructura tridimensio­nal de los anticuerpos, cada cadena H está

asociada con una cadena L (fig. 3.32). La conformación que adopta la molécula com­pleta es de una T o una Y.

La porción central de las cadenas H es una zona (de unos 15 aminoácidos) de gran fle­xibilidad, llamada bisagra o gozne, por donde se deforma la molécula cuando se produce la unión antígeno-anticuerpo (Ag-Ab).

Las cadenas L constan de dos regiones de estructura primaria bien definidas y diferen­ciadas: una región de gran variabilidad en número y secuencia de aminoácidos, deno­minada región variable (V); dentro de la re­gión variable hay zonas hipervariables, con grupos de aminoácidos siempre distintos, determinados por cada antígeno particular.

Estos son los sitios de combinación donde se realiza la unión de la inmunoglobulina con su antígeno; en cierto modo compara­bles al sitio activo de una enzima.

Otra parte de las inmunoglobulinas mues­tra una composición fija en número y orden de aminoácidos que se denomina región constante (C). Las regiones constantes de las cadenas H son las que determinan la cla­se a la que pertenece el anticuerpo (ver más adelante), es la que produce la fijación de las proteínas del complemento y proporciona la región necesaria para que los anticuerpos crucen la membrana placentaria. La parte constante de las cadenas ligeras puede ser de dos tipos, de ahí que existan dos tipos de ca­denas ligeras: kappa (K) y lambda (X). En las cadenas pesadas, la parte constante determi­na cinco tipos: alfa (a), gamma (y), delta (5), mu (ji), y épsilon (e), a los que se refie­

ren las cinco clases diferentes de inmuno-globulinas. Cada clase de inmunoglobulinas sólo contienen un tipo de cadenas pesadas pero pueden contener uno u otro tipo de ca­dena ligera.

Clases de inmunoglobulinas

Las inmunoglobulinas pueden ser de las cla­ses siguientes: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, se­gún posean las cadenas pesadas gamma, mu, alfa, delta y épsilon, respectivamente, (tabla 3.6).

IgG. Esta clase de Ig se encuentra en el plasma a elevadas concentraciones y es la que se forma en mayor cantidad durante la respuesta secundaria a antígenos extraños. Los anticuerpos IgG pueden promover la fa­gocitosis y también activar el complemento;

Tienen la propiedad de atravesar activamen­te las membranas biológicas. El alto nivel de IgG en el feto se debe a que esta Ig atraviesa la placenta. Este hecho, en determinadas cir­cunstancias, puede tener consecuencias ne­fastas para el feto, cuando la madre Rh (-) produce anticuerpos anti Rh (+) contra el fe­to en la llamada enfermedad hemolítica del recién nacido. Se han reconocido 4 subcla­ses de IgG.

IgM. Se encuentran principalmente en el plasma, y son los primeros anticuerpos que actúen contra un antígeno extraño (respuesta primaria). La IgM tanto en sangre como en otros líquidos se encuentra como tetrámero o pentámero, (unidos estos por puentes di-sulfuro) de una estructura cova lente básica [(LH)2]5; de ahí que esta Ig sea la de mayor PM (900,000). Debido a esa estructura pen-tamérica que determina 10 sitios de unión con el antígeno, la IgM es un anticuerpo muy efectivo. Los anticuerpos como los pre­sentes en la artritis reumatoide (anti IgG) son de esta clase. Al igual que las IgG, las IgM pueden promover la fagocitosis de mi­croorganismos por los macrófagos y leuco­citos polimorfonucleares y son potentes activadores del complemento. Se han identi­ficado 2 subclases de IgM.

IgA. Las Ig de esta clase se encuentran principalmente en las secreciones extravas-culares (secreciones mucosas, bronquial, nasal, intestinal, urinaria, lágrimas, leche y calostro). Como tales, estas inmunoglobuli-nas son la defensa inicial contra los antíge-nos virales y bacterianos invasores, con anterioridad a su entrada en el plasma. Se presentan habitualmente como un dímero de la estructura básica (LH2)2- Actúan en forma sinérgica con otras secreciones (lisozima y complemento) para destruir a ciertos mi­croorganismos.

Tanto a los dímeros de IgA como a los pentámeros de IgM se pueden unir dos pép-tidos adicionales que son la pieza de secre­ción y la cadena J. La pieza de secreción es

una glicoproteína que se sintetiza en células epiteliales de mucosas y glándulas exócri-nas; es la que permite a IgA e IgM salir a las secreciones biológicas.

IgD. Está presente en la superficie de los linfocitos del recién nacido. Parece partici­par en la diferenciación de linfocitos B a cé­lulas plasmáticas.

IgE. Aunque presente en plasma en con­centraciones bajísimas es la inmunoglobuli-na que determina las reacciones alérgicas y anafilácticas, como son asma bronquial, ri­nitis alérgica, urticaria, ciertos casos de der­matitis, incluso el más grave de todos, el choque anafiláctico. La IgE posee la capaci­dad de unirse por su extremo Fe (ver adelan­te) a los mastocitos o células cebadas. Cuando los mismos antígenos que indujeron su formación vuelven a entrar, se unen por el extremo Fab, se producen cambios alosté-ricos y se liberan grandes cantidades de his-tamina, serotonina, leucotrienos y otras sustancias vasoactivas que producen vasodi-latación periférica o broncoconstricción; es­to puede acarrear la muerte del individuo por hipotensión e insuficiencia respiratoria.

