cuantificacion de bacterias

CUANTIFICACION DE BACTERIAS NITRIFICANTES, DENITRIFICANTES, FIJADORAS DE NITROGENOY HETEROTROFAS DE HUMEDALES ARTIFICIALES

SUB-SUPERFICIALES PARA EL TRATAMIENTO DE AGUA RESIDUAL.

ERICKA TRINIDAD GAITAN. COD: 4801044.

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA. FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS.

MICROBIOLOGIA CON ENFASIS EN ALIMENTOS. PAMPLONA.

2006.

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CUANTIFICACION DE BACTERIAS NITRIFICANTES, DENITRIFICANTES, FIJADORAS DE NITROGENOY HETEROTROFAS DE HUMEDALES ARTIFICIALES

SUB-SUPERFICIALES PARA EL TRATAMIENTO DE AGUA RESIDUAL.

ERICKA TRINIDAD GAITAN. COD: 4801044.

Trabajo de pasantía como requisito de graduación.

Irma Janeth Sanabria. Directora de proyecto.

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA.

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS. MICROBIOLOGIA CON ENFASIS EN ALIMENTOS.

PAMPLONA. 2006.

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CONTENIDO

Pág. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………… 4.

1. OBJETIVOS…………………………………………………………. 5. 2. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………. 6. 3. MARCO REFERENCIAL…………………………………………… 7. 3.1. MARCO TEORICO………………………………………………… 7. 3.1.1. Microbiología del agua…………………………………….……. 7. 3.1.2. Agua residual…………………………………………………… 7. 3.1.3. Humedales……………………………………………………… 8. 3.1.4. Humedales sub-superficiales……………………………………. 10. 3.1.5. Ventajas de los humedales sub-superficiales…………………… 10. 3.1.6. Remoción biológica……………………………………………… 11. 3.1.7. Nitrificación biológica…………………………………………… 12. 3.1.8. Denitrificación…………………………………………………… 12. 3.1.9. Fijación biológica del nitrógeno molecular……………………… 13. 3.2. MARCO CONTEXTUAL………………………………………….. 14. 3.3. MARCO LEGAL…………………………………………………… 15. 4. METODOLOGÍA…………………………………………………... 16. 5. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES……………………………. 18. 6. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS……………… 19. 7. CONCLUSIONES………………………………………………….. 27. 8. RECOMENDACIONES O SUGERENCIAS……………………… 28. 9. GLOSARIO……………………………………………………….... 29. 10. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………... 30. 11. ANEXOS. ………………………………………………………….. 32.

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INTRODUCCIÓN

Este trabajo es una recopilación de toda la parte experimental y teórica desarrollada en el laboratorio de microbiología ambiental de la Universidad del Valle en colaboración con el proyecto “Modelación de los mecanismos involucrados en la remoción de nutrientes y materia orgánica en humedales sub-superficiales para el tratamiento de aguas residuales domesticas”, durante la segunda etapa del mismo. En los últimos años se ha aumentado la contaminación por parte de la población, incluyendo la contaminación de las fuentes de agua, situación que afecta la disponibilidad de las mismas, estos hechos han llevado a la comunidad científica a la búsqueda de soluciones para mantener un equilibrio en el medioambiente. Actualmente se están realizando investigaciones para el modelamiento de humedales sub-superficiales en el trópico, por ser un método natural para el tratamiento de aguas residuales domesticas. Los estudios buscan aportar información que ayude a la optimización en la aplicación de estos tratamientos, ya que se trabaja con ellos pero como un modelo de caja negra, debido a que no se han esclarecido completamente las comunidades, poblaciones, e interacciones que allí se llevan a cabo. Dentro de las actividades realizadas esta el recuento de los cuatro grupos bacterianos (nitrificantes, denitrificantes, fijadoras de nitrógeno y heterótrofas), de los humedales artificiales sub-superficiales para el tratamiento de agua residual de la planta ubicada en Ginebra-Valle, y apoyo a las actividades desarrolladas en laboratorios de docencia. En este informe, basado principalmente en el recuento de bacterias nitrificantes, denitrificantes, fijadoras de nitrógeno, y heterótrofas de humedales sub-superficiales como componentes fundamentales en la eliminación de contaminantes en los humedales anteriormente mencionados, para el tratamiento de aguas residuales, se pretende aportar datos que contribuyan a la elaboración de un modelo matemático. La realización del proyecto fue a nivel de campo, con toma de muestras en la estación de Ginebra –Valle, las cuales fueron procesadas en el laboratorio.

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1. OBJETIVOS.

1.1. OBJETIVO GENERAL.

Incursionar en el campo investigativo, como apoyo en el área de microbiología para el desarrollo del proyecto “Modelación de los mecanismos involucrados en la remoción de nutrientes y materia orgánica en humedales sub-superficiales para el tratamiento de aguas residuales domesticas”, durante la segunda etapa del mismo.

1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS.

Evaluar y aplicar los protocolos propuestos para el recuento de bacterias

nitrificantes y fijadoras de nitrógeno, por la técnica de placa en superficie, bacterias heterótrofas por la técnica de placa en profundidad, y bacterias denitrificantes por el método del numero mas probable (NMP).

Proponer recomendaciones para optimizar los protocolos propuestos para el aislamiento de las bacterias de interés.

Apoyar las actividades del laboratorio de docencia. Actualizar la base de datos en formato PDF del grupo de investigación GAOX.

(Grupo de investigación en procesos avanzados de oxidación).

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2. JUSTIFICACIÓN.

Con el crecimiento de la población mundial la demanda de agua para el consumo humano y la contaminación de las fuentes de agua, hacen necesario aplicar métodos de tratamiento a las aguas residuales domesticas e industriales para evitar la contaminación de los cuerpos de agua a los cuales se vierten estas agua residuales para un mejor cuidado del ambiente y del recurso hídrico. En el área del tratamiento de aguas residuales hay varias opciones a la hora de escoger, sin embargo estos métodos pueden llegar a ser demasiado costosos y aún si el beneficio es grande, los costos son una limitante para la puesta en marcha de dichos tratamientos no obstante se han venido estudiando métodos naturales, igualmente efectivos en el tratamiento de las aguas residuales como son los humedales artificiales de flujo sub- superficial. Este trabajo contribuye a la recopilación de datos, para el estudio y análisis de este tipo de humedales, con el fin de usarlos en modelación, con miras a la aplicación a gran escala de este tipo de tratamiento.

