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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyN-INTI

Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio

CEBI_E1_5: Electroforesis capilar

Materia de Especialización CEBI_E1 Técnicas de análisis en biotecnología

Módulo I: Moléculas pequeñas. Módulo II: Macromoléculas.

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Electroforesis capilar

Técnicas de Análisis

La electroforesis capilar (CE) es una familia de técnicas que emplean capilares estrechos (entre 20-200 µm de diam. int.) tanto para separar moléculas grandes como pequeñas. Introducción comercial: fin 1980.

Las separaciones se facilitan por el uso de voltajes altos, lo que generan dos flujos,el electroosmótico (EOF) y el electroforético, de las especies del buffer y de las especies iónicas, respectivamente.




Las propiedades de separación así como el resultado obtenido (electroferograma) recuerda a una mezcla entre HPLC y CG con PAGE.

Ventajas principales -requiere poca muestra (nL) -eficiencias elevadas (simil GC o +) -cuantificación -automatización -> repetitibilidad -admite muchos analitos -usa poco reactivo




El siguiente es un diagrama del funcionamiento básico de un equipo de CE.




Cómo y por qué migran los solutos si… (o por qué se mueve la fase móvil…) -No hay bomba, como en HPLC

-No hay gas presurizado, como en CG

-No hay capilaridad (como cromatografía en papel)

VER: http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/CE.swf

http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/CE.swf




El flujo electroosmótico (EOF) es el proceso impulsor fundamental en CE. Se produce por la superfice cargada en la pared del capilar. Se debe a la formación de una doble capa eléctrica, en la interfase entre el líquido y la superficie interna del capilar. Habitualmente, el interior de los capilares es de sílica, que presenta grupos silanoles (Si‐OH) libres en la superficie interna. El pI de la silica fundida es > 1,5. Por encima de ese pH (normalmente > 3 para estar seguros), los silanoles permanecen cargados y confieren a la superficie interna del capilar una carga neta negativa.

Como se origina el EOF?

Ánodo +

Cátodo -

Detector



El EOF se produce por el sentido de flujo de los cationes adyacentes al capilar






Los cationes del buffer migran hacia la pared del capilar cargada negativamente, lo que termina formando una doble capa eléctrica. Al aplicar el campo eléctrico, los cationes tenderán a migrar hacia el cátodo (de carga opuesta) y los aniones hacia el ánodo. Como los cationes se encuentran solvatados con las cargas negativas de los silanoles de la pared del capilar, ellos terminan arrastrando incluso los aniones y el resto de la solución con ellos.




A pH elevados (en capilar de 50 um i.d.): 4 nL/s A pH bajos: 0,5 nL/s.




La intensidad del flujo electroosmótico depende de las cargas de la pared y de la intensidad del campo eléctrico. La intensidad de la carga neta negativa de las paredes depende también del pH (cuanto más alcalino, mas ionizados los silanoles). Se grafica la velocidad de EOF en función del pH.

El grado de ionización depende el pH




La velocidad de migración real de un analito en CE depende también del flujo electroosmótico, que fluye hacia el cátodo (carga negativa). EOF se mide inyectando un analito patrón (y neutro) y evaluando el tiempo que demora en llegar al detector.

Por lo tanto, la migración real depende del resultado neto entre la atracción de cargas hacia el electrodo de carga opuesta y el flujo electroosmótico.




Los analitos con carga neta positiva son atraídos hacia el cátodo (‐), en el mismo sentido que el flujo electroosmótico. Los analitos con carga neta negativa son atraídos hacia el ánodo (+), en contra del flujo electroosmótico. En condiciones de capilaridad, la fuerza del flujo electroosmótico es mucho mayor que la atracción hacia el ánodo, por lo que los analitos con carga negativa también migran hacia el cátodo (‐), pero con una velocidad mucho menor. Incluso aniones con triple carga negativa terminan migrando hacia el cátodo (‐), por la fuerza del flujo electroosmótico.

Velocidades aparentes

Analitos con carga neta + se mueven más rápido que EOF

EOF

Analitos sin carga neta se moverán igual que el EOF. Útil para determinar la velocidad del EOF

EOF

Analitos con carga – se mueven más lentamente que EOF

EOF






El tiempo de migración (tm) es uno de los parámetros prácticos claves, y es el tiempo que tarda el soluto en moverse por el capilar desde su inicio hasta el detector.

