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CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

El trmino cultivo de tejidos vegetales involucra diferentes tcnicas de cultivo, de material vegetalEsquema de Tcnicas de cultivo de tejidos vegetales en plantas superioresCultivo de protoplastosCultivo de semillasCultivo de embriones Cultivo de meristemasCultivo de clulas,callos, explantos y picesCultivo de microesporasy anterasCultivo de tejidos vegetales de plantas superiores3Mediante el cultivo de tejidos, es posible obtener plantas libres de patgenos en un medio nutritivo, asptico y en condiciones ambientales controladas.

Esta tcnica tiene numerosas aplicaciones, entre otras:

Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales de las plantas superioresInduccin de variabilidad gentica in vitroRegeneracin de plantas potencialmente tilesPropagacin masiva de plantas alimenticiasObtencin de plantas libres de virusRecuperacin de plantas en peligro de extincinPreservacin de germoplasma in vitroCULTIVO DE TEJIDOS VEGETALESAlgunas aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas

Algunas aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas Semillas sintticas

Embriones somticos cultivo de clulas

encapsulados en una matriz inerte (alginato de calcio).

Micropropagacin

Violeta africana trozos de hojas

desinfectados introducidos en condiciones de esterilidad. Existen tres conceptos bsicos que fundamentan el cultivo in vitro de clulas y tejidos vegetales:Totipotencialidad celular: toda clula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro, sin importar el grado de diferenciacin alcanzado. Para esto se requieren condiciones especficas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperodo, etc.

Desdiferenciacin / Rediferenciacin: es en la prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico y posteriormente la rediferenciacin de estas clulas previamente desdiferenciadas.

Balance hormonal: el proceso de diferenciacin est regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citoquininas.

BALANCE HORMONAL

AUXINA: CITOQUININAS = ~1 Induce formacin de Callo

AUXINA: CITOQUININAS > 1 Induce formacin de Races

AUXINA: CITOQUININAS< 1 Induce formacin de Tallo

Las clulas vegetales crecidas en condiciones aspticas, sobre medios de cultivo que contienen hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de Morfognesis:

Morfognesis La morfognesis es la formacin de rganos y comprende el crecimiento y la diferenciacin celular y puede seguirdos rutas alternativas: La Organognesis: en la cual se produce la formacin de rganos (tallos, races u otras estructuras) La Embriognesis: en la que se forman embriones que al germinar dan lugar a una planta.

En ambos casos, el proceso se genera a partir de clulas somticas.

Si la primera respuesta al estmulo morfogentico es la formacin de callo, antes de diferenciarse en meristemas o embriones, se habla de organognesis y de embriognesis indirecta.La organognesis es una de las vas en la cual se diferencian meristemas a partir de las clulas o tejidos cultivados. Cuando se produce un meristema apical su desarrollo da lugar a una planta.En este proceso la produccin de tallos y races es independiente.La embriognesis es un proceso por el cual se generan embriones a partir de clulas somticas en cultivo. Estos embriones somticos siguen las mismas etapas de desarrollo que los embriones cigticos pero no son el resultado de la fecundacin de gametos.Estos embriones germinan igual que una semilla dando origen a un tallo y una radcula simultneamente.

Organognesis directa: Consiste en la generacin de plantas sin races directamente del explanto.

Esta ruta generalmente se sigue cuando se usan meristemas vegetativos terminales o laterales.

D. plantas obtenidas por micropropagacin, listas para aclimatar

Organognesis directa Violeta Africana A. zona del explanto donde se est produciendo la brotacin de yemas adventiciasB. Detalle de los nuevos brotes que se estn formando en el borde del explantoC. Aspecto del explanto una vez sacado del tubo de cultivoEmbriognesis directa: Los embriones se forman directamente a partir de los explantos sin formacin de callos

Cultivo de anteras y regeneracin de plantas haploides

Antera al inicio del cultivoAntera con 6 das de cultivo.Embrin emergiendo de la antera con 30 das en cultivo mostrando races Embrin mostrando races y brotes. Plntula con cotiledonesPlntula con hojas Subcultivo en un medio de crecimiento. planta haploide regenerada a 80 das de cultivo .PLANTA DE AJ Embriognesis directa

Organognesis indirecta: Los embriones se desarrollan a partir de callos desarrollados del explanto y a partir de ste se forman partes vegetativas diferenciadas como brotes o races, de las cuales se obtiene la plntula segn sea la especie y las hormonas usadas.