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3. MARCO REFERENCIAL

3.1. MARCO TEORICO 3.1.1. Microbiología del agua. La hidrosfera es un hábitat adecuado para el crecimiento microbiano, ya que contiene agua, que es necesaria para el metabolismo microbiano. En la hidrosfera hay poblaciones microbianas autóctonas que comparten un número limitado de características generales. Los microorganismos del agua pueden crecer a baja concentración de nutrientes. En el medio acuático, la mayoría presentan movilidad por flagelos u otros mecanismos. La hidrosfera se divide en los hábitats de agua dulce (limnéticos) como lagos, estanques, pantanos, fuentes, humedales, arroyos y ríos, y los hábitats marinos como océanos, mares y estuarios. (Atlas, Richard, 2002). En el ambiente acuático, el papel de los microorganismos en la degradación de materia orgánica refleja el proceso que ocurre en las plantas de tratamiento de aguas residuales, pero además de esto los microorganismos en el ambiente acuático pueden ser importantes como indicadores de contaminación. (Lester et al., 1999). A diferencia de las plantas de tratamiento de aguas residuales, muchas aguas naturales contienen muy poca materia orgánica y consecuentemente tienen baja densidad microbiana. Si la biodegradación de compuestos específicos puede ocurrir esto transcurre bajo condiciones de limitaciones severas de nutrientes. Las bajas concentraciones de nutrientes podrían no permitir el crecimiento excepto a tasas muy bajas, esto podría significar que el flujo de energía en el sistema es insuficiente para el mantenimiento de la población microbiana (Atlas, Richard, 2002). 3.1.2. Agua residual. Los residuos líquidos se producen por las actividades humanas diarias (aguas residuales domesticas) y por diferentes actividades agrícolas e industriales. Mediante drenaje a través del alcantarillado, las descargas de residuos líquidos alcanzan las masas naturales de aguas superficiales, como ríos, lagos y océanos. Estas mismas capas de agua se utilizan de formas alternativas : como agua potable , para uso doméstico e industrial y para el riego ; para el cultivo de peces y mariscos ; y para piscinas y otras actividades de ocio ,por lo tanto es crucial mantener la calidad de esta agua naturales lo mejor posible .El mantener la calidad de agua significa no sobrecargar con nutrientes orgánicos e inorgánicos, o con sustancias toxicas, nocivas o inaceptables desde el punto de vista estético .No deben alterase significativamente su oxigenación, temperatura, salinidad, turbidez o pH. Las aguas naturales tienen la capacidad inherente de auto purificación. Los microorganismos acuáticos heterótrofos utilizan y mineralizan lo nutrientes orgánicos. El amonio se nitrifica y junto con otros nutrientes inorgánicos es utilizado e inmovilizado por las algas y plantas acuáticas superiores. Las bacteria patógenas se reducen y finalmente se eliminan por las presiones de competencia y depredación ejercidas por poblaciones

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acuáticas autóctonas es así como las aguas naturales pueden aceptar una cantidad moderada de aguas residuales sin depurar, sin que se produzca un deterioro significativo de la calidad. El aumento en el volumen de las aguas residuales lleva a la búsqueda de nuevas soluciones que lleven a un uso adecuado del agua natural y la posibilidad de reutilizar aguas residuales domesticas tratadas (Atlas, Richard, 2002). De los constituyentes enumerados en la tabla 1, los sólidos suspendidos, los compuestos orgánicos biodegradables y los organismos patógenos son de mayor importancia, y por ello la mayoría de instalaciones de manejo de aguas residuales son diseñadas para su remoción. TABLA 1. Principales constituyentes de interés en el tratamiento de aguas residuales. (Crites, Tchobanoglous, 2000). Constituyentes Razón de interés Sólidos suspendidos totales Formación de depósitos de lodos y

condiciones anaerobias. Compuestos orgánicos biodegradables

Agotamiento del oxigeno en fuentes naturales y desarrollo de condiciones sépticas.

Constituyentes inorgánicos disueltos (Sólidos disueltos totales )

Constituyentes inorgánicos adicionados por el uso. Aplicaciones en la reutilización de aguas residuales

Metales pesados Constituyentes metálicos adicionados por el uso. Muchos metales se clasifican como Polutantes de prioridad.

Nutrientes Crecimiento excesivo de la vida acuática. Indeseable, eutrofización, concentración de nitratos en agua para consumo humano.

Patógenos Transmisión de enfermedades. Polutantes orgánicos prioritarios Sospechosos de ser carcinogénicos,

mutagénicos, teratogenicos o de toxicidad aguda alta. Muchos polutantes prioritarios son resistentes a los métodos de tratamientos convencionales. (Conocidos como contaminantes orgánicos refractarios.)

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3.1.3. Humedales (wetlands). Los humedales son ambientes acuáticos de poca profundidad en los que predominan las plantas emergentes. Estos se desarrollan en condiciones climáticas diversas en zonas acuáticas superficiales con escaso drenaje. Las plantas emergentes sirven como base para la clasificación de los humedales. Los humedales y sistemas acuáticos de tratamiento son aquellos que utilizan plantas acuáticas y animales para el tratamiento de aguas residuales municipales e industriales. Los humedales construidos son una alternativa natural a los métodos técnicos de tratamiento de aguas de desecho (Atlas, Richard, 2002). Son sistemas pasivos de depuración, se caracterizan por su simplicidad de operación, un bajo o nulo consumo energético, una baja producción de residuos, un bajo impacto ambiental sonoro y una buena integración al medio ambiente rural. Hay varios tipos de humedales y sistemas acuáticos de tratamiento como:

Fig.1 Sistemas de humedales para el tratamiento de aguas residuales(A, estanque con plantas libres flotantes; B, estanque de flujo sub-superficial horizontal con plantas emergentes; C, humedal de flujo sub-superficial horizontal; D, humedal de flujo vertical). (Stottmister ,2003) Humedales artificiales de flujo libre

• Como pantanos o ciénagas. • Con su vegetación parcialmente en el agua. • Profundidad entre 100- 450 mm.

Humedales artificiales de flujo sub-superficial • La vegetación emergente se planta en el medio que puede ser grava o arena. El

propósito de la vegetación es proveer oxigeno ala zona radicular y aumentar el área superficial para el crecimiento biológico en la zona de las raíces.

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• Profundidad del lecho 0, 45 a 1 m. y tienen una pendiente característica desde 0 a 0,5 %.