La movilidad electroforética (up) se calcula a partir de la velocidad de migración o electroforética (vp) y la fuerza del campo eléctrico (V/cm). Ld: distancia capilar- detector Lt: distancia total capilar

La movilidad electroforética es proporcional a la carga neta de la molécula, e inversamente proporcional a las fuerzas de fricción presentes en el buffer.




Movimientos y ecuaciones asociadas: - Analito ν = µ E ν = velocity µ = electrophoretic mobility E = Electric field - Movilidad electrofóretica µ = q/[6πηr] q = charge η = solution viscosity r = Stoke's radius (analito) - Flujo electroosmotico νEOF = [ε/4πη]ζE ε = dielectric Constant ζ = Zeta potential - Flujo de migración ν = [(μEO + μe)V]/L V = potential L = length of capillary




Además, el perfil de avance del flujo en los sistemas basados en el flujo electroosmótico, es plano, a diferencia del flujo laminar, perfil característico de los sistemas impulsados por presión (HPLC). Por lo tanto, el flujo no contribuye al ensanchamiento de bandas, como si ocurre en HPLC. La CE puede tener cientos de miles de platos teóricos.




El número de platos teóricos (Eficiencia de separación) está dado por: N: Número de platos teóricos μ: Movilidad aparente Dm: Coeficiente de difusión del analito Por lo tanto, la eficiencia solo estaría limitada por la difusión, y acrecentada por la fuerza del campo eléctrico. ¡Y no depende del largo del capilar!




Problemas principales Joule heating (calentamiento por la corriente). Se debe a la resistencia que muestra el buffer a fluir con la corriente. Hoy en día no se pueden aplicar corrientes mayores a 30 kV. Difusión del calor dentro del capilar. Genera gradiente, que afecta a la viscosidad. Solución: capilares más estrechos y efectiva remoción del calor (por diseño de equipo).




Inyección de la muestra Los viales de origen, destino y el capilar contienen un buffer salino acuoso (electrolito). 2 métodos más difundidos - por presión. - eléctrocinética. Aplicación de un voltaje a la muestra para que ingrese.




Detección Pueden usarse varios métodos de detección. Lo más común es absorbancia UV o UV-Visible. Habitualmente una parte del mismo capilar (cercana al extremo de salida) se usa como celda de detección. La detección en el mismo tubo evita una pérdida en resolución. Los capilares habitualmente están cubiertos por un polímero, que debe ser transparente en la ventana de detección, o debe removerse.




El recorrido del haz de luz en la detección de CE (50 um) es mucho menor que en una celda UV tradicional (1 cm). Como la sensibilidad es directamente proporcional a la longitud del recorrido del haz, es necesario encontrar formas de aumentar el recorrido en la CE, a pesar de una segura pérdida de resolución. El mismo capilar puede ser expandido formando una burbuja (Fig. a), o puede agregarse un fragmento perpendicular al capilar (Fig. b) para aumentar el recorrido en el lugar de detección.




La detección del analito puede ser directa o indirecta (se coloca un analito patrón que absorba mucho, y se registra la bajada en la Abs como señal; claramente, esta metodología tiene sus limitaciones) (detalle en animación, en diapositiva siguiente)




Los conceptos principales de CE se pueden observar en la siguiente animación:

http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/CE.swf - Componentes del sistema - Inyección de muestra - EOF - Detección

http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/CE.swf




Modos de CE • Capillary zone electrophoresis (CZE) • Capillary Isoelectric focusing (CIEF) • Capillary gel electrophoresis (CGE) • Capillary Isotachophoresis (CITP) • Micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC) Algunas de las técnicas (CZE, CIEF y CITP) están descriptas en la siguiente animación, con sus diferencias y similitudes http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/CEs.swf

http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/flashfiles/CEs.swf




Selección de técnica según muestra

Introduction to CE, Beckman Handbook




Capillary Zone Electrophoresis - CZE Es la más común entre las CE. Las moléculas son separadas por su relación carga/masa, dentro de un capilar, sometidas también a un campo eléctrico. Es clave: homogeneidad de los buffers (mantener pH exacto), fuerza eléctrica constante a lo largo del capilar. Se pueden separar tanto moléculas grandes como pequeñas.