Este es el caso principalmente del cultivo de protoplastos.

Organognesis indirecta

SeccinEntrenudoInduccin calloorganognicoInduccin broteInduccin razEmbriognesis indirecta: El explanto genera la formacin de un callo, a partir de ste se forman embriones somticos, de los que se obtienen plntulas segn sea la especie y las hormonas usadas.

Este es el caso de secciones de tallo, hoja o raz y protoplastos.

Embriognesis indirecta

SeccinentrenudoEstablecimiento e induccin de callo embriognicoMantencin y multiplicacin1. Desarrollo2. Maduracin y3. Germinacin embrionesMICROPROPAGACIONMicropropagacinMtodo de propagar plantas usando partes muy pequeas de sta (explantos), que se desarrollan en cultivos estriles (in vitro).

Se usa en la produccin de especies hortcolas, aromticas, medicinales, frutcolas, ornamentales y forestales.

Ventajas Micropropagacin / mtodos convencionalesMultiplicacin acelerada del nmero de plantas, Menor tiempo de multiplicacin, Produccin permanente de material (no hay estacionalidad), Mayor cantidad de plantas en una superficie pequea (en tiempos y costos econmicamente viables), Mayor control sobre la sanidad del material propagado, Mayor Facilidad para el transporte del material in vitro,

Desventajas Micropropagacin / mtodos convencionales

Instalaciones muy especializadasPersonal especializadoContaminacinProtocolos no estandarizadosMenor tamao de las plntulasTransicin heterotrofa/autotrofaCostos: produccin a gran escalaEl cultivo in vitro exige un control absoluto del ambiente, tanto qumico como fsico, en el que se sita al explanto. AMBIENTE QUMICO Medio de CultivopHAMBIENTE FSICO TemperaturaLuzAMBIENTE QUIMICOMedio de cultivoSe agrupan en medios slidos, semislidos y lquidos.

Conjunto de elementos que integran la sustancia nutritiva que da anclaje, nutricin y estimulacin al desarrollo del explanto, ya que los explantos no son autotrficos

Slidos o SemislidosSegn la concentracin del soporte llevan diferentes componentes que tienden a solidificar y mantener el medio solidificado en la superficie, como el agar que se usa en de 0,3 a 1% de concentracion.LquidosSe puede usar como soporte papel filtro o perlas de cristalMedio Slido (Agar)

Medio Lquido

Se han desarrollado muchas formulaciones para los medios de cultivo (Medio Basal), que se diferencian en las cantidades y tipos de sales usadas.

Los ingredientes del medio de cultivo varan segn el tipo de planta y la etapa de propagacin en que se est trabajando.

Estos ingredientes se agrupan en:Sales InorgnicasCompuestos OrgnicosIngredientes naturales complejosSoportes Inertes

Sales Inorgnicas: Aportan:macronutrientes (N, K, P, Ca, Mg y S) y micronutrientes (Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Co, I,)

Requeridos para el desarrollo normal de cualquier planta

Compuestos Orgnicos:Carbohidratos: Como el explanto no puede fotosintetizar, se usan como fuente de energa, principalmente sacarosa. Se pueden emplear otras como, glucosa, fructosa, lactosa.

Vitaminas: Son compuestos que normalmente la planta necesita para completar su desarrollo, las que ms se incluyen en la preparacin de medios son: Tiamina, cido Nicotnico, Piroxidina.

Hormonas y Reguladores de crecimiento: las dos ms importantes que se usan son auxinas y citoquininas, que controlan la formacin de raz, tallo y formacin de callo.

Auxinas: Relacionadas con la formacin de callo y la divisin celular. (0.01 a 10 mg/l) Se disuelven enNaOH 1N.Acido indol actico (AIA) (natural); Acido dicloro fenoxiactico (2,4-D) (sinttica), Acido indol butrico (AIB) (sinttica), Acido Naftalen actico (ANA) (sinttica).

Citoquininas: Relacionadas con la formacin primaria de los rganos y embriones y la divisin celular. (0.03 a 10 mg/l). Se disuelven en HCl 1N.Zeatina (natural), Kinetina (sinttica), isopentil adenina (IPA) (sinttica), Bencil adenina (BA) (sintticas).

