Extracción y Cuantificación de ADN

Extracción y Cuantificación de ADN

Tecnología Básica

Extracción y Cuantificación

Amplificación: PCR (Polymerase Chain Reaction)

Separación: Electroforesis

Detección

Análisis

Extracción de ADN: Múltiples maneras!!

EXTRACCION DE ADNEXTRACCION DE ADN

ORGANICA CHELEX PAPEL FTA OTRAS

Extracciones basadas en estuches QIAamp, GeneClean, etc.

Pueden depender en Protocolos de LAB Tipo de muestra

ORGANICA CHELEX PAPEL FTA OTRAS

Extracciones basadas en estuches QIAamp, GeneClean, etc.

Pueden depender en Protocolos de LAB Tipo de muestra

Preparación de MuestraPreparación de Muestra

Extracción de ADN Orgánica

Extracción por Chelex

Extracción de ADN utilizando papel FTA

Estuches QIAamp para separar ADN Equipo basados en robótica pueden

requerir otros métodos

Extracción de ADN Orgánica

Extracción por Chelex

Extracción de ADN utilizando papel FTA

Estuches QIAamp para separar ADN Equipo basados en robótica pueden

requerir otros métodos

EXTRACCION ORGANICA DE ADNEXTRACCION ORGANICA DE ADN

PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI)

PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR

CONSUME MUCHO TIEMPO QUIMICOS PELIGROSOS MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles

errores)

PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI)

PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR

CONSUME MUCHO TIEMPO QUIMICOS PELIGROSOS MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles

errores)

EXTRACCION ORGANICA DE ADN

EXTRACCION ORGANICA DE ADN

COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO

AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K ROMPE LAS CELULAS (SDS) ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)

AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y lípidos Particiona macromoléculas basedo en propiedades

hidrofóbicas e hidrofílicas Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol Alcohol Isoamyl disminuye la espuma ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA

RECUPERACION DE ADN Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto

COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO

AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K ROMPE LAS CELULAS (SDS) ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)

AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y lípidos Particiona macromoléculas basedo en propiedades

hidrofóbicas e hidrofílicas Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol Alcohol Isoamyl disminuye la espuma ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA

RECUPERACION DE ADN Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto

EXTRACCION POR CHELEX EXTRACCION POR CHELEX 1991 Laboratorios Bio-Rad

RESINA QUELANTE

REMUEVE MAGNESIO

(INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)

ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA

CELULA

UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)

1991 Laboratorios Bio-Rad

RESINA QUELANTE

REMUEVE MAGNESIO

(INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)

ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA

CELULA

UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)

EXTRACCION POR CHELEX EXTRACCION POR CHELEX AÑADA MUESTRA AL TUBO

AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE

CHELEX

100°C PARA ROMPER CELULAS DESTRUIR PROTEINAS

ADN ES DENATURADO A CADENAS

SENCILLAS

UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE

EN PCR

AÑADA MUESTRA AL TUBO

AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE

CHELEX

100°C PARA ROMPER CELULAS DESTRUIR PROTEINAS

ADN ES DENATURADO A CADENAS

SENCILLAS

UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE

EN PCR

EXTRACCION CON PAPEL FTA™

EXTRACCION CON PAPEL FTA™

PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA

CONTIENE QUIMICOS PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E

INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO

ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS

UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS

PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA

CONTIENE QUIMICOS PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E

INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO

ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS

UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS

Tecnología FTA®

Rompe células y membranas de organelos -Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN)

Preserva y Proteje Acidos Nucleicos-Previene Daño por radicales libres/UV

-Previene Daño Enzimático

-Inhibe crecimiento de hongos y bacterias

Provee Seguridad al Usuario-Inactiva Potenciales Viruses Peligrosos

Preparación de ADN Rápida y Eficiente

FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva

10 Platos = 240 muestras

Temp de almacenaje = -200C

240 Tarjetas = 240 muestras

Temp de almacenaje = Temp ambiente

Costo$2,000/congelador/año

Costo$75/gabinete de

archivo

240 Tubos = 240 muestras*

Temp de almacenaje= -200C

Convencional versus FTA

Archivado a Temperatura Ambiente

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

6 Blue Blood-B-Pro

1000200030004000

6 Green Blood-B-Pro

5001000

1500

6 Yellow Blood-B-Pro

500100015002000

6 Red Blood-B-Pro

200

400

600

Perfil de STR de sangre archivada en 1989 y analizada en 2003

• Muestras archivadas en ambientes diferentes, selladas en sobre de aluminio

• Proceso normal de colección de muestra

• 10 µL de reacciones de Profiler™ añadido a muestras, 24 ciclos

EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™

EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™

Sangre o saliva seca en papel FTA Células se ROMPEN al contacto UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA al

TUBO LAVE para remover HEME y otros inhibidores

de PCR

Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción de PCR

Sangre o saliva seca en papel FTA Células se ROMPEN al contacto UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA al

TUBO LAVE para remover HEME y otros inhibidores

de PCR

Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción de PCR

EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™

EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™

CUANTIFICACIÓN NO es necesaria Cantidad de muestra consistente Resultados consistentes