Sistemas acuáticos de plantas flotantes • Plantas flotantes suspendidas con raíces relativamente largas (Jacinto de agua), y la

raíz sirve como medio para el crecimiento de películas de bacterias. • Lentejas de agua (sistemas de sombreado superficial). Sistemas combinados • Combinación de humedales y sistemas acuáticos para lograr objetivos en relación

a la calidad del agua. Los humedales de flujo sub-superficial tienen ventajas respecto a los de flujo superficial: • Menor incidencia de mal olor debido a la naturaleza subterránea del flujo. • Bajo riesgo de exposición directa de las personas y de aparición de insectos gracias

al flujo subterráneo. • Protección térmica debido a la acumulación de restos vegetales y del flujo

subterráneo, ventaja interesante en los países nórdicos, donde la cobertura del hielo y nieve invernal no afectan el proceso.

Entre lo inconvenientes cabe destacar:

• Mayor coste de construcción debido fundamentalmente al material granular, el coste puede incrementarse hasta un 30 %.

• Menor valor como ecosistema para la vida salvaje debido a que el agua es difícilmente accesible a la fauna.

• Colmatacion del medio granular por grasas y aceites, aportes continuos de materiales finos inertes.

Ventajas frente a los sistemas convencionales mecanizados:

• Simplicidad en operación.Requieren un tiempo bajo de operarios y pocos equipos electromecánicos; pueden ser explotados por operarios con poca experiencia.

• Consumo energético mínimo o nulo.En general limitado al pre-tratamiento o elevaciones.

• Baja producción de residuos durante la operación del sistema, bajo costo de explotación y mantenimiento en la operación del sistema.

• Fiabilidad en la operación del sistema de tratamiento. Con tiempos de permanencia hidráulica muy altos.

• Bajo impacto ambiental.

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• Creación y restauración de zonas húmedas aptas para potenciar vida salvaje, educación ambiental y zonas de recreo.

Principales inconvenientes frente a sistemas convencionales:

• Requieren una superficie superior (20-80 veces superior ). • Coste de construcción similar, o incluso mayor. • Larga puesta en marcha, desde meses hasta un año. • Difíciles de diseñar bien dado al alto numero de procesos y mecanismos implicados

en la eliminación de contaminantes. • Pocos o ningún factor de control durante la operación.

Los humedales construidos e han utilizado para tratar una gamma amplia de aguas residuales:

• Aguas domésticas y urbanas. • Aguas industriales ,incluyendo fabricación del papel ,productos químicos

y farmacéuticos, cosméticos, alimentación, refinerías y mataderos entre otros.

• Lixiviados de vertederos. • Aguas de drenaje de extracciones mineras. • Aguas de escorrentía superficial agrícola y urbana. • Tratamiento de fangos de depuradora. (Atlas, Richard, 2002).

3.1.6. Remoción biológica. Dado que tanto el nitrógeno como el fósforo pueden causar impacto en la calidad del agua que los recibe ,la descarga de uno o ambos constituyentes debe ser controlada con frecuencia .El nitrógeno puede estar presente en las aguas residuales de varias maneras por ejemplo en forma orgánica amoniaco , nitritos o nitratos. El fósforo se encuentra en las aguas residuales en forma de fosfatos complejos los cuales representan cerca de la mitad de los fosfatos de las aguas residuales municipales y provienen del uso de estos materiales en detergentes sintéticos (Atlas et al., 2002). La figura 2 muestra el flujo del nitrógeno en la tierra.

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Figura 2. Ciclo del nitrógeno .Los pasos críticos en la fijación del nitrógeno, en la nitrificación y en la denitrificación están mediados por las bacterias. 3.1.7. Nitrificación biológica .En la nitrificación biológica, el amoniaco se oxida en un proceso de dos pasos: primero a nitritos luego a nitratos. En la conversión de amonio a nitritos representada por la Nitrosomonas sp. ocurre el mayor consumo de oxígeno (4.33 mg O2 / mg N-NH4+ oxidado), además de que se generan iones hidrógeno, propiciando en el cultivo un descenso del pH. En un primer paso, la enzima amonio mono-oxigenasa (AMO) transforma al amonio en hidroxilamina, que posteriormente se convierte en nitrito, mediante la hidroxilamina óxidoreductasa (HAO). (AMO) NH 4 + + H + + 2e - + O 2 NH 2 OH + H 2 O (HAO) NH 2 OH + H 2 O NO 2 - + 5 H + + 4e - La conversión de nitritos a nitratos esta representada por Nitrobacter sp. Mediante la acción de la nitrito óxido-reductasa (NOR): (NOR) NO2- + H 2 O NO3- + 2 H + + 2 e - Las bacterias nitrificantes son quimiolitotrófas y utilizan la energía de la nitrificación para fijar CO2, son microorganismos sensibles y extremadamente susceptibles a un amplio rango de sustancias inhibitorias .A partir de estudios realizados tanto en laboratorio como en plantas a gran escala se encontró que los siguientes factores afectan el proceso de nitrificación:

• Concentración de amonio y nitritos.

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• Relación DBO5 / TKN (ver glosario). • Concentración de oxigeno disuelto. • Temperatura. • pH

Las concentraciones de oxigeno disuelto que estén por encima de 1 mg /L son esenciales para que ocurra el proceso de nitrificación. Si los niveles de oxigeno disuelto caen por debajo de este valor el oxigeno se convierte en el nutriente limitante y la velocidad de nitrificación disminuye o el proceso se detiene. Existe un rango óptimo entre pH 7.5 a 8.6, pero los sistemas que están aclimatados a valores de pH menores llevan a cabo la nitrificación con éxito (Atlas et al., 2002). 3.1.8. Denitrificación. Las bacterias denitrificantes obtienen energía para su crecimiento de la conversión en nitrógeno gaseoso, pero requieren una fuente de carbono para la síntesis celular .Dado que los efluentes nitrificados tienen, por lo general un bajo contenido de materia carbonácea, se requiere con frecuencia una fuente externa de carbono. La desnitrificación es un proceso respiratorio anaerobio heterotrófico del tipo anóxico, donde la reducción del nitrato hasta N2 sigue una serie de pasos que involucran la actividad de enzimas diferentes. Nar Nir Nor Nos

NO3- → NO2- → NO → N2O → N2 Nitrato nitrito oxido nítrico oxido nitroso nitrógeno gaseoso Nar: nitrato reductasa; Nir: nitrito reductasa; Nor: oxido nítrico reductasa; Nos: oxido nitroso reductasa. Dentro de las variables que afectan el proceso de denitrificación se encuentran:

