cuantificacion de proteinas

Melina A. VarnavoglouBiologia II

Trabajo practico N°6: Cuantificación de proteínas.

Introducción:

Las proteínas estructuralmente son polímeros formados por secuencias de aminoácidos unidos por enlaces peptidicos. Esta unión entre. El enlace peptídico tiene lugar mediante la pérdida de una molécula de agua entre el grupo amino de un aminoácido y el carboxilo de otro. El resultado es un enlace covalente CO-NH. Es, en realidad, un enlace amida sustituido. Podemos seguir añadiendo aminoácidos al péptido, porque siempre hay un extremo NH2 terminal y un COOH terminal

Los aminoacidos son los monómeros fundamentales de las proteínas. Se conocen veinte aminoácidos proteinogenéticos, cada uno de los cuales responden a la fórmula de ser ácidos 2-aminocarboxílicos y tienen una cadena lateral R distinta, que es la que define sus propiedades particulares; asi, existen varios tipos de aminoacidos según la naturaleza de su cadena lateral R. Hay algunos aminoácidos que

tienen en su cadena lateral anillo aromático, tal es el caso del triptófano y de

la fenilalanina , entre otros.

La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede ser utilizada para su identificación y cuantificación.La absorción de luz depende de la estructura química del compuesto absorbente, y en especial de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un compuesto por medio de las características de su espectro de absorción.

Cuantificación de proteínas de solución:

La tecnica de cuantificación de proteínas consiste en estimar la concentración de proteínas de una muestra dada. En general, no hay un método completamente satisfactorio para medir la concentración de proteínas en una muestra. La elección del método depende de la naturaleza de la proteína, de la rapidez y la sensibilidad deseada. Pero el fundamento de cualesquiera de los métodos utilizados se remite a las propiedades intrínsecas que una proteína tiene de:

a) Absorber activamente la luz de la región ultravioleta. La relación entre esta absorción y la concentración proteica es lineal (cumple lo establecido por la ley de Lambert-Beer : La absorción de luz es proporcional al número de moléculas de las


sustancias en solución por donde pasa el haz luminoso). Además la absorción de un rango de longitud de onda da cuenta de la región de la proteína que la esta absorbiendo, ya que se presentan dos picos máximos de absorción de luz: uno a 280 nm correspondiente a la absorción de fotones por parte de los electrones de un anillo aromático y, otro a los 200 nm ya que los enlaces pepiticos absorben fotones por debajo de los 210 nm. La ventaja del método por absorción de luz UV es entonces que la absorvancia vs la concentración de proteínas tiene una relación lineal, que no hay consumo de proteínas, es decir, esa misma muestra puede volver a reutilizarse y que no se necesitan soluciones estándar para medir la absorvancia. Sus desventajas son que hay componentes no proteicos que absorben UV y que la estructuras 1°,2°, 3° y 4° afectan la absorvancia

b) Unir ciertos colorantes. El color indica la capacidad de las sustancias de absorber o reflejar ciertos componentes de la luz que incide sobre ellos. Mediante el agregado de diferentes reactivos químicos que reaccionan con las proteínas se origina un producto coloreado que será medido en el espectro visible, y cuya intensidad es lineal con respecto a la concentración proteica en un rango determinado. Para este método, el colorimétrico, si es necesaria una curva estándar.

En esta experiencia se utilizó el método colorimétrico de Bradford, que fue

diseñado por Bradford en 1976 y está basado en el cambio de color del colorante

Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos . Este tiene ademas las siguientes caracterisitcas y ventajas:

Es Barato, solo se utiliza un reactivo el colorante Comassie Blue G-250. De alta sensibilidad (1-100 μg). Es rápido, la reacción finaliza a los 5 min. y es estable hasta una 1 hr después. Es sencillo (solo un reactivo se utiliza) La Absorbancia se lee a 595 nm

Objetivo:

Determinación de la concentración proteica de una muestra de albumina utilizando el método colorimétrico de Bradford.