CZE Los componentes se separan en zonas discretas: Inicio durante





La movilidad electroforética de un analito a un pH determinado se puede aproximar por la teória Debye-Huckel-Henry (ya vista antes): Siendo z la carga neta de la molécula y r el radio de Stokes del analito, y η viscosidad del medio




CZE En muchos casos, y especialmente los que involucran a macromoléculas, la carga neta de una molécula: DEPENDE DEL pH.

Capilar típico: De sílica fundida, de 25-75 um. Son transparentes al UV, alta durabilidad y potencial zeta adecuado. Importante: debe ser acondicionado antes del primer uso (0,1M NaOH 10'; H2O, 5'; buffer de corrida, 10'). Objetivo: asegurarse que la superficie del mismo se encuentre uniformemente cargada.




Efecto del pH: cambio en la migración - pH elevado → EOF es importante → orden migración: cationes, neutros, aniones. Estos últimos igual migran hacia el cátodo, dada la magnitud de EOF (EOF > migración electroforética). OJO: los compuestos neutros no se separan entre si dado que su carga neta es 0. - pH bajo → EOF es pequeño → puedo medir cationes y aniones en diferentes corridas, pero NO juntos. Se cambia la posición del cátodo (si mido cationes, configuración std) o ánodo (mido aniones) respecto al detector, revirtiendo la polaridad de los electrodos.




Efecto del pH: cambio en la migración Por lo tanto, el cambio de pH influye en las proteínas y péptidos y en su migración! Afectando la sensibilidad en su separación.

Regla: elegir un pH al menos 2 unidades > que el pKa para asegurarnos una completa ionización.

Cuidados - en pH muy alcalinos, ya que EOF es muy grande y podría no separar mis compuestos de interés por su velocidad. - en pH muy ácidos, pared del capilar sin carga. No hay interacción, pero la proteínas pueden precipitar.




CZE


Ideales para proteínas! (reducen calentamiento)




CZE – selección de buffers - concentración típica: 50-100 mM. - filtrado a 0,45 um para evitar obstruir capilar. Problema de capilares y coating: - pegado de sustancias + a las paredes. - coating puede evitarlo. Hay varios tipos. También se utiliza para evitar el pegado hidrofóbico de proteínas.




CZE


Ojo: alteran la movilidad electroforética de las protreínas




CZE - aplicaciones Proteínas y péptidos. Diferencias de hasta 1 aminoácido son detectables. Ejemplo: separación de BSA reducida, desnaturalizada y digerida. Realizada a pH bajo con 1,5 M Urea.





CZE - aplicaciones





Capillary Isoelectrofocusing - CIEF Se usan anfolitos carriers, y se forma un gradiente de pH similar al visto para IEF una vez aplicado el voltaje. Contraste con CZE, en donde el buffer debía mantenerse lo más estable posible, mientras aquí es discontínuo.





CIEF Las moléculas migrarán mientras estén cargadas. El EOF debe ser suprimido (momentaneamente) para que el IEF sea efectivo (sino, no se forma un gradiente y “corre” todo). Se realiza un coating de metilcelulosa o poliacrilamida. Esto suprime tanto el EOF como la adsorción de proteínas. Uso principal: separación de alta resolución de proteínas y polipéptidos. Se resuelven hasta 0,02 unidades de pH.




CIEF Importante: pH del buffer anódico debe ser menor que el pI del anfolito más acídico, mientras que el pH del buffer básico debe ser mayor que el del anfolito más básico, para evitar sus migraciones en los mismos. 3 pasos para su aplicación: - cargado - enfocado - mobilización




CIEF Cargado. Mezcla muestra + anfolitos (1-2 %). Inyección más común por presión o vacío. Enfoque. Buffer cátodo: NaOH; buffer ánodo: H3PO4. Campo: 500-700 V/cm. Ojo: precipitación: uso de aditivos. Movilización. Etapa necesaria, ya que si quedan fijos en el capilar, ¿cuándo los detecto? Se puede realizar para el cátodo o ánodo, depende de que buffer se reemplace, para que se reinicie el EOF. Detección a 280 nm dado que los anfolitos absorben a 214 nm.