• Concentración de nitratos • Concentración de carbono • Temperatura • pH

3.1.9. Fijación biológica de nitrógeno molecular. La fijación de nitrógeno molecular la llevan a cabo diversos géneros de bacterias de vida libre, algunas de las cuales están asociadas a la rizosfera y géneros de bacterias que forman asociaciones mutualisticas con las plantas. El proceso de reducción de nitrógeno a amoniaco es catalizado por la enzima nitrogenasa. El complejo de la enzima nitrogenasa tiene dos coproteinas, una que contiene hierro y molibdeno, y otra que solamente contiene hierro. La nitrogenasa es muy sensible al oxigeno, necesita una presión parcial o muy baja de este elemento para poder realizar su

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actividad. Los genes que determinan la fijación del nitrógeno, están sometidos a una rigurosa regulación genética. Existe un sistema regulador muy complejo que controla la expresión de numerosos genes nif necesarios para la síntesis de la nitrogenasa activa. La fijación necesita además de la nitrogenasa, ATP, una ferrodopsina reducida y quizás otros citrocromos y enzimas. La ecuación total de la reacción se muestra a continuación:

El amonio es el primer producto que se detecta en el proceso de fijación, y tal como lo indica la DG`o positiva (DG`o = + 150 Kcal. /mol = 630 Kj / mol), la reacción requiere una considerable entrada de energía. El amonio se asimila en forma de aminoácidos, que se polimerizan, formando proteínas. (Atlas et al., 2002).

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3.2. MARCO CONTEXTUAL La universidad del valle , el instituto de investigación y desarrollo de agua potable saneamiento básico y conservación del recurso hídrico (CINARA ), el departamento de biología vegetal aplicada ,el instituto VON HUMBOLDT y la corporación autónoma regional del Valle del Cauca (CVC) se unen para la realización del proyecto : “Modelación de los mecanismos involucrados en la transformación y remoción de nutrientes y materia orgánica en humedales artificiales sub-superficiales para el tratamiento de aguas residuales domesticas “en el año 2003. La investigación se centra en identificar los principales mecanismos involucrados en la transformación de nutrientes y materia orgánica en un humedal artificial sub-superficial, para el tratamiento de aguas residuales domésticas. El trabajo es realizado en Santiago de Cali, Valle del Cauca, por el proyecto ya especificado y atendiendo al problema de contaminación del recurso hídrico, y las posibilidades de re-uso de aguas residuales domésticas tratadas. En el laboratorio de Microbiología ambiental de la Universidad del Valle, son llevados a cabo los recuentos de bacterias nitrificantes, denitrificantes, fijadoras de nitrógeno y heterótrofas, con el propósito de conocer la proporción de las poblaciones ya mencionadas presentes en la interacción planta-rizosfera.

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3.3. MARCO LEGAL La experimentación va dirigida al tratamiento de aguas residuales domesticas para la realización de la modelación de los humedales en Ginebra (Valle ) y su potencialidad para ser aplicados como solución al problema de contaminación del recurso hídrico tanto para la región como para el país ,por lo cual se trae a colación los siguientes decretos : DECRETO 1594 DEL 26 DE JUNIO DE 1984, del ministerio de agricultura y por el cual se reglamenta parcialmente el titulo I de la ley 9 de 1979, axial como el capitulo II de titulo VI parte III –Libro II y el titulo III de la parte III – Libro I del decreto – Ley 2811 de 1974 en cuanto a usos del agua y residuos líquidos. GUIA TECNICA PARA EL DESARROLLO DE PROYECTOS DE REUSO DE AGUAS RESIDUALES DOMESTICAS MUNICIPALES, 2001, Ministerio del medio ambiente, dirección general ambiental sectorial ,grupo de gestión ambiental , urbano y salud .

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4. METODOLOGÍA. 4.1. Descripción del sistema. La planta de tratamiento, ubicada en el municipio de Ginebra (Valle del Cauca), perteneciente a la empresa Acuavalle S.A., cuenta con tres humedales de flujo sub-superficial como tratamiento terciario de las aguas residuales domesticas de este municipio, las aguas que llegan al sistema vienen de un tratamiento en la laguna anerobia (fig.３）. En esta etapa del proyecto se trabajo con las siguientes cargas hidráulicas:

• Humedal plantado con Heliconia psittacorum 600 ml /10 s. • Humedal sin vegetación 200 ml / 10 s. • Humedal plantado con Phragmites australis 400ml / 10 s.

Figura 3. Vista de los humedales Phrag: humedal plantado con Phragmites australis SV: humedal sin vegetación Caa: columna de agua afluente Cae: columna de agua efluente Hel: humedal plantado con Heliconia psittacorum

4.2. Toma de muestra La toma de muestra de realizó desde octubre 13 hasta diciembre 13 de 2006(para un total de 63 días). Se tomaron dos tipos de muestra , las muestras de columna de agua ( muestra de agua tomada de tubos PVC donde por medio de pequeños orificios fluye el agua, cada humedal tiene la columna de agua del afluente y del efluente ) y las muestras de sustrato (muestra de carbonilla cercana a la rizosfera de las plantas ), Los humedales fueron muestreados en cuatro puntos ,.sustrato y columna de agua del afluente y del efluente, fueron escogidas tres plantas aleatoriamente para la toma de muestra en cada punto para las muestras de carbonilla, en el humedal sin vegetación las muestras de sustratos también se aleatorizaron, se realizo el mismo procedimiento en cada recolección . Las muestras fueron trasladadas al laboratorio de microbiología ambiental para realizar el recuento de microorganismos.

