carrera de especializacion en biotecnologia...

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyN-INTIFCEyN-INTI

Materia de Especialización CEBI_E1bTécnicas de análisis en biotecnología

Macromoléculas

Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio

CEBI_E1b: Técnicas varias

Patricio Santagapita_CEBI_E1b

Técnicas de Análisis-Macromoléculas

Técnicas (en esta clase y la siguiente)1. Métodos espectroscópicos para cuantificación de proteínas2. Métodos basados en fluorescencia3. Métodos basados en espectrometría de masa4. ELISA/EIA.5. Amplificación de ADN (PCR)6. Secuenciación de ADN7. Arrays8. Técnicas de análisis para conocer estructura y conformación (FT-IR, light scattering y otras)

Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by

means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949El método de Biuret se basa en la reacción de sales de Cu+2 con moléculas

que contienen más de dos enlaces peptídicos en un medio alcalino; el Cu+2 es reducido a Cu+ formando complejos color púrpura que tienen un máximo de absorción a 540 nm. El método se usa para soluciones que tienen de 1 a 10 mg proteína/ml.

Es un método poco sensible. Es útil cuando se quiere analizar grandes lotes de proteína.

Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la proteína con un volumen igual de ácido tricloroacético al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las proteínas en NaOH 1 N.

Cuantificación de proteínas


Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by

means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949



Método de LowryLowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951

El color producido por el método de Lowry resulta de la reacción de Biuret sobre los enlaces peptídicos, y posterior reducción del reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por las proteínas pretratadas con cobre en medio alcalino.

El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptofano y cisteína reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo un producto inestable que es reducido a azul de molibdeno/tungsteno.

El color azul es determinado a 750 nm. Este es un método muy sensible (más aún si se utilizan las

modificaciones introducidas en los últimos años), por lo que permite trabajar con soluciones muy diluídas de proteínas (20 – 1500 ug proteína/ml).



Método de BradfordBradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248

El método de Bradford de basa en que el Azul Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina en las proteínas.

El complejo proteína-colorante tiene un coeficiente de extinción elevado, lo que le confiere gran sensibilidad.

La reacción entre el colorante y la proteína es muy rápida (aproximadamente 2 min), y el complejo proteína-colorante permanece disperso en solución por un tiempo relativamente largo.

Rango de detección: 0,5-1500 ug proteína/ml.



Método de BCASe basa en la reacción de biuret.El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de

formar un complejo púrpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos.

OH-Proteína + Cu2+ → Cu1+Cu1+ + BCA → complejo púrpura BCA- Cu1+(se lee a 562 nm)

Rango de detección: 5-2000 ug proteína/ml. (simil Bradford)



Absorción Ultravioleta de las ProteínasLa mayoría de proteínas presenta un máximo de absorbancia a

280 nm, debido a la presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano y fenilalanina).

La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir proteínas en concentraciones entre 0,1 y 3 mg/ml, en la ausencia de sustancias que interfieran con la lectura.

Algunas preparaciones de proteínas parcialmente purificadas pueden tener ácidos nucleicos, los cuales tienen un máximo de absorción a 260 nm.

Una ecuación para calcular la concentración de proteína en la presencia de ácidos nucleícos en cubetas de 1 cm de paso es:

(proteína)mg/ml = 1,55 A280nm – 0,76 A260nm



Absorción Ultravioleta de las Proteínas

La ecuación fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1,75) en la presencia de ácido nucleico de levadura (A280/A260 = 0,49) y por tanto puede no ser precisa para otras proteínas y otros ácidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solución de proteína 0,1% (p/v) varía entre 0,5 y 2,5, dependiendo de la proporción de aminoácidos aromáticos que contengan.






(lipasa)

Efecto de los solventes: agua




No cambian los máximos

Efecto de los solventes: etanol



Cuadro comparativo: métodos espectroscópicos

Lowry: muchas interferencias con EDTA (50 mM), cloruro de guanidina (4 M), Triton X-100 (1%), sacarosa (40%), sulfato de amonio (3%), DTT o mercaptoetanol. No todas las proteínas reaccionan de la misma forma en la tinción.