Auxinas CitoquininasAuxinas Citoquininas

Parte areaEnraizamiento Ingredientes naturales complejos:Existen un tipo variado de compuestos que se incorporan a los medios de cultivo cuando no se ha logrado resultados con sustancias conocidas. Los principales son:Leche de coco(5-15% v/v)Antioxidantes ( cido ctrico, cido ascrbico)Aminocidos ( Sulfato de Adenina (2-120 ppm), glicina, asparraguina, cistena, tirosina, glutamina,etc.)Carbn activado ( 0.1-5%)Casena hidrolizada(0.1-1%)Jugos de frutasExtractos de papa o levadura.Purinas y Pirimidinas.

Soportes Inertes:

Son el medio de soporte de los tejidos u rganos que se siembran, reemplazan el suelo que es el sustrato natural, los ms empleados son el agar (5 a 6 g/L) y tambin se ha usado pectinas comerciales (8 a 10 g/L). pHCuando se prepara un medio de cultivo, se debe ajustar el pH final al valor deseado, y una vez ajustado el pH, se esteriliza.En general se trabaja con valores entre 5.0 y 6.0, pero para plantas acidfilas es mejor un pH 4.5Un pH < a 3.5 impiden la solidificacin de los agentes gelificantes. El valor del pH puede afectar:La solubilidad de algunos componentes del medio de cultivo La absorcin de determinados nutrientes por parte del explante (p.e. la absorcin de iones NO3- aumenta con la acidez del medio) El pH del citoplasma y como consecuencia la actividad de muchas enzimas

TEMPERATURALa temperatura afecta el crecimiento del cultivo y es un factor que induce determinados procesos fisiolgicos.

En general temperaturas de 21 a 30C son adecuadas, aunque algunas plantas pueden necesitar temperaturas ms bajas.

AMBIENTE FSICOLUZLos aspectos relacionados con la luz que son importantes son:

LA IRRADIACIN: La cantidad de luz

EL ESPECTRO: La calidad de la luz

EL FOTOPERODO: La alternancia de los ciclos de luz y oscuridadIRRADIACIN: Cantidad de luz que incide sobre las superficies fotosintticas de las plantas y determina en gran medida la capacidad fotosinttica de ellas.

Los cultivos in vitro necesitan menos luz porque el medio de cultivo contiene cantidades importantes de sacarosa.

Adems, una irradiacin excesiva puede producir un aumento de la temperatura dentro del recipiente de cultivo debido al efecto invernadero.

La irradiacin habitual en campo (a plena insolacin puede llegar a 450 W/m2) es nociva en condiciones in vitro.

In vitro es habitual usar irradiaciones mucho menores (un 10% o incluso menos del valor de plena insolacin)

ESPECTRO: (calidad de la luz)En la fotosntesis se capta la energa contenida en diferentes radiaciones para incorporarla a las diversas reacciones qumicas que constituyen el proceso.

La cmara de cultivo debe reproducir lo mejor posible el espectro de luz activo, por lo tanto conviene conocer cual es el espectro que emiten las fuentes de luz y en que medida se adapta ste a las necesidades del cultivo.

FOTOPERIODO: La germinacin, floracin, tuberizacin,... entre otros, se activan por el n de horas diarias de luz que reciben las plantas. Tambien, el nmero de horas de luz que recibe el explanto cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo.

En general, se usa un fotoperiodo de 16 horas. Etapas dentro del proceso de micropropagacin0: Seleccin y Preparacin de la planta madre.1: Desinfeccin del material vegetal.2: Introduccin del material seleccionado in vitro.3: Multiplicacin de brotes.4: Enraizamiento.5: Aclimatacin

Etapa 0: PREPARACIN DE LA PLANTA MADRESe deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado.

Para esto es recomendable mantener a las plantas madre un perodo de tiempo que puede ser entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en condiciones sanitarias ptimas, bajo condiciones controladas.

Recomendable que crezca en invernadero o cmara de crecimiento Usar material homogneo Elegir plantas vigorosas Promover nuevas brotaciones con podas severas En maceta con sustrato estril Programa sanitario

Las plantas madres influyen en la capacidad regenerativa del explanto obtenido de ellas debido a:

Genotipo: Dicotiledneas mejor que monocotiledneas, y entre ellas las Solanceas y crucferas son de muy fcil regeneracin.Edad: Partes juveniles mejor que las adultasEstado del rgano o tejido: Mejor no leososEstado fisiolgico: Partes vegetativas mejor que partes generativas

Estado sanitario: Las ms saludables y vigorosas son mejoresCondiciones de crecimiento: diferente respuesta si crece en campo que en invernaderoTamao del explanto: En general a mayor tamao mayor capacidad regenerativaEtapa 1: DESINFECCIN DEL MATERIAL VEGETALSe extraen los fragmentos de la planta madre a partir de los cuales se obtendrn los explantos (yemas, trozos de hojas, porciones de races, semillas, etc).

