caracterizaciÓn funcional del transportador abcg2 de … · 2016-11-25 · empleadas para...
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CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DEL TRANSPORTADOR ABCG2 DE
LEISHMANIA MAJOR
Director de Tesis Dr. Francisco Gamarro Conde.
Memoria presentada por el licenciado David León Guerrero para optar al
grado de doctor por la Universidad de Granada
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Universidad de Granada
Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra” Consejo Superior de Investigaciones Científicas.
Editor: Universidad de Granada. Tesis DoctoralesAutor: David Le·n GuerreroISBN: 978-84-9125-748-6URI: http://hdl.handle.net/10481/43490
Imagen de la cubierta: Ensayo de interacción parásito/célula. Macrófagos peritoneales de ratón
teñidos con FM-464 y parásitos dominantes negativos marcados con Cell Tracker Green,
observados mediante un microscopio Confocal Leyca SP5.
D. FRANCISCO GAMARRO CONDE, Investigador Científico del Consejo Superior
de Investigaciones Científicas,
CERTIFICA:
Que el trabajo titulado “Caracterización funcional del transportador ABCG2 en
Leishmania major” ha sido realizado bajo su dirección en el Departamento de
Bioquímica y Farmacología Molecular del Instituto de Parasitología y Biomedicina
“López-Neyra” (C.S.I.C.) de Granada, por David León Guerrero, licenciado en
Biología por la Universidad de Granada, para optar al grado de doctor por esta misma
Universidad.
Fdo. Dr. Francisco Gamarro Conde
Investigador Científico del C.S.I.C.
Esta Tesis Doctoral se ha realizado en el Departamento de Bioquímica y Farmacología
Molecular del Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra” (C.S.I.C.) de
Granada, y ha sido financiada con una beca predoctoral de Formación de Profesorado
Universitario (F.P.U.) del Ministerio de Educación y Ciencia (2009-2013), dentro del
Proyecto de Investigación Científica y Desarrollo Tecnológico, Programa Nacional de
Biomedicina. Referencia: SAF2009-07440 y titulado: “Caracterización de nuevos
transportadores ABC en Leishmania: su implicación en infectividad y resistencia a
nuevos fármacos”.
Las asistencias a congresos nacionales se han podido realizar gracias a becas concedidas
por la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (SEBBM),
Parte de los resultados de esta Tesis Doctoral han sido publicados en:
Campos-Salinas* J, León-Guerrero D*, González-Rey E, Delgado M, Castanys S,
Pérez-Victoria JM, Gamarro F. (2013). LABCG2, a new ABC transporter implicated
in phosphatidylserine exposure, is involved in the infectivity and pathogenicity of
Leishmania. PLoS Negl Trop Dis. 7: 2179.
* Ambos autores comparten autoría en el trabajo.
A mis padres
A Virginia
Nuestra recompensa se encuentra en el esfuerzo y no en el resultado. Un
esfuerzo total es una victoria completa. M. Gandhi.
ÍNDICE
Índice
195
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................... 1
GENERALIDADES .................................................................................... 1
1.1. La leishmaniasis: un problema sanitario mundial .................................................. 1
1.2 La leishmaniasis canina (LCan) .............................................................................. 3
1.3 Coinfección Leishmania-VIH ................................................................................. 4
1.4. Manifestaciones clínicas de la leishmaniasis en humanos ..................................... 7
1.4.1. Leishmaniasis cutánea (LC) ............................................................................ 7
1.4.2. Leishmaniasis Mucocutánea (LMC) ............................................................... 8
1.4.3. Leishmaniasis visceral o “Kala-azar” (LV) .................................................... 8
1.5. Agente etiológico: El parásito Leishmania ............................................................ 9
1.6. Ciclo biológico del parásito Leishmania ............................................................. 11
1.7. Establecimiento de la infección ........................................................................... 12
1.8. Implicación de la fosfatidilserina en la interacción y/o invasión del parásito
Leishmania con su célula hospedadora ....................................................................... 15
1.9. Respuesta inmunológica del hospedador vertebrado ........................................... 18
1.9.1. Evasión de la respuesta inmune por el parásito Leishmania ......................... 20
1.10. Diagnóstico ........................................................................................................ 23
1.11. Tratamiento ........................................................................................................ 24
1.11.1. Desarrollo de vacunas contra la leishmaniasis ............................................ 24
1.11.2. Fármacos leishmanicidas............................................................................. 26
1.11.3. Otros fármacos empleados en el tratamiento de la leishmaniasis ............... 31
1.12. Biología y bioquímica del parásito .................................................................... 33
Organización genómica del parásito Leishmania .................................................... 33
Kinetoplasto ............................................................................................................ 36
Acidocalcisomas...................................................................................................... 36
Glicosomas .............................................................................................................. 37
Componentes de la membrana de Leishmania ........................................................ 38
Tráfico vesicular en el parásito Leishmania: Fenómenos de endocitosis y
exocitosis ................................................................................................................. 41
Translocación de lípidos en Leishmania ................................................................. 44
i
Índice
196
2. TRANSPORTADORES ABC .............................................................. 46
2.1. Organización estructural ...................................................................................... 47
2.2. Mecanismo de acción ........................................................................................... 49
2.3. Transportadores ABC en tripanosomátidos ......................................................... 51
2.3.1. Transportadores ABC en Leishmania ........................................................... 51
Subfamilia ABCA ................................................................................................... 53
Subfamilia ABCB ................................................................................................... 55
Subfamilia ABCC ................................................................................................... 56
Subfamilia ABCG ................................................................................................... 58
2.3.2. Transportadores ABC en otros tripanosomátidos ............................................. 62
II. OBJETIVOS. ........................................................................................ 64
III. MATERIALES Y MÉTODOS. ......................................................... 66
1. MATERIALES. ..................................................................................... 66
1.1. Líneas celulares. ................................................................................................... 66
1.2. Medios de Cultivo para Leishmania. ................................................................... 66
1.3. Medio de congelación para Leishmania. ............................................................. 67
1.4. Antibióticos de selección para Leishmania. ........................................................ 67
1.5. Medios de cultivo para bacterias. ........................................................................ 68
1.5.1. LB líquido. .................................................................................................... 68
1.5.2. LB Agar. ........................................................................................................ 68
1.6. Medio de congelación para bacterias. .................................................................. 68
1.7. Tampones y soluciones generales. ....................................................................... 68
1.8. Tampones de carga para electroforesis de proteínas. ........................................... 69
1.9. Soluciones y reactivos para electroforesis de proteínas. ...................................... 69
1.10. Soluciones y reactivos para Southern blot. ........................................................ 69
1.11. Vectores plasmídicos y construcciones. ............................................................ 70
1.11.1. Vectores de clonaje. .................................................................................... 70
1.11.2. Vectores de expresión para Leishmania. ..................................................... 71
1.12. Oligonucleótidos. ............................................................................................... 72
1.12.1. Oligonucleótidos empleados para el clonaje de ABCG1 y ABCG2 en
vectores de expresión para Leishmania. .................................................................. 72
1.12.2. Oligonucleótidos utilizados en la mutagénesis de ABCG2. ........................ 72
1.12.3. Oligonucleótidos empleados para el análisis de la expresión de ABCG1 y
ABCG2 mediante RT-PCR en parásitos transfectados. ........................................... 72
ii
Índice
197
1.12.4. Oligonucleótidos empleados para la construcción del cassette utilizado en la
generación de parásitos mutantes nulos para ABCG1 y ABCG2 mediante
recombinación homóloga. ....................................................................................... 73
1.12.5. Oligonucleótidos empleados para la obtención de sondas de ADN
empleadas para confirmar la deleción de los genes ABCG1 y ABCG2. ................. 73
