Cuantificacion de DNA Circulante en Plasma (cfDNA) y su Utilidad para el Estudio de (cfDNA) y su Utilidad para el Estudio de

Mutaciones Oncogénicas en una Población de Candidatos a Ensayos Clínicos Tempranos Candidatos a Ensayos Clínicos Tempranos

Joaquin Mateo 1,2, Michael Ong1,2, Jesús Corral1*, Lorna Pope2, q , g , , p ,Amy Cassidy2, Rhoda Molife1, Udai Banerji1, Stan B. Kaye1,

David Olmos1** & Johann S. De Bono1,2

1. DRUG DEVELOPMENT UNIT, THE ROYAL MARSDEN NHS FOUNDATION TRUST2. BIOMARKERS TEAM, THE INSTITUTE OF CANCER RESEARCH

* Actualmente, HOSPITAL VIRGEN DEL ROCÍO, ESPAÑA** Actualmente, PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA, CNIO - ESPAÑA

INTRODUCCIÓN

• Desarrollo de nuevas drogas: costoso y poco eficienteDesarrollo de nuevas drogas: costoso y poco eficiente• Estrategias de seleccion de pacientes según “relevancia biológica”• Biomarcadores predictivos y de prueba de concepto

• Acceso a tejido tumoral: • Acceso a tejido tumoral: • Invasivo• A veces no es factible• Muestras secuenciales

• Cuestiones logisticas: pacientes derivados de otros centros.g p

Contexto: cfDNA

• cfDNA en plasma: resultado de procesos deapoptosis y estrés celular (diferentesapoptosis y estrés celular (diferentestamaños)

• Evidencia niveles altos cfDNA anteenfermedades (inflamatorias autoinmunesenfermedades (inflamatorias, autoinmunes,infecciosas) o estrés (ejercicio)

• Aplicaciones al diagnóstico prenatalAt i k t l

Posibles aplicaciones en oncología:

Atamaniuk et al. Eur J Appl Physiol 2008

Posibles aplicaciones en oncología:

•Diagnóstico ?•Pronóstico ?•Pronóstico ?•Respuesta a tratamiento ?

Schwarzenbach et al,Mol ByoSyst 2011

OBJETIVOS

• Identificar mutaciones oncogénicas en cfDNA y su Identificar mutaciones oncogénicas en cfDNA y su correlación con el análisis de tejido tumoral

• Genotipado de DNA tumoral rápido y no invasivo

• Aplicar los resultados a una selección racional de pacientes para ensayos fase I

• Optimizar el desarrollo / selección de nuevas drogasdrogas

MÉTODOS

Valoración en la Unidad Ensayos fase I:Consentimiento informado

24 ml sangre – 2ml plasma Revisión tejido tumoral (primario o met)

“A” l ( 104 + 20 V)Extracción cfDNA Extracción DNA tumoral

mue

stra

s

“A” manual (n 104 + 20 V)“B” robotizado (n 176 + 21

V)

ras

Cuantificación de DNA (Picogreen)

Análisis de mutaciones: plataforma Multiplex 9

5% m

% m

uest

r

Análisis de mutaciones: plataforma MultiplexSequenom OncoCarta v1.0 Panel (238 mut en 19 oncogenes)

med

iana

);

69%

Detección de mutación SI/NO

7 dí

as (m Análisis resultados: MALDI‐TOF ‐MassArray Typer Analyzer 

software 4.0.4.20 – revisión humana (ciega)

Detección de mutación SI/NOEN PLASMA Y/O EN TEJIDO TUMORAL

Selección de pacientes para ensayos fase I (participaron 160, 57%)

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

19 Genes;238 mutaciones n=265

[cfDNA] < V

[cfDNA] > V238 mutaciones

puntuales:

KRAS, HRAS, NRAS

rango V rango V

Mutacion en cfDNA

19 (33.3%) 38 (66.7%)

No mutaciónKRAS, HRAS, NRASPIK3CAAKT 1,2B-RAF

No mutación cfDNA

118 (56.7%) 90 (43.3%)

Pearson Chi cuadrada p=0.002 

T t l 63 t i 57 i tMETEGFR

KIT

Total: 63 mutaciones en 57 pacientes

ABCB1ERBB2CDK4

Matched cfDNA mutation

Healthy Volunteers

NS

FGFR 1,3FLT3JAK-2

PDGFA

4 8 16 32 64 128

256

5

No cfDNA mutation

[cfDNA] in ng/ml (E pansion phase)PDGFA

RET(Expansion phase)

RESULTADOS

n=181 muestras pareadas ( l )

RAS  PIK3CA  MET  AKT  RAF (plasma y tumor) 

RAS  PIK3CA  MET  AKT  RAF 

Mutación en cfDNA 20 10 9 3 7Mutación en cfDNA  20 10 9 3 7

Coincidencia tumor (%)  16 (80%)  8 (80%)  6  (67%)   3(100%)  5 (71%) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

RESULTADOS Analisis de mutaciones en 181 muestras pareadasTumor primario Mutations RAS PIK3CA MET AKT RAF Otros

Mama Coincidencia ++ 4 4 1Mama Coincidencia ++ 4 4 1

15/46 pts (32.6%) Sólo tumor + 2 3 1 2

con mutaciones Sólo cfDNA + 1 110 1 1 2Colorectal Coincidencia ++ 10 1 1 2

25/35 pts (71.4%) Sólo tumor + 7 1 1 1

con mutaciones Sólo cfDNA + 1 2 2

Ovario Coincidencia ++ 1

5/28 pts (17.9%) Sólo tumor + 3 2 1

con mutaciones Sólo cfDNA + 1con mutaciones Sólo cfDNA + 1

Próstata Coincidencia ++ 1 1

6/13 pts (46.2%) Sólo tumor + 1 3

con mutaciones Sólo cfDNA + 1

Melanoma Coincidencia ++ 2 1 3

9/12 pts (75.0%) Sólo tumor + 1 2/ p ( )con mutaciones Sólo cfDNA + 1

Other Sites  Coincidencia ++ 4 2

19/47 pts (40 4%) Sólo tumor + 2 2 219/47 pts (40.4%) Sólo tumor + 2 2 2

con mutaciones Sólo cfDNA + 2 2 1 2

79/181 pts (43.6%) 36 18 10 5 9 14

CONCLUSIONES

• Estudio no invasivo a partir de plasma

• Cuantificación de cfDNA tiene valor pronóstico

• Rápida disponibilidad de información. Resultado cualitativo

• Información sobre la evolución tumoral, repetible

• Alta fiabilidad cuando una mutación se identifica en plasma

• Falta correlación plena para resultados negativos.

Posibles motivos: hetereogenidad tumoral? Evolución? Técnica?

• Correlación variable según tipo tumoral y gen: estrategias de

personalización del screening molecular

• Multiplex vs next-gen sequencing

AGRADECIMIENTOS

• A los pacientes que participaron y sus familiaresA t d l i ti d h t b j d l t • A todos los investigadores que han trabajado en el proyecto T. Yap, G. Perkins, G. Attard, I. Judson,…….

• A investigadores de otros grupos que han colaboradoM. O’Brien, S. Johnston

PROYECTO FINANCIADO POR

• Fundación SEOM

PROYECTO FINANCIADO POR:

Experimental Cancer Medicine CentreMedicine Centre