Se hace una desinfeccin de los fragmentos, con soluciones desinfectantes (etanol-hipoclorito de sodio), para eliminar contaminantes externos y poder extraer los explantos. Se trabaja en cmaras de flujo laminar en condiciones de asepsia para extraer los explantos a partir del material vegetal.

Estos explantos se introducen en un tubo de cultivo que contenga un medio de iniciacin para poder controlar la sanidad y la viabilidad.

Esquema de la etapa 1 del proceso de micropropagacin FragmentoPlanta MadreExplantos

Segmentos uninodalesEtapa 2: INTRODUCCIN DEL MATERIAL IN VITROLos explantos, se ponen en un medio de cultivo estril.

En 7 a 15 das, comienza el proceso de germinacin o regeneracin de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

Etapa 3: MULTIPLICACIN DE LOS BROTESEn esta fase los explantos originan brotes con varias hojas.

En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollar si se pone en contacto con el medio de cultivo.

Peridicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio, mediante divisiones y resiembras en condiciones de asepsia.

Esquema del proceso de multiplicacin de los brotesBrote de Explanto

Divisin del Brote

Siembra y resiembra de brotes

Etapa 4: ELECCIN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOSPara enraizar los explantos se utilizan principalmente dos mtodos:Enraizamiento in vitro Enraizamiento ex vitro

Embrin Germinado In Vitro

Enraizamiento in vitro Enraizamiento ex vitroENRAIZAMIENTO IN VITRO En la cmara de flujo laminar, se transfieren los explantos a un medio que solo contenga auxinas.

Este mtodo permite ms flexibilidad para escoger los brotes, ya que stos obtienen del medio de cultivo la fuente de energa para enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosntesis.

ENRAIZAMIENTO EX VITROLos explantos se transfirieren a un sustrato limpio, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.

El medio de enraizamiento debe estar libre de patgenos y los brotes deben tener las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosntesis, para tener energa para enraizar y desarrollarse.Los explantos se plantan en contenedores cubiertos por un plstico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o dentro de un invernadero en un rea sombreada y con "mist-system".

fase de enraizado ex vitro.

Fotografa de un cultivo en la fase de enraizado ex vitro.

Etapa V: ACLIMATACIN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOSLos explantos son muy sensibles a los cambios ambientales, por lo que el xito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatacin.

Los explantos enraizados in vitro estn poco adaptados a crecer en invernadero porque sus estomas no son completamente funcionales, adems de la falta de una cutcula con cera bien desarrollada para evitar la perdida de agua.Los explantos deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo en forma progresiva la humedad relativa y aumentando progresivamente la intensidad de luz.

Estos explantos se llevan a contenedores cubierto con un plstico para mantener una lata humedad relativa.

Para trasplantar, se elige un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena y turba, para lograr un desarrollo y crecimiento rpido de races.

Aclimatacin en contenedores cubierto con plstico

Se debe controlar la humedad, para mantener un ambiente hmedo a nivel del sustrato.

A los 15 das del trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor.

Esquema del proceso de aclimatacin ex vitro

Planta enteraMicrotnel

Los cambios deben ser muy graduales para minimizar el estrs y tener mayor tasa de sobrevivencia, ya que las condiciones del cultivo in vitro, genera cambios en algunos aspectos anatmicos y fisiolgicos de las plantas como estomas no completamente funcionales, y falta de cutcula con cera bien desarrollada para evitar perdida de agua.Comparacin de las caractersticas de una planta in vitro respecto a una planta in vivoPlanta In vitroNo realiza fotosntesisCrecimiento en condiciones controladasCrecimiento en condiciones de asepsiaAlta humedad relativaEstomas no funcionalesAusencia de pelos radicularesAusencia de cera en la cutculaPlanta In vivoRealiza fotosntesisCrecimiento en condiciones no controladasExposicin a patgenos y grmenes del ambienteHumedad relativa variableEstomas funcionalesPresencia de pelos radicularesPresencia de cera en la cutcula

Plntula de vid aclimatada al sustrato en condiciones de invernadero, funcionando su actividad auttrofaBrotes de vid que muestran las races inducidas por el cido indolacticoExplante de yema axilar mostrando nuevos brotes en la axila de cada hoja,60 das despus de su cultivo in vitroPropagacin in vitro de vid variedad Red Globe