CIEF - Aplicaciones


Determinación de pI de proteínas, separación de mezclas Ig, variantes Hb, modificaciones post-traduccionales


Mezcla de proteínas (1-5); 1: pI >; 5: pI <




Capillary Gel Electrophoresis - CGE

- EOF está suprimido (el mismo gel lo suprime), al igual que en CIEF (previo a movilización). - Aplicación de CE a electroforesis en geles para separación de ADN. Tendremos separación por tamaño como en PAGE. - Se usan capilares rellenos de poliacrilamida (más usual, pero veremos otros). Agarosa no se puede utilizar dado que no soporta el calentamiento excesivo por los altos voltajes.





CGE Dos clases de relleno de geles: geles físicos (hidroxipropilmetil celulosa) o químicos (poliacrilamida). Capilares de 50 a 100 μm, y entre 10 y 100 cm. A mayor largo, mejor resolución, pero más calentamiento. Puedo cambiar el rango de PM a resolver cambiando la concentración en el gel (= PAGE). Ojo con el calentamiento! Puede ocasionar poros en el gel. Los geles físicos son más sensibles que los químicos.




CGE Muy utilizado para proteínas y ADN. Proteínas: se suelen desnaturalizar (calor, SDS, ß-mercaptoetanol). Ventaja: igualdad de carga/masa y forma (todas rod-like). Buffer típico: 90 mM Tris-fosfato pH 8,6 con 0,1 % SDS. Se debe realizar calibración con marcador de PM (= PAGE). Inyección: electrocinética (por presión se obstruye el gel).




CGE Ej. separación homopolímero sintético de 50 timidinas. Se logra resolución de separación de 1 unidad.





CGE Ej. separación doble hebra de ADN. Resolución de 3 pb! También es útil para separación de fragmentos ADN por PCR y digestiones con enzimas de restricción (caso en la figura de al lado).





Capillary Isotachophoresis - CITP Al igual que CIEF, se debe eliminar el EOF (así nació, pero hoy en día tb se usa) y se posee un sistema heterogéneo en el buffer. Se usa un electrolito iniciador (alta movilidad) y uno finalizador (baja movilidad), y la separación de la muestra ocurre en el medio.





CITP El electrolito líder se coloca tanto en capilar como en el reservorio “catódico” (cerca del detector). Debe poseer mayor movilidad que el analito más móvil que yo quiera separar. Por ej: Cl- (si separo especies cargadas negativamente). En el otro reservorio, se pone al electrolito finalizador (posee una movilidad menor a cualquiera de los analitos). Como es un sistema heterogéneo: la fuerza eléctrica en cada zona será diferente, y será inv. proporcional a la conductividad (depende de movilidad y concentración)




CITP Como se logran zonas muy delimitadas, la separación por movilidad es muy elevada. Todas las bandas se mueven a la misma velocidad (único en CE), una vez que se enfocaron. Esto es pq: - Si muy móvil: alta conductividad, por lo que E baja, y por lo tanto la velocidad se reduce; - Si poco móvil, baja conductividad (alta resist), generando mayor E y por lo tanto aumentan su velocidad. Al final, la velocidad de todos será igual.




CITP Como consecuencia de esto, existe entonces un efecto de enfoque, al igual que en CIEF, debido al juego entre conductividad y caída del voltaje, que son indirectamente proporcionales. Movilidad = conductividad x caída de voltaje No se pueden determinar cationes y aniones en la misma corrida (Cationic CITP y Anionic CITP).




CITP

El orden de migración es el mismo con y sin EOF

El orden de migración es inverso con y sin EOF!




CITP – selección de buffer




CITP Así se ve un electroferograma por CITP. Se utilizan spacers para que se asemeje a los obtenidos por CZE (detección UV). Son compuestos de movilidad intermedia que no absorben. Así se obtiene separación entre bandas! (sino no la habría).


Grafico conductividad




CITP Contras respecto a CZE: Es más compleja la elección de buffers. Uso de spacers para evitar superposición de bandas. Capilares de silica 0,25% de metilcelulosa suprime el EOF. Electrolito lider: ácido fosfórico. Electrolito finalizador: valina (100 mM, ajustado a pH con amina primaria).




