“diseÑo de heterociclos triazoicos derivados de …
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA
DE BIOTECNOLOGÍA
“DISEÑO DE HETEROCICLOS TRIAZOICOS DERIVADOS DE RIBAVIRINA DE POTENCIAL ACTIVIDAD ANTIVIRAL”
INFORME TECNICO DE LA OPCION CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACION
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: INGENIERIA FARMACEUTICA
PRESENTA: NORBERTO MORENO AGUILAR
DIRECTOR DE PROYECTO: DR. MARCO AUGUSTO BRITO ARIAS EVALUADOR: DR. EFREN VENANCIO GARCIA BAEZ
MÉXICO D.F. DICIEMBRE DE 2011
SINTESIS DE HETEROCICLOS 1,2,4-TRIAZOICOS DERIVADOS DE RIBAVIRINA Norberto Moreno Aguilar, Karen Martínez Zamora, Marco A. Brito Arias*
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, Instituto Politécnico Nacional Av. Acueducto s/n Col. La
Laguna Ticomán, C.P. 07340, Mexico D.F., Tel 5729 6000 Ext. 56324, [email protected]
Introduccion: La hepatitis C es una enfermedad
infectocontagiosa que en México se calcula afecta a 1
millón 200 mil enfermos y se manifiesta a través de
un daño que afecta al hígado, y en un proceso
degenerativo que tarda entre 15 y 20 años produce
cirrosis hepática y cáncer de hígado. Este virus
pertenece al genero hepacivirus familia flaviviiridae, y
el tratamiento farmacológico más eficaz se basa en la
asociación de interferón administrado por vía
subcutánea, con ribavirina por vía oral.
La síntesis de Ribavirina se llevo a cabo en 1970 sin
embargo el método involucra el uso de derivados
azufrados los cuales presentan elevada toxicidad(1)
por lo que se requieren métodos alternativos de
fármaco.
La Ribavirina es un profármaco de naturaleza
glicosídica que ademas de ser usado en el
tratamiento de hepatitis C, se indica en el tratamiento
de otras enfermedades virales como el herpes simple
1 y 2, varicela zoster, y de la hepatitis B.
Figura 1.- Descripción general de la ribavirina, unión entre en 1,2,3-triazol-3-carboxamida y la pentosa. Metodología. Aunque el mecanismo de acción no
está completamente establecido se ha demostrado
que afecta al virus y al huésped, relacionándolo con
su incorporación en el AND viral, conduciendo hacia
la mutagénesis.
La síntesis del Heterociclo 1,2,4 triazoico 4 se llevó a
cabo de acuerdo a la secuencia de reacciones
descrita en el esquema 1, el cual inicia con la
reacción entre el cianoformiato de etilo 1 con
formilhidrazina 2 para generar el intermediario 3. Esta
reacción se llevo a cabo bajo distintas condiciones de
reacción que se describen el la tabla 1. El
intermediario 3 somete a condiciones de ciclación
bajo condiciones acidas y calentamiento para generar
el heterociclo 1,2,4-triazoico 4.
Esquema 1.
ON
O
ONH
O
HNNH3
HHN
H2N
O
+
O
H
ON
O
HNN
4
1 2
Esquema 1.- desarrollo para la obtención del
heterociclo 1,2,4-triazoico.
Resultados y discusión. La síntesis de la iminofenil
hidrazina 3 se llevo acabo a diferentes condiciones
de reacción indicados en la tabla 1 observándose que
el ensayo 3 con cloruro de zinc a temperatura
ambiente no se observa el producto de reacción, en
tanto que en los ensayos 1 bentonita activada con
medio acido, 2 acido acético y 4 radicación de
microondas, se observa la formación de
intermediario 3. Para este ultimo ensayo se observa
que a tiempos de 2 y 3 minutos la presencia de un
subproducto en proceso de caracterización. El
espectro de 1H RMN del intermediario 3 muestra una
señal triple en 1.09 correspondiente al metilo, un
cuarteto en 4.01 para el metileno del grupo ester y en
7.9 una señal simple para el hidrogeno del aldehído .
Posteriormente se llevo a cabo la reacción de
ciclación para obtener el heterociclo 4 bajo
condiciones de radiación de microondas a 3 minutos
observando la presencia de las señales triple y
cuádruple del grupo ester metílico así como la
desaparición de la señal simple en 8 ppm.
El hijo sabio regocija a sus padres. (Proverbios)Que la bondad amorosa y el apego a la verdad mismos no te dejen. Átalos alrededor de tu
garganta. Escríbelos sobre la tabla de tu corazón, y así halla favor y buena perspicacia a los
ojos de Dios y del hombre terrestre. Confía en Jehová con todo tu corazón, y no te apoyes en
tu propio entendimiento. En todos tus caminos tómalo en cuenta, y él mismo hará derechas tus
sendas.
