Reporte Practica No.8 Determinacion de la concentracion de proteinasMateria: Laboratorio de Biotecnologa Molecular

Unidad Profesional Interdisiplinaria de Ingenieria Campus Guanajuato

Ingeniera BiotecnolgicaLaboratorio de Biotecnologa MolecularPractica 8.- Determinacin de la concentracin de proteinas5BV127/04/2014Hugo Ramrez Rodrguez 2011660475Juan Cristbal Garca Garca 2012660213Jos Gilberto Savi Tejeda 2012660319Ricardo Rafael Marn Mosqueda 2010660234Erick No Soto Martnez 2011660270

ResultadosPara estimar la concentracin de protenas presentes en una muestra problema mediante el ensayo Bradford, se realizaron diluciones de un stock de albmina de suero bovino (BSA) de 1mg/mL, estas diluciones se utilizaron para la construccin de una curva estndar, leyendo las diluciones y la muestra problema a una absorbancia de 595 nm.

Tabla 1. Lectura de Absorbancia para la curva de calibracin para la concentracin de albuminaConcentracin de albumina (mg/mL)Absorbancia a 595nm

0.3157-0.152

0.5-0.057

10.306

Se realiz una regresin lineal con el software estadstico minitab 17 para la construccin de una curva estndar.

Figura 1. Curva de calibracin para la concentracin de Albumina BSA

Si se despeja la ecuacin de la recta obtenida es posible realizar una estimacin de una muestra problema. Ecuacin 1

La muestra problema se midi por triplicado en un espectrofotmetro UV a una absorbancia de 595 nm, obteniendo los siguientes resultados.

Tabla 2. Lectura de absorbancia de la concentracin de la muestra probemaMuestra Problema Absorbancia a 595 nm por triplicado.

Lectura 10.435

Lectura 20.423

Lectura 30.458

Promedio0.4387

Desviacin Estndar0.0178

Discusin de Resultados

Tabla 3. Cuadro comparativo entre diversas tcnicas para la cuantificacin de protenas Mtodo Ventajas Inconvenientes

Mtodos de absorcinNo se pierden las muestrasInterfieren muchos compuestos que absorben en el UV

MtodoVentajasInconvenientes

Mtodos derivados Colorimtricos

BiuretBastante especfico para protenas.Muestra con pocas Interferencias. Mtodo econmico.

Tiene poca sensibilidad.

LowryMuy sensible Menos afectado por la turbidez. Mtodo relativamente simple se puede completar en 1 a 1.5 horas.

No todas las protenas reaccionan igual. La muestra puede tener interferencias con varios compuestos como detergentes no inicos, sulfato de amonio etc.

BradfordMtodo muy sensible a bajas concentraciones de protena.

La muestra puede tener interferencias con detergentes y soluciones bsicas.

BCAEs el mtodo mas sensible.Es el que presenta menos interferencias con la muestra.El color no es estable con el tiempo. Los azcares reductores interfieren con la reaccin. La respuesta en la absorbancia no es lineal

Mtodos derivados Fluorimtricos

o-ftalaldehidoMuy sensibleInterferencia de aminas contaminantes en la muestra No todas las muestras reaccionan igual

(Fernandez, 2002)1

El ensayo de Bradford es un mtodo de determinacin de protena que consiste en la unin del colorante Coomassie Brilliant Blue G- 250 a las protenas. (Bradford, 1976)2El colorante existe en tres formas: catinico ( rojo) , neutro ( verde ), y aninico (azul). En un medio cido, el colorante es predominantemente en forma catinica roja doblemente protonado (Amax = 470nm) . (Compton y Jones 1985)3Sin embargo , cuando el colorante se une a la protena, esta se convierte en una forma no protonada azul estable ( Amax = 595 nm ) (Reisner et al.1975 , Fazekes de St. Groth et al . 1963 , Sedmack y Grossberg 1977)4,5,7

Esta forma de protena - colorante azul es la que se detecta a 595 nm en el ensayo utilizando un espectrofotmetro.