CITP – selección de buffer




CITP –comparaciones

Anionic CITP: capilar con cobertura (SIN EOF) Capilar sin cobertura (CON EOF)




CITP –comparaciones Con spacers, mejor separación

Anionic CITP: capilar con cobertura (SIN EOF)




Micellar electrokinetic Capillary cromatography - MECC Ideal para determinación de moléculas pequeñas. Se usan micelas que forman soluciones surfactantes, similares a cromatografía líquida en fase reversa, pero con los beneficios de la CE.





MECC Para profundizar: apunte adjunto Introduction to capillary electrophoresis – Beckman handbook. Fundamento: (caso pH neutro a básico)


EOF (fuerte)

Los analitos se particiona entre bulk y micela ; si en micela, tiene menor vel.; sino, es la v del EOF




MECC - aplicaciones





Aplicaciones: Secuenciación automática de ADN Ver:http://www.sealund.com/forensicdna/images/module4/DNACD_mod04-2-08.swf Equipo automatizado: https://www.jenck.com/productos/producto/mce-202-multina

Ladder-500

Detalle: DNA Sequencing, Applied Biosystems

http://www.sealund.com/forensicdna/images/module4/DNACD_mod04-2-08.swf

http://www.sealund.com/forensicdna/images/module4/DNACD_mod04-2-08.swf

https://www.jenck.com/productos/producto/mce-202-multina




Aplicaciones: Análisis de proteínas séricas Objetivo: investigar las modificaciones del perfil proteico y evaluar posibles anomalías presentes en la curva electroforética. Se puede llevar a cabo el análisis cualitativo o cuantitativo de muestras de distinto origen: suero, sangre, orina y/o líquido cefalorraquídeo.

MARIA DE LAS NIEVES SANZ, 2013

FIGURA 1. CAPILARES DE SILICE FUNDIDO

FIGURA 4. FRACCIONES DE UN PROTEINOGRAMA DE SUERO

NORMAL

8 capilares en paralelo




Aplicaciones: Análisis de proteínas séricas

MARIA DE LAS NIEVES SANZ, 2013

FIGURA 4. FRACCIONES DE UN PROTEINOGRAMA DE SUERO NORMAL

COMPONENTE MONOCLONAL

FIGURA 6. PROTEINOGRAMA

ANOMALO. PRESENCIA DE COMPONENTE

MONOCLONAL EN LA ZONA DE LAS

GAMMAGLOBULINAS.

(cuantificación relativa)

FIGURA 7. Inmunofijacion en gel de agarosa con Ac monoclonales específicos anti cadena pesada IgG, IgA e IgM y anti cadena liviana Kappa y Lambda. (cualitativo)

Caso de análisis: Mieloma Múltiple (tipo de cáncer de la médula ósea que afecta a las células plasmáticas)

Buffer: alcalino


Electroforesis capilar-Problemas


Problema 1. Los siguientes electroferogramas corresponden a muestras de proteínas de suero lácteo nativa (a) y almacenadas con lactosa a 37ºC durante 5 y 10 horas (b y c, respectivamente) obtenidos por electroforesis de zona (CZE) en capilares de sílice sin recubrir en buffer borato 50 mM a pH 9,25. La detección se realizó en el UV a 214 nm. Se grafica el tiempo de inyección (X) vs. Intensidad de señal detectada (Y). a) Indique a que corresponden los picos en el gráfico a. b) Analice que sucede en los electroferogramas b y c. Indique si las proteínas ganaron o perdieron peso. ¿Se debe tener en cuenta cambios en el pI? c) El EOF, ¿es mayor o menor a pH 9 que a pH 3?




a b

c




Problema 2. Calcular el n° de platos teóricos si se conoce que una proteína (mioglobina) pesa 13,9 kDa y posee una movilidad de 0,65 10-4 cm2/V s (20 mM bicine/TEA buffer, pH 8,5) con un D = 1 10-6 cm2/s a 30.000 V.




Problema 3. El siguiente es un electroferograma obtenido de ADN amplificado por PCR obtenido por digestión, realizado por CGE. Indique: a) como es el peso comparable de los picos A-D; b) a que puede corresponder el pico A.

http://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/fig_tab/nprot.2006.8_F1.html

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