Feliz es el hombre que ha hallado sabiduría, y el hombre que consigue discernimiento, porque
el tenerla como ganancia es mejor que tener la plata como ganancia; y el tenerla como
producto, que el oro mismo. Es más preciosa que los corales, y todos tus otros deleites no
pueden ser igualados a ella. Largura de días está en su diestra; en su siniestra hay riquezas y
gloria. Sus caminos son caminos de agradabilidad, y todas sus veredas son paz. Es árbol de
vida a los que se asen de ella, y los que la mantienen firmemente asida han de ser llamados
felices.
El hijo sabio es el que regocija a un padre, y el hijo estúpido es el desconsuelo de su madre.
Los tesoros del inicuo no serán de provecho alguno, pero la justicia es lo que librará de la
muerte. El que trabaja con mano floja será persona de escasos recursos, pero la mano del
diligente es lo que enriquece a uno. El hijo que actúa con perspicacia recoge durante el verano;
el hijo que actúa vergonzosamente está profundamente dormido durante la siega. En los labios
del entendido se halla la sabiduría, pero la vara es para la espalda de uno falto de corazón.
Tan grande es tu bondad y tan infinita es tu sabiduría que hoy me permites concluir con un
ciclo mas de mi vida, “Feliz es el hombre que sigue aguantando la prueba, porque al llegar a
ser aprobado recibirá la corona de la vida, que Jehová prometió a los que continúan amándolo.
Al estar bajo prueba, que nadie diga: “Dios me somete a prueba”. Porque con cosas malas
Dios no puede ser sometido a prueba, ni somete a prueba él mismo a nadie. Más bien, cada
uno es probado al ser provocado y cautivado por su propio deseo. Entonces el deseo, cuando
se ha hecho fecundo, da a luz el pecado; a su vez, el pecado, cuando se ha realizado, produce
la muerte. (Santiago 1:13).
Dedicatorias.
Queridos padres:
Gracias por haberme enseñado tantas cosas de la vida, ustedes son la base con la que he
logrado todos mis objetivos, se que como todo ser humano tienen errores pero a pesar de
todos los problemas que hemos vivido han luchado para salir delante de ellos, lo cual siempre
me recuerda que para ser alguien en esta vida, se tiene que luchar “verdad papá”, pero nunca
dejando de ser humilde y jamás mirar hacia atrás, porque atrás no hay nada, siempre mirando
primero hacia los costados para ver a las personas que están a mi lado siempre juntos,
caminando y después mirar hacia adelante, donde siempre encontrare un objetivo por el cual
luchar. Mamá gracias a ti por guiarme en el camino de dios y enseñarme tantas cosas de la
vida, siempre veré en ti a la mujer perfecta y que nunca podrá ser igualada por tus cualidades,
espero no haberte defraudado y como familia “siempre seguiremos adelante”
Queridos hermanos:
Gracias por ser ustedes mi alegría día con día, por compartir mis penas y tristezas, espero no
me vean como ejemplo a seguir por que tengo muchos errores, pero a pesar de todos ellos
siempre podrán contar conmigo para cualquier cosa. Eder tu eres mejor que yo “ que nadie te
diga que no puedes hacer algo y no te compares con los demás por que no debe existir una
medida para alguien que es único en el mundo y a los ojos de dios”. Rubi tu eres la niña que
trajo alegría a esta familia, ponle mucho empeño en todo lo que hagas no sea cual sea tu
camino por que aun eres muy pequeña pero siempre formate objetivos positivos en la vida y
lucha para conseguirlos.
ii
Agradecimientos.
Dr. Marco Augusto Brito Arias.
Gracias por el apoyo para el presente trabajo y por los consejos personales que en su
momento me brindo, más que profesor siempre lo mire como un amigo usted es una persona
admirable, respetable y sincera.
Dr. Efrén Venancio García Vaez.
Por la revisión del presente trabajo, asi como su importante participación como mi evaluador en
proyecto terminal III.
Amigos.
Gracias por ser parte de mi formación universitaria, espero seguir compartiendo muchos más
logros como este.
