carrera de especializacion en biotecnologia...
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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyN-INTI
Materia de Articulación CEBI_E3
Cultivos Celulares
Docente: Erina Petrera
CEBI_E3_3: Métodos de cultivo de células animales
EVOLUCIÓN DE UN CULTIVO
Semanas en cultivo
Célu
las t
ota
les
(log n
úm
ero
de c
élu
las)
1er subcultivo
Pasajes seriados
transformación
Línea celular Cultivo
primario
Línea celular
Contínua
Envejecimiento
y muerte
clonado
Cepa celular
contínua
TRANSFORMACION
Implica un cambio en el fenotipo que depende de la obtención de
nuevo material genético.
Los siguientes cambios fenotípicos son:
1 Inmortalización
2 Control de crecimiento aberrante
3 Malignidad
Cuando se realiza artificialmente se denomina
TRANSFECCION
La adquisición únicamente de una esperanza de vida infinita se
denomina
INMORTALIZACION
FINITA CONTINUA
POLIPLOIDÍA DIPLOIDE/EUPLOIDE HETEROPLOIDE/ANEUPLOIDE
TRANSFORMACIÓN NORMAL TRANSFORMADA
TUMORIGENICIDAD NO SÍ
DEPENDENCIA DE ANCLAJE SÍ NO
INHIBICIÓN POR CONTACTO SÍ NO
LIMITACIÓN DE CRECIMIENTO
POR DENSIDAD
SÍ NO
MANTENIMIENTO CÍCLICO POSIBILIDAD QUIESCENCIA
REQUERIMIENTOS DE SUERO ELEVADOS BAJOS
EFICIENCIA DE CLONAJE BAJA ELEVADA
MARCADORES ESPECÍFICOS DE
TEJIDO
CROMOSOMALES,
ENZIMÁTICOS, ANTIGENICOS
FUNCIONES ESPECIALIZADAS SE MANTIENEN SE SUELEN PERDER
TASA DE CRECIMIENTO BAJA (24 – 96 H.) RÁPIDA (12- 24 H.)
RENDIMIENTO EN CULTIVO BAJO (MENOR A 105
CÉLS/CM2)
ALTO (MAYOR A 105 CÉLS/CM2)
CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS
DE LOS CULTIVOS CELULARES
CURVA DE CRECIMIENTO
ALIMENTACIÓN
SUBCULTIVO
LÍNEA CELULAR
CONTINUA O ESTABLE
Línea de células gliales
humanas normales
Línea celular contínua de
melanoma metastásico
humano
Fre
qu
en
cy
Fre
qu
en
cy
Diploide: 23 x 2
• Cultivos primarios.
• Líneas diploides: 50-80 generaciones.
• Líneas celulares continuas: heteroploides.
Con crecimiento sin límite.
TIPOS DE CULTIVOS DE CÉLULAS
SOPORTE ÁREA DE
CRECIMIENTO
N0 DE CÉLS
ADHERENTES X
106
VOLUMEN DE
MEDIO (ML)
PLACA 90 MM 49 1 10
PLACA 60 MM 21 0,4 5
PLACA 35 MM 8 0,15 3
24 POCILLOS 2 0,04 1
12 POCILLOS 4,5 0,09 2
6 POCILLOS 9,6 0,2 3 - 4
FRASCO 25 CM2 25 0,5 5 - 10
FRASCO 75 CM2 75 1,5 15 - 30
FRASCO 162 CM2 162 3 30 - 50
TABLA DE GUÍA PARA LA
SIEMBRA DE CÉLULAS
Número de células/mL: (L1 + L2 + L3 + L4) x 10000
dilución
HEMOCITOMETRO
BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado
CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico
MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel)
CHO: Epitelio de ovario de hamster chino
VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano
HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano
MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto
HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana
FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino
Etc., etc., etc.
