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Cuantificacion de proteinas

Cuantificacion de proteinasMARTINEZ GONZALEZ GUSTAVO ARMANDO RODRIGUEZ TREJO JUAN GUILLERMO

Mtodos para la cuantificacin de protenas:

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en:

a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicosc) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes.

Metodos de cuantificacionMtodos de Absorcin:Propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV.

Mtodos Derivados Fluorimtricos:Formacin de derivados qumicos.

Mtodos Colorimtricos La capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantesMetodo UVTodas la protenas pueden ser detectadas, sin embargo solo ciertos residuos de aminocidos son los que se leen en la regin del UV.

Absorcion UV en proteinasLas bandas de absorcin ms significativas se encuentra en el ultravioleta cercano, en el intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm.

Concretamente absorben en este rango las cadenas laterales de los aminocidos aromticos, la histidina y la cistina.

Ley lambertRelaciona la absorcin de luz con las propiedades del material atravesado.La ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y A, la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.

METODOS COLORIMETRICOSMtodo de Biuret Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita aadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de plstico.

Mtodo de Bradford Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas. Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie Blue G-250 con 10 ml de fosfrico al 88% y 4,7 ml de etanol absoluto. Aadir H2O hasta 100 ml. Filtrar a travs de papel de filtro y guardar en la oscuridad.

Mtodo de BCA El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un complejo prpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos. Reactivo preparado del siguiente modo. Reactivo A: BCA 1%, Na2CO3 2%, tartrato sdico 0,16%, NaOH 0,4% y NaHCO3 0,95%. Ajustar a pH 11,25 con NaOH. Reactivo B: CuSO4 al 4% Reactivo de trabajo: mezclar 100 volmenes de A con 2 volmenes de B.

METODO DE LOWRYEste procedimiento involucra la formacin de un compejo cobre - protena en solucin alcalina.

Este complejo reduce al reactivo fosfomolibdico- fosfotungstato lo que produce una intensa coloracin azul.

Primera reaccin Biuret. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato.

Segunda reaccin reactivo de Folin- Ciocalteau. La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador. El reactivo de FolinCiocalteau es una mezcla de fosfomolibdato y fosfotungstato, usado para la determinacin de antioxidantes fenlicos y polifenlicos de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.Sin embargo, este reactivo no slo mide los fenoles totales, sino que reaccionar con cualquier sustancia reductora.

Metodos fluorimetricosEn el fenmeno de lafluorescencia, una molcula emite luz de una longitud de onda determinada tras absorber luz a otra longitud de onda. Los ensayos fluorimtricos usan la diferencia en la fluorescencia entre producto y sustrato para medir la reaccin enzimtica.

Tcnicas de separacin y anlisis de las protenasLos procedimientos ms utilizados actualmente en el laboratorio clnico para el estudio de las protenas son los siguientes:1. Turbidimetra y nefelometra2. Inmunodifusin3. Electroforesis4. Inmunoelectroforesis5. Inmunoelectroforesis en cohete6. Inmunofijacin7. CromatografaTURBIDIMETRA Y NEFELOMETRALa dispersin de la luz se puede medir por turbidimetra o por nefelometra.En ambas tcnicas, para dar como resultado una concentracin de protena concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersin con los valores de dichos parmetros en estndares proteicos conocidos.La turbidimetra mide la disminucin de la luz transmitida a travs de una suspensin de partculas utilizando para ello un espectrofotmetro (detector en la misma direccin del haz de luz, se mide A o T).

La nefelometra: mide la luz dispersada en direccin distinta a la luzemitida (generalmente con ngulos que oscilan entre 15 y 90).Utiliza como instrumento el nefelmetro (en el que el detector seubica con un ngulo que oscila entre 15 y 90 ej. a 90). Se sueleutilizar para concentraciones ms diluidas.