iii
Contenido
Índice de Figuras ........................................................................................................................... v
1. Introducción ........................................................................................................................... 1
a) Definicion e incidencia…………………………………………………………………………….1
b) fuentes de contagio………………………………………………………………………………..2
c) prevencion y tratamiento………………………………………………………………………….3
d) Farmacos Antivirales………………………………………………………………………………3
e) Mecanismo de Accion de Ribavirina………………………………………………….…………4
f) Glicosidos antivirales……………………………………………………………………………...5
1.1. Justificación .................................................................................................................... 8 1.2. Objetivos ........................................................................................................................ 9 1.2.1. General ......................................................................................................................... 9 1.2.2. Específicos ................................................................................................................... 9
2. Materiales y Métodos………………………………………………………………………………10
3. Resultados y discusión ....................................................................................................... 13
4. Conclusiones ....................................................................................................................... 25
5. Referencias ......................................................................................................................... 26
iv
v
Índice de Figuras
Figura 1. Distribución de la hepatitis C a nivel mundia……………………………………………….1
Figura 2. Distribución en porcentaje de las posibles causas de transmisión para la hepatitis C…………………………………………………………………………………………………………....2 Figura 3. Virus de la hepatitis C…………………………………………………………………………3 Figura 4. Ejemplos representativos de nucleosides y carbociclos antivirales. Estructuralmente
ribavirina es un nucleósido triazóico de nombre 1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-triazole-3-
carboxamida (figura 5) obtenido sintéticamente por Witkowski y Robins en 1972.1……………..6
Figura 5.- Estructura de ribavirina……………………………………………………………………....6
Figura 6. Esquema general de glicosidación………………………………………………………….7
Figura 7. Esquema de reacción para la obtención del intermediario 2……………………………11
Figura 8. Esquema de reacción para la obtención del intermediario 4…………………………...11
Figura 9. Reacción de ciclación para la formación del heterociclo triazoico……………………..12
Figura 10. Esquema de cromatoplaca para obtención del intermediario 3……………………….15
Figura 11 Purificación por cromatografía en columna…………………………………….............15
Figura 12. Características morfológicas del intermediario 3……………………………………….16
Figura 13. Espectro de RMN 1H obtenido del intermediario 3 ensayo …………………………..17
Figura 14. Espectro de 13C RMN del intermediario 3 ensayo……..……………………………….18
Figura 15. Espectro de 1H RMN en esayos de microondas con un minuto de tiempo de
reacción para el intermediario 3……………………………………………………………...............19
Figura 16. Espectro de RMN 1H en esayos de microondas con dos minutos de tiempo de
reacción obtenido para el intermediario 3…………………………………………………..............20
Figura 17. Espectro de RMN 1H en esayos de microondas con tres minutos de tiempo de
reacción obtenido para el intermediario 3…………………………………………………………….20
Figura 18. Espectro de 1H RMN de compuesto simétrico………………………………………….22
Figura 19. Estructura de estructura simétrica del intermediario 5 obtenida en el ensayo 4…….23
Figura 20. Figura 20. Diagrama ortep (b,c) interacciones intramoleculares……………………...24
1. INTRODUCCIÓN
a) Definición e incidencia La hepatitis C es una infección causada por un ARN virus encapsulado de tamaño 55-65 nm
perteneciente a la familia Flaviviridae. Esta enfermedad en su primera etapa no presenta
síntomas y en etapas crónicas ataca al hígado produciendo en etapas avanzada daño hepático
en forma de cirrosis y otros trastornos hepáticos incluyendo cáncer de hígado.
A diferencia de la infección por el virus de la hepatitis B, la infección por el virus de la hepatitis
C es común en el mundo desarrollado. En México cerca de afecta alrededor de 170 millones de
personas a nivel mundial y en México se estima que hay alrededor de 1 millón 200 mil
enfermos (figura 1).
Figura 1.- Distribución de la hepatitis C a nivel mundial.
1
b) Fuentes de contagio
hepatitis C (VHC) es casi exclusivamente a través del contacto La diseminación del virus de la
con la sangre. La transmisión sexual es rara. Alrededor del 80% de los infectados no tienen
signos o síntomas, y si están presentes, son semejantes a los de otras hepatitis. Entre el 55 y
el 85% de ellos padece una infección crónica, que lleva a la enfermedad persistente del hígado.
La infección crónica da lugar a cirrosis y a cáncer hepático en el 5 al 20% de los afectados
Figura 2.- Distribución en porcentaje de las posibles causas de transmisión para la hepatitis C.
c) Morfología y genoma del (VHC)
o de tamaño 55-65 nm clasificado como un genero
El VHC es una ARN virus encapsulad
separado (Hepacivirus) dentro de la familia Flaviviridae (figura2).
(http://www.who.int/csr/disease/hepatitis/whocdscsrlyo2003/en/index2.html)
El genoma es altamente mutable y debido a esto VHC puede evadir la detección inmunológica
y eliminación por parte del huésped. Las mutaciones se distribuyen al azar a lo largo del
genoma pero están más pronunciadas dentro de la región hipervariable localizada cerca de la
terminal N de la proteína E2, que contiene un determinante antigénico (epitope B-celular) que
desarrolla evolución antigénica a lo largo del tiempo. (Klenerman P et al. Immunity to hepatitis
C virus: stunned but not defeated. Microbes Infect, 2002, 4:57-65).
2
Once genotipos con varios subtipos distintos han sido identificados, lo cual genera una
diversidad significativa que dificulta la respuesta al tratamiento interferón/ribavirina y más aun
impide el desarrollo de una vacuna efectiva para todos los serotipos.
Figura 3. Virus de la hepatitis C
d) Prevención y Tratamiento
Actualmente no hay vacunas o inmunoglobulinas (IG) disponibles para prevenir la infección.
Debido a esto las únicas formas de prevención tienen que ver con la adopción de medidas
precautorias contra posible infección por via sanguínea o de transmisión sexual. (Mast EE, Alter
MJ, Margolis HS. Strategies to prevent and control hepatitis B and C virus infections: a global
perspective. Vaccine, 1999, 17:1730-1733).