Spector (1978) encontr que el coeficiente de extincin de una solucin del complejo del colorante con albmina BSA fue constante en una gama de concentracin de 1 g/mL hasta 15g/mL de albmina BSA. Por lo tanto, la ley de Beer se puede aplicar para la cuantificacin exacta de la protena mediante la seleccin de una relacin adecuada de volumen de colorante para la concentracin de la muestra. (Spector,1978)8Ciertos interacciones qumicas con el colorante pueden interferir con el ensayo. La interferencia de compuestos no protenicos se debe a su capacidad de cambiar los niveles de equilibrio del colorante entre las tres especies de colores. Las fuentes conocidas de interferencia, tales como algunos detergentes, flavonoides, y tampones bsicos de protenas, estabilizan el colorante neutro verde ya sea por la unin directa con el colorante o por un cambio en el pH impidiendo la reaccin de coloracin. (Compton y Jones 1985, Fanger 1987)3,4

Figura 2.- Curva de calibracin para un ensayo Bradford donde se muestra la regin de concentracin que mejor se comporta de acuerdo a la Ley de Lambert Beer.Los valores de concentracin para realizar la curva de calibracin y de la muestra problema no se encuentran dentro de la regin que mejor se comporta de acuerdo a la Ley de Lambert Beer, por lo que es necesario un ajuste estadstico que mejor se adapte a los resultados, por otro lado los resultados obtenidos para las primeras dos mediciones de la curva de calibracin son valores negativos lo cual indica un error.Con lo mencionado, el presunto motivo por el cual se obtuvieron lecturas errneas fue por la presencia de restos de detergentes en los materiales usados durante la sesin, pudiendo estar principalmente contaminados los tubos de ensaye y probablemente las celdas donde se colocaron las muestras para ser analizadas o bien estas se encontraban en malas condiciones. En el caso particular de los resultados obtenidos en las mediciones de la muestra problema, se puede observar que se encuentran dentro del rango de sensibilidad que cita Fernandez (2002), por lo cual se descartan posibles problemas de contaminacin con detergentes que pudieran interferir en las lecturas de la muestra problema.

Se realiz una estimacin de una curva estndar ideal utilizando una relacin proporcional tomando como referencia el valor positivo (0.306) de absorbancia a 595nm obtenido para una concentracin de 1 (mg/mL) de albumina.

Figura 3. Curva de calibracin ficticia basada en la lectura positiva obtenida experimentalmente

Se realizo un despeje de la ecuacin obtenida para poder estimar la concentracin de la muestra problema a partir de la absorbancia.

Ecuacin 2El anlisis de regresin lineal es una tcnica estadstica utilizada para estudiar la relacin entre variables.Cabe destacar que la estimacin realizada no tiene validez estadstica, debido a que no se puede realizar una regresin lineal asumiendo una relacin proporcional y=mx+b con un solo valor como variable de respuesta.Se compararon nuestros resultados con los obtenidos del estudio Plasmid vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergillus niger donde realizan un ensayo Bradford debido a la dificultad para medir la densidad ptica del hongo, ya que crece en estructuras complejas, son pesados y unicelulares. Por lo tanto optaron por la medicin de extractos de protenas del hongo.Para el ensayo de Bradford realizaron una serie de diluciones estndar con concentraciones conocidas de albmina de suero bovino (BSA) se realizaron con el fin de determinar las concentraciones de las protenas. (Storm, 2005)9Tabla 4. Tabla de concentraciones de la curva de calibracin del estudio Plasmid Vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergilus nigerStandardL standardL dH2OConcentration

Std 1300 L stock1200L2 mg/ml

Std 2200 L stock1000L1,67mg/ml

Std 3700 L Std 1700L1 mg/ml

Std 4700 L Std 2700L0 mg/ml

Std 5700 L Std 3700L0,5 mg/ml

Std 6700 L Std 4700L0 mg/ml

Std 7700 L Std 5700L0.25mg/ml

Std 8700 L Std 7700L0,125mg/ml

Std 9-700L0 mg/ml

Figura 4. Curva de calibracin del estudio Plasmid Vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergilus niger

Donde la ecuacin despejada para conocer la concentracin utilizando la absorbancia de una muestra problema es la siguiente.