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A las muestras de columna de aguas se realizaron mediciones de oxigeno disuelto. 4.3. Recuento de microorganismos. Se realizaron diluciones sucesivas de las muestras a partir de 1 g. de sustrato y 1 ml de agua respectivamente en solución salina 0.85 % .las muestras de sustrato se maceraron para desprender los microorganismos , para bacterias fijadoras de nitrógeno (medio para bacterias fijadoras de nitrógeno, protocolos de laboratorio de microbiología ambiental) y nitrificantes se sembraron por la técnica de placa en superficie en el medio autotrófico para Nitrobacter 756 c (DSMZ), para ver la morfología típica (gotas de agua), se utilizo como control positivo Nitrobacter winogradski DSM 10237 ,las bacterias heterótrofas se sembraron por la técnica de placa profunda en agar nutritivo (Merck), y las bacterias denitrificantes por el método del número mas probable en medio para bacterias denitrificantes (Londoño, 2002)., determinado por la desaparición de nitrito y nitrato revelado por el reactivo de Griess-Ilosvay tomando 50 ul de muestra a los cuales se agregaron 50 ul del reactivo, se utilizo el medio de cultivo sin inocular como control negativo para asegurar que las bacterias provienen de la muestra. La máxima dilución fue de 10-7. Para el recuento de bacterias se utilizaron las cajas que presentaron el crecimiento entre 15 y 300, con estos datos se calculo ufc/ml utilizando la siguiente formula: numero de colonias * factor de dilución Ufc/ml = __________________________________ ml sembrados en la placa

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5. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES MES AGOSTO SEPTIEMBRE OCTUBRE NOVIEMBRE DICIEMBRE ENERO ACTIVIDAD \ SEMANA 2 3 4 5 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 5 1 2 3 4 1 2 Lectura de articulo introductoria X X Control T º de incubadoras X Organización manuales de equipos X Inducción X X Recolección de artículos para la base de datos.

X X

Limpieza de vidrios zona de lavado X Limpieza de estantes X Apoyar las actividades del laboratorio de docencia.

X X X X X X X X X

Lectura de la bitácora Norma Perez.

X X X

Búsqueda de bibliografía X X X Planificación del trabajo X Revisión de 1ª parte del trabajo X Reactivar y conservar en glicerol las cepas de E. coli, Salmonella sp y Shigella sp.

X

Toma y procesamiento de muestra X X X X X X Recuento de heterótrofas X X X X X X Recuento de fijadoras, nitrificantes y denitrificantes.

X X X X X X

Organización de datos. X X Realización de gráficos. X Elaboración del trabajo final. X X

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6. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS Se observo el crecimiento de bacterias nitrificantes y fijadoras de nitrógeno, caracterizado por la formación de colonias translucidas en forma de gota de agua en los respectivos medios de cultivo. (Figuras 4,5 ,6 y 7).

Figuras 4. Figura 5. Crecimiento típico de bacterias nitrificantes en medio autotrófico para nitrobacter 756c (DSMZ), las colonias se observan en los círculos negros. El medio proporciona nitrito como fuente inorgánica de nitrógeno y las bacterias fijan el CO2 como fuente de carbono, el crecimiento de estas bacterias varia de 13 a 14 días debido a su metabolismo lento.

Figura 6. Figura 7. Bacterias fijadoras. Crecimiento típico de bacterias fijadoras en medio por componentes para bacterias fijadoras. El medio proporciona fuente de carbono orgánico e inorgánico sin proporcionar fuente de nitrógeno solo los microorganismos capaces de tomar el nitrógeno atmosférico se desarrollan en este medio.

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Las bacterias denitrificantes se cultivaron en medios líquidos, se considero positivo con la eliminación total del nitrógeno del medio de cultivo, revelado por la permanencia del color amarillo del medio de cultivo, al adicionar el reactivo de griess ( figura 8 y 9).

Figura 8. Figura 9. Microplacas donde se revela la presencia de bacterias denitrificantes, los pozos que luego de agregar el reactivo de griess (reactivo del nitrito) se tornaban de color rojo se toma como negativo, si luego de la adición del reactivo no hay cambio de color se agrega el polvo de zinc (detecta nitratos) si no hay cambio de color, se detecta la desaparición de las formas nitrogenadas, la prueba es positiva para el crecimiento de bacterias denitrificantes. En la figura 9 los 5 pozos en la parte inferior corresponden al control negativo. En esta investigación se cuantificaron las bacterias del ciclo del nitrógeno, ya que los principales procesos para la remoción de nitrógeno de las aguas residuales se da principalmente por nitrificación /denitrificación. Las poblaciones encontradas para la zona cercana a la rizosfera varían entre 5,42 y 10,15 unidades logarítmicas para bacterias heterótrofas, 5,48 y 8,31 unidades logarítmicas para fijadoras de nitrógeno, 4,02 y 7,97 unidades logarítmicas para nitrificantes y <2,47 y 10,79 unidades logarítmicas para denitrificantes.

Se resalta la falta de datos en las gráficas correspondientes a las columnas de aguas. Se esperaba encontrar diferencias en las poblaciones de los humedales con plantas y el humedal sin vegetación, ya que el propósito de la vegetación es proveer oxigeno a través de la zona radicular y aumentar el área superficial para el crecimiento biológico en la zona de las raíces , sin embargo el transporte real de oxigeno hacia la zona radicular y luego a la columna de agua es limitado , las raíces también liberan sustancias orgánicas .Estas diferencias no son grandes ya que el humedal sin vegetación presentaba crecimiento de pastos ( figura 13) , al igual que el humedal plantado con Phragmites y Heliconia, que presentaban crecimiento de gramíneas (Leucaena sp.) (figuras 13, 14,15 y 16). Estas plantas poseen una raíz densa y expansiva (figura 17.) y en la rizosfera de estas plantas existen altas poblaciones de bacterias fijadoras y nitrificantes.

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10,0012,00

13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dicf echas

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HeterotrofasFijadorasNitrificantesdenitrificantes

Figura 10. Bacterias cuantificadas en los cuatro puntos del humedal plantado con Heliconia psittacorum. a. Rizosfera del afluente, hay gran cantidad de bacterias denitrificantes en los tres primeros muestreos. b. Columna de agua afluente, el 27 de octubre disminuye el oxigeno disuelto (figura 18), a su vez hay un descenso en el número de bacterias heterótrofas, nitrificantes y fijadoras de nitrógeno, y un aumento de las bacterias denitrificantes. c. Rizosfera del efluente, en las últimas fechas se resalta el aumento de bacterias heterótrofas. d. Columna de agua efluente. Los vacíos en b y d corresponden a las muestras que no fue posible tomar. En todos los puntos de muestro se destaca la disminución del número de bacterias denitrificantes en las dos últimas fechas de muestreo.