El tratamiento propone en primera instancia la reducción de la inflamación para evitar la
progresión hacia fibrosis o cirrosis, y como terapia de primera elección la combinación de
interferón con ribavirina. (Alberti A et al. Therapy of acute hepatitis C. Hepatology, 2003,
36:S195-S200).( Barnes E et al. Long-term efficacy of treatment of chronic hepatitis C with
alpha interferon or alpha interferon and ribavirin. Journal of Hepatology, 1999, 31:244-249).
e) Fármacos antivirales
Los fármacos se definen cono aquellas especies químicas que actúan en sitios específicos,
normalmente conocidos como receptores; la interacción resultante, desencadena cambios
fisiológicos que se observan en forma de actividad terapéutica. Por otra parte, la OMS
considera como drogas (en el contexto de droga= fármaco) a todas las sustancias químicas
que, introducías voluntariamente en el organismo de un sujeto, poseen la propiedad de
modificar las condiciones físicas o químicas de este. Los fármacos antivirales se pueden dividir
en base a las siguientes aproximaciones: (Erik De Clercq Nature Rewiews| Drug Discovery
2002, 1, 13-25)
3
Modo de inhibición Virus susceptibles Fármacos aprobados
adsorción de virus HIV, HSV, CMV, RSV y
otros virus encapsulados
fusión célula-virus HIV, RSV y otros
paramixovirus
ADN polimerasa viral Herpes virus (HSV-1, -2,
VZV, CMV, EBV, HHV-6, -
7, -8)
Acyclovir, valaciclovir, ganciclovir,
valganciclovir, penciclovir famciclovir,
brivudin, foscarnet
transcriptasa inversa HIV NRTIs: zidovudine, didanosine,
zalcitabine, stavudine, lamivudine,
abacavir NNRTIs: nevirapine, delavirdine,
efavirenz
Nucleósidos fosfonato
aciclicos
DNA virus (polioma-,
papiloma-, herpes-,
adeno- y poxvirus), HIV,
HBV
CMV: cidofovir HIV: tenofovir
procesos asociados
con la síntesis de ARN
viral
HIV, HCV
proteasa viral HIV, herpesviruses,
rhinoviruses, HCV
HIV: tenofovir nelfinavir, amprenavir,
lopinavir
neuraminidasa viral Influenza A y B virus Zanamivir, oseltamivir
IMP deshidrogenasa HCV, RSV Ribavirin/Interferon
hidrolasa viral (–)RNA fiebre
hemorrágica
virus (ejemplo, Ebola)
f) Mecanismo de acción de Ribavirina
Se ha determinado que ribavirina actúa sobre la enzima IMP deshidrogenasa la cual es una
enzima importante en la biosíntesis de purine mononucleótidos. Se le ha implicado en la
oxidación de NAD-dependiente a xantosina 52-monofosfato (XMP) el cual es convertido
posteriormente a GMP, GDP, y también de GDP a través de dGDP a dGTP. La ribavirina es un
inhibidor competitivo de IMP deshidrogenasa aunque también pueden inhibir la síntesis de
4
ARN y ADN viral en células infectadas. También se ha demostrado que ribavirina como un
mutágeno ARN viral forzando su ARN a la acumulación de errores letales. Por lo tanto la
actividad antiviral de ribavirina resulta del efecto mutagénico antiviral seguido por la
incorporación en el genoma viral, asi como del efecto inhibitorio en su forma de monofosfato
sobre la IMP deshidrogenasa. Crotty, S. et al. The broad-spectrum antiviral ribonucleoside
ribavirin is an RNA virus mutagen. Nature Med. 6, 1375–1379 (2000). Crotty, S., Cameron, C.
E. & Andino, R. RNA virus error catastrophe: direct molecular test by using ribavirin. Proc. Natl
Acad. Sci. USA 98, 6895–6900 (2001). Otras investigaciones consideran que ribavirina también
afecta la respuesta del sistema inmune del huésped con respecto al virus, por ejemplo en
número de células T activadas que expresan citoquina y gama interferón se reducen
significativamente en pacientes tratados con la combinación de ribavirina e interferón alfa.4
g) Glicósidos antivirales Los glicósidos antivirales son análogos de las bases púricas y pirimídicas que constituyen el
material genético de los organismos. Están constituidos por un heterociclo unido a un azúcar o
análogo sintético a través de un nitrógeno o un carbono y la posición anomérica o equivalente.
Los resultantes nucleósidos modificados se constituyen en valiosos agentes terapéuticos como
agentes antivirales, antitumorales y antibióticos, y se han empleado con diferentes grados de
éxito contra padecimientos como el SIDA, hepatitis, herpes, y algunos de los mas
representativos son: AZT, ddI, ddC, ddG, abacavir, neplanocin, carbovir entre otros (figura 4).
(Brito-Arias M Synthesis and Characterization of Glycosides ed Springer 1997).
O
N3
HO
N
NH
O
O
O
N3
HO
N
NH
O
O
O
F
HO
N
NH
O
O
AZT
5
N
NN
N
NH2
O
HO
NH
NN
N
O
O
HO
NH
NN
N
O
O
HONH2
ddA ddI ddG
N
N N
N
H2N
HN
HO
NH
NN
N
O
HONH2
Carbovir
N
NN
N
NH2
HO
Neplanocin A
OH OH
Abacavir Figura 4. Ejemplos representativos de nucleosides y carbociclos antivirales.
