CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyN-INTI

Materia de Articulación CEBI_E3 Cultivos Celulares

Docente: Erina Petrera

CEBI_E3_5: Métodos de cultivo de células animales

EVOLUCIÓN DE UN CULTIVO

Semanas en cultivo

Cél

ulas

tota

les

(log

núm

ero

de c

élul

as)

1er subcultivo

Pasajes seriados

transformación

Línea celularCultivo primario

Línea celular Contínua

Envejecimiento y muerte

clonado

Cepa celular contínua

TRANSFORMACION

Implica un cambio en el fenotipo que depende de la obtención de nuevo material genético.

Los siguientes cambios fenotípicos son:

1 Inmortalización 2 Control de crecimiento aberrante 3 Malignidad

Cuando se realiza artificialmente se denomina TRANSFECCION

La adquisición únicamente de una esperanza de vida infinita se denomina

INMORTALIZACION

FINITA CONTINUA

POLIPLOIDÍA DIPLOIDE/EUPLOIDE HETEROPLOIDE/ANEUPLOIDETRANSFORMACIÓN NORMAL TRANSFORMADATUMORIGENICIDAD NO SÍ

DEPENDENCIA DE ANCLAJE SÍ NOINHIBICIÓN POR CONTACTO SÍ NO

LIMITACIÓN DE CRECIMIENTO POR DENSIDAD

SÍ NO

MANTENIMIENTO CÍCLICO POSIBILIDAD QUIESCENCIA

REQUERIMIENTOS DE SUERO ELEVADOS BAJOSEFICIENCIA DE CLONAJE BAJA ELEVADAMARCADORES ESPECÍFICOS DE

TEJIDOCROMOSOMALES, ENZIMÁTICOS, ANTIGENICOS

FUNCIONES ESPECIALIZADAS SE MANTIENEN SE SUELEN PERDERTASA DE CRECIMIENTO BAJA (24 – 96 H.) RÁPIDA (12- 24 H.)

RENDIMIENTO EN CULTIVO BAJO (MENOR A 105 CÉLS/CM2)

ALTO (MAYOR A 105 CÉLS/CM2)

CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS DE LOS CULTIVOS CELULARES

CURVA DE CRECIMIENTO

ALIMENTACIÓN

SUBCULTIVO

LÍNEA CELULAR CONTINUA O ESTABLE

Línea de células gliales humanas normales

Línea celular contínua de melanoma metastásico

humano

Freq

uenc

yFr

eque

ncy

Diploide: 23 x 2

• Cultivos primarios. • Líneas diploides: 50-80 generaciones. • Líneas celulares continuas: heteroploides. Con crecimiento sin límite.

TIPOS DE CULTIVOS DE CÉLULAS

SOPORTE ÁREA DE CRECIMIENTO

N0 DE CÉLS ADHERENTES X 106

VOLUMEN DE MEDIO (ML)

PLACA 90 MM 49 1 10

PLACA 60 MM 21 0,4 5

PLACA 35 MM 8 0,15 3

24 POCILLOS 2 0,04 1

12 POCILLOS 4,5 0,09 2

6 POCILLOS 9,6 0,2 3 - 4

FRASCO 25 CM2 25 0,5 5 - 10

FRASCO 75 CM2 75 1,5 15 - 30

FRASCO 162 CM2 162 3 30 - 50

TABLA DE GUÍA PARA LA SIEMBRA DE CÉLULAS

Número de células/mL: (L1 + L2 + L3 + L4) x 10000 dilución

HEMOCITOMETRO

BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel) CHO: Epitelio de ovario de hamster chino VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino Etc., etc., etc.

LÍNEAS CELULARES CONTINUAS: ALGUNOS EJEMPLOS

CRIOPRESERVACIÓN DE CULTIVOS

CONGELACIÓN

Alto número de células

Glicerol, DMSO, SFB

Congelación lenta 1 °C /min

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO

TEMPERATURA SUPERVIVENCIA ESTIMADA

Nitrógeno líquido - 196oC Varios años

Nitrógeno gaseoso - 150oC Varios años

Freezer - 80oC Hasta 2 años

DESCONGELACIÓN

Descongelación rápida a 37°C

Sigla Nombre u organismo Ciudad, país Nº de cultivos

ATCC American Type Culture Collection

Minassas, USA ≈800

DSMZ Human and Animal Cell Cultures

Braunschweig, Alemania

≈500

ECACC European Collection of Cell Cultures

Salisbury, Wiltshire, UK

≈1000

GEIMM Instituto Giannina Gaslini Genova, Italia ≈2300

COLECCIONES INTERNACIONALES MÁS IMPORTANTES

EN LA ARGENTINA

• ABAC: Asociación Banco Argentino de Células

– Desde 1987 mantiene y/o administra varias decenas de líneas celulares en distintos centros de investigación.

– Provee células congeladas o en cultivo a cambio de un arancel razonable (U$s 250 + envío por cada botella con una monocapa celular de 75 cm2 de cultivo ).

– Brinda servicios relacionados con los cultivos celulares: detección de Mycoplasma, mantenimiento de células en depósito de nitrógeno líquido, dispone de manuales de la ATCC traducidos que ofrece a la venta, etc.

– www.abac.org.ar

FUENTES DE CONTAMINACIÓN

1.- Ambiente: superficies, polvo, aerosoles, etc. 2.- Operador 3.- Células 4.- Medios y soluciones 5.- Botellas de cultivo, pipetas, etc. 6.- Estufas

CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES

CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES CON BACTERIAS Y

HONGOS

Tipos de contaminación: Bacterias

•Fácil de detectar a microscopía

•Formas motiles (cocos, bacilos..)

•Origina cambios en el pH del medio

•Origina turbidez en el medio

•Control: penicilina/estreptomicina, gentamicina

•No utilizar antibióticos, al menos durante algún tiempo, para su control

•Eliminar los cultivos contaminados

Tipos de contaminación: Hongos

• Fácilmente observables a microscopía o incluso a simple vista.

• No provocan cambios inmediatos en el pH del medio

• Generalmente no son citotóxicos

• Esporas difíciles de detectar

• Blanquecinos, amarillentos o negros

• Control: Anfotericina B (Fungizone) o Nistatina

Tipos de contaminación: Levaduras

• Fáciles de detectar a microscopía

• Partículas redondeadas u ovoides formando cadenas

• No causan cambios rápidos en el pH del medio

• El medio se vuelve turbio

• Pueden causar alcalinización del medio

• Olor típico a pan (¿Quién anda oliendo los cultivos?)

Medio Microorganismo

Temperatura (°C)

Tiempo de observación

(días)

Agar sangre 5% de sangre fresca de conejo desfibrinada

Bacterias y levaduras 37 14

Caldo tioglicolato bacterias 37 14

Caldo tripticasa soja bacterias 37 14

Caldo infusión cerebro corazón

bacterias 37 14

Caldo Sabouraud hongos 37 21

Caldo YM Hongos y levaduras 37 21

Caldo nutritivo con 2% de extracto de levadura

bacterias 37 21

CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES CON BACTERIAS Y

HONGOS

CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES CON

MYCOPLASMA

HOECHST 33258 o con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol)

Tratamiento con tilosina y ciprofloxacina

Virus de la inmunodeficiencia humana Virus de la leucemia L y T humanas Retrovirus endógenos Virus de la Hepatitis B o C Virus Herpes 6 humano Virus Epstein-Barr Hantavirus Virus de la Coriomeningitis linfocítica Hepatitis murina Virus Simianos Virus de la Diarrea Bovina Virus del papiloma Cytomegalovirus

CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES

CON VIRUS

•Observación de ECP •Inoculación de animales •Hemoadsorción •Co-cultivo •PCR •Hibridización de ácidos nucleicos • Fluorescencia •Ultraestructura por ME

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE VIRUS EN CULTIVOS CELULARES

Efecto citopático

Hemoadsorción

CONTAMINACIÓN DE CULTIVOS CELULARES CON OTRAS CÉLULAS EUCARIOTAS

1) INTERESPECÍFICA: por manipulación de células de distintos orígenes

2) INTRAESPECÍFICA: por manipulación de células provenientes de distintos tejidos pero todas del mismo origen

HeLa contamina fibroblastos humanos

Co-cultivo de queratinocitos y fibroblastos

Contaminación cruzada

Precauciones

• Obtener líneas celulares de bancos autorizados o fuentes fiables

• No tener frascos abiertos con más de una línea celular al mismo tiempo.

• Manipular las líneas de crecimiento rápido en solitario y tras otros cultivos.

• No utilizar la misma pipeta o las mismas soluciones para líneas celulares diferentes • Manipular cada línea celular por separado

• No compartir medios de cultivo entre diferentes líneas

• Manipular las líneas celulares con mayor capacidad de proliferación las últimas

• Verificar periódicamente las propiedades del cultivo

• Usar un programa adecuado de almacenamiento

• No aceptar cultivos no seguros, poco caracterizados o sin referencia...

Ya conocemos al enemigo…

¡¡SE PUEDE PREVENIR SI APRENDEMOS A TRABAJAR ADECUADAMENTE!!

Prevención: Manejo de la cabina

Antes de utilizar la cabina

▫ Prender lámpara UV 10 minutos

▫ Apagar la lámpara UV

▫ Encender la luz

▫ Desinfectar las superficies con el desinfectante apropiado

▫ Desinfectar y colocar el material necesario dentro de la cabina

▫ Dejar funcionar el ventilador durante 5-10 min. antes de empezar a trabar

Prevención: Manejo de la cabina

Durante el uso

▫ Colocar el material en la parte posterior

▫ No bloquear rejillas de entrada y salida de aire

▫ Usar técnicas que reduzcan salpicaduras y aerosoles

▫ Las pipetas estériles solo deben tocar el interior de frascos. Ante la duda retirar el material de trabajo estéril.

▫ No realizar movimientos bruscos que rompan el flujo de aire

▫ Uso de mecheros controvertido

Mantenimiento

▫ Diario –Limpiar la superficie de trabajo

▫ Mensual –Limpiar las superficies verticales

▫ Anual –Verificar intensidad de lámpara UV

▫ Descontaminación con formaldehído (gas)

Verificar funcionamiento filtro HEPA y ventilador

Al terminar el trabajo

▫ Mantener encendido el ventilador 5 min

▫ Sacar y descontaminar equipo y materiales

▫ Desinfectar superficies de la cabina

▫ Apagar ventilador y luz

▫ Encender lámpara UV

Encuentre las diferencias!??

PRECAUCIONES

1.- Controlar regularmente los cultivos celulares para la detección precoz de contaminación;

2.- No mantener los cultivos celulares en medios con antibióticos, de rutina;

3.- No intentar la decontaminación;

4.- Poner en cuarentena las líneas celulares nuevas hasta estar seguro de que no están contaminadas;

5.-No compartir medios o soluciones entre distintas líneas celulares y operadores.