Comparar los resultados que se obtienen de realizar el mismo procedimiento pero con diluciones seriadas y con diluciones punto a punto.


Materiales:

Instrumental de laboratorio:

o Tubos de hemólisis o Tubos eppendorf.o Micropipetas automáticas p200 y p 2000 o Espectrofotómetro o Cubetas de cuarzo

Sustancias proporcionadas:

o Solución madre de Albúmina bovina (BSA) o Solución ácida del reactivo de color (Coomassie Blue G) o Agua destilada.

Metodología:

Fundamento del método:

El pico de absorción máxima del colorante en una solución ácida1, se desplaza desde los 465 nm a los 595 luego del agregado de la proteína, debido a la estabilización de la forma aniónica del colorante por interacciones tanto iónicas como hidrofóbicas. El colorante reacciona principalmente con los residuos de arginina, y en menor proporción con histidina, lisina, tirosina, triptofano y fenilalanina.

Procedimiento:

Se realizaron previamente las diluciones correspondientes para la curva de calibrado y de la muestras incógnita BSA. Dos grupos de trabajo realizaron una dilucion seriada de la muestra y su duplicado y, los dos restantes hicieron, en cambio una dilucion punto a punto y el duplicado de esta otra. Se realizo esto con el fin de obtener dos curvas de calibrado: una seriada y una punto a punto. En la experiencia de este grupo la curva a realizar asignada fue la seriada, por lo que solo se describirá el procedimiento de dilucion seriada en este trabajo: La misma consistió en, a partir de una concentración original dada dentro de un tubo eppendorf (que era de 20 mg/ml de BSA cuyo volumen, al estar en solución fue de

1 Para la preparacion del reactivo colorante ver el anexo 1 al final de este trabajo.


100 mcl), realizar una primera dilucion (con 150 mcl de agua) e ir tomando alicuotas (en general y en esta experiencia particular, siempre de la misma medida: 100 mcl) de la dilucion que le antecedía. De esta forma se obtuvieron 4 concentraciones contenidas en 4 tubos eppendorf, descriptas en la siguiente tabla:

Concentracion BSA (100 mcl) Agua8 mg/ml 20 mg/ml 150 mcl4 mg/ml 8 mg/ml 100 mcl2 mg/ml 4 mg/ml 100 mcl1 mg/ml 2 mg/ml 100 mcl

Se realizó este procedimiento con una micropipeta automática P200.

Finalmente, se rotularon cada uno de los tubos numerándolos de mayor a menor concentración.

Luego, se procedió a rotular cuatro tubos de hemólisis de la misma forma que los tubos eppendorf. En ellos es donde tendrá lugar el ensayo colorimétrico. Se colocó 1 ml de reactivo de Brandorf (Coomasie) en cada uno de ellos. Una vez preparado esto, con una micropipeta automática se extrajeron 0,5 mcl de cada uno de los tubos eppendorf que contenían la muestra y se los colocó en cada uno de los tubos de hemólisis que contenía el reactivo. Por último se agito cada tubo, tapando la boca con un pequeño papel que parecia estar siliconado, con el fin de homogenizar la mezcla muestra-reactivo. Se los dejo incubar durante 5 minutos y se encendió el espectrofotometro, ya este deber ser prendido 15 minutos antes de realizarlo. Colocando los tubos que contenian diferentes concentraciones en orden podía observarse un degradé en color azul (color caracterisitico del reactivo Coomasie), así, se definió una curva colorimétrica que tal como lo explicitado en la introducción, expresaba la relacion directa entre el desarrollo de color y la concentración de proteínas: a mayor intensidad del color azul, mayor concentración de proteínas. Efectivamente esto era asi, ya que el tubo con el rotulo “1” (la muestra mas concentrada), era el mayormente coloreado.