Fijación de antígeno por molécula de anticuerpo

Las regiones variables de las cadenas L y H constituyen un centro de fijación de anti­cuerpo. Dado que cada unidad básica de an­ticuerpo contiene dos pares de cadenas (LH)2, existen dos centros de fijación de an­tígeno por molécula de anticuerpo. Esta ca­racterística ha podido ser estudiada tratando las Ig con papaína, enzima que divide la molécula en tres fragmentos (fig. 3.33), dos de los cuales son iguales entre sí y compren­den la porción NH2- terminal de la cadena H y toda la cadena L. Estos fragmentos se de­signan fragmentos Fab (antigen binding) y pueden fijar antígenos con una afinidad si­milar a la del anticuerpo completo. El otro

Figura 3.33 Hidrólisis de la IgG en los fragmentos Fab y uno Fe por la enzima proteolítica papaina.

fragmento conocido como Fe (cristaliza-ble), es la mitad COOH- terminal de las ca­denas H y no puede fijar antígeno, por lo que se deduce que hay dos centros de fijación de

Ag por molécula de Ab) situados en los extre­mos amino-terminales de las cadenas H y L que comprende las secuencias variables de aminoácidos. La valencia 2 que tiene cada molécula de Ab permite que cada Ab fije dos Ag diferentes. Esta propiedad favorece la aglutinación y precipitación clásicas de la reacción antígeno-anticuerpo (Fig. 3.34). La fuerza de asociación entre Ag y Ab se debe a fuerzas no covalentes.

Es evidente que existen sobradas razones para hablar más extensamente de los fenó­menos inmunológicos en medicina; basta mencionar la inmunidad a las infecciones, las reacciones de hipersensibilidad y alergia, la autoinmunidad, los trasplantes y el cán­cer. Sin embargo, escapa a los objetivos de este texto de bioquímica cubrir estos tras­cendentales aspectos que pueden consult­arse en obras dedicadas a esas disciplinas.

3.7.3. Proteínas plasmáticas

El plasma es el medio líquido de suspensión de los elementos sólidos de la sangre (eritro­citos, leucocitos, plaquetas, etc.). Si se toma una muestra de sangre, se deja coagular y se separa el coágulo, el líquido remanente es el suero; éste no contiene elementos figurados (células) ni fibrinógeno, proteína involucra­da en la formación del coágulo. Por el con­trario, si se impide la coagulación de la sangre y se separan las células, el líquido re­sultante es el plasma, que contiene lo mismo que el suero y además fibrinógeno. En resu­men, la sangre sin elementos celulares es el plasma y el plasma sin fibrinógeno es el sue­ro.

Aunque en el plasma se encuentran más de 200 proteínas, muchas no son estricta­mente "plasmáticas" ya que se encuentran ahí sólo transitoriamente o experimentando parte de su catabolismo. El término proteí­nas plasmáticas se restringe a unas 50 molé­culas que realmente llevan a cabo funciones

Figura 3.34 Unión de anticuerpo a antígenos en reacciones de precipitación (a) y en reacciones de aglutinación (b).

específicas en el plasma: de transporte, nu­tritiva, reguladora del equilibrio hídrico y ácido base, inmunitaria, etc.

La facilidad con la que pueden obtenerse muestras de sangre ha permitido que el estu­dio de sus constituyentes sea uno de los pila­res más importantes del desarrollo de la bioquímica en general y, en particular, de la bioquímica clínica.

Las proteínas plasmáticas son una mezcla muy heterogénea que comprende no solo proteínas simples, sino también conjugadas, como las glucoproteínas y lipoproteínas.

Las primeras técnicas de separación, elec-troforesis e inmunoelectroforesis, permitió separarlas en diferentes componentes: albú-mina^lobulinas^y fibrinógeno (ver subcapí-tulos 3.6.3). A medida que las técnicas de fraccionamiento se hicieron más resolutivas, se identificaron subgrupos de globulinas (a, p y y) que con las primeras técnicas migra-ban juntas. Hasta hoy se han aislado puras

unas 70 proteínas plasmáticas; seguramente quedan muchas por descubrir y caracterizar.

En la tabla 3.7 se muestran las principales proteínas plasmáticas, ordenadas de acuerdo a su movilidad electroforética. Como se po­drá observar, la mayoría contiene un resto glucídico.

F'realbúmina. Esta es una de las proteínas que une y transporta hormonas tiroideas, aunque también fija algunos fármacos como aspirina y barbitúricos.

Albúmina. Es una de las pocas proteínas del plasma que carecen de carbohidratos. Es la más abundante (55%) y tiene un PM muy bajo (69,000); por lo tanto, la albúmina es responsable del 80% de la presión osmótica coloidal total deljílasma. Está compuesta por 610 aminoácidos en una sola cadena po-lipeptídica con 50% de a-hélice y 15% de estructura p. Se sintetiza exclusivamente en el hígado a razón de 20g al día y tiene una vida media de 10 días.

Además de contribuir a la presión osmóti­ca coloidal, la albúmina actúa como molécu­la transportadora de bilirrubina, ácidos grasos, oligoelementos y algunos fármacos: cafeína, salicilatos, fenilbutazona, antibióti­cos, digitálicos, barbitúricos, etc. También se fija a la albúmina el triptófano, hecho im­portante porque un incremento de su con­cen t r ac ión l ibre r e p e r c u t e sob re e l funcionamiento cerebral (por aumento de serotonina cerebral).