Estructuralmente ribavirina es un nucleósido triazóico de nombre 1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-
triazole-3-carboxamida (figura 5) obtenido sintéticamente por Witkowski y Robins en 1972.1
Figura 5.- Estructura de ribavirina
A partir de la síntesis original de Ribavirina se han diseñado algunos análogos que contienen
modificaciones tanto en el heterociclo como en la ribosa. Tales modificaciones incluyen 2 y 3
desoxi Ribavirina5, fosfatos6, imidatos7, sulfamoyl8, y tioribofuranosa9.
En virtud de la importancia que reviste esta molécula como fármaco de primera elección en el
tratamiento de hepatitis C, así como de otras afecciones virales se considera la búsqueda de
métodos alternativos para la síntesis de esta molécula, así como la de algunos análogos
isostéricos como una alternativa de gran potencial.
Métodos de preparación de nucleósidos antivirales.
Las estrategias mas empleadas para conjugar un heterociclo con un derivado de azúcar o
equivalente sintético para generar un C-, N-, o carbociclo nucleósidico, se basan en la
incorporación de un grupo saliente a la posición anomérica del azúcar que previamente es
protegido en las posiciones hidroxílicas para generar una especie conocida como un donante
glicosídico, y en presencia de un promotor glicosídico hacerlo condensar con el heterociclo
6
respectivo (figura 6). Entre lo métodos mas comunes se encuentran: la reacción de Michael,
Fischer-Helferich, Davol-Lowy, reacción mediada por grupos sililo, reacción mediada por
azufre, reacción Mitsunobu, reacciones mediadas por Paladio y reacciones
microbianas/enzimáticas.
+
NH
promoter
X = Cl, Br
O
XPO
NO
PO
Figura 6. Esquema general de glicosidación
7
1.1. JUSTIFICACIÓN La hepatitis C es una infección viral para la que actualmente no hay vacuna efectiva,
que afecta alrededor de 170 millones de personas a nivel mundial y en México se
estima que hayan alrededor de 1 millón 200 mil enfermos. La Ribavirina en
combinación con interferón alfa es el tratamiento de elección, sin embargo el método
de obtención de este nucleósido fue desarrollada hace mas de 30 años por lo que se
propone un método más eficiente que además permita la obtención de análogos de
potencial actividad antiviral contra hepatitis C e influenza.
8
1.2. OBJETIVOS
1.2.1. General
Desarrollar una metodología sintética optimizada que permita obtener el nucleósido Ribavirina de actividad contra el virus de hepatitis C, así como el de algunos análogos sintéticos.
1.2.2. Específicos
Síntesis y caracterización estructural de intermediarios y de análogos del nucleósido Ribavirina Purificación de intermediarios y productos por cromatografía en columna Caracterización estructural por resonancia magnética nuclear, espectrometría de masas y en su caso por difracción de rayos X.
9
2. MATERIALES Y METODOS
Equipo, maquinaria e instalaciones: La unidad en la que se desarrollo el presente proyecto de investigación, cuenta con una
laboratorio de proyectos de investigación provisto con mesa de trabajo, campanas de
extracción, evaporador rotatorio, cuarto de reactivos, equipos de destilación, equipo de
resonancia Magnética Nuclear y Equipo de Infrarrojo.
• Equipo de Resonancia Magnética Nuclear. Marca: Varian Modelo: Gemini Frecuencia: 300 MHz Solvente utilizado: Cloroformo deuterado (CDCl3) Referencia interna: TMS *El equipo de RMN requiere cargas de helio y nitrógeno liquido para su adecuado mantenimiento.
Materiales y suministros. Reactivos: (Marca Aldrich)
Cianoformiato de Etilo. Formil Hidrazina. Metanol grado industrial Hexano grado industrial Diclorometano grado industrial Acetona grado industrial Tetrahidrofurano grado industrial Acido acético
Material de vidrio. Matraces bola de 50 y 100 ml Vasos de precipitados de 50 y 100 ml graduados Probeta graduada de 10 ml Columna cromatografica de 35 x 3 (largo x diámetro) Embudos de separación Pipetas Pasteur Viales Buretas
10
a) Desarrollo experimental.
Obtención de Clorhidrato Carboetoxiformimidato (2).
Figura 7. Esquema de reacción para la obtención del intermediario 2.
En un matraz bola de 50 ml conteniendo cianoformiato de etilo (1ml, 0.01012 mol) con
éter etílico como disolvente, la solución se coloca en un baño de hielo-acetona en un
rango de temperatura entre -35°C y -10°C, se adiciona lentamente etanol (0.6 ml, 0.176
mol) y se burbujea acido clorhídrico en forma gaseosa, la reacción se agita durante 15
minutos.