1.13. Reactivos para el estudio funcional del transportador ABCG2 de L. major. .... 74
1.14. Sondas empleadas para el marcaje de los orgánulos subcelulares de Leishmania.
.................................................................................................................................... 75
1.15. Reactivos para la inmunodetección mediante Western blot y citometría de flujo.
.................................................................................................................................... 76
1.16. Reactivos utilizados en biología molecular. ...................................................... 77
2. MÉTODOS ............................................................................................ 79
2.1. Parásitos. .............................................................................................................. 79
2.1.1. Cultivo in vitro de Leishmania. ..................................................................... 79
2.1.2. Criopreservación y descongelación de parásitos. .......................................... 79
2.1.3. Transfección de parásitos mediante electroporación. ................................... 80
2.1.4. Ensayos de viabilidad celular en Leishmania mediante el método
colorimétrico MTT. ................................................................................................. 81
2.2. Bacterias. .............................................................................................................. 82
2.2.1. Cultivo de bacterias. ...................................................................................... 82
2.2.2. Preparación de células competentes y transformación por choque térmico.. 82
2.3. Extracción de ácidos nucleicos. ........................................................................... 83
2.3.1. Aislamiento de ADN genómico de L. major................................................. 83
2.3.2. Aislamiento de ADN plasmídico procedente de cultivos bacterianos. ......... 83
2.3.3. Purificación de ADN procedente de una electroforesis en geles de agarosa. 83
2.3.4. Digestión del ADN con enzimas de restricción. ........................................... 83
2.3.5. Reacción de ligación. .................................................................................... 84
2.4. Amplificación de ácidos nucleicos. ..................................................................... 84
2.4.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). ................................................ 84
2.4.2. RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polimerase Chain Reaction). .................... 85
2.4.3. Mutagénesis dirigida. .................................................................................... 85
2.5. Electroforesis de ADN en geles de agarosa. ........................................................ 85
2.6. Transferencia de ADN mediante Southern blot. .................................................. 86
2.6.1. Marcaje de sondas de ADN para Southern blot con digoxigenina. .............. 86
iii
Índice
198
2.6.2. Hibridación y revelado de ácidos nucleicos mediante sondas marcadas con
digoxigenina. ........................................................................................................... 87
2.7. Electroforesis de proteínas en geles SDS-PAGE e inmunodetección por Western
blot. ............................................................................................................................. 88
2.8. Técnicas para el estudio funcional del transportador ABCG2 de L. major. ........ 89
2.8.1. Clonaje en vectores de expresión. ................................................................. 89
2.8.2. Generación de parásitos mutantes nulos para los genes ABCG1 y ABCG2. . 92
2.8.3. Marcaje de L major con análogos fluorescentes de fosfolípidos de cadena
corta. ........................................................................................................................ 94
2.8.4. Medidas del eflujo de C6 NBDPS en líneas de L major. ............................. 95
2.8.5. Ensayos de unión a Anexina V en Leishmania. ............................................ 96
2.8.6. Infección in vitro de macrófagos peritoneales de ratón con líneas de L major.
................................................................................................................................. 97
2.8.7. Ensayos de interacción inicial parásito/célula. .............................................. 98
2.8.8. Análisis de la expresión de moléculas de superficie: LPG y gp63. .............. 98
2.8.9. Purificación de parásitos metacíclicos. ......................................................... 99
2.8.10. Estudios de colocalización subcelular de ABCG2. ................................... 100
2.8.11. Determinación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las
diferentes fases de crecimiento de las distintas líneas de Leishmania. ................. 100
2.8.12. Susceptibilidad de las distintas líneas de L. major a la lisis mediada por
complemento. ........................................................................................................ 101
2.8.13. Estudio de la infección in vivo de diferentes líneas de L. major en un
modelo murino de leishmaniasis. .......................................................................... 101
IV. RESULTADOS ................................................................................. 103
1. Características de la secuencia génica del transportador ABCG2. ....................... 103
2. Caracterización funcional del transportador ABCG2 en L. major. ...................... 106
2.1. ABCG2 está involucrado en la exposición de fosfatidilserina (PS) en la cara
externa de la membrana plasmática de Leishmania .............................................. 107
2.2. Localización subcelular del transportador ABCG2. ...................................... 115
2.3. Los parásitos ABCG2K/M
presentan una menor infectividad en macrófagos
peritoneales............................................................................................................ 119
2.4. El transportador ABCG2 está implicado en el desarrollo de la enfermedad en
un modelo murino de leishmaniasis cutánea. ........................................................ 125
2.5. Generación de parásitos mutantes nulos para los genes ABCG1 y ABCG2. .. 130
iv
Índice
199
2.6. Rescate del fenotipo de parásitos ABCG1ABCG2 mediante transfección de
los genes ABCG1 y ABCG2: Caracterización funcional. ...................................... 133
V. DISCUSIÓN. ....................................................................................... 144
1. Situación actual de la leishmaniasis. ..................................................................... 144
2. Transportadores ABC en Leishmania. .................................................................. 146
3. Implicación de la fosfatidilserina (PS) en el proceso de infección del parásito
Leishmania. ............................................................................................................... 148
4. Caracterización funcional del transportador ABCG2 de Leishmania major. ....... 153
4.1. Mutante dominante negativo para ABCG2. ................................................... 153
4.2. Parásitos mutantes nulos para ABCG2. ......................................................... 164
VI. CONCLUSIONES. ........................................................................... 168
VII. BIBLIOGRAFÍA. ............................................................................ 171
Anexo I ...................................................................................................... 194
Campos-Salinas J, León-Guerrero D, González-Rey E, Delgado M, Castanys S,
Pérez-Victoria JM, Gamarro F. (2013). LABCG2, a new ABC transporter
implicated in phosphatidylserine exposure, is involved in the infectivity and
pathogenicity of Leishmania. PLoS Negl Trop Dis. 7: 2179. .............................. 194
v
RESUMEN
Resumen
Una gran parte de las enfermedades tropicales están ocasionadas por protozoos parásitos
de la familia trypanosomatidae. Entre estas enfermedades, la leishmaniasis es la que
más muertes provoca tras la malaria, por lo que se ha convertido en una prioridad para
la Organización Mundial de la Salud. No existen vacunas eficaces contra esta
enfermedad y solo hay un reducido arsenal de fármacos disponible; siendo necesaria la
búsqueda de nuevos fármacos y nuevas dianas terapéuticas frente al parásito. Los
transportadores ABC (ATP-binding cassette), implicados en funciones fisiológicas
relevantes para el parásito Leishmania como el transporte de fosfolípidos, resistencia a
fármacos e infectividad, podrían constituir dianas terapéuticas de interés.
El genoma de Leishmania contiene 42 genes que codifican para proteínas ABC,
agrupadas en 9 subfamilias (desde ABCA hasta ABCI). La subfamilia ABCG de
Leishmania engloba a 6 transportadores: ABCG1-ABCG6, de los que sabemos que
ABCG4, ABCG5 y ABCG6 están implicados en el tráfico de fosfolípidos y de hemo,
así como en la resistencia a fármacos.
En esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio y caracterización funcional del
transportador ABCG2 de Leishmania major, perteneciente a la subfamilia ABCG. Para
el estudio funcional del transportador se obtuvieron parásitos mutantes (por cambio de
una lisina por una metionina en la posición 108 del motivo Walker A del dominio de
unión a nucleótidos), que expresan un fenotipo dominante negativo para ABCG2
(ABCG2K/M), y parásitos mutantes nulos para ABCG2 y su repetición en tándem
ABCG1 (∆ABCG1+G2).