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fechas

heterotrofasFijadorasNit rif icantesDenit rif icantes

0,001,002,003,004,005,006,007,008,009,00

10,00


fechas

Heterotrofasf ijadorasNitrif icantesDenitrif icantes

Figura 11. Bacterias cuantificadas en los cuatro puntos del humedal sin vegetación. a. Rizosfera del afluente, presenta un aumento de bacterias heterótrofas y denitrificantes el 23 de noviembre. b. columna de agua afluente, del 26 de octubre al 23 de noviembre se da una leve disminución del oxigeno disuelto (figura 18), y un aumento de bacterias denitrificantes en esta fecha. La cantidad de oxigeno empieza a aumentar el 6 de diciembre fecha en la cual empieza el descenso en el numero de bacterias denitrificantes. c. Rizosfera del efluente, se aprecia un aumento de tres grupos bacterianos (heterótrofas, nitrificantes y fijadoras) el 23 de noviembre. d. Columna de agua efluente, hay disminución del oxigeno disuelto desde el 26 de octubre hasta el 6 de diciembre (figura 18), sin embargo las bacterias denitrificantes disminuyen a partir del 6 de diciembre. Los vacíos en b y d corresponden a las muestras que no fue posible tomar. En todos los puntos de muestreo se destaca la disminución del número de bacterias denitrificantes en las dos últimas fechas de muestreo.

b

c

a

d

24

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00


Fechas

Log

UFC

/g-b

act./

ml

Heterotrofas

Fijadoras

Nitrificantes

Denitrificantes

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00


Fechas

Log

UFC

/g-b

act./

ml

Heterotrofas

Fijadoras

Nitrificantes

Denitrificantes

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

10,00


fechas

Log

UFC

/g-b

act./

ml

Nitrificantes

Fijadoras

Nitrificantes

denitrificantes

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00


fechas

Log

UFC

/g-b

act./

ml

Heterotrofas

Fijadoras

Nitrificantes

Denitrificantes

Figura 12. Bacterias cuantificadas en los cuatro puntos del humedal plantado con Phragmites australis. a. Rizosfera del afluente. b. columna de agua afluente, en la muestra del 13 de octubre el oxigeno disuelto es de 6,3 mg/l (figura 18) y se obtuvo un alto número de bacterias denitrificantes, para el 13 de diciembre el oxigeno disuelto fue 1,8 mg /l y las bacterias denitrificantes disminuyen, la cual puede ser causada por otra variable. c. Rizosfera del efluente, se aprecia un aumento de bacterias heterótrofas, y una leve disminución de bacterias nitrificantes y fijadoras. d. Columna de agua efluente, presenta un comportamiento similar al de la columna de agua del afluente donde disminuye el numero de bacterias al igual que la cantidad de oxigeno disuelto. En todos los puntos de muestreo se destaca la disminución del número de bacterias denitrificantes en las últimas fechas de muestreo.

b

c

a

d

25

Figura 13. Humedal sin vegetación, se puede apreciar el crecimiento de pasto (Cyperus rotundus) en todo el humedal.

Figura 14. Humedal plantado con Phragmites. Se puede ver la maleza

Figura 16. Humedal plantado con Heliconia, se observa la maleza.

Figura 17. Malezas encontradas en los humedales, se aprecia el tamaño de la raíz.

Figura 15. Humedal plantado con Heliconia, se observa la maleza.

26

Oxigeno disuelto en la columna de agua

012345678

13-oct 27-oct 10-nov 24-nov 8-dic

fecha

mg

/l O

2 HCAAHCAESVCAASVCAEFCAAFCAE

Figura 18. Datos de oxigeno disuelto tomado en la columna de agua. HCAA: columna de agua Heliconia afluente. HCAE: columna de agua Heliconia efluente. SVCAA: columna de agua humedal sin vegetación afluente. SVCAE: columna de agua humedal sin vegetación efluente FCAA: columna de agua Phragmites afluente. FCAE: columna de agua Phragmites efluente. Los resultados de oxigeno disuelto reflejan los cambios producidos en el humedal a causa de la poda realizada en los humedales el 27 de octubre, los restos vegetales no son retirados de los humedales lo que incrementa el contenido de materia orgánica en los humedales plantados. El número de bacterias denitrificantes se redujo considerablemente en los dos últimos muestreos, se debe tener en cuenta que las acondiciones de anoxia son proporcionadas por el humedal sin embargo su disminución puede ser causa de la disponibilidad de materia orgánica para la síntesis celular.

27

8. CONCLUSIONES

• Los protocolos aplicados permiten la cuantificación de los grupos bacterianos, en esta etapa fue necesario disminuir el número de diluciones, para obtener una buena recuperación de bacterias fijadoras de nitrógeno.

• De acuerdo a los resultados obtenidos las poblaciones bacterianas

cuantificadas, indican un alto potencial de la ocurrencia de los procesos de remoción de nitrógeno, esto es importante en el tratamiento del agua residual para la eliminación de las formas nitrogenadas presentes en estas aguas.

• Las condiciones específicas para cada humedal marcan las diferencias en el

número de bacterias cuantificadas.

• En esta etapa del proyecto no fue posible relacionar las variables físico- químicas, con el aumento o disminución de las poblaciones, debido a la falta de datos.

28

9. RECOMENDACIONES

Para encontrar los parámetros que expliquen las variaciones de los microorganismos se recomienda:

• Tener en cuenta los factores físico químicos (pH, Tº, DBO, concertación de nitratos (NO3), nitritos (NO2)) que afectan cada grupo bacteriano y asegurar la medición de dichos parámetros en cada muestreo.

• Controlar en los humedales factores que pueden causar variaciones, como la carga hidráulica y malezas.

29

10. GLOSARIO

Heterótrofo: microorganismo que sintetiza todo el material celular a partir de compuestos orgánicos. Humedal artificial: sistema construido que replica las características y capacidad de reciclaje de aguas de los sistemas pantanosos naturales. Modelación: es la habilidad para describir la situación problemática que confronta un analista. Puede expresarse a través de matemáticas, símbolos o palabras, pero es esencialmente una descripción de entidades y las relaciones entre ellas. Polutante: Es una sustancia que causa contaminación y por definición puede causar algún efecto peligroso. Quimiolitótrofo: Microorganismos capaces de usar el CO , CO2 o carbonatos como fuente de carbono para la biosíntesis celular y que derivan energía de la oxidación de componentes inorgánicos. Rizosfera: es la parte del suelo inmediata a las raíces, tal que al extraer una raíz, es aquella porción de tierra que resta adherida a la misma. TKN: Método analítico que determina el nitrógeno total orgánico y el amonio. DQO :Medida del oxigeno requerido para oxidar todos los compuestos presentes en el agua ,tanto orgánicos como inorgánicos ,por la acción de agentes fuertemente oxidantes en medio ácido La materia orgánica se oxida hasta dióxido de carbono y agua ,mientras el nitrógeno se convierte en amoniaco.