BCA: interferencias con EDTA (50 mM), sulfato de amonio (20%)

Bradford. Interferencia con detergentes y lípidos.

Biuret. Poco sensible.

Absorción. Muchos compuestos absorben en el UV. Cuidado!




Fluorescencia - fenómeno

Fluorescencia



Fluorescencia

Los espectros de emisión y excitación proveen información fundamental de todos los experimentos de fluorescencia. Sirven para identificar las especies que emiten, verificar su pureza, detectar artefactos, y pueden indicar fenómenos como uniones de ligandos o transferencia de energía. Son más sensibles que los fenómenos de absorción a cambios del entorno. Algunas reglas generales:

*la emisión se da a longitudes de onda mayores que la excitación*La forma general del espectro de emisión no varía al cambiar la excitación*para especies de emisión única, el espectro de excitación es el mismo que el de absorción*el espectro de emisión es la imagen especular del de excitación

Fluorescencia



Ej de espectros de fluorescencia en proteínas.Experimentos de quenching para análisis de fracciones accesibles y no accesibles.

Trp, Tyr y Phe: regla general: fluorescen a 360 nm, se excitan a 280 nm..., se cumple?.

0100000200000300000400000500000600000

200 400

Long de onda (nm )

u.a.

de

Fl TrpTyr

Phe

Aminoácido Absorbancia Emisión

Trp 285 real 274 exp.

350

Tyr 275 real270 exp

300-305

Phe 256 real250 exp

280

Fluorescencia



Quenching

Nota: un requisito importante (metodológicamente hablando) para los análisis es que la absorbancia de la muestra, en la longitud de excitación, no debe ser mayor a 0,1 con respecto al blanco, debido a que si no existen problemas de filtro interno.

0

5E+10

1E+11

1.5E+11

2E+11

2.5E+11

250 300 350 400 450

Long de onda (nm)

u.a.

Fl

Trp s/QTrp + 50 ul QTrp + 100 ul QTrp + 150 ul QTrp + 200 ul QTrp + 250 ul QTrp + 300 ul Q

Fluorescencia


Fluorescencia


Ecuación de Stern Volmer Fl°/ Fl = 1 + kq tau° [Q][Q] = Vq/ (Vo + Vq) 1MFl= Imax (Vo+Vq)/Vo(siendo: Flº = Imax de Fluorescencia en ausencia de Quencher Q; Fl = Imax de Fl con el Q; kq = cte de quenching; tau° = tiempo de vida media en ausencia de Q; [Q] = concentración de Q; Imax = intensidad máxima de Fl, Vo = volumen inicial; Vq = volumen de Q agregado).

y = 4.1107x + 0.9965R2 = 0.9952

0

0.5

1

1.5

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1

[Q] (M)

Fl°/

Fl


Fluorescencia


Ecuación de Stern Volmer

Albumina: posee 5 Trp y 10 Tyr. Abs. 285, emis. 330 nm.Máximo de fluorescencia del Trp se desplaza a λ menores si en entornos hidrofóbicos. Por lo tanto, al desplegarse la proteína, habrá cambios en el máximo de Fl. si hay aa no accesibles.

0.9

1.1

1.3

1.5

0 0.05 0.1

[Q] (M)

F°/F

y = 0.051x + 3.9136R2 = 0.9343

02468

0 20 40 60 80

1/[Q] (M)F°

/AF

Desviación por Fl. residual

Eq modificada por fracción accesibles (fa) de fluoróforos. Puedo calcular fa


Fluorescencia


Ecuación de Stern Volmer

Ecuación de Stern- Volmer modificada (Ec. 2)F°/∆F = (1/(fa kq τ° [Q])) +1/fa, que corresponde a la ecuación de una recta.Se toma como ∆F = F- F° = F°a/(1+ kq τ° [Q]) +F°a = F°a kq τ° [Q]/ 1 + kq τ° [Q].(las referencias utilizadas son idénticas a las utilizadas en la ec. (1), siendo fa = fracción accesible de fluoróforos = F°a/ F°).