Puesto que algunos de los transportadores de la subfamilia ABCG están implicados en
el transporte de fosfolípidos, los cuales son esenciales para la fisiología del parásito,
realizamos un ensayo de acúmulo de fosfolípidos en los parásitos dominante negativo y
mutantes nulos para ABCG2. Los parásitos dominantes negativos ABCG2K/M presentan
una disminución en la translocación de análogos fluorescentes de cadena corta de
fosfatidilserina. Este fenotipo dominante negativo es específico para fosfatidilserina
(PS), ya que el transporte de los análogos fluorescentes de fosfatidilcolina,
fosfatidiletanolamina y esfingomielina no se vio afectado. Este mismo fenotipo se
obtuvo en los parásitos mutantes nulos ∆ABCG1+G2. Los ensayos de Anexina V-Alexa
Flúor 488 demuestran que los parásitos dominantes negativos ABCG2K/M presentan una
i
Resumen
menor exposición de PS en la cara externa de la membrana plasmática en fase
estacionaria de crecimiento al compararlo con los parásitos control.
La PS se expone en la cara externa de la membrana plasmática de células que entran en
apoptosis. El reconocimiento de la PS es la principal señal a través de la cual los
cuerpos apoptóticos son reconocidos vía el receptor de PS (PSR) del macrófago. La
exposición temporal de PS en la cara externa de la membrana plasmática del parásito es
uno de los mecanismos empleados por las formas intracelulares (amastigotes) y
promastigotes metacíclicos del parásito para infectar al macrófago y silenciar su
respuesta citotóxica.
En base a todos los resultados anteriores, nos propusimos estudiar la infección de
macrófagos peritoneales de ratón con las diferentes líneas de parásitos: control,
dominantes negativos ABCG2K/M y mutantes nulos ∆ABCG1+G2. Los resultados
muestran que los parásitos dominantes negativos ABCG2K/M y mutantes nulos
∆ABCG1+G2 son menos infectivos que los parásitos control; por tanto, la menor
expresión de PS en la superficie del parásito juega un papel relevante en el proceso de
infección.
Para corroborar que las diferencias en infectividad no sean debidas a alteraciones en el
crecimiento y/o desarrollo de los parásitos, procedimos a la purificación de metacíclicos
de parásitos controles y dominantes negativos ABCG2K/M usando la lectina de cacahuete
(PNA). Observamos que no existen diferencias significativas a nivel del porcentaje de
metacíclicos purificados en ambas líneas; igualmente, estos parásitos metacíclicos
presentan una morfología y movilidad idéntica en ambas líneas de parásitos. Para
afianzar el resultado anterior, realizamos un Western blot frente a la proteína HASPB,
específica de parásitos metacíclicos y amastigotes; no observándose diferencias en la
expresión de esta proteína en los parásitos controles y dominantes negativos ABCG2K/M
En el caso de los parásitos mutantes nulos ∆ABCG1+G2, observamos que presentan un
porcentaje de recuperación de metacíclicos muy inferior al obtenido con los parásitos
control (salvajes) y parásitos mutantes nulos ∆ABCG1+G2 cotransfectados con ABCG1
y ABCG2; sin embargo, la expresión de la proteína HASPB no se vio afectada. Estos
datos sugieren que la eliminación del transportador, o su completa inactivación, condu-
ii
Resumen
ce a un bloqueo en la maduración y/o modificaciones estructurales del lipofosfoglicano
(LPG) que deben producirse en la metaciclogénesis, las cuales son necesarias para
resistir la lisis del complemento en el hospedador vertebrado. Por todo lo anterior, los
parásitos mutantes nulos ∆ABCG1+G2 son aglutinados vía PNA y son más sensibles a
la lisis del complemento de suero humano en la fase estacionaria de crecimiento.
Hemos querido comprobar si las diferencias de infección observadas in vitro se
mantenían en un modelo murino de leishmaniasis cutánea, empleando parásitos
dominantes negativos ABCG2K/M y controles. Los resultados revelan que los ratones
infectados con parásitos dominantes negativos ABCG2K/M presentan una reducida
inflamación y no se aprecian lesiones tisulares al compararlo con los parásitos controles.
En conclusión, nuestros resultados sugieren que la función de ABCG2 es necesaria para
la externalización de la PS en la cara externa de los promastigotes metacíclicos, proceso
necesario para la infección de macrófagos peritoneales de ratón y para el desarrollo y
progresión de la enfermedad en un modelo murino de leishmaniasis.
iii
INTRODUCCIÓN
Introducción
1
1. GENERALIDADES.
1.1. La leishmaniasis: un problema sanitario mundial.
La leishmaniasis es un conjunto de enfermedades causada por diversas especies del
protozoo parásito flagelado Leishmania.
Actualmente se encuentra distribuida por cuatro de los cinco continentes, afectando a 12
millones de personas en todo el mundo y estando presente en 98 países de las regiones
tropicales y subtropicales. La mayoría de los países afectados por leishmaniasis se
encuentran en vías de desarrollo. Se contabilizan alrededor de 2 millones de nuevos casos
al año y existen 350 millones de personas susceptibles de ser infectadas ya que residen en
áreas endémicas. Datos epidemiológicos de la Organización Mundial de la Salud reflejan
que se producen de 0,7 a 1,2 millones de nuevos casos de leishmaniasis cutánea por año.
Diez son las regiones donde se registran el mayor número de casos: Afganistán, Argelia,
Colombia, Brasil, Irán, Siria, Etiopía, Sudán, Costa Rica y Perú. En Bolivia, Brasil y Perú
se da la versión mucocutánea de la enfermedad (Alvar et al. 2012).
En la leishmaniasis visceral (LV), la forma más grave de la enfermedad, se han estimado de
0,2 a 0,4 millones de casos al año, el 90% de los cuales se distribuyen en India,
Bangladesh, Sudán, Brasil, Etiopía y Nepal. Sin tratamiento, la LV causa la muerte.
La leishmaniasis lleva asociada unas 40.000 muertes por año, en base a los datos obtenidos
en los registros hospitalarios; sin embargo, esta información es escasa o inexistente en
muchos países, lo cual dificulta el análisis del impacto real de esta enfermedad.
La leishmaniasis es una enfermedad fundamentalmente zoonótica, propagada por dípteros
hembras del género Phleblotomus en el Viejo Mundo o Lutzomya en el Nuevo Mundo,
que actúan como vectores transmisores de la enfermedad (Figura 1).
Introducción
2
Figura 1: Díptero hembra del género Phleblotomus.
La LV producida por Leishmania infantum es el paradigma de la zoonosis, en la que el
reservorio principal es el perro y el hombre actúa como hospedador accidental al ser
infectado por la picadura del insecto vector.
Recientemente, en el área metropolitana de Madrid se ha producido un brote de
leishmaniasis humana, siendo la liebre (Lepus granatensis) el principal reservorio
transmisor de la enfermedad (Molina et al. 2012; Ruiz-Fons et al. 2013; Jiménez et al.
2013). La amplia presencia de L. infantum en las muestras histológicas de liebres de
distintas regiones de España, y la reciente evidencia de la capacidad de las liebres
naturalmente infectadas de transmitir el parásito al insecto vector (Phlebotomus
perniciosus), sugieren que las liebres pueden tener un importante papel en la epidemiología
de L. infantum en España (Molina et al. 2012; Ruiz-Fons et al. 2013; Jiménez et al. 2013).
Existe un ciclo antroponótico de transmisión de la enfermedad parasitaria en el que el
hombre actuaría de hospedador y reservorio al mismo tiempo. La transmisión antroponótica
puede ser natural y artificial. En la transmisión natural, el parásito se transmite de humano
a humano a través del insecto vector. En la versión artificial del ciclo, la transmisión del
parásito se efectúa a través de jeringuillas que son compartidas entre toxicómanos, que
normalmente presentan coinfección con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
(Alvar et al. 2008).