Una vez que se hubieron cumplido los 15 minutos desde el encendido del espectrofotómetro, se procedió a utilizarlo. Para ello, primero se lo calibro en una longitud de onda de 595 nm ya que esa es la longitud de onda en la que se lee la absorvancia para el método de Brandford. Luego, se colocó una cubeta de cuarzo que solo contenia el reactivo y se pulso la tecla AUTOCERO para que este valor se restara a todas las demás muestras a analizar para que se mida no la concentracion del reactivo color mas el de la proteína sino el de la proteína solamente. Se fue colocando el contenido de cada uno de los tubos en cubetas de cuarzo llenándolas hasta su volumen mínimo y se procedió a colocarlas en el espectrofotómetro para la medición de la absorvancia de la sustancia que cada una de ellas contenía. Registrando los valores se confeccionó la siguiente tabla:

Dilucion BSA (concentración)

Volumen a pipetear (mcl) Absorvancia (DO)


1 (8 mg/ml) 100 ml 0,175 2 (4 mg/ml) 100 ml 0,287 3 (2 mg/ml) 100 ml 0,381 4 (1mg/ml) 100 ml 0,502

Con los datos de los demas grupos se confeccionaron estas tablas:

PUNTO A PUNTO GRUPO 1 GRUPO 2 Concentracion (mg/ml)

Absorbancia

Absorbancia PROM

0 0 0 01 0,128 0,163 0,146

2,6 0,283 0,254 0,2695 0,412 0,471 0,442

7,6 0,448 0,52 0,484

CURVA SERIADA

GRUPO 3 GRUPO 4

Concentracion (mg/ml)Absorbancia

Absorbancia

PROM

0 0 0

1 0,175 0,436

2 0,287 0,474

4 0,381 0,533

8 0,502 0,55

Aclaracion: de la dilucion punto a punto y su duplicado se realizo un promedio ya que los valores obtenidos eran bastante similares, en cambio de la dilucion del grupo 3 para con su duplicado con el grupo 4 no era conveniente hacerlo ya que sus valores distaban bastante entre si y realizar un promedio significaría aumentar el error, ya que es probable que una de las dos este bien. En este caso el grupo que obtuvo valores mas cercanos al a concentracion incognita fue el grupo de este trabajo, el grupo 3. Los datos que se utilizaron para interpolar en la ecuacion de la recta de la curva estandar fueron solo estos, los del grupo del grupo 3. Esta, la curva estandar, se realiza con diferentes soluciones de una proteína patrón cuya concentracion es conocida. Luego se procede a interpolar los puntos obtenidos en ella, dando como resultado un grafico como el siguiente: (Este es tan solo un ejemplo, no son los resultados obtenidos)

Absorbancia vs ug de proteinas

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 5 10 15 20 25 30

Ab

s (

59

5n

m)


Esta recta describe la siguiente funcion

Donde y = Abs 595

m = pendiente

m = a.b , siendo a= cte de absortividad y b= longitud de la trayectoria a traves de la solucion.

x= la concentración de proteínas

b = ordenada al origen

La concentracion de la muestra patron es entonces igual a

X = y – b / a

Resultados:

y = m . x

Absorbancia vs ug de proteinas

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 5 10 15 20 25 30

Ab

s (

59

5n

m)


0 1 2 3 4 5 6 7 80

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.074342686699072 xR² = 0.957599708945761

concentracion (mg/ml)

AB

S

Conclusiones:

Los resultados obtenidos, los puntos de la curva, de los que se obtuvo la concentracion que tenia la solucion de BSA coincidian con gran aproximacion a los datos develados luego de realizar la experiencia, estos eran: 1,5; 3; 6 y 12.

Observaciones:

Si un punto se obtiene fuera de la linealidad de la curva, es conveniente diluir la muestra en ese punto hasta obtener un valor que si este dentro de ella. En este caso no fue necesario ya que todos los puntos dieron conforme a la linealidad de la curva o recta estandar, como se muestra en los resultados


Anexo 1 Preparacion del reactivo de color:

Se disuelve 100 mg de Serva Blue G en una mezcla de 100 ml de 85% de ácido fosfórico y 50 ml de etanol 95%, después de la completa disolución del colorante se lleva el volumen a 1 litro con agua.

cuantificacion de proteinas

Documents