Varias técnicas pueden acoplarse a espectrometría de masa para la identificación de proteínas.

ESPECTROMETRIA DE MASA

Componentes básicos:

Generador de iones

Analizador de masas

Detector

Generación de iones:

MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption – sin límite

ESI: Electro Spray Ionization – límite práctico: 10 kDa

Espectrometría de masa



Las proteínas se mezclan con una matriz , usualmente orgánica, y se permite que se evapore, y se forman cristales. Sobre la muestra se aplica un pulso de láser, que produce la desorción y carga de la proteína.

Matrices

MALDI




ESI

En ESI la muestra de proteína con buffer es hecha spray a través de una pequeña aguja al final de la cual se aplica una diferencia de potencial.

El solvente se evapora y las partículas quedan cargadas

El spray se produce a partir de una columna de HPLC de fase reversa.





Misma proteína, diferentes cargas




En una primera etapa los iones son separados por m/z y transmitidos a un segundo cuadrupolo, a partir de este se transmite un ión en particular y pasa a la cámara de colisión.

En la cámara de colisión el ión es fragmentado por irradiación con un gas inerte

Los fragmentos del ión péptidico son luego resueltos en base a su relación m/z en el tercer cuadrupolo.

Masa/masa (MS/MS)




Ejemplo de aplicaciónMS/MS




Permite el fraccionamiento de una muestra utilizando los principios de cromatografía, la detección de las proteínas se realiza mediante SELDI (semejante a MALDI)

Los Chips para proteínas o Protein chips arrays están preparados con diferentes propiedades cromatográficas: - intercambio aniónico o catiónico; - afinidad por metal; - fase reversa, etc



• Proteins are captured, retained and purified directly on the chip (affinity capture )

Sample

Laser

Molecular Weight

100 µ m2to

1 mm2

Chemical, Biochemical or Biological Affinity Capture Surface

The SELDI Process andThe SELDI Process and ProteinChip ProteinChipTMTM Arrays Arrays• Sample goes directly onto the ProteinChip™ Array

• Retentate Map™ is “read” by Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI)• Retained proteins can be processed directly on the chip

ProteinChipTM Array


Electroforesis capilar - MasaTécnicas de Análisis-Macromoléculas

Para la identificación de las bandas que salen de la CE, muchas veces se acopla la misma a un espectrómetro de masa.Para ello es necesario primero someter la muestra a una ionización por electrospray, lo que requiere que el buffer de corrida sea volátil. Esto altera la resolución del sistema.


ELISA


ELISA = Enzyme- Linked Inmunoabsorbant Assay

Procedimiento

BIORAD ©

Recordar detección en Western blot


ELISA


ELISA = Enzyme- Linked Inmunoabsorbant Assay

Anticuerpo Resultado

Animación sobre el procedimiento de la técnicahttp://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2004/04-0522/04-0522_ELISA.html

ELISA

vs.

Western Blot

ELISA- Resultado rápido- Screening primario- Identifico proteínas basado en la especificidad del anticuerpo

Western Blot- Confirma resultados ELISA- Más específico- Identifico proteínas tanto por especificidad del anticuerpo como por tamaño

ELISA


BIORAD ©


EIA


EIA = Enzyme Inmunoenzymatic

Assay

Es en fase sólida,

pero similar a ELISA

Principio de prueba

Disponible para varios

inmunoensayos:

HIV/ Chagas/ Clamidia

Toxoplasmosis/

Rubeola/ Hepatitis

Dengue IgM e IgG – Immunocomb Orgencis


EIA


EIA = Enzyme Inmunoenzymatic Assay.