Posible AUTOMATIZACIÓN

CUANTIFICACIÓN NO es necesaria Cantidad de muestra consistente Resultados consistentes

Posible AUTOMATIZACIÓN

ORGÁNICA Papel FTA CHELEX

Mancha de

sangre

ROTO

LAVAR Múltiples veces con buffer de extracción

PREPARAR PCR

Reactivos de PCR

SDS, DTT, EDTA y

proteinase K

ENCUBAR (56 oC)

Phenol,chloroform,

isoamyl alcohol

CUANTIFICAR ADN

Aplicar sangre al papel y dejar que

se seque Mancha de

sangre

VORTEX

(NO CUANTIFICACIÓN)

Agua

ENCUBAR (ambiente)

5% Chelex

ENCUBAR (100 oC)

REMOVER sobrenadante

ENCUBAR (56 oC)

CUANTIFICAR ADN

PREPARAR PCR

PREPARAR PCR

Centrifugar

Centrifugar

Centrifugar

Centrifugar

REMOVER sobrenadanteTRANSFER aqueous (upper) phase to new tube

CONCENTRAR muestra (Centricon/Microcon-100 or ethanol

precipitation)

Centrifugar

TE buffer

Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

CUANTIFICACIÓN DE ADNCUANTIFICACIÓN DE ADN

ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE

ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA

MÉTODOS INICIALES NO MUY SENSITIVOS O ESPECÍFICOS ABSORBENCIA A 260 nm TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO

Cuantificación comparada a marcador estándar

ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE

ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA

MÉTODOS INICIALES NO MUY SENSITIVOS O ESPECÍFICOS ABSORBENCIA A 260 nm TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO

Cuantificación comparada a marcador estándar

Cuantificación por "Slot Blot" Cuantificación por "Slot Blot"

Procedimiento Común Específico para primates Ha sido modificado para utilizar

quimioluminiscencia en vez de radioactivida Puede detectar cantidades menores que

nanogramos Puede detectar ADN de cadena doble y

cadena sencilla

Procedimiento Común Específico para primates Ha sido modificado para utilizar

quimioluminiscencia en vez de radioactivida Puede detectar cantidades menores que

nanogramos Puede detectar ADN de cadena doble y

cadena sencilla

CUANTIFICACIÓN DE ADNCUANTIFICACIÓN DE ADN

CUANTIFICACIÓN POR "SLOT BLOT" ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE

PRIMATE D17Z1

RADIOACTIVO COLORIMÉTRICO QUIMIOLUMINISCENTE

CUANTIFICACIÓN POR "SLOT BLOT" ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE

PRIMATE D17Z1

RADIOACTIVO COLORIMÉTRICO QUIMIOLUMINISCENTE

CUANTIFICACIÓN DE ADNCUANTIFICACIÓN DE ADN

CAPTURAR ADN GENÓMICO EN MEMBRANA DE NILÓN

AÑADIR PRUEBA D17Z1 INTENSIDAD DE LA MUESTRA

COMPARADA A ESTÁNDARES SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50

copias de ADN genómico

CAPTURAR ADN GENÓMICO EN MEMBRANA DE NILÓN

AÑADIR PRUEBA D17Z1 INTENSIDAD DE LA MUESTRA

COMPARADA A ESTÁNDARES SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50

copias de ADN genómico

Slot Blot Ventajas Desventajas

Slot Blot Ventajas Desventajas

Puede ser sensitivo Reemplaza

radioactividad Puede detectar

cadenas sencillas y ADN parcialmente degradado.

Cantidad dada es sólo de ADN humano

Puede ser sensitivo Reemplaza

radioactividad Puede detectar

cadenas sencillas y ADN parcialmente degradado.

Cantidad dada es sólo de ADN humano

Consume tiempo Labor intensiva

Consume tiempo Labor intensiva

20 ng

10 ng

5 ng

2.5 ng

1.25 ng

0.63 ng20 ng

10 ng

5 ng

2.5 ng

1.25 ng

0.63 ng

Estándares de Calibración

Estándares de Calibración

Muestras Desconocidas

~2.5 ng

Figure 3.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Fluorometría vs Espectrofotometría

Fluorometría vs Espectrofotometría

Fluorometría

*Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o PicoGreen

-- aumento en emisión a 458 nm cuandoenlazado a ADN de doble cadena

*Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla o ARN

--se enlaza al surco menor, rico en A-T

*Muestra es comparada a curva estándar de ADN cuya concentración es conocida

--utilize estándar con composición similar para lecturas más precisas

Cuantificación de ADN por espectrofotometría

Cuantificación de ADN por espectrofotometría

Concentración de ADN puede ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo

Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0.

Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 µg de ADN por ml

A260 = 1 ⇒ 50 µg/ml

Concentración de ADN puede ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo

Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0.

Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 µg de ADN por ml

A260 = 1 ⇒ 50 µg/ml

Pureza de ADN: Proporción A260/A280

*Proporción indica pureza/presencia de contaminantes que pueden absorber luz UV (proteínas, etc.)

*ADN puro tiene una proporción de ≈ 1.7-2.0 --en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5

*Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN)--imita alta pureza y producción--aumenta el valor A260

PCR utilizando 'Real time'

(qPCR)Continuará!!Continuará!!