Ecuacin 3

Tabla 5. Comparacin de los resultados obtenidos en el laboratorio con los obtenidos del estudio Plasmid Vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergilus niger

Origen de la curva estndarEcuacin ObtenidaConcentracin estimada de la muestra problema en mg/mL.(Valor Promedio)

Curva obtenida en el laboratorio.

R2=0.9911.20

Curva ficticia construida con el valor de absorbancia positivo.

R2=11.433

Curva del trabajo Plasmid vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergillus nigerR2=0.996

1.071

Conclusiones

No es posible realizar una estimacin correcta de la muestra problema con el ajuste de la curva estndar obtenida, debido a que se obtuvieron valores de absorbancia negativos y el numero de diluciones es muy reducida como para realizar una curva estndar con validez estadstica, sin embargo al hacer uso de la curva estndar de (Storm, 2005)9, se logr estimar que la concentracin de la muestra problema es de 1.071 mg/mL.Cuestionario1. Menciona que rango de concentracin de protenas puedes detectar en el mtodo de Lowry, si la muestra se lee a una longitud de onda de 500, 660 y 750 nm.

El mtodo de Lowry posee diversos grados de sensibilidad dependiendo de la longitud de onda a la cual se analice la muestra (Badui, 1999).A una longitud de onda de 550 nm el mtodo presenta una baja sensibilidad permitiendo as detectar nicamente concentraciones de protenas elevadas (Storch, 2000), el rango va de 100-2000 mg/mL o en su defecto, de 25 a 100 mg de protena (M. Walker, 2002)A una longitud de onda de 750 nm el mtodo presenta una alta sensibilidad por lo que es posible detectar bajas concentraciones de protena (Storch, 2000), para un rango de concentraciones menores a 500 mg/mL o en su defecto, de 1 a 2 mg de protena (M. Walker, 2002)A una longitud de onda de 660 nm el mtodo presenta su mximo de absorbancia y por ende es la longitud de onda ms empleada, pues pues incrementa el rango de identificacin de las protenas (Hall, 1996), sin embargo, al no presentar la misma sensibilidad que a 750 nm diversos compuestos no proteicos pueden interferir en la lectura. A esta longitud se puede detectar protenas en un rango de 2 a 30 mg (Universidad del Quindio, 2010).

2. Menciona ventajas y desventajas en el uso del mtodo de Lowry.

Ventajas Es ms sensible que muchos mtodos como el de Biuret (50-100 veces) o absorcin de rayos UV a 280 nm (10-20 veces). Es ms especfico. Relativamente simple debido a que se puede llevar a cabo en un tiempo corto. Es menos afectado por la turbiedad de la muestra

Desventajas El color vara con diferentes protenas. El color no necesariamente es proporcional a la concentracin de protenas. Puede tener interferencia con varios compuestos como lo son azcares reductores (Nielsen,2010).

3. Escribe el fundamento de los mtodos de Bradford y el cido bicinconnico (BCA) utilizados en la determinacin de la concentracin de protenas.

El mtodo de Bradford se basa en la unin no covalente de la forma aninica del colorante Azul de Coomassie G-250 con la protena. El colorante reacciona principalmente con los residuos de Arginina, los cuales poseen una cadena cargada positivamente, y tiene pequeas interacciones con otros residuos bsicos (Histidina y Lisina) y residuos aromticos (Tirosina, Triptfano y Fenilalanina). En ausencia de protena el colorante es de color rojo plido y, una vez se une a la protena, se forma una coloracin azul con una absorbancia mxima a 590 nm a la cual se realiza la lectura en el espectrofotmetro.

Figura 5. Estructura del azul de coomassie(Mikkelsen & Cortn, 2004)

El mtodo del cido bicinconnico (BCA) es tambin conocido como el mtodo de Smith y se basa en el uso de este reactivo. El BCA en la forma de una sal de sodio es soluble en agua, estable y altamente especfico y un reactivo sensible a a iones de en solucin alcalina. Es similar al mtodo de Lowry en el sentido de que en solucin alcalina, , los enlaces peptdicos y los residuos de principalmente Cistena, Cistina, Triptfano y Tirosina reaccionan con los iones de y los reducen a (Reaccin de Biuret). Entonces el forma un complejo con 2 molculas de BCA para producir un color prpura el cual es soluble en agua y tiene una fuerte absorbancia a 562 nm.

Figura 6. Reaccin del mtodo del BCA (Hall, 1996)

4. Menciona que compuestos pueden interferir en el ensayo de Lowry y en el ensayo de Bradford.

Existen varios compuestos que pueden causar interferencia dependiendo de su concentracin y su efecto sobre el reactivo que ayuda en la cuantificacin, sin embargo, solo se han caracterizado algunos de ellos , por lo que solo se mencionarn algunos de ellos. Bradford; Detergentes inicos y no inicos (Triton y SDS) (Nielsen,2010). Tris Glicina Acetato de Sodio Bicarbonato de Sodio Glucosa Urea Azida de Sodio EDTA 2-Mercaptoetanol Acido Ascrbico Acetona Etanol Metanol (Sigma,2012)Lowry; Glucosa Sacarosa Sulfato de Amonio Tris Fosfato de Sodio Glicina Urea Cloruro de Sodio Azida de Sodio cido clorhdrico Hidrxido de Sodio EDTA (Hall,1996)

Referencias 1. Fernndez, E. (2002). Mtodos para la cuantificacin de protenas. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales. Espaa

2. Bradford MM (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, 248254

3. Compton SJ and Jones CG (1985), Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay, Anal Biochem 151, 369374

4. Fanger B (1987), Adaptation of the Bradford protein assay to membrane-bound proteins by solubilizing in glucopyranoside detergents, Anal Biochem 162, 1117

5. Fazekas St. Groth S et al. (1963), Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips, Biochim Biophys Acta 71, 377391

6. Reisner AH et al. (1975), The use of Coomassie Brilliant Blue G-250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels, Anal Biochem 64, 509516

7. Sedmak JJ and Grossberg SE (1977), A rapid, sensitive and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blue G-250, Anal Biochem 79, 544552

8. Spector T, (1978) Refinement of the Coomassie blue method of protein quantitation. A simple and linear spectrophotometric assay for less than or equal to 0.5 to 50 micrograms of protein, Anal Biochem 86, 142146

9. Storm R, et al. (2005), Plasmid vectors for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergillus niger, El Sevier, Plasmid 53, 191204

Referencias Cuestionario

1. Badui, S. (1999). Qumica de los Alimentos. Mxico: Pearson Educacin.2. Hall, G. (1996). Methods of Testing Protein Functionality. Great Britain: Chapman and Hall.

3. Fernndez, E. (2002). Mtodos para la cuantificacin de protenas. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales. Espaa4. M. Walker, J. (2002). The Protein Protocols Handbook. New Jersey: Humana Press.

5. Mikkelsen, S., & Cortn, E. (2004). Bioanalytical Chemistry. New Jersey: John Wiley & Sons.

6. Nielsen, S. (2010). Food Analysis, 4th Edition. Indiana, USA: Springer.7. Sigma. (s.f.). Bradford Reagent Technical Bulletin. Recuperado el 25 de Abril de 2014, de http://www.chem.uky.edu/courses/che554/1_Photometry/SigmaBulletin_b6916bul.pdf8. Storch, W. (2000). Inmunofluorescence in clinical inmunology: a primer and atlas. Boston: Birkhauser.

9. Universidad del Quindio. (2010). Laboratorio de Bioqumica: una visin prctica. Colombia: Universidad del Quindio.

10. Zor, T., & Selinger, Z. (1995). Linearization of the Bradford Protein Assay Increases Its Sensitivity: Theoretical and Experimental Studies. Analytical Biochemestry .Pgina 1