30

11. BIBLIOGRAFÍA ATLAS, M. RONALD; BARTHA, RICHARD, 2002.Ecología microbiana y microbiología ambiental, Madrid, España .Adison Wesley. CARRILLO, CERVANTES FRANCISCO; PEREZ, JAIME; GOMEZ, JORGE.2000.Avances en la eliminación biológica del nitrógeno de las aguas residuales. Revista Latinoamericana de microbiología 42:73-82. CRITES, RON; TCHOBANDGLOUS, GEORGE, 2000.Sistemas de manejo de aguas residuales para núcleos pequeños y descentralizados. 1043pp . KHIN, THAN; ANNACHHATRE, AJIT P.2004.novel microbial nitrogen removal processes. Biotechnology Advance 22: 519-532 LESTER, J.N; BIRKETT, J .N.1999.Microbiology and chemistry for environmental scientist and engineers, 2 nd edition, E&fn SPON. Tailor & Francis group. London and New York. LONDOÑO, 2002.Evaluación de las tasas de nitrificación y denitrificación en la columna de agua de un sistema natural para el tratamiento de agua residual doméstica basado en la utilización de Spirodella polirrhyza, Tesis de post-grado. Cali-Colombia. Universidad del Valle. MARCHETTO, MARGARITA; GIANOTTI POZZI, ELOISA ;CAMPOS, ROBERTO JOSE; PIRES ,ROBERTO CLETO;2003.Estimate of denitrifying microbiota in terciary sewage treatment and kinetic of denitrification process using different sources of carbon,Brazilian Journal of microbiology. 34:104-110. PÉREZ, NORMA.2006. Cuantificación de bacterias nitrificantes, denitrificantes, fijadoras de nitrógeno y heterótrofas de humedales artificiales sub-superficiales para el tratamiento de agua residual. Tesis de pregrado. PRINCIC, ALENKA ; MAHNE,IVAN ;MEGUSAR , FRANCE; PAUL, A. ELDOR ; TIEDJE JAMES.1998.Effects of pH and ammonium concentrations on the community structure of nitrifiying bacteria from wastewater. Applied and Environmetal Microbiology. 3584-3590. RICK, YE W.; STUART, THOMAS M.2001.Microbial nitrogen cycles: physiology, genomics and applications. Current opinion in microbiology 4:307-312. SCMIDT, INGO; SLIEKERS, OLAV; SCHMID;BOCK, EBERHARD;FUERST,JOHN;KUENEN ,GIJS J.;JETTEN, MIKE S. M.; STROUS, MARC.2003.New concepts of microbial treatment processes for the nitrogen removal in wastewater. FEMS Microbiology Reviews 27: 481-492.

31

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32

12. ANEXOS Anexo 1. TABLAS DE RESULTADOS NMP

13 octubre/2006

HAR

Tubos Dilucion No. Positivo

No. Negativo

No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta

1 0,0001 4 1 5 0,00001 338330,0605 0 0 5,94699 3,38E+09 2 0,00001 3 2 5 0,000001 3 0,000001 1 4 5 1E-07

HE..

Tubos Dilucion No. Positivo No. NegativoNo. Tubos Vol.Inoc. x L R P

Pop. Esta

1 0,01 4 1 5 0,001 2116,250209 0,01 0,01 4706,16 2,12E+05 2 0,001 1 4 5 0,0001 3 0,0001 1 4 5 0,00001

HE…

Tubos Dilucion No. Positivo No. NegativoNo. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta

1 0,0001 3 2 5 0,00001 167509,8202 0 0 1047,05 1,68E+09 2 0,00001 3 2 5 0,000001 3 0,000001 0 5 5 1E-07

HER

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 3 2 5 0,00001 136070,3443 0 0 56361,4 1,36E+09 2 0,00001 2 3 5 0,000001 3 0,000001 0 5 5 1E-07

33

SVAR Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta

1 0,0001 2 3 5 0,00001 281906,9398 0 0 1,8E-10 2,82E+09 2 0,00001 5 0 5 0,000001 3 0,000001 4 1 5 1E-07

SVER


FAR


FA


FE

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 1,00E-04 3 2 5 1,00E-05 246440,6218 0 0 0,01118 2,46E+09 2 1,00E-05 3 2 5 1,00E-06 3 1,00E-06 2 3 5 1,00E-07

34

FER Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 1,00E-04 3 2 5 1,00E-05 170044,029 0 0 16,1595 1,70E+09 2 1,00E-05 1 4 5 1,00E-06 3 1,00E-06 2 3 5 1,00E-07

26 de octubre/2006 HAR


HCAA

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,01 5 0 5 0,001 7921,74367 0,01 0,01 12996,9 7,92E+05 2 0,001 3 2 5 0,0001 3 0,0001 0 5 5 0,00001

HCAE

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 4 1 5 0,00001 167421,2294 0 0 1229643 1,67E+09 2 0,00001 1 4 5 0,000001 3 0,000001 0 5 5 1E-07

HER


35

SVAR


SVCAA


SVCAE


SVER


FAR

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 4 1 5 0,00001 525359,6651 0 0 1E-05 5,25E+09 2 0,00001 4 1 5 0,000001 3 0,000001 3 2 5 1E-07

36

FER Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 5 0 5 0,00001 362498,1689 0 0 2155894 3,62E+09 2 0,00001 1 4 5 0,000001 3 0,000001 0 5 5 1E-07

9 noviembre/2006 HAR


HER


SVAR

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 3 2 5 0,00001 107819,6945 0 0 3469815 1,08E+09 2 0,00001 1 4 5 0,000001 3 0,000001 0 5 5 1E-07

SVER


37

FAR

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 3 2 5 0,00001 321054,2371 0 0 2,9E-05 3,21E+09 2 0,00001 5 0 5 0,000001 3 0,000001 2 3 5 1E-07

FER


23 de noviembre/2006 HAR

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 4 1 5 0,00001 662897,9569 0 0 7,4E-08 6,63E+09 2 0,00001 4 1 5 0,000001 3 0,000001 4 1 5 1E-07

HCAA Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 1 4 5 0,00001 82610,97107 0 0 2407,82 8,26E+08 2 0,00001 2 3 5 0,000001 3 0,000001 1 4 5 1E-07