Dengue IgM e IgG – Immunocomb Orgencis


PCR


PCR – Polymerase chain reaction

Síntesis repetitiva bidireccional de ADN por primer extention de una región de ácidos nucléicos de interés.

Requerimientos y animación del proceso:

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf

http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf


PCR



Requerimientos:• Template de ácidos nucleicos (102 –105 moléculas)• Buffer de reacción (10-50 mM Tris-HCl, pH 7,5- 9) • dNTP* ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP ): • DNA polimerasa• Primers• MgCl2 (cofactor polimerasa)

Concentraciones de dNTP, primers, MgCl2 y condiciones de ciclado dependen de cada reacción y de la relación especificidad – eficiencia – fidelidad que se quiere obtener (eficacia de la reacción de la PCR).


PCR



a)ESPECIFICIDAD. Generación de un único producto de amplificación,

b)EFICIENCIA. Máxima producción de amplificación en función del número de ciclos,

c)FIDELIDAD. Número de errores que comete la DNA pol. durante la copia.

d)SENSIBILIDAD. Mínima cantidad de DNA que se necesita para obtener una gran cantidad de copias.


PCR



Ciclado1. DESNATURALIZACION: 5min. 94ºC,2. CICLO típico de 3 repeticiones: a) Desnaturalización: 1-2 min. 94ºC, b) Annealing del primer: 1-2 min. 50-65ºC

(apareamiento) (5ºC debajo de Tm), c) Extensión: 1-2min. 72ºC,

(depende del tamaño del fragmento)3. EXTENSIÓN FINAL: 5-10 min. 72ºC, 4. HOLD: 4ºC.

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swfhttp://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf


PCR



Acumulación de producto Nf = No ( 1 + Y )n, donde n: número de ciclos Y: eficiencia.

• Ciclos extras: > n < especificidad

Para obtener más masa de amplificación se realiza una reamplificación.

N° ciclos: aprox. 30


PCR



0.0E+00

2.0E+08

4.0E+08

6.0E+08

8.0E+08

1.0E+09

1.2E+09

1.4E+09

1.6E+09

1.8E+09

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR cycle

DNA

copy

num

ber

Sin tener en cuenta las consideraciones anteriores: copias de ADN = 2n


PCR



Template• DNA o RNA (genómico, plasmídico, cDNA, RNAm)• Grado de purificación intermedio• DNA genómico mamífero (1 ug)• DNA genómico bacteria o plasmídico (1fg-1pg)

< Tamaño de fragmento > Eficiencia (100- 400 pb.) hasta 40 kb.

> Cantidad de templado > Fidelidad < Eficiencia.


PCR



PRIMERS Y dNTPs

• Especificidad: Hibridizar eficientemente a la secuencia target y no a otra secuencia relacionada o con homología que puedan estar presentes en la muestra.• Tamaño 15 a 30 Nt. > Tamaño, < Eficiencia, > especificidad.• Tm = 2°C Σ(A+T) + 4°C Σ(G + C ) hasta 20 pb (después fórmula + compleja). (circa 50-65°C)• Concentraciones de dNTPs depende del tamaño del target.(20 a 200 uM)


PCR




PCR



DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS

• Detección en geles (electroforesis): Southern Blot (revelado con sonda marcada)

• Detección inmunológica:Hibridación del producto de PCR con una sonda inmovilizada en placa de ELISA (revelado con anticuerpos anti-biotina acoplado a abidina y a la peroxidasa para reacción de color).


PCR



Si quiero secuenciar los productos obtenidos por PCR: debo purificar.

Algunos métodos:UltrafiltraciónPrecipitación con etanolPurificación cromatográficaPurificación enzimática

Ver detalles en archivo adjunto DNA sequencing by capillary electrophoresis chemistry guide


PCR



Real Time-PCR

Ventajas principales: -sigo el proceso en tiempo real-cuantificación (pare ver detalles ver archivo adjunto Appl Note RT-PCR. Applied Biosystems)

Animación:http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055079.swf


PCR



RT-PCR

Uso: PCR en muestras de ARN.