Introducción
3
Con frecuencia, se ha encontrado en el material de inyección desechado por consumidores
de drogas parenterales, el ADN de L. infantum (Cruz et al. 2002).
El parásito puede transmitirse por vía venérea, congénita, transfusiones de sangre, o a
través de los trasplantes de órganos, formando parte de la transmisión antroponótica
artificial, aunque se producen con baja frecuencia (WHO 2010).
Estos datos demuestran la magnitud epidemiológica de la enfermedad, y la necesidad de
buscar nuevos tratamientos más eficaces y accesibles a las clases más desfavorecidas para
poder luchar contra el parásito.
1.2. La leishmaniasis canina (LCan).
Producida por L. infantum en el continente Euroasiático o Leishmania chagasi en América,
tienen como principal reservorio al perro doméstico. Las altas tasas de infección en áreas
endémicas suponen un mayor riesgo de transmisión del parásito al humano. Existen tres
grandes focos de LCan a nivel mundial: China, la Cuenca Mediterránea y Brasil (Baneth et
al. 2008). Se ha estimado que el número de perros infectados en el Sureste de Europa es de
2,5 millones. En España el 7% de la población canina está afectada, pero existen regiones
de mayor endemicidad como Málaga, donde la incidencia de la enfermedad puede llegar al
35% (Morillas et al. 1996; Aragón et al. 2006).
En el caso de Sudamérica, la incidencia de la LCan es similar a la del continente europeo,
siendo Brasil y Venezuela los países más afectados (Baneth et al. 2008).
Los perros afectados por el parásito presentan diferentes manifestaciones clínicas, entre
ellas: caquexia, dermatitis, úlceras dérmicas, queratoconjuntivitis, epistaxis (hemorragias
nasales), incremento en el grosor de las uñas (onicogrifosis), etc. (Figura 2).
Introducción
4
Para evitar la transmisión del parásito al humano se deben controlar los perros de áreas
endémicas por medio de análisis serológicos preventivos, tratamiento y seguimiento de
perros afectados, eutanasia de perros en fase terminal, etc. Debido a la alta incidencia de la
enfermedad, tiene un gran interés el desarrollo de nuevos fármacos, y vacunas que ayuden a
controlar la expansión del parásito (Wylie et al. 2014).
Figura 2: Manifestaciones clínicas en perros parasitados: a) queratoconjuntivitis, b) lesiones dérmicas
faciales, c) epistaxis (hemorragia nasal), d) onicogrifosis, e) lesión ulcerosa en la oreja. Tomado de
Banet et al. 2008.
1.3. Coinfección Leishmania-VIH.
Los niveles pandémicos del virus del VIH han modificado la epidemiología de la
leishmaniasis.
El primer caso de leishmaniasis asociada a VIH se describió en 1985; posteriormente el
número de coinfecciones publicadas aumentó rápidamente, sobre todo en el sureste de
Europa (Alvar et al. 2008).
Introducción
5
En las últimas décadas, en regiones endémicas para Leishmania como la Cuenca
Mediterránea, India, o el Sudeste de África, se ha producido un solapamiento
epidemiológico con la infección por VIH, debido a la rápida extensión del VIH de regiones
urbanas a rurales en países en vías de desarrollo y a una redistribución del parásito en el
ámbito urbano de dichos países (Okwor y Uzonna, 2013) (Figura 3).
Figura 3: Distribución mundial de la leishmaniasis y de países que notifican coinfección
Leishmania/VIH. WHO 2010.
Debido a la magnitud global del problema, en 1991 la Organización Mundial de la Salud
crea una red global de vigilancia epidemiológica de la coinfección denominada Leishnet.
La expansión viral en áreas de distribución natural del parásito facilita el proceso de
coinfección (Alvar et al. 2008). La infección con VIH aumenta el riesgo de desarrollar LV
de 100 a 2000 veces en áreas endémicas, incrementa el fallo terapéutico y el riesgo de
recidivas (Alvar et al. 2008).
Leishmaniasis
Coinfección Leishmania/ VIH
Introducción
6
Con respecto a España, cabe destacar que presenta una mayor tasa de coinfección que otros
países europeos. La distribución geográfica española de la coinfección, basada en el
número de hospitalizaciones comprendidas en el período de estudio (1997-2008), revela
que las áreas más afectadas son Madrid, Valencia y las Islas Baleares, esto supone un gasto
al Sistema Nacional de Salud español de 1,1 millón de euros al año (Gil-Prieto et al. 2011).
En la región mediterránea son frecuentes los casos de leishmaniasis asintomáticas,
presentando una prevalencia del 15% en Italia, 36% en los Alpes franceses y 46% en las
Alpujarras granadinas; en estas regiones es recomendable el análisis de la población para
evitar que actúen como transmisores del parásito en transfusiones sanguíneas, trasplantes de
órganos, etc. (Gil-Prieto et al. 2011).
En el área mediterránea, las manifestaciones clínicas de la leishmaniasis en pacientes VIH
positivos no difieren de las presentadas en individuos inmunocompetentes, esto se debe al
empleo de una terapia antiretroviral (HAART) eficaz en Europa desde 1997; dicho
tratamiento aumenta la calidad de vida de los pacientes, disminuye el número de
notificaciones de casos de coinfección, y reduce la mortalidad. Se necesitan ensayos
clínicos en la región mediterránea para determinar las opciones terapéuticas más adecuadas
para los pacientes Leishmania/VIH, así como los métodos de profilaxis más idóneos
(Monge Maillo et al. 2014).
En regiones donde la incidencia de la coinfección es muy elevada como India, Etiopía, y
Este de Sudán, el acceso a HAART es muy complicado debido a la situación
socioeconómica de dichos países, dificultando con ello el control epidemiológico de la
coinfección (Alvar et al. 2008).
Se ha demostrado que existe una sinergia entre ambos patógenos en el desarrollo y
evolución de la enfermedad, ya que tanto el parásito Leishmania como el VIH infectan a
células inmunitarias inhibiendo su función defensiva (Okwor y Uzonna, 2013). Los
mecanismos moleculares no se conocen con exactitud, pero estudios experimentales han
demostrado la implicación de Leishmania en la replicación del VIH y en la progresión de la
enfermedad (Okwor y Uzonna, 2013).
Introducción
7
El lipofosfoglicano (LPG) de Leishmania o el núcleo de inositol fosfato donde se ancla a la
membrana el LPG, son capaces de inducir la replicación viral en células T (Okwor y
Uzonna, 2013). Se piensa que las moléculas LPG del parásito interactúan con la célula T
infectada por VIH durante la presentación antigénica entre el macrófago infectado por
Leishmania y la célula T; en dicho proceso se desencadenan rutas bioquímicas complejas
que facilitan la translocación del factor de transcripción NF-kβ al núcleo, favoreciéndose la
replicación del virus (Okwor y Uzonna, 2013).
También se ha demostrado que la infección por VIH favorece la expresión en superficie del
receptor de fosfatidilserina (PS) CD91/LRP-1 en macrófagos humanos, lo que facilita una
mayor fagocitosis del parásito al interaccionar con la PS expuesta en su superficie (Lodge
et al. 2012).
Todos estos resultados experimentales demuestran el complejo vínculo molecular que
existe en la coinfección Leishmania-VIH.
1.4. Manifestaciones clínicas de la leishmaniasis en humanos.
Los principales signos y síntomas de la enfermedad se engloban en tres cuadros clínicos
principales:
1.4.1. Leishmaniasis cutánea (LC).
La LC se produce por múltiples especies de Leishmania como Leishmania infantum,
Leishmania major, Leishmania tropica, Leishmania mexicana, etc. (WHO 2010).