INMUNODIFUSINLa inmunodifusin se basa en la formacin de bandas de precipitacin Ag-Ac en medios semislidos (generalmente de agarosa).La zona ptima de concentracin para la formacin del precipitado Ag-Ac se llama zona de equivalencia.Para visualizar el resultado de la inmunodifusin, una vez terminada la difusin se lava el gel y se tie con colorantes para protenas (ej. Negro amido o azul brillante de Coomassie).Inconvenientes de la inmunodifusin:1. Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo contrario no se alcanza la equivalencia y no se forma el precipitado. El precipitado solo se forma en el punto de equivalencia o cuando hay un ligero exceso de Ag.2. Las molculas ms pequeas migran con ms rapidez que las de gran tamao y conforme la migracin contina el precipitado puede redisolverse y volverse a formar de acuerdo con los cambios de concentracin de Ag o Ac en el gel.3. Si hay grandes cantidades de Ac, el antgeno no se difunde muy lejos antes de alcanzar la equivalencia y el anillo es ms grueso o espeso.ELECTROFORESISUna de las tcnicas ms sencillas para la separacin (y posterior cuantificacin) de protenas es la electroforesis (tcnica en la cual una partcula cargada se hace desplazar a travs de un medio aplicando un campo elctrico).Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de protenas puesto que los aminocidos (aa) constituyentes de la protenas, y por tanto las protenas, son compuestos anfteros que se comportan como cidos (ceden protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones y quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el que estn.

Si una disolucin de protenas se somete a la accin de un campo elctrico la tasa de migracin durante la electroforesis depende de: La carga neta de la molcula, su forma y tamao La fuerza del campo elctrico Caractersticas del soporte

La cantidad de carga neta en la molcula es variable y depende del pH del amortiguador. Si el pH del medio es menor que el punto isoelctrico, las protenas se comportan como cationes y, si el pH del medio es superior al pI, se comportan como aniones. La carga de la protena se hace ms negativa a medida que el pH del amortiguador se hace ms bsico.A pH 8,6 (bsico) todas las protenas migran hacia el nodo (tienen carga global negativa). La albmina, con pI de 4,7 tendr una mayor carga negativa que la gamma-globulina, que tiene un pI de 7,2. En definitiva, lo anterior explica que la albmina recorra una mayor distancia que la gamma-globulina cuando se siten en un campo elctrico. Los pasos a seguir en una electroforesis se pueden resumir en:

1. Separacin 2. Fijacin 3. Revelado 4. Cuantificacin

INMUNOELECTROFORESISLa inmunoelectroforesis es una inmunodifusin en la que se aplica una corriente elctrica para separar las protenas de la muestra.Esta tcnica se realiza en dos fases: Electroforesis para separar las protenas de la muestra en funcin de su carga. Aplicacin de un antisuero, mono o poliespecfico, en un surco paralelo a la direccin del campo elctrico. El o los anticuerpos difunden durante 18-24h. Si se produce el reconocimiento Ag-Ac se forman bandas de precipitacin.

INMUNOELECTROFORESIS EN COHETELa inmunoelectroforesis en cohete es una tcnica cuantitativa equivalente a la inmunodifusin radial pero, a en la que la placa se expone a un campo elctrico.

INMUNOFIJACINLa inmunofijacin consiste en la separacin electrofortica de las protenas de una muestra seguida del contacto del gel con una tira de acetato de celulosa impregnada con antisuero.

La unin Ag-Ac da lugar a la formacin de bandas de precipitacin visulalizadas tras lavar y teir. Es una tcnica muy rpida que se utiliza especialmente en le deteccin de bandas oligoclonales en lquido cefalorraqudeo.bibliografiahttp://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE%20PROTE%C3%8DNAS.pdfManual de Practicas Biologia Molecular de la Celula LEscrito por Claudia Andrea Segal Kischinevzky,Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de CienciasAspectos bsicos de bioqumica clnicaEscrito por Jacobo Daz Portillo,Mara Teresa Fernndez del Barrio,Fernando Paredes Salido