La transcriptasa reversa se utiliza para copiar todos los ARNm en una muestra de RNA en cADN.

Este cADN de cadena sencilla puede ser amplificado por PCR utilizando los primers que reconocen una secuencia de transcripción específica.


PCR



RT-PCR


Secuenciación de ADN


Secuenciación de ADN – Sanger dideoxy sequencing (Sanger et al., 1974)

Requerimientos y animación del proceso:

http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055078.swf

Notar el acoplamiento con Capillary Electrophoresis

Detalles experimentales completos en archivo adjunto DNA sequencing by capillary electrophoresis chemistry guide

http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055079.swfhttp://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055079.swf





Pasos (se pueden automatizar):

1. Preparación de la muestra2. Ciclos de secuenciación3. Purificación4. Detección (CE permite automatización)5. Análisis de datos




Secuenciación de ADNCrecimiento:

dirección 5’-3’

http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055078.swfhttp://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_055078.swf





Recuerden complementariedad de bases…




Secuenciación de ADN - ciclos




Secuenciación de ADNPuedo separar los productos obtenidos por electroforesis y revelado radioactivo (la secuenciación se realiza con nucléotidos marcados), como ya vimos en las primeras teóricas, o por CE.


Microarrays


Microarrays

-Los microarrays permiten el análisis simultáneo de la expresión de miles de ARNm.- Se basan en las secuencias EST (expressed sequence tags).- Miles de copias de estas se colocan en cada uno de los spots.- Útiles para determinar los cambios en los patrones de expresión génica de un tejido de una muestra a otra.-Por ejemplo: uso de los microarrays para estudiar las diferencias en la expresión génica en los tejidos tumorales diferentes.


Microarrays


Microarrays


Microarrays


Microarray ej: identificación de cáncer de pulmónMuestrasMuestras

Genes

Genes

Garber, Troyanskaya et al. Diversity of gene expression in adenocarcinoma of the lung. PNAS 2001, 98(24):13784-9.


FT-IR


FT-IR: Fourier transform infrared spectroscopy

Método para análisis de vibraciones moleculares2


FT-IR


Absorción de radiación IRCondiciones para que se produzca

1) Cuando una molécula es irradiada con radiación IR, la unión vibrante absorberá energía si la frecuencia de la radiación coincide con la frecuencia vibracional.

1) Para que se produzca la absorción, la molécula debe experimentar un cambio neto en su momento dipolar como consecuencia de los movimientos vibracionales o rotacionales.

1) Las bandas observadas dependerán del nivel poblacional en cada nivel vibrac. o rotacional.


FT-IR


Análisis de proteínasSe debe analizar la banda amida I (1700-1600 cm-1).

Review: Infrared spectroscopy of proteins, Barth, A., 2007, BBA 1767, 1073.

Se deben aplicar técnicas de estrechamiento al espectro (band narrowing techniques). Opciones:

1) Cálculo de derivada segunda. 2)Fine structure enhancement. 3) Deconvolución de la FT.


FT-IR


Conformación de las proteínas por FTIR.

Rey, L., May, J.C. (Eds.), Freeze-Drying/ Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products, Marcel Dekker, Inc., New York, pág. 123- 160.


FT-IR



FT-IR


Tutoriales sobre análisis por FT-IR

-Tutorial más simple sobre la técnica: http://www.a2technologies.com/downloads/Tutorial.swf

De macromoléculas (es claro pero extenso):http://shaker.umh.es/docencia/aesma/Espectroscopia_de_infrarrojo.swf


DLS


Dynamic Light scattering

Mide el radio hidrodinámico de una partícula en solución

Ej. Lisozima (15 kDa)Baja polidispersidad (20%) - mejorableRadio alrededor de 1,95 nm

http://www.chemeurope.com


DLS


Dynamic Light scattering

Muestra agregada y polidispersa

http://www.chemeurope.com

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