Su función nutritiva consiste en proveer de aminoácidos utilizables para la síntesis de proteínas del organismo. En casos de desnutrición grave, disminuye la síntesis de proteínas y se presenta hipoalbuminemia. Esta hipoalbuminemia repercute, sobre to­do, en la función coloidosmótica; en las en­fermedades renales y hepáticas que también se acompañan de hipoalbuminemia, se pre­senta edema tisular (ver unidad 2, subcapí-tulo 2.2.2.1). Además, la albúmina a pH 7.4

posee 17 cargas negativas que, por el efecto Gibbs-Donnan, aumentan la concentración plasmática de cationes y ocasiona indirecta­mente un aumento de presión osmótica.

ok\-glucoproteína acida. Contiene un alto contenido en carbohidratos, sobre todo áci­do siálico, responsable éste del bajo punto isoeléctrico (3.5) de la proteína, el más bajo de todas las plasmáticas. Se sintetiza en el hígado y por su abundancia en plaquetas se le ha relacionado con la coagulación.

ai-antitripsina. Forma parte de otras pro­teínas antiproteásicas; ésta posee el 90% de la capacidad antiproteásica total del plasma. Su actividad antiproteasa es polivalente (tripsina, quimotripsina, colagenasa, elasta-sa, etc.) pero sobre todo sobre la elastasa de origen neutrófüo. Según la teoría elastasa-antielastasa del enfisema (destrucción de al­veolos pulmonares y ensanchamiento de bronquiolos), los neutrófilos pulmonares li­beran elastasa de sus lisosomas; en ausencia

de al-antitripsina, las células pulmonares son sensibles a la proteasa que destruye la elastina de las fibras y disminuye la elastici­dad pulmonar, ocasionando insuficiencia respiratoria crónica. Contribuye a la enfer­medad el humo de tabaco que inhibe a la an­titripsina. Sería interesante prevenir a fumadores potenciales con fenotipos predis­ponentes al efisema.

a\-Fetoglobulina. Llamada también a l -fetoproteína, posee gran afinidad por los es-trógenos. Su concentración aumenta en tumores digestivos, carcinoma hepático y tumor embrionario del testículo. En líquido amniótico se ha encontrado elevada en em­barazos que conllevan fetos anencefálicos.

a\-Antiquimotripsina. Es otra de las anti-proteasas plasmáticas. Se ha sugerido un pa­pel protector de las mucosas, dada su concentración en la secreción bronquial.

Transcortina- Se denomina también glo­bulina fijadora de corticosteroides.

Globulina fijadora de tirosina. Incorpora las dos terceras partes de las hormonas tiroi­deas circulantes.

Inter-al-inhibidor de la tripsina. Da cuenta del 3% de la capacidad antiproteasa plasmática.

Proteína ligadora de retinol. Su papel es transportar la vitamina A.

al-Macroglobulina. Es la proteína plas­mática de mayor peso molecular, se une prácticamente a todas las endopeptidasas.

^-Globulina ligadora de esteroides. Se une específicamente a los esteroides testostero-na, androstanolona y estradiol.

Haptoglobina. Constituye el 25% de las proteínas plasmáticas. Su función es unirse irreversiblemente a la hemoglobina con lo que se excede el umbral renal de excreción; se lo­gra así un ahorro de hierro y se protege al riñon del efecto nocivo de la hemoglobina libre.

Hemopexina. Su papel consiste en la fija­ción del grupo hemo con lo cual se impide su excreción urinaria y contribuye al ahorro de hierro, que es reutilizado por el hígado.

$2-Microglobulina. Es sintetizada por las células linfoides. Es una proteína de mem­brana de linfocitos, plaquetas, células PMN y de cultivos de carcinoma mamario, pul­món embrionario, etc. Aumenta en enferme­dades malignas y en pacientes con riñones trasplantados.

Otras proteínas de la fracción a-globulí-nica son la ceruloplasmina, que transporta cobre y parte de las lipoproteínas. En la fracción fi-globulínica se encuentran tam­bién la P1 -glucoproteína específica del em­barazo, la proteína C reactiva (que aumenta en procesos infecciosos y denominada así porque precipita al polisacárido C del neu­mococo), parte de las lipoproteínas, la transferrina, que transporta hierro, y las proteínas relacionadas con la coagulación.

Fracción y-globulínica. Está integrada por las inmuno globulinas que se trataron en el subcapítulo 3.7.2.

Lipoproteínas plasmáticas. Dentro de las proteínas plasmáticas se encuentra este gru­po complejo de proteínas y lípidos unidos por fuerzas no covalentes, que por su impor­tancia en el transporte de lípidos es más conveniente tratar en el capítulo correspon­diente al metabolismo de estas sustancias.

Factores de la coagulación

Se define como hemostasia el cese de la he­morragia que sigue a la interrupción traumáti­ca de la integridad vascular. La coagulación sanguínea es uno de los tres mecanismos que contribuyen al proceso fisiológico de la he­mostasia. El primero de estos mecanismos es la constricción del vaso dañado con objeto de frenar la salida de sangre de la herida; la se­gunda fase consiste en la formación de un trom­bo o coágulo blanco de plaquetas en el lugar del daño; la tercera fase es la formación de un coágulo sanguíneo insoluble o trombo rojo.

En la primera fase participan sustancias vasconstrictoras locales cuya acción es lúe-

Las proteínas son moléculas formadas por aminoácidos por un enlace particular (enlace peptídico) que bloquea los grupos ct-amino y a-carboxilo, excepto en el aminoácido ini­cial y el terminal. De esta manera, en las proteínas la existencia de grupos ionizables dependerá de las cadenas R laterales de los aminoácidos, y el valor del pl característico de una proteína dependerá de las concentra­ciones relativas de los diferentes grupos áci­dos y básicos. En virtud de que el pH isoeléctrico de una proteína es difícil de cal­cular a partir de los valores de pK de sus aminoácidos constituyentes, los valores de pl de las proteínas se miden experimenta 1-mente determinando el pH en el que la pro­teína no se mueve en un campo eléctrico.

Al igual que con los aminoácidos, a un pH superior al pl, la proteína tendrá una carga neta negativa. A un pH inferior al pl la pro­teína tendrá una carga neta positiva. La im­portancia del cálculo del pl de una proteína se tratará más adelante en este capítulo.

3.7.3. Reacciones químicas de los aminoácidos

Los aminoácidos pueden presentar reaccio­nes químicas a tres niveles: en el grupo a -amino, en el a-carboxilo y en los grupos activos de la cadena lateral R. No obstante que no es objetivo primordial de este texto revisar exhaustivamente el alto número de reacciones posibles, se considerarán aque­llas reacciones importantes de identificación de aminoácidos.

3.13.1. Reacciones del grupo a -carboxilo

El grupo carboxilo a puede esterificarse con alcoholes o formar amidas en presencia de amoniaco.

El grupo carboxilo de un aminoácido pue­de reaccionar con el grupo amino de otro pa­ra formar, por medio de un enlace peptídico, un dipéptido.

go amplificada por serotonina, adrenalina, y una potente sustancia vasoconstrictora deri­vada de prostaglandinas, el tromboxano A2 que, en conjunto con el ADP liberado del te­jido colágeno, contribuyen a la agregación plaquetaria para formar el tapón laxo de plaquetas que constituye la segunda fase. Esta fase de la hemostasia se mide mediante el tiempo de sangrado.

La coagulación sanguínea o tercera fase, que culmina con la formación del trombo rojo de eritrocitos y fibrina, se puede llevar a cabo a través de dos vías {extrínseca e in­trínseca) que convergen en una ruta final común que, al activar el factor X, la pro-trombina se transforma en trombina, la cual cataliza la transformación de fibrinógeno (soluble) en el coágulo de fibrina (insolu-ble).

La vía extrínseca es la que sigue a una le­sión en respuesta al daño tisular, debido a la presencia de sustancias que no están presen­tes normalmente en la sangre. La vía intrín­seca se inicia a través del contacto de la sangre con una superficie distinta de los va­

sos sanguíneos, por ejemplo, una pared vas­cular anormal o un área de circulación san­guínea restringida. A causa de una herida se desencadenan ambos mecanismos, pues la sangre entra en contacto con una superficie ajena a los vasos y, además, con otras sus­tancias de los tejidos que interaccionan con ella. Las dos vías convergen en el camino común y finalmente se forma el coágulo.

El elevado número de factores plasmáti­cos de la coagulación ha obligado a estable­cer por parte de un Comité Internacional, una nomenclatura para los mismos. En ésta, cada factor se designa por un número roma­no de acuerdo al orden cronológico de su descubrimiento pero que no tiene relación con el orden en el cual actúa (tabla 3.8).

Vía extrínseca. Esta vía es sumamente rá­pida en respuesta al daño tisular. Se inicia con la liberación de un factor tisular, la tromboplastina, que forma un complejo ac­tivo, en presencia de Ca2+, con el factor Vlla (activado) plasmático. La tromboplastina ti­sular es una lipoproteína que se encuentra ampliamente distribuida en las membranas

de los tejidos, especialmente cerebro, pul­mones y capas del endotelio vascular.

Vía intrínseca. Esta es una vía lenta, por­que en ella intervienen un número mayor de factores que, al operar en un mecanismo de cascada, generan el factor Xa (activado). Se inicia con la fase de contacto en la cual se activa parcialmente el factor XII, enzima que cataliza la transformación de prekali-kreína (factor Fletcher) en kalikreína, enzi­ma autocatalítica, que ataca al factor XII y lo activa totalmente (Xlla). El sustrato princi­pal del factor Xlla es el factor XI el cual es activado (Xla). La acción del factor Xla constituye la última etapa del sistema intrín­seco; su sustrato es el factor IX el cual se ac­tiva en dos etapas con participación de Ca2+.

La activación del factor X constituye la etapa clave y vía común de la coagulación al estar regulada por las vías extrínseca e in­trínseca. La activación del factor X, catali­zada por el factor IXa, es acelerada 500 veces por la presencia del factor VIII o fac­tor antihemofílico; este último factor es acti­vado previamente por trombina (fíg. 3.35).

La formación de la red de fibrina se inicia con el paso de protrombina a trombina, cata­lizado por el complejo Xa-Ca2+-Va-FL. La velocidad de activación de la protrombina por el factor Xa aumenta 50 a 100 veces en presencia de fosfolípidos (FL) y Ca2+. El co-factor Va acelera el proceso unas 350 veces. El valor global del complejo activador de protrombina es de 20,000 veces.

El paso de fibrinógeno a fibrina se produce por la acción proteolítica de la trombina sobre el fibrinógeno, que se encuentra a una alta concentración en el plasma. El fibrinógeno pasa, así, a la forma de monómero de fibrina; estos monómeros se asocian y forman una fibra polimerizada conocida como coágulo blando cuyo paso a la estructura insoluble lla­mada coágulo duro o red de fibrina requiere la presencia del factor XHIa como catalizador.

En situación normal, los procesos de for­mación del coágulo están bloqueados por

sustancias inhibidoras de la coagulación que aseguran la ausencia de trombos intra-vasculares. Estas sustancias son principal­mente la heparina, las antiproteasas descritas anteriormente y, fundamentalmente, la anti-trombina III; el efecto de la antitrombina es potenciado varios cientos de veces por hepa­rina. La heparina se localiza en los granulos metacromáticos de las células cebadas que se localizan en la pared vascular, por lo que su distribución es muy amplia.

El proceso de disolución del coágulo a los pocos días de su formación, llamado^fer/nd-lisis, se inicia con la activación del plasmi-nógeno plasmático a plasmina, que es una serinproteasa capaz de digerir tanto al fibri­nógeno como a la fibrina. El activador del plasminógeno es una serinproteasa tisular catalíticamente inactiva hasta que se expone a la fibrina; cuando la plasmina digiere a la fibrina, el activador ya no manifiesta acti­vidad y la fibrinólisis cesa. Existe interés terapéutico en este activador tisular del plas­minógeno, para reducir el daño de una trombo­sis coronaria aguda. Así mismo, la urocinasa serinproteasa sintetizada en el riñon y la es-treptocinasa del estreptococo p-hemolítico, estimulan la activación del plasminógeno. Las propiedades anticoagulantes de la es-treptocinasa se utilizan a nivel terapéutico.

Otros factores anticoagulantes de uso te­rapéutico incluyen a los cumarínicos, que inhiben la carboxilación, dependiente de vi­tamina K, de los residuos de glutamato a carboxiglutamato (Gla) en las regiones NH2-terminales de los factores II, VII, IX y X. El dicumarol, antagonista de la vitamina K, se usa como anticoagulante en pacientes predispuestos a formar coágulos intravascu-lares.

3.7.4. Glicoproteínas y proteoglicanos

Las glicoproteínas y proteoglicanos son mo­léculas constituidas por proteínas a las cua-

les se han agregado cadenas de oligosacári-dos unidos por covalencia. Casi todas las proteínas plasmáticas, excepto la albúmina, son glucoproteínas. Muchas proteínas de membrana, los grupos sanguíneos y algunas hormonas, son glucoproteínas. Muchos in­vestigadores del cáncer piensan que el fenó­meno de la metástasis se debe, por lo menos en parte, a alteraciones de las glucoproteínas de la superficie de las células cancerosas. Las glicoproteínas forman la mayor parte

del mucus secretado por las células epitelia­les que permite la lubricación de los conduc­tos del cuerpo. Las glucoproteínas son proteínas con pesos moleculares que van de 15,000 a más de un millón, a las cuales se unen una o varias cadenas de oligosacáridos (menos de 15 azúcares) que contribuyen con 60%. Los proteoglicanos son de mayor ta­maño en comparación con la glucoproteí­nas, su PM es de varios millones, tienen 90-95% de carbohidratos, con múltiples ca­denas de glicosaminoglicanos. La heparina es un proteoglicano en la que más de la mi­tad de las serinas se encuentran enlazadas con cadenas de polisacáridos. Además de anticoagulante, la heparina se une a la lipo-proteinlipasa de la pared capilar y causa su liberación.

En el aspecto estructural, es importante la unión entre la glicoproteína colágena y los proteoglicanos con sulfato y carboxilato (ver más adelante).

Por defectos hereditarios en la enzima lisosomal encargada de hidrolizar los glico­saminoglicanos presentes en los proteoglica­nos, se produce un grupo de enfermedades, clasificadas dentro de los errores innatos del metabolismo, llamadas mucopolisacarido-sis; (ver unidad de carbohidratos).

Es de particular interés el estudio de estos compuestos en medicina, en particular de la microbiología, en virtud de que la pared bacteriana está construida por peptidoglica-nos, entre otras moléculas. Las bacterias gram positivas tienen una pared que contiene pep-tidoglicanos y ácido teicoico, cuya síntesis es bloqueada por penicilina. La especifici­dad de las reacciones inmunológicas a las bacterias depende de los peptidoglicanos de su pared.

3.7.5 Colágeno y proteínas contráctiles.

El colágeno, principal proteína del tejido conectivo es la proteína más común en el

mundo animal y más abundante del cuerpo humano. Es una proteína insoluble en agua, rígida y muy resistente a la tensión; es la que proporciona fuerza estructural y forma a todos los tejidos y órganos del cuerpo. Pre­domina en el tejido conjuntivo o conectivo donde forma parte de los tendones, cartíla­gos, cristalino, piel, etc. (tabla 3.9). La gela­tina, proteína de uso común, se obtiene como alimento desnaturalizando el coláge­no por el calor.

Se denomina sustancia fundamental o ba-sal a la estructura de carácter gelatinoso compuesta de fibrillas de colágeno incrusta­das en un matriz de polisacáridos aminados y glicoproteínas.

En la estructura del colágeno predomina la glicina (35%), prolina (10.12%), alanina (11 %) y los aminoácidos derivados hidroxi-prolina (10%) y 5-hidroxilisina (10%). No posee triptófano ni cisterna. La unidad mole­cular básica del colágeno en las fibrillas contiene tres cadenas polipeptídicas, con una glicina cada tercer aminoácido, que se de­nomina tropocolágeno, o según la termino­logía más reciente, simplemente colágeno.

Existen por lo menos 5 tipos distintos de colágeno en los tejidos por lo que se consi­dera una familia de moléculas que compar­ten numerosas propiedades. La propiedad

más definida es la triple hélice, estructura enrollada de tres subunidades polipeptídicas unidas entre sí por puentes de hidrógeno. La prolina determina su arreglo helicoidal y el pequeño tamaño de la glicina asegura la ínti­ma unión de las tres cadenas que permite una estructura de superhélice (fig. 3.36).

Síntesis de colágeno. El colágeno maduro es una proteína extracelular pero su síntesis es de inicio intracelular bajo la forma de una molécula precursora llamada preprocoláge-no. Este precursor pierde una secuencia guía de 100 aminoácidos (péptido señal) y se transforma en procolágeno; en está forma las hidroxilasas de prolina y lisina las trans­forma en hidroxiprolina e hidroxilisina res­pectivamente. Estas enzimas requieren oxígeno molecular, a-cetoglutarato, hierro ferroso y, sobre todo, ácido ascórbico; du­rante la adolescencia hay una gran demanda de vitamina C para este tipo de reacciones. En ausencia de ácido ascórbico, se forma un colágeno con dificultad para formar fibras, ocasionando fragilidad de los tejidos y la aparición de lesiones de la piel, huesos, dientes y vasos sanguíneos, todas ellas ca­racterísticas del escorbuto. Posteriormente, el procolágeno es glicosilado, con glucosa o galactosa, en las hidroxilisinas. En una etapa posterior, se forman puentes disulfuro entre cadenas de procolágeno y se integra una tri­ple hélice que sale de la célula. Después de la formación de triple hélice, no puede ocu­rrir una hidroxilación ulterior de los resi­duos de prolina y lisina.

Después de este proceso intracelular, el procolágeno glicosilado alcanza el exterior; las enzimas extracelulares amino y carboxi-proteasas remueven los propéptidos amino y carboxilo terminal, donde se encuentran las cisternas, responsables de los puentes disul­furo (-S-S-), y se forman unidades de tropo-colágeno que se ensambla espontáneamente en fibrillas de colágeno inmaduro. Sin em­bargo, estas fibrillas no tienen la fuerza ten-sora del colágeno maduro hasta que se

forman enlaces covalentes en forma cruza­da; en este entrecruzamiento participan con­densaciones aldólicas con el e-amino de la lisina que se desamina oxidativamente a un 6-aldehído (al-lisina) y forma bases de Schiff con otros e-NH2 de lisinas o hidroxi­lisinas.

El resultado es la fibra de colágeno madu­ra. En el latirismo, enfermedad que se debe a la ingestión del frijol Lathyrus, no pueden formarse con facilidad los enlaces covalen­tes y el colágeno se vuelve muy frágil.

En el cartílago, los proteoglicanos y el co­lágeno son biológica y mecánicamente in-terdependientes. El cartílago es una matriz extracelular en la cual el colágeno contribu­ye a su fuerza tensora y los proteoglicanos son los causantes de su notable elasticidad.

Enfermedades del colágeno

Las enfermedades del colágeno pueden re­sultar de defectos adquiridos o hereditarios; entre los primeros podemos ubicar al escor­buto y el latirismo. Las enfermedades here­ditarias por defectos en la síntesis o el ensamble sirven muy bien para ilustrar las consecuencias de diferentes tipos de muta­ciones. La consideración de los pasos de biosíntesis del colágeno (fig. 3.37) es nece­saria para entender estas enfermedades.

Osteogénesis imperfecta. Es el nombre que se da a un grupo de 4 enfermedades ca­racterizadas por múltiples fracturas (fragilidad ósea) que dan como resultado deformidades óseas; se debe a síntesis defectuosa de una de las cadenas del colágeno tipo I. En esta enfermedad se impide la formación normal de la triple hélice con la consiguiente degra­dación de todas las cadenas, fenómeno deno­minado con propiedad "suicidio proteico".

Síndrome de Ehlers - Danlos. Con este nombre se designa a un grupo de al menos 10 enfermedades que comparten entre todas ellas síntomas de debilidad estructural en el

tejido conectivo. Por ejemplo, el síndrome de Ehlers-Danlos tipo IV, está causado por defectos en el colágeno tipo III; los síntomas son graves por el embarazo o el parto y ten­dencia a sufrir contusiones. El síndrome de Ehlers-Danlos tipo V, llamada también cutis laxa, se manifiesta por piel suelta, que apa­rece excesivamente arrugada y cuelga en pliegues. En el síndrome de Ehlers-Danlos tipo VI hay una deficiencia de lisil-hidroxi-lasa; las características clínicas incluyen marcada hiperextensibilidad de la piel y las articulaciones, difícil curación de las heridas y deformaciones músculo-esqueléticas. En el tipo VII del síndrome la piel se magulla fácilmente y es hiperextensible.. pero la prin­cipal manifestación es la dislocación de las articulaciones como la cadera y rodillas.

Síndrome de Marfán: Es una enfermedad que se caracteriza por síntomas relacionados con esqueleto, ojo y corazón, que suelen ter­

minar con accidentes vasculares, en especial con ruptura de la aorta. Se ha identificado el colágeno tipo I como el posible factor donde reside la base de esta enfermedad.

Síndrome de Menkes. Se caracteriza por­que el cabello toma aspecto rizado. Hay de­ficiencia de lisinoxidasa y los enlaces cruzados son defectuosos; esta asociado a un metabolismo anormal del cobre.

Proteínas contráctiles

El movimiento es una característica esencial de todas las formas vivas, desde el movi­miento de cilios y flagelos hasta el más fino de la mano humana. Las moléculas respon­sables de esta importante propiedad son las proteínas contráctiles. El mecanismo con­tráctil del músculo esquelético de los verte­brados es el mejor conocido.

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Diámetro de 1 5 A

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Figura 3.37 Estructura de! colágeno desde la secuencia primaria hasta la fibrilla.

Para que se realicen los movimientos de una célula (pseudópodos) o de un organismo (contracción muscular) se requiere de un mecanismo disparador del proceso (el Ca2+), una fuente de energía (el ATP) y un sistema transductor (el músculo). El músculo es el principal transductor bioquímico que con­vierte la energía (química) potencial en energía (mecánica) cinética. Este sistema me-canoquímico es la maquinaria más eficiente y versátil de conversión energética jamás co­nocida.

Un transductor químico-mecánico debe satisfacer varios requerimientos: 1) suminis­tro constante de energía; 2) debe haber un sistema regulador de la actividad mecánica; 3) debe existir un operador, función cubierta por el sistema nervioso y 4) que la máquina pueda regresar a su estado original. Estos re­querimientos son satisfechos, en el hombre, por tres tipos de músculos: esquelético, car­diaco y liso. El músculo esquelético y car­diaco aparecen estriados en el microscopio; el músculo liso no es estriado. El músculo esquelético se encuentra bajo control ner­vioso voluntario, el músculo cardiaco y liso es de control involuntario.

El tejido muscular es el más abundante del cuerpo humano. Más del 40% de la masa muscu­lar de un individuo adulto es músculo esquelé­tico. Durante una actividad muscular intensa, los músculos pueden consumir 85% o más del ATP total producido en el metabolismo.

Todos los músculos estriados del cuerpo están formados por gran número de fibras. Cada fibra muscular contiene millares de miofibrillas, ordenadas en paralelo, las cua­les poseen a su vez unos 2,500 filamentos que se encuentran inmersos en un citoplas­ma soluble (sarcoplasma), rodeados por una membrana celular (sarcolema). La célula muscular posee un abundante retículo endo-plásmico (sarcoplásmico) poco rugoso, lo cual habla de una síntesis proteica muscular poco activa; su contenido en mitocondrias es muy variable, los músculos aeróbicos de

actividad continua son muy abundantes en mitocondrias, mioglobina y citocromos, son los llamados músculos rojos; en cambio, los músculos blancos son poco abundantes en mitocondrias y mioglobina y su metabo­lismo es anaeróbico.

Las miofibrillas son la maquinaria contrác­til del músculo y su unidad es la sarcómera. Cuando se examinan cortes de una miofibrilla al microscopio óptico o electrónico presentan un aspecto estriado. Este se debe a la alter­nancia de bandas oscuras y claras; la banda oscura, banda A, es anisotrópica, birrefrin-gente a la luz polarizada, lo cual sugiere un ordenamiento geométrico regular de las mo­léculas; la banda I es isotrópica, no es refrin-gente, lo que indica un ordenamiento más al azar. Dentro de la banda A se distingue una zona de poca densidad a los electrones o zo­na H con una línea central muy densa, linea M. Dentro de la banda I se define una línea muy densa a los electrones o línea Z; dos lí­neas Z delimitan una sarcómera (fig. 3.38).

Detrás de la estructura microscópica de la miofibrilla subyace una estructura molecu­lar de sus componentes. Cada sarcómera está formada por filamentos gruesos, confinados a la zona H de la banda A y que constan de la proteína miosina; los filamentos delgados se localizan en la banda I pero se extienden hasta la banda A y consisten en las proteínas acuna, tropomiosina y troponina. La línea Z es un material amorfo de a-actinina al cual se unen los filamentos delgados y la línea M es un ensanchamiento de los filamentos gruesos formada por proteína M. Al corte transversal, cada filamento grueso está ro­deado por seis filamentos delgados y cada filamento delgado está rodeado por tres fila­mentos gruesos (fig. 3.39).

Proteínas musculares

La actina, descubierta por Straub, es una proteína globular que representa el 25% en

peso de la proteína muicular. La forma glo­bular monomérica es la actina-G, la cual se prolimeriza, en presencia de Mg2+ para for­mar un filamento de doble hélice, insoluble, llamado actina-F. Ninguna de las dos for­mas (G o F) muestra actividad catalítica.

La tropomiosina, descubierta por Bailey, es una molécula en forma de varilla o bastón que se encuentra asociada con filamentos de actina. Constituye el 2.5% de las proteínas musculares. La otra proteína ligada a la acti­na es la troponina. Mientras que la tropo­miosina existe en todos los músculos, la troponina es exclusiva del músculo estriado. La troponina consta de tres subunidades di­ferentes: la troponina-C, proteína fijadora de calcio; la troponina-I, inhibe la interacción actina-miosina y también la actividad ATPasa; la troponina-T, interviene en el en­samble de las subunidades C e I al complejo actina-tropomiosina (fig. 3.40).

El componente fundamental del filamento grueso es la miosina descubierta por Kuhne, es la proteína más abundante del músculo esquelético (55% de la proteína muscular). La miosina está compuesta por dos cadenas pesadas entrelazadas helicoidalmente con una cabeza globular en cada extremo, lo cual le da un aspecto característico (fig. 3.41). Además, cada cabeza globular está asociada a dos cadenas ligeras. La porción globular de la miosina tiene actividad ATPasa y se combina con la actina.

Cuando la miosina es digerida con tripsi­na, se forman 2 fragmentos denominados meromiosinas. La meromiosina pesada po­see la porción globular y parte de la porción fibrosa; conserva la actividad ATPasa y se une a la actina-F. La meromiosina ligera contiene la porción fibrosa y no muestra ac­tividad ATPasa ni se une a la actina-F. La actividad ATPasa se incrementa 100 a 200 veces por la adición de actina-F.

Actomiosina. Hace ya más de 30 años que Szent-Gyórgyi mezcló en un tubo de ensayo actina con miosina y observó la formación

de un complejo actomiosina que aumentó la viscosidad de la solución. La fibra de acto­miosina preparada por Engelhardt, posee un comportamiento óptico de doble refracción análogo a la fibra muscular intacta; esto jus­tificó el considerar que una fibra de acto­miosina preparada es, en efecto, un modelo molecular de la fibrilla muscular.

Bases moleculares de la contracción muscular

La contracción muscular se inicia con la lle­gada del impulso nervioso y con ello la ace-tilcolina que despolariza la membrana muscular y se alcanza el potencial crítico o de acción que se propaga por el sarcolema. Esta despolarización provoca aumento de permeabilidad al Ca2+. En ausencia de cal­cio la interacción actinamiosina está inhibi­da por la troponina-I y el músculo está en reposo, relajado. Al entrar el Ca2+ al sarco-plasma, se une a la troponina-C y se produce un cambio conformacional que afecta a las otras subunidades de troponina y a la tropo­miosina que se desplaza de su lugar y permi­te interaccionar a las cabezas globulares de la miosina con las moléculas de actina.

En conjunto, se produce un deslizamiento de filamentos de actina sobre los de miosina y con ello un acortamiento, no de filamentos, sino de la zona H (fig. 3.42). Al acortarse la zona H, se acorta la sarcómera, la miofibrilla y el músculo completo. La energía que aporta fuer­za para la contracción muscular es la hidró­lisis del ATP (ver capítulo Bioenergética). La característica de este ciclo bioquímico de con­tracción es que la actina posee poca afinidad por el complejo miosina-ATP (fibra-relajada); al hidrolizarse el ATP, se produce la contrac­ción por la elevada afinidad de la actina por el complejo miosina-ADP (fibra contraída). En términos simples, la energía producida por hidrólisis de ATP se usa para que se produz­ca la unión-desunión de actina y miosina.

La relajación de músculo tiene lugar con dio de una Na+-K+-ATPasa. En esta fase de el cese del impulso nervioso y el retorno del relajación interviene también el ATP para sarcolema a su estado polarizado original lo bombear Ca2+, contra un gradiente de con-cual se logra por bombeo de Na+ hacia afue- centración, hacia afuera de la célula por una ra y de K+ hacia dentro de la célula por me- C 1+-M |+-ATPasa.

El grupo carboxilo puede ser química­mente descarboxilado para dar la correspon­diente amina.

5.13.2. Reacciones del grupo a -amino

El grupo amino de los aminoácidos reaccio­na con la ninhidrina en caliente para dar un compuesto púrpura intenso (excepto la prolina que da un derivado amarillo) que absorbe al máximo la luz con longitud de onda de 570 nm (el amarillo de la prolina a 440 nm).

El color obtenido con la ninhidrina es la base de una prueba colorimétrica que permi­

te detectar cantidades del orden de 1 micro-gramo ó 3 * 10~9 moles de un aminoácido.

La fluorescamina reacciona con los ami­noácidos a temperatura ambiente dando un producto fluorescente, cuya concentración puede medirse con un espectrofluorímetro. Este es un reactivo aún más sensible (10 a 100 veces mayor que la ninhidrina), ya que permite detectar cantidades de nanogramos de un aminoácido o 10-10 a 10"11 moles.

La reacción con dinitrofluoro benceno (reactivo de Sanger) fue muy utilizada hace años para identificar aminoácidos N-termi-nales, hoy, casi en desuso. Los a -aminoáci­dos en presencia del reactivo dan lugar a los dinitrofenil derivados.

3.13.3. Reacciones de la cadena lateral

Un buen número de reacciones químicas pueden ser utilizadas para cuantificar cade­nas laterales específicas en una solución de aminoácidos libres o proteínas desnaturali­zada.

El reactivo de Ellman (ácido ditiobis-ni-trobenzoico) reacciona con el tiol de la ca­dena lateral de la cisterna a pH 8.0 dando un producto, el ácido tionitrobenzoico, que ab­sorbe intensamente a 412 nm.

La reacción de Sakaguchi se utiliza para cuantificar espectrofotométricamente el grupo guanidino de la arginina. El reactivo de Ehlrich es un ensayo colorimétrico para

el grupo indol del triptófano. El reactivo de Pauly da un color rojo con el imidazol de la histidina y el fenol de la tirosina.

3.1.4. Clasificación

Entre las diferentes clasificaciones estructura­les de los aminoácidos, quizá la más extendida es la que los agrupa según las propiedades fisicoquímicas de su cadena lateral, en parti­cular, en cuanto a su polaridad. Los aminoá­cidos se denominan en forma sistemática o trivial. La más extendida es la denomina­ción trivial o común, fruto del material don­de se aislaron por primera vez (asparagina