HCAE

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 3 2 5 0,00001 344843,555 0 0 6E-09 3,45E+09 2 0,00001 4 1 5 0,000001 3 0,000001 4 1 5 1E-07

38

HER Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 3 2 5 0,00001 267350,9904 0 0 3,2E-05 2,67E+09 2 0,00001 3 2 5 0,000001 3 0,000001 3 2 5 1E-07

SVAR


SVCAA


SVCAE

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,001 5 0 5 0,0001 32621,21557 0 0 2187764 3,26E+07 2 0,0001 1 4 5 0,00001 3 0,00001 0 5 5 0,000001

SVER


39

FAR Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,0001 5 0 5 0,00001 4829172,72 0 0 0,00792 4,83E+10 2 0,00001 5 0 5 0,000001 3 0,000001 5 0 5 1E-07

FCAE


FER


6 DIC / 06 HAR

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,01 2 3 5 0,001 446,8615158 0,01 0,01 2E+09 4,47E+04 2 0,001 0 5 5 0,0001 3 0,0001 0 5 5 0,00001

HER

Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,01 1 4 5 0,001 606,7688063 0,01 0,01 261633 6,07E+04 2 0,001 1 4 5 0,0001 3 0,0001 1 4 5 0,00001

40

Punto nmp Pop.esta HCAA 000 <3 E 2 SVCAA 000 <3 E 2 SVCAE 000 <3 E 2 SVER 000 <3 E 2 FAR 000 <3 E 2

SVAR Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,01 2 3 5 0,001 683,9156901 0,01 0,01 2,3E+07 6,84E+04 2 0,001 1 4 5 0,0001 3 0,0001 0 5 5 0,00001

FER Tubos Dilucion No. Positivo No. Negativo No. Tubos Vol.Inoc. x L R P Pop. Esta 1 0,01 2 3 5 0,001 1176,082853 0,01 0,01 505,624 1,18E+05 2 0,001 2 3 5 0,0001 3 0,0001 1 4 5 0,00001

13 dic /06 Punto nmp Pop. esta HAR 000 <3 E 2 HCAA 000 <3 E 2 HCAE 000 <3 E 2 HER 000 <3 E 2 SVAR 000 <3 E 2 SVCAA 000 <3 E 2 SVCAE 000 <3 E 2 SVER 000 <3 E 2 FAR 000 <3 E 2 FCAA 000 <3 E 2 FCAE 000 <3 E 2 FER 000 <3 E 2

41

ANEXO 2 TABLAS DE RESULTADOS DE LA CUANTIFICACION DE BACTERIAS heterotrofas 13-Oct 26-Oct 09-Nov 23-Nov 06-Dic 13-DicHAR 7,03 5,42 6,19 8,30 7,30 6,40HCAA 8,41 6,12 8,66 6,90 5,70HCAE 6,29 4,30 6,53 6,48HER 6,81 7,19 6,13 10,01 9,72 10,15 fijadoras 13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dic HAR 6,18 6,72 6,37 7,59 7,35 6,69HCAA 6,64 5,00 5,72 5,94 5,50HCAE 6,20 5,40 5,16 5,55HER 6,66 6,26 6,11 6,38 8,31 5,65 nitrificantes 13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dic HAR 5,48 5,70 5,45 4,41 5,95 4,30HCAA 4,95 4,53 5,61 4,70 4,32HCAE 5,36 5,20 4,19 4,06HER 5,40 5,35 5,78 5,15 7,97 4,20 Denitrificantes HAR 9,53 10,27 10,21 9,82 4,65 < 2,47 HCAA 5,33 5,90 8,92 < 2,47 < 2,47 HCAE 9,23 9,22 9,54 < 2,47 HER 9,13 9,37 9,14 9,43 4,78 < 2,47

heterotrofas 13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dic SVAR 8,48 6,13 5,83 10,44 6,60 8,98SVCAA 6,45 8,57 8,35 6,79SVCAE 6,77 6,39 8,49 8,16SVER 7,04 6,57 5,64 9,01 7,62 6,84 fijadoras 13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dic SVAR 6,77 6,11 5,95 6,32 6,60 5,48SVCAA 5,48 7,86 6,20 6,78SVCAE 6,60 4,93 4,60 7,33SVER 6,34 5,93 5,95 8,18 5,52 6,23 nitrificantes 13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dic SVAR 4,98 4,85 5,05 4,51 5,76 4,16SVCAA 3,78 6,39 4,60 4,45SVCAE 5,24 3,94 4,11 5,06SVER 5,00 6,11 5,06 7,57 4,64 4,02 Denitrificant. 13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dic SVAR 9,45 5,90 9,03 9,49 4,84 < 2,47 SVCAA 9,30 10,30 < 2,47 < 2,47 SVCAE 9,43 7,51 < 2,47 < 2,47 SVER 9,38 9,50 9,31 9,24 < 2,47 < 2,47

42

heterotrofas 13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dic FAR 7,74 9,53 7,75 7,27 7,81 6,71FCAA 6,90 9,35FCAE 9,09 6,79 10,22FER 7,45 7,77 8,05 9,05 7,85 7,84 fijadoras 13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dic FAR 7,28 8,31 7,45 7,67 7,46 7,80FCAA 6,65 6,65FCAE 6,36 6,41 7,34FER 7,33 7,73 6,60 7,65 6,85 7,62 nitrificantes 13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dic FAR 6,80 5,98 5,38 6,32 6,63 4,61FCAA 5,66 4,18FCAE 5,60 3,80 4,35FER 6,48 6,26 5,54 4,42 5,15 5,48 denitrificant. 13 oct 26 oct 9 nov 23 nov 6 dic 13 dic FAR 10,79 9,72 9,51 10,68 < 2,47 < 2,47 FCAA 9,23 < 2,47 FCAE 9,39 6,38 < 2,47 FER 9,23 9,56 9,66 10,68 5,07 < 2,47

ANEXO 4. Valores de oxigeno disuelto tomado en las columnas de agua. Punto 13-Oct 26-Oct 23-Nov 06-Dic 13-Dic HCAA 1,6 0,7 6,8 4,7 1,3 HCAE 2,7 6,9 1,1 - 1,4 SVCAA - 1,5 1,1 0,6 1,2 SVCAE - 3,2 1,2 0,7 2,3 FCAA 6,3 - - - 1,8 FCAE 5,2 - 1,7 - 1,6

El guión (-), representa las muestras no tomadas por falta de agua en las columnas.

cuantificacion de bacterias

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