El precipitado solido que se obtiene en la reacción se filtra y se coloca en un vial, se
introduce en un desecador con la finalidad de eliminar la humedad.1H RMN (300 MHz,
D2O/TMS): δ(ppm) 1.10 (t, 2H), 1.29 (t, 3H), 3.58 (c, 3H), 4.21 (c, 3H).
b) Obtención de β-formiloxalamidrazina (4)
Figura 8. Esquema de reacción para la obtención del intermediario 4.
Se pesan 0.3 g (0.00303 mol) del producto de la reacción anterior (2) se pasa a un
matraz bola de 50 ml previamente conteniendo 2 ml de etanol y se le adiciona
lentamente 0.18189 g (0.00303 mol) formil hidrazina (3) la reacción se agita por 30
minutos a 5°C.
El precipitado se colecta, se deja secar y se obtiene un sólido de color blanco, el cual
se purifica por una cromatografía en columna, usando silica gel como fase estacionaria
y acetato de etilo- metanol como fase móvil en concentraciones (3:0, 3:1, 2:2, 2:1, 3:0)
el cual se caracteriza mediante técnicas de espectroscopia de RMN (300 MHz,
D2O/TMS): δ(ppm) 1.10 (t, 2H), 1.29 (t, 3H), 3.58 (c, 3H), 4.21 (c, 3H).
c) Variante para la obtención de β-formiloxalamidrazina con bentonita como catalizador.
11
La bentonita es una arcilla que tiene la propiedad de absorber una determinada
sustancia en la metodología se utilizo acido sulfúrico como facilitador para promover la
reacción, se colocaron 0.3 g (0.00303 mol) de cianoformiato de etilo, con formil
hidrazina 0.18189 g (0.00303 mol), con tetrahidrofurano como disolvente. Se filtra y se
lava con metanol para Se obtienen cristales transparentes solubles en metanol, se
purifica por una cromatografía en columna, usando silica gel como fase estacionaria y
acetato de etilo- metanol como fase móvil en concentraciones (3:0, 3:1, 2:2, 2:1, 3:0) el
cual se caracteriza mediante técnicas de espectroscopia de RMN (300 MHz,
D2O/TMS): δ(ppm) 1.10 (t, 2H), 1.29 (t, 3H), 3.58 (c, 3H), 4.21 (c, 3H).
d) Obtención del heterociclo 1,2,4-Triazol-3-Carboxilato 4.
O
HN
NH
H
O
NH
OO
O
HN N
N
Figura 9. Reacción de ciclación para la formación del heterociclo triazoico.
Se colocan 0.2 g (0.001156 mol) de β-formiloxalamidrazina con acido sulfúrico al 20% y
se coloca a reflujo durante 4 horas.
12
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La síntesis del heterociclo 1,2,4-triazol-3-carboxilato se planteo inicialmente en base al
esquema 1, que consiste en la reacción de cianoformiato de etilo 1 con etanol en medio
ácido para generar el intermediario 2 de acuerdo el método descrito por Vemishetti et
al (1988), sin embargo esta reacción requiere el uso de ácido clorhídrico en forma
gaseosa lo cual mostró dificultades operativas, además que consideramos que el el
intermediario 3 puede obtenerse de manera directa entre el cianoformiato de etilo y la
formilhidracina. En base a este análisis se propuso un esquema modificado que plantea
la eliminación del paso inicial y en su lugar llevar a cabo la condensación directa de
cianoformiato de etilo con formiato de hidracina bajo catálisis ácida para generar el
intermediario 3 a través de una reacción de adición nucleofílica de la amina primaria al
grupo ciano como se observa en el esquema 2.
Esquema 1
Esquema 2
13
La reacción de condensación de cianoformiato de etilo con formiato de hidracina se
llevo a cabo bajo diferentes condiciones de catálisis ácidas como ácido acético a
temperatura ambiente, bajo condiciones de radiación por microondas y la arcilla
bentonita activada con ácido sulfúrico (Tabla 1).
Tabla 3.- Tabla de ensayos para la obtención de intermediario 3 esquema 2.
Ensayo Temperatura (°C) Catálisis H+ Disolvente Rendimiento %
1. T Amb. AcOH _ 65.35
2. T Amb. Bentonita
(H+) THF 59.3
3. MW - - 72.8
4. MW AcOH - 70.03
La reacción de cianoformiato de etilo con formilhidracina para obtener el intermediario 3
fue monitoreada por cromatografía en capa fina empleando como fase móvil un sistema
acetato de etilo- metanol a diferentes gradientes de concentración, y yodo como
agente revelador. La cromatoplaca muestra que las materias primas el cianoformiato
de etilo y formil hidracina, el mayor y menor valor de Rf respectivamente, entanto que el
producto de reacción un valor intermedio lo cual sugiere que el producto obtenido
presenta propiedades intermedias de solubilidad y afinidad hacia la fase estacionaria
(figura 10).
14
1 (cianoformiato de etilo )
2 (producto de reacción)
3 (formil hidracina)
Figura 10. Esquema de cromatoplaca para obtención del intermediario 3.