La enfermedad cursa con una lesión dérmica a modo de úlcera que presenta una depresión
central necrótica circundada por un borde turgente; esta lesión también se conoce como”
botón de Oriente”. Pueden aparecer lesiones secundarias o satélites a consecuencia de la
diseminación del parásito. Las principales manifestaciones clínicas son el dolor,
adenopatías, prurito y el desarrollo de infecciones secundarias, fundamentalmente
Introducción
8
bacterianas, debidas a la destrucción que el parásito y el sistema inmune del hospedador
ocasionan a los tejidos (Figura 4A). Las lesiones pueden tardar meses e incluso años en
cicatrizar (David y Craft, 2009; Goto y Lauletta Lindoso, 2012).
1.4.2. Leishmaniasis Mucocutánea (LMC).
Leishmaniasis típica de la región del Amazonas, se produce frecuentemente por Leishmania
braziliensis y Leishmania amazonensis (WHO 2010).
La infección se inicia con una o varias lesiones dérmicas que pueden curar de forma
espontánea. La diseminación del parásito a las mucosas va a depender de la virulencia del
parásito, estado nutricional del individuo y de la inmunocompetencia del mismo. Los
principales síntomas son epistaxis, edema bucal, gingivitis, periodontitis, perforación del
septo nasal, ulceración palatal, etc. (David y Craft, 2009; Goto y Lauletta Lindoso, 2012).
La progresión de la enfermedad puede terminar con la destrucción de la mucosa
nasofaríngea y la eliminación de los cartílagos faciales, lo que conlleva a la generación de
deformidades que estigmatizan al individuo. Una lesión muy característica de este tipo de
leishmaniasis es la “nariz de tapir” que ocurre como consecuencia de la destrucción del
septo nasal (Figura 4B).
1.4.3. Leishmaniasis visceral o “Kala-azar” (LV).
La LV se produce por Leishmania infantum y Leishmania donovani, y la infección implica
la afectación de todo el sistema mononuclear fagocítico del hospedador vertebrado, a través
del cual el parásito migra hacia órganos internos donde se multiplica activamente. El
período de incubación puede ser de varias semanas o meses y la sintomatología es muy
diversa apareciendo caquexia, fiebre, oscurecimiento de la piel (de ahí el término hindú de
Kala-azar o fiebre negra), además se desarrollan los denominados fenómenos “megas”
como hepato y esplenomegalia, distensión abdominal, hipergammaglobulinemia,
linfoadenopatía, anemia, pancitopenia, etc. (Figura 4C). Es una enfermedad muy grave
causando la muerte sin tratamiento. Pueden darse casos de manifestaciones subclínicas y de
Introducción
9
curación espontánea (WHO 2010). La reactivación de la LV por una curación no efectiva
se conoce como leishmaniasis Post Kala-azar y cursa a modo de lesiones nodulares en la
piel con alta capacidad de diseminación (Singh et al. 2012) (Figura 4D).
Figura 4: Manifestaciones clínicas de la leishmaniasis cutánea (4A), mucocutánea (4B), visceral (4C) y
post Kala-azar (4D).
1.5. Agente etiológico: el parásito Leishmania.
Leishmania es un protozoo flagelado parásito perteneciente al Orden Kinetoplastida,
Familia Trypanosomatidae y Género Leishmania (Figura 5). A través del uso de las
B
C
A
D
Introducción
10
técnicas de biología molecular y análisis genéticos se han descrito 30 especies de
Leishmania, de las cuales aproximadamente 20 son patógenas para humanos; sin embargo,
el estatuto taxonómico de muchas de ellas está en discusión. En base a recientes estudios de
marcadores moleculares como la proteína de 20 kDa heat-shock-protein (hsp20) y hsp70 se
ha obtenido una clasificación filogenética molecular más precisa (Fraga et al. 2010; Fraga
et al. 2013). Dichos estudios proponen agrupar las distintas especies o complejos de
Leishmania de la siguiente forma: 1) Subgénero Leishmania que incluye a L. major, L.
tropica, L. aethiopica, L. mexicana y L. donovani. En el complejo L. donovani se incluyen
dos especies: L. donovani idéntica a L. archibaldi y L. infantum indistinguible de L.
chagasi, y 2) Subgénero Viannia con L. lainsoni, L. naiffi, L. guyanensis y L. braziliensis.
L. braziliensis; está formada por dos subespecies L. b. braziliensis y L. b. peruviana (Fraga
et al. 2013).
Figura 5: Clasificación taxonómica del parásito Leishmania.
Introducción
11
1.6. Ciclo biológico del parásito Leishmania.
Leishmania presenta un ciclo biológico digenético con dos formas diferentes en cuanto a su
morfología y bioquímica. El promastigote (Figura 6A), es una forma alargada, flagelada y
móvil; estas formas se desarrollan en el tracto digestivo de dípteros hembras de la familia
Phlebotomida o Lutzomya. La forma amastigota (Figura 6B), no flagelada, intracelular,
se desarrolla en células del sistema fagocítico del hospedador vertebrado.
Figura 6: Formas promastigotas extracelulares (A) y formas amastigotas de Leishmania (indicadas
mediante flechas) en el interior de un macrófago (B).
El ciclo se inicia cuando hembras parasitadas del insecto vector inoculan las formas
infectivas o promastigotas metacíclicas del parásito al picar al hospedador vertebrado; estas
formas metacíclicas son fagocitadas por células del sistema mononuclear del mamífero. En
el interior del fagosoma, el parásito sufre una profunda transformación y origina la forma
amastigota, la cual se divide por fisión binaria hasta producir la lisis de la célula; dicho
proceso favorece la infección de otros macrófagos próximos, así como de células
fagocíticas ubicadas en otros tejidos tras diseminarse la infección. El ciclo se completa
cuando el insecto vector ingiere sangre donde existen amastigotes libres o macrófagos
parasitados; dichos macrófagos se lisaran en el tracto digestivo del díptero liberándose los
amastigotes que, en aproximadamente 7-10 días, se transforman en promastigotes que serán
inoculados a otro hospedador vertebrado (humanos, cánidos, roedores) (WHO 2010)
(Figura 7).
A B
Introducción
12
Figura 7: Ciclo biológico del parásito Leishmania spp.
(http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Leishmaniasis_life_cycle_diagram_en.sg).
1.7. Establecimiento de la infección.
Dentro del insecto vector, los promastigotes procíclicos se encuentran adheridos a las
microvellosidades intestinales, con ello evitan ser expulsados en la defecación de la sangre
digerida por el flebotomo (Oliveira et al. 2009). Durante el proceso de metaciclogénesis,
los promastigotes procíclicos no infectivos se transforman en metacíclicos o infectivos, en
un proceso dependiente de autofagia y de una remodelación de la superficie del parásito
(Besteiro et al. 2006b; Franco et al. 2012).
Este proceso de diferenciación es crucial para la supervivencia del parásito en el
hospedador vertebrado. Los parásitos procíclicos son sensibles a la lisis del complemento y
al ambiente microbicida del fagolisosoma, mientras que los parásitos metacíclicos son
completamente resistentes a estos mecanismos de defensa. En la metaciclogénesis, el
parásito experimenta cambios moleculares y bioquímicos que le facilitan la invasión del
hospedador vertebrado (Besteiro et al. 2006b; Franco et al. 2012).