LÍNEAS CELULARES CONTINUAS: ALGUNOS EJEMPLOS
CRIOPRESERVACIÓN DE CULTIVOS
CONGELACIÓN
Alto número de células
Glicerol, DMSO, SFB
Congelación lenta
1 °C /min
CONDICIONES DE
ALMACENAMIENTO
TEMPERATURA SUPERVIVENCIA
ESTIMADA
Nitrógeno líquido - 196oC Varios años
Nitrógeno gaseoso - 150oC Varios años
Freezer - 80oC Hasta 2 años
DESCONGELACIÓN
Descongelación
rápida a 37°C
Sigla Nombre u organismo Ciudad, país Nº de
cultivos
ATCC American Type Culture
Collection
Minassas, USA 800
DSMZ Human and Animal Cell
Cultures
Braunschweig,
Alemania
500
ECACC European Collection of Cell
Cultures
Salisbury,
Wiltshire, UK
1000
GEIMM Instituto Giannina Gaslini Genova, Italia 2300
COLECCIONES INTERNACIONALES MÁS IMPORTANTES
EN LA ARGENTINA
• ABAC: Asociación Banco Argentino de Células
– Desde 1987 mantiene y/o administra varias decenas de líneas celulares en distintos centros de investigación.
– Provee células congeladas o en cultivo a cambio de un arancel razonable ($ 3750 + envío por cada botella con una monocapa celular de 75 cm2 de cultivo ).
– Brinda servicios relacionados con los cultivos celulares: detección de Mycoplasma, mantenimiento de células en depósito de nitrógeno líquido, dispone de manuales de la ATCC traducidos que ofrece a la venta, etc.
– www.abac.org.ar
FUENTES DE CONTAMINACIÓN
1.- Ambiente: superficies, polvo, aerosoles, etc.
2.- Operador
3.- Células
4.- Medios y soluciones
5.- Botellas de cultivo, pipetas, etc.
6.- Estufas
CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES
Medio
Microorganismo
Temperatura
(°C)
Tiempo de
observación
(días)
Agar sangre 5% de
sangre fresca de conejo
desfibrinada
Bacterias y levaduras 37 14
Caldo tioglicolato bacterias 37 14
Caldo tripticasa soja bacterias 37 14
Caldo infusión cerebro
corazón
bacterias 37 14
Caldo Sabouraud hongos 37 21
Caldo YM Hongos y levaduras 37 21
Caldo nutritivo con 2%
de extracto de levadura
bacterias 37 21
CONTAMINACIÓN DE
CULTIVOS CELULARES CON
BACTERIAS Y HONGOS
CONTAMINACIÓN DE
CULTIVOS CELULARES CON
BACTERIAS Y HONGOS
CONTAMINACIÓN DE
CULTIVOS CELULARES CON
MYCOPLASMA
HOECHST 33258 o con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol)
Virus de la inmunodeficiencia humana
Virus de la leucemia L y T humanas
Retrovirus endógenos
Virus de la Hepatitis B o C
Virus Herpes 6 humano
Virus Epstein-Barr
Hantavirus
Virus de la Coriomeningitis linfocítica
Hepatitis murina
Virus Simianos
Virus de la Diarrea Bovina
Virus del papiloma
Cytomegalovirus
CONTAMINACIÓN DE
CULTIVOS CELULARES
CON VIRUS
•Observación de ECP
•Inoculación de animales
•Hemoaglutinación
•Co-cultivo
•PCR
•Hibridización de ácidos nucleicos
• Fluorescencia
•Ultraestructura por ME
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE VIRUS
EN CULTIVOS CELULARES
Efecto citopático
Hemoadsorción
CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS
CELULARES CON OTRAS
CÉLULAS EUCARIOTAS
1) INTERESPECÍFICA: por manipulación
de células de distintos orígenes
2) INTRAESPECÍFICA: por manipulación
de células provenientes de distintos
tejidos pero todas del mismo origen
PRECAUCIONES
1.- Controlar regularmente los cultivos celulares para
la detección precoz de contaminación;
2.- No mantener los cultivos celulares en medios con
antibióticos, de rutina;
3.- No intentar la decontaminación;
4.- Poner en cuarentena las líneas celulares nuevas
hasta estar seguro de que no están contaminadas;
5.-No compartir medios o soluciones entre distintas
líneas celulares y operadores.