El siguiente paso consistió en la purificación de esta reacción para cada ensayo
descrito en la tabla 1, por cromatografía en columna (figura 11) empleando silica gel
como fase estacionaria y como fase móvil el sistema acetato de etilo- metanol a
diferentes gradientes de concentración (6:1, 4:1, 2:1 y 1:1). Como resultado, de los
ensayos 1, 2, 5 y 6 se obtuvieron cristales solubles en metanol los cuales fueron
analizados por resonancia magnética nuclear.
Figura 11. Purificación por cromatografía en columna.
Posteriormente se determino el rendimiento de la reacción para las fracciones de
mayor grado de pureza obteniéndose rendimientos de 59, 65, 70 y 72 % para las
diferentes condiciones empleadas. La figura 12 muestra las características
morfológicas de los cristales obtenidos.
15
Figura 12. Características morfológicas del intermediario 3.
La caracterización estructural por resonancia magnética nuclear (1H RMN) del
intermediario 3 (ensayo 1) parcialmente puro, muestra una señal triple en 1.1 ppm y
cuarteto en 4.0 ppm correspondientes a una relación triple-cuarteto características de
grupos etilo unido a un átomo de oxígeno que desplaza las señales a campo bajo por
un efecto “deshielding”. También se observa dos señales en la región de 8.0 ppm
correspondientes unos de ellos al aldehído del intermediario 3 y el otro a formilhidracina
como contaminante (figura 13).
16
Figura 13. Espectro de RMN 1H obtenido del intermediario 3 ensayo 1.
La caracterización por RMN de carbono 13 (13C RMN) muestra en 14.0 ppm una
señales para el carbono del grupo metilo, en 64.0 ppm una señal para en metileno, y 2
señales sobrepuestas en 161 ppm para el grupo aldehído del intermediario 3 y de la
formilhidracina como contaminante (figura 14).
17
Figura 14. Espectro de 13C RMN del intermediario 3 ensayo 1.
Los ensayos realizados con microondas a 1 minuto de exposición mostraron resultados
semejantes al ensayo 1 (figura 15), lo cual confirma que esta alternativa instrumental es
una opción aceptable al igual que el uso de la arcilla bentonita activada previamente
con H2SO4 al 20 %.
18
Figura 15. Espectro de 1H RMN en ensayos de microondas con un minuto de tiempo
de reacción para el intermediario 3.
Sin embargo tiempos más prolongados en condiciones de microondas 2 y 3 minutos
generaron para el primer caso mezcla de 2 productos en proporción 2:1 (figura 16), y
señales complejas en la región de 8.0 ppm para el segundo (figura 17).
19
Figura 16. Espectro de RMN 1H en esayos de microondas con dos minutos de tiempo
de reacción obtenido para el intermediario 3.
Figura 17. Espectro de RMN 1H en esayos de microondas con tres minutos de tiempo
de reacción obtenido para el intermediario 3.
20
Una vez obtenido el intermediario 3 se procedió a llevar a cabo ensayos de ciclización
para obtener el intermediario heterocíclico 4 considerado el paso clave de la
metodología. Para llevar a cabo este objetivo se sometió el intermediario 3 a diferentes
condiciones de catálisis ácida, incluyendo resina de intercambio iónico catiónica y
ácidos de Lewis como se observa en la tabla 4.
Tabla 4.- Ensayos realizados para la ciclación y obtención del heterociclo 1,2,4-Triazol-
3-Carboxilato 4 a partir del intermediario 3.
Ensayo Temperatura (°C) Catalisis H+ Disolvente
1. 100 AcOH -
2. 150 AcOH -
3. 85 H2SO4 20% agua
4. 120 H2SO4 20% agua
5. Anhídrido tríflico THF
6. 25 RII* catiónica THF
7. 25 AlCl3 THF
RII* Resina de intercambio iónico Dowex
21
Los espectros de 1H RMN para los ensayos descritos en la tabla 4, no mostraron la
desaparición de la señal del aldehído lo cual es indicativo que la reacción de adición
nucleofílica de la imina hacia el carbonilo, y por lo tanto estas condiciones no condujeron a la
obtención del heterociclo 4 esperado. Sin embargo el espectro de 1H RMN (figura 18) del
ensayo 4 bajo condiciones de H2SO4 al 20% a 120oC mostro un patrón de señales triple-
cuarteto característicos de una molécula simétrica que contiene un grupo etilo unido a oxígeno
(figura 18).
Figura 18. Espectro de 1H RMN de compuesto simétrico
La elucidación de esta estructura fue confirmada por el método de difracción de rayos X de
monocristal, encontrándose que la estructura corresponde a un compuesto de fórmula química:
C6H12N2O4, sistema monoclínico, grupo espacial C12/c1 que corresponde a la estructura 5
mostrada en la figura 19. Así mismo se determinaron las longitudes de enlace, ángulos,
ángulos de torsión e interacciones intermoleculares, las cuales se indican en la tabla 5.
22
Figura 19. Estructura de estructura simétrica del intermediario 5 obtenida en el ensayo 4.