Introducción
13
Una vez dentro del mamífero, los parásitos deben evitar su degradación por el sistema
inmune del hospedador, para ello, moléculas como el lipofosfoglicano (LPG) y la
metaloproteasa gp63 de los parásitos metacíclicos juegan un papel fundamental en la
evasión de la respuesta inmune y en la interacción del parásito con los macrófagos. Los
receptores de manosa y fucosa del macrófago se unen a los residuos de manosa del LPG
facilitando la fagocitosis del parásito (Blackwell et al. 1985; Coelho-Finamore et al. 2011;
de Assis et al. 2012). La proteína C reactiva (CRP) tiene la capacidad de unirse al LPG de
los metacíclicos permitiendo su internalización en el macrófago vía CRP receptor
(Bodman-Smith et al. 2002).
Los receptores cr1 y cr3 del macrófago se unen a la proteína gp63 del parásito, la cual actúa
como opsonina favoreciendo la fagocitosis del parásito (Franco et al. 2012). Además gp63
tiene la capacidad de unirse a los receptores de fibronectina del macrófago aumentando la
afinidad parásito/macrófago (Brittingham et al. 1999).
Los amastigotes de L. major se unen prioritariamente a cr3 de los macrófagos favoreciendo
que el parásito sea endocitado (Wenzel et al. 2012).
Tanto LPG como gp63 protegen al parásito de la actividad lítica del complemento y de su
degradación vía lisosoma. En los parásitos metacíclicos se expresan proteínas que se usan
como marcadores específicos de estas formas del parásito como son: hydrophilic acylated
surface protein (HASP), y small hydrophilic ER associated (SHERP); parece ser que estas
proteínas están implicadas en la supervivencia y/o invasión del parásito (Sadlova et al.
2010). Otro factor de virulencia de gran importancia en la interacción y en el silenciamiento
de la actividad microbicida del macrófago, es la exposición de fosfatidilserina (PS) en la
superficie del parásito en fase estacionaria de crecimiento (de Freitas Balanco et al. 2001;
Wanderley y Barcinski, 2010). Existen estudios que sugieren que la PS de Leishmania es
importante para la evolución clínica de las enfermedades causadas por L. braziliensis
(Farias et al. 2013). La importancia de la PS como factor de virulencia se estudiará en
profundidad en el siguiente apartado.
Introducción
14
Tras la unión del parásito a la superficie del macrófago, los promastigotes son endocitados
y englobados en una estructura conocida como fagosoma o vacuola parasitófora, la cual
sufre una serie de eventos de fusión que la transforman en un fagolisosoma con
características de compartimento endosoma/lisosomal, donde reside la forma amastigote
del parásito.
La vacuola parasitófora contiene numerosas hidrolasas ácidas y en su membrana aparecen
proteínas de la vía endosoma/lisosoma como Rab7, LAMP-1 y LAMP-2. La H+-ATPasa de
la membrana vacuolar es responsable de la acidificación (pH 4.7-5.2) de este
compartimento vital para el amastigote (Vinet et al. 2009). En la membrana de dicha
vacuola también aparecen moléculas características del retículo endoplasmático (RE), como
es la calnexina, chaperona que facilita el plegamiento correcto de proteínas en el RE
(Ndjamen et al. 2010).
Las observaciones sugieren que la vacuola parasitófora tiene una composición híbrida entre
RE y constituyentes de la vía endocítica (Moradin y Descoteaux, 2012).
En la vacuola parasitófora, las moléculas de LPG del promastigote evitan la fusión de esta
vacuola con el lisosoma, ya que inhiben la biogénesis del fagolisosoma. El LPG induce la
acumulación perifagosomal de F-actina (Holm et al. 2001), como consecuencia de la
retención de proteínas de la familia Rho GTPasas (Cdc42) en el fagosoma; además se
produce el secuestro de la maquinaria de polimerización de actina de la célula hospedadora
a nivel de la membrana del fagosoma.
El mecanismo por el cual el LPG inhibe la maduración del fagolisosoma, implica la
transferencia de moléculas de LPG desde la superficie del parásito a microdominios
lipídicos de la membrana del fagosoma; este mecanismo produce la desestructuración de
estos microdominios, y evita el anclaje de otras proteínas como la NADPH oxidasa y la v-
ATPasa, ambas esenciales para la regulación de la fusión fagosoma-lisosoma (Vilhardt y
van Deurs, 2004). La exclusión de la NADPH oxidasa de la membrana del fagosoma evita
la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS), y limita la actividad proteolítica del
fagosoma, la cual es esencial para la presentación antigénica del parásito (Rybicka et al.
Introducción
15
2012), este proceso contribuye a la evasión de la respuesta inmune del mamífero.
La acidificación del fagosoma es esencial para la eliminación del microorganismo patógeno
y para un adecuado procesamiento antigénico. Además, las hidrolasas ácidas presentan
actividad máxima a pH ácido y son fundamentales para la destrucción del agente invasor.
La no fusión de la v-ATPasa evita la acidificación del endosoma donde se encuentra el
promastigote, creándose un nicho favorable para el establecimiento del patógeno (Vinet et
al. 2009).
Al no existir datos concluyentes sobre el pH del fagosoma que alberga al promastigote, se
asume que el inicio de la infección por el promastigote ocurre en un ambiente relativamente
ácido y con una elevada temperatura, lo cual facilita la conversión de la forma promastigote
a la intracelular o amastigote (Rosenzweig et al. 2008). Cuando el promastigote se
diferencia a la forma amastigote, la vacuola parasitófora adquiere las características típicas
de un compartimento endosomal/lisosomal, con enzimas líticas y pH ácido. La forma
amastigote reside en un ambiente ácido pH 4.7-5.2, dónde los niveles de glucosa son
escasos y los aminoácidos abundantes. Los resultados indican que en el proceso de
diferenciación de promastigote a amastigote, se produce un desplazamiento del
metabolismo glucídico hacia el de los ácidos grasos y aminoácidos. Además, el glicerol y
los aminoácidos son utilizados como precursores para la síntesis de glúcidos para
compensar la falta inicial de azúcares exógenos (Rosenzweig et al. 2008). Los amastigotes
obtienen del fagolisosoma del macrófago la mayoría de los nutrientes y fuentes de carbono
que requieren para su metabolismo, desarrollo y división, estableciéndose de forma
eficiente la infección en el mamífero.
1.8. Implicación de la fosfatidilserina en la interacción y/o invasión del parásito
Leishmania con su célula hospedadora.
La fosfatidilserina (PS) es un fosfolípido presente en la mayoría de las membranas
celulares. En condiciones normales, dicho fosfolípido se dispone en la cara interna o
citoplasmática de la membrana (Pomorski y Menon, 2006). En determinados procesos
Introducción
16
celulares como la apoptosis, se produce un incremento notorio de PS en la cara externa de
la membrana; la exposición de PS en la superficie es necesaria para que los cuerpos
apoptóticos sean reconocidos por las células fagocíticas, fundamentalmente macrófagos, y
así favorecer su eliminación (Wu et al. 2006). La PS también está asociada a otros procesos
fisiológicos, destacando la activación de las plaquetas en la coagulación sanguínea
(Hankins et al. 2014).
En Leishmania, la PS está implicada en la interacción del parásito con el macrófago. Se ha
demostrado que amastigotes de L. amazonensis exponen una mayor densidad de moléculas
de PS en la superficie de la membrana; este mecanismo se utiliza para su internalización en
la célula hospedadora y posterior expansión de la infección (Wanderley et al. 2006). La
unión de la PS con su receptor en el macrófago promueve la secreción de IL-10 y del
factor de crecimiento transformante β (TGF- β), con ello se produce el silenciamiento de la
actividad microbicida del macrófago y se facilita la supervivencia del parásito (Wanderley
et al. 2012). Para demostrar la implicación de la PS en la infectividad de Leishmania en el
modelo in vitro de macrófagos peritoneales de ratón, amastigotes de L. amazonensis se
pretrataron con Anexina V, observándose una disminución en la infectividad de los
amastigotes en torno al 50%; además, se reduce de forma significativa la secreción de TGF-
β (de Freitas Balanco et al. 2001; Wanderley et al. 2006). La participación de la PS en la
internalización del amastigote en el macrófago se demostró también al enmascarar al
receptor de la PS en el macrófago mediante bloqueo con anticuerpos, observándose una
disminución en la entrada del parásito en la célula (de Freitas Balanco et al. 2001).