Tabla 5. Longitudes de enlace
O(2) - C(2) 1.2090(17) O(3) - C(2) 1.3352(16) O(3) - C(4) 1.4544(18) N(1)
- C(2) 1.3512(18) N(1) - N(1)a 1.3789(16) C(4) - C(5) 1.496(2) N(1) - H(1)
0.86 C(4) - H(4A) 0.97 C(4) - H(4B) 0.97 C(5) - H(5A) 0.96 C(5) -
H(5B) 0.96 C(5) - H(5C) 0.96
Ángulos de enlace
C(2) - O(3) - C(4) 116.44(11) C(2) - N(1) - N(1)a 120.05(12) O(2) - C(2) -
O(3) 125.33(13) O(2) - C(2) - N(1) 125.59(13) O(3) - C(2) - N(1)
109.06(11) O(3) - C(4) - C(5) 106.82(13) C(2) - N(1) - H(1) 120 H(1) -
N(1) - N(1)a 120 O(3) - C(4) - H(4A) 110 O(3) - C(4) - H(4B) 110 C(5)
- C(4) - H(4A) 110 C(5) - C(4) - H(4B) 110 H(4A) - C(4) - H(4B) 109
C(4) - C(5) - H(5A) 109 C(4) - C(5) - H(5B) 110 C(4) - C(5) - H(5C) 109
H(5A) - C(5) - H(5B) 109 H(5A) - C(5) - H(5C) 109 H(5B) - C(5) - H(5C)
109
Ángulos de torsión
C(2) N(1) N(1)a C(2)a 83.71(16) O(2) C(2) O(3) C(4) 4.3(2) N(1) C(2)
O(3) C(4) -174.42(12) O(2) C(2) N(1) N(1)a 5.1(2) O(3) C(2) N(1) N(1)a -
176.22(11) C(5) C(4) O(3) C(2) 171.10(13) C(2) N(1) N(1)a H(1)a -96 H(1)
N(1) N(1)a C(2)a -96 H(1) N(1) N(1)a H(1)a 84 O(2) C(2) N(1) H(1) -175
O(3) C(2) N(1) H(1) 4 H(4A) C(4) O(3) C(2) 51 H(4B) C(4) O(3) C(2) -69
O(3) C(4) C(5) H(5A) -61 O(3) C(4) C(5) H(5B) 179 O(3) C(4) C(5) H(5C)
23
59 H(4A) C(4) C(5) H(5A) 59 H(4A) C(4) C(5) H(5B) -61 H(4A) C(4) C(5)
H(5C) 179 H(4B) C(4) C(5) H(5A) 179 H(4B) C(4) C(5) H(5B) 59 H(4B) C(4)
C(5) H(5C) -61
Interacciones Donador --- H....Aceptor
1 1 N(1) --H(1) ..O(2) [ 4565.01] 0.86 2.04 2.8773(16) 164
La proyección ortep muestra que los grupos éster unidos a los nitrógenos presentan un ángulo
de torsión de 83.7 con interacciones por puente de hidrógeno N---H….O intermoleculares.
Figura 20.- Diagrama ortep
Figura 20 (b,c). interacciones intramoleculares en diferentes direcciones.
24
4. CONCLUSIONES
Se llevo a cabo mediante una metodología sintética alterna la obtención de un precursor
del heterociclo 1,2,4-triazoico presente en ribavirina.
Se ensayaron diferentes condiciones de reacción descritas en la tabla 3 para la
obtención del precursor del heterociclo triazóico en rendimientos aceptables del 72.8 y
70.03 % para los ensayos con microondas.
Se obtuvo un intermediario simétrico que fue caracterizado por difracción de rayos X y
que tiene potencial uso en la obtención de anillos triazoicos sustituidos.
25
5. PERSPECTIVAS PARA TRABAJO FUTURO El presente proyecto de investigación se enfoco en la síntesis del heterociclo triazoico e
intermediarios, así mismo se pretende llevar una continuación de la metodología desarrollada
hasta el momento con el fin de obtener intermediaros con posibles sustituyentes como se
muestra en los esquemas siguientes:
EtO CN
O
H2N NH2
N
HN N
O
O
HO
H
H
OH
HO
H
HO
H
CH2OH
CHO
OHH
HHO
OHH
OHH
CH2OH
++
La molécula de ribosa favorece la ciclación del heterociclo triazoico debido al grupo funcional
aldehído, además puede servir como sustituyente con la finalidad de poder comparar la
actividad biológica con respecto a la ribavirina de actual uso comercial.
EtO CN
O
H2N NH2
N
HN N
O
O
++
CHO
R
R
La reacción planteada sigue el mecanismo anterior pero ahora con benzaldehído para la
ciclación con la finalidad de agregar algunos sustituyentes en la diferentes posiciones del
grupo fenilo.
26
+
NH2
RO N
H
HN O
O
O
N
N N
HOOH
R
La reacción está dada por el intermediario isométrico con las respectivas aminas sustituidas
para generar diferentes análogos triazoicos.
27
28
6. REFERENCIAS 1. - J.T. Witkowski, R.K. Robins, R.W. Sidwell, and L.N. Simon J. Med Chem, 1972, 15, 1151-
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Panamericana, Primera Edición. Buenos Aires Argentina 2009. Páginas 474-504.