Se ha descrito que los promastigotes de Leishmania en fase estacionaria exponen una
mayor cantidad de PS en superficie, comparándolos con promastigotes en fase de
crecimiento logarítmica (Tripathi y Gupta, 2003); además el porcentaje de infección de
macrófagos peritoneales de ratón disminuye al incubar los parásitos estacionarios con
Anexina V (Tripathi y Gupta, 2003), hecho no observable en parásitos en fase logarítmica.
Todos estos resultados sugieren que la infectividad del parásito está mediada por la
exposición de PS en superficie (Tripathi y Gupta, 2003).
Introducción
17
En estudios experimentales de infección realizados con promastigotes de L. amazonensis,
se observa que coexisten dos tipos de poblaciones parasitarias: 1º- Una subpoblación que
presenta los marcadores típicos del proceso apoptótico como son: la condensación y
fragmentación del ADN, alteración de la mitocondria, aumento de la permeabilidad de la
membrana plasmática, etc., y 2º- Otra subpoblación no apoptótica que infecta a las células
hospedadoras de forma eficiente. Tanto in vitro como in vivo existe un mecanismo de
cooperación entre ambas subpoblaciones que favorece que la infección se desarrolle
adecuadamente, ya que la subpoblación apoptótica produce el silenciamiento del macrófago
y con ello se promueve que la subpoblación no apoptótica infecte a las células fagocíticas
(van Zandbergen et al. 2006; Wanderley et al. 2009).
Se ha demostrado que otros parásitos presentan la misma estrategia para internalizarse en
sus hospedadores, entre los que podemos destacar a T. cruzi cuyas formas infectivas
exponen PS en superficie (Damatta et al. 2007). Igualmente, los taquizoitos infectivos de T.
gondii exhiben PS en la membrana, la cual es necesaria para inmunomodular a los
macrófagos e inhibir la actividad microbicida de los mismos (Seabra et al. 2004; Santos et
al. 2011).
La PS expuesta en la superficie de partículas virales facilita la invasión de nuevas células
hospedadoras (Soares et al. 2008). Además, se ha observado que determinados virus como:
Herpesvirus, Hepatitis C, VIH-1, entre otros, pueden generar un aumento del calcio
intracelular que promueve la translocación de PS a la superficie de las células infectadas a
modo de mimetismo apoptótico, con ello se evita la activación del sistema inmune,
expandiéndose la infección viral (Gautier et al. 2003; Mercer y Helenius, 2008). La
utilización de anticuerpos específicos que reconocen a la PS de virus y células infectadas,
combinados con un tratamiento antiviral, reducen la mortalidad de ratones infectados con
citomegalovirus, ya que activan respuestas inmunitarias eficaces (Soares et al. 2008).
Recientemente se ha confirmado la importancia de la PS en el desarrollo y progresión de la
leishmaniasis. Amastigotes obtenidos de pacientes con leishmaniasis cutánea difusa (LCD),
presentan una elevada exposición de PS en superficie, en comparación con sus homólogos
extraídos de pacientes con leishmaniasis cutánea localizada (LCL) (Franca Costa et al.
Introducción
18
2012). La mayor exposición de PS favorece la diseminación del parásito y una rápida
progresión de la enfermedad. Los pacientes con LCD presentan un mayor número de
lesiones tisulares, y la persistencia de la enfermedad se incrementa de forma considerable
(Franca Costa et al. 2012).
La PS expuesta en la superficie del amastigote promueve una mayor liberación de TGF-β
por parte de los macrófagos parasitados; esta citoquina incrementa la actividad de la
arginasa con la consecuente disminución en la síntesis de óxido nítrico (ON),
favoreciéndose la diseminación del parásito (Wanderley et al. 2012).
Las moléculas de PS expuestas en la superficie de los amastigotes de Leishmania están
implicadas en la maduración de las células dendríticas (DC), y son capaces de modular la
presentación antigénica que dichas células realizan (Wanderley et al. 2013). Estos datos
sugieren la importancia que juega la PS en la regulación de la respuesta inmune frente a
patógenos.
1.9. Respuesta inmunológica del hospedador vertebrado.
Tras producirse la inoculación del parásito por la picadura del insecto vector, se desarrolla
un proceso inflamatorio local. Las células endoteliales y los tejidos circundantes liberan IL-
33 que favorece la atracción de polimorfonucleares (PMNs) (Kaye y Scott, 2011). Estas
células muestran quimiotaxis a sustancias presentes en la saliva del insecto vector no muy
bien caracterizadas; además, el parásito secreta un factor denominado (leishmania
chemotactic factor, LCF); se trata de un conjunto de moléculas con un tamaño molecular
entre 10 y 50 kDa, estables al calor y sensibles a la proteinasa K. Dichas moléculas
potencian la atracción de PMNs en la zona de la infección (van Zandbergen et al. 2002).
Los PMNs fagocitan a los parásitos y liberan citoquinas como la IL-8 y MIP1-β (Charmoy
et al. 2010) que atraen a los macrófagos, que a su vez liberan quimioquinas como la
monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1 o CCL2) que recluta a otras poblaciones celulares
como células natural killers (NK) y DC, y además aumenta la eficacia en la atracción de
Introducción
19
más macrófagos (Teixeira et al. 2006).
Las DC de los tejidos o las células de Langerhans en la piel tienen la capacidad de
reconocer al parásito Leishmania, fagocitarlo, y desarrollar el mecanismo de presentación
antigénica vía complejo principal de histocompatibilidad. Las DC activadas transportan los
antígenos procesados del parásito en superficie hacia los órganos linfoides secundarios,
dónde interaccionará con linfocitos T, desarrollándose la respuesta inmune celular (Miriam
et al. 2013).
El estudio de biopsias dérmicas realizadas a pacientes con LC producida por L. major o L.
tropica, demuestra una disminución en el número de células de Langerhans (Jabbour et al.
2014), que puede contribuir a una mayor diseminación del parásito.
En humanos, los perfiles de citoquinas secretadas por las células inmunes están asociados
con el proceso de curación o con el progreso de la enfermedad. La liberación de IL-12 por
las DC tras producirse la infección promueve una respuesta inmune tipo Th1, que se
caracteriza por una activación de las células NK y por la expansión de células CD4+ T
helper 1 (Th1), que producen Interferón-γ (IFN-γ) y el Factor de Necrosis Tumoral (TNF-
α) que estimulan la síntesis de ON en el macrófago parasitado, produciéndose la muerte de
los parásitos (da Silva Santos y Brodskyn, 2014). Otra población celular que participa en la
defensa inmunitaria frente a Leishmania, son las células TCD8+ o linfocitos citotóxicos. Su
función efectora contra el patógeno consiste en la liberación de perforinas y granzima B
que producen la eliminación del parásito (Ruiz y Becker, 2007).
La progresión de la enfermedad se ve favorecida por una respuesta tipo Th2 en la cual
existe una alta producción de citoquinas antiinflamatorias como IL-10, IL-4, IL-2, TGF- β,
y la ausencia de INF-γ; este contexto citoquímico facilita la diseminación del parásito (da
Silva Santos y Brodskyn, 2014).
La respuesta inmune murina tiene un patrón citoquímico muy similar al de los humanos;
una respuesta Th1 produce una activación de células NK y Th1 que secretan IFN-γ, TNF-α
y estimulan la síntesis de ON en el macrófago, todo ello se resuelve con la eliminación del
Introducción
20
parásito (Alexander y Bryson, 2005). Una respuesta Th2 secreta IL-4, IL-5, IL-10 y TGF-βl
que inhiben la respuesta Th1, y favorecen una mayor síntesis de poliaminas en el
macrófago que son esenciales para el crecimiento y la supervivencia del parásito (Awasthi
et al. 2004; Dey et al. 2007) (Figura 8).
Figura 8: Respuesta inmunológica frente a Leishmania: La respuesta Th1 se resuelve con el control y la
eliminación del parásito. Las citoquinas secretadas en la respuesta inmune Th2 favorecen la progresión
y diseminación del parásito.
1.9.1. Evasión de la respuesta inmune por el parásito Leishmania.
Actualmente se han desarrollado diversas teorías que tratan de explicar los mecanismos que
usa el parásito para invadir a la célula hospedadora, y evadir la respuesta inmune del
hospedador, es lo que se denomina “Trojan Horse” y “Trojan rabbit strategy”.
Introducción
21
1) “Trojan Horse”.
Los neutrófilos constituyen una de las primeras líneas de defensa celular frente a patógenos
(Nathan, 2006); presentan una vida media corta (de 6-10 horas) en circulación y mueren
rápidamente por apoptosis. Los cuerpos apoptóticos son fagocitados por los macrófagos
que se encargan de su eliminación (Arango Duque y Descoteaux, 2014).
Se ha demostrado que la infección de neutrófilos con microorganismos intracelulares como
L. major, produce una expansión poblacional de dichas células, y además aumenta el
tiempo de supervivencia de los neutrófilos al inhibirles la apoptosis, favoreciéndose con
ello la multiplicación del patógeno y el desarrollo de la infección (van Zandbergen et al.
2004).
Transcurridas 48 horas post-infección, el neutrófilo entra en apoptosis y se produce la
liberación de IL-8 (primates) o MIP-2 y KC (citoquina murina equivalente a IL-8), que
favorecen la atracción quimiotáctica de los macrófagos (Müller et al. 2001).
Los macrófagos reconocen a los cuerpos apoptóticos de los neutrófilos a través de la PS
que exponen en su superficie; este reconocimiento mediado por el receptor de PS del
macrófago (PSR) promueve la fagocitosis de las células dañadas e inhibe la actividad
microbicida del macrófago, a este proceso se le denomina “silenciamiento del macrófago”
(Wanderley et al. 2012).
Leishmania dentro del neutrófilo fagocitado por el macrófago no solo sobrevive sino que
además se divide (van Zandbergen et al. 2004; Laskay et al. 2008); sin embargo, se
desconoce cómo se produce la transferencia de parásitos desde el neutrófilo al macrófago
(Charmoy et al. 2010) (Figura 9).
Introducción
22
2) “Trojan rabbit strategy”.
Otra vía de evasión de la respuesta inmune y de la entrada del parásito en el macrófago es
la denominada “Trojan rabbit strategy”, en la cual Leishmania escapa del neutrófilo
antes de que entre en apoptosis y sea fagocitado por el macrófago. Cuando el neutrófilo
entra en apoptosis e induce el silenciamiento del macrófago, el parásito Leishmania
aprovecha esta situación para ser internalizado vía fagocitosis en el macrófago, sin
desencadenar la respuesta microbicida del mismo (Peters et al. 2008; Ritter et al. 2009).
Figura 9: Vías de interacción del parásito Leishmania con su célula hospedadora. (1): Interacción e
invasión del macrófago por Leishmania. (2): El parásito es transferido al macrófago a través de los
neutrófilos (Trojan Horse), y (3): Inhibición de la respuesta inmune al impedirse la presentación
antigénica entre células dendríticas y células T. Tomado de Ribeiro-Gomes y Sacks, (2012).
1 2 3
Introducción
23
1.10. Diagnóstico.
Aunque los enfoques clínicos y serológicos pueden ser útiles para el diagnóstico de la
leishmaniasis, la demostración real del parásito es importante y definitiva. Para poner de
manifiesto a los parásitos, las muestras de tejidos infectados se tiñen y visualizan al
microscopio. En la LC, las muestras se obtienen de biopsias de lesiones dérmicas mediante
raspado de los bordes no necróticos de la lesión. En el caso de la LV se realizan aspirados
de bazo, médula ósea y ganglios linfáticos. Los aspirados esplénicos son los más sensibles
a la detección por microscopio en torno al 90-97%; sin embargo, debe de realizarse por
personal con alto grado de experiencia ya que son frecuentes los procesos hemorrágicos.
Otros tejidos empleados para corroborar la presencia del parásito son el hígado, sangre y
líquido cefalorraquídeo, aunque se utilizan con baja frecuencia (WHO 2010).
Para la identificación del parásito también se emplea la reacción en cadena de la
polimerasa; siendo una técnica de diagnóstico altamente sensible y específica, basada en la
amplificación de secuencias de ADN características del parásito, tales como el ADN del
kinetoplasto. Se ha comprobado que en muestras procedentes de aspirados de la médula
ósea, la sensibilidad de esta técnica es del 100%. El problema principal de la implantación
de este sistema de diagnóstico es que solo puede realizarse en hospitales y centros de
investigación (WHO 2010).
Existen distintos métodos serológicos que se emplean para detectar anticuerpos generados
contra el parásito, generalmente se basan en técnicas de inmunofluorescencia indirecta
(IFI), ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) y Western blot. Estas técnicas son muy
sensibles pero requieren de equipamiento no accesible para regiones pobres donde la
enfermedad es endémica (WHO 2010).
Se han desarrollado dos test serológicos de fácil aplicación para diagnosticar la enfermedad
fuera de un laboratorio:
1) Un test de aglutinación directa (DAT). Si existen anticuerpos contra el parásito en la
sangre u orina del paciente, se desarrolla una aglutinación visible tras 18 horas de
incubación.
Introducción
24
2) Un test de inmunocromatografía frente al antígeno rK39, el cual se realiza sobre una tira
reactiva obteniéndose el resultado en 20 minutos (WHO 2010).
Todos los test serológicos presentan dos limitaciones principales: 1- No tienen capacidad de
discriminar entre pacientes curados con elevados niveles de anticuerpos y enfermos, y 2-
Existe un porcentaje de la población de áreas endémicas que dan positivos en los test
serológicos sin presentar signos evidentes de la enfermedad (WHO 2010).
Existen otra serie de tests basados en los fenómenos de inmunidad celular. El principal de
ellos es la reacción de Montenegro o intradermorreacción (LST) y consiste en inyectar
a nivel subdérmico antígenos del parásito. La reacción se considera positiva si el diámetro
del nódulo generado en la piel es mayor a 5 mm. Se emplea para el diagnóstico de LC y
LMC. El principal problema es la falta de discriminación entre una infección pasada y una
que cursa en el presente (David y Craft, 2009).
Actualmente se buscan métodos diagnósticos más específicos que eviten los problemas que
presentan los test serológicos. Un ejemplo de este tipo de pruebas es el test de
aglutinación de latex (KAtex), que se basa en la detección de antígenos del parásito en la
orina de pacientes con Kala-azar. El test está compuesto por una serie de “bolitas de látex”
recubiertas por el anticuerpo policlonal que reconoce al antígeno del parásito (carbohidrato
de bajo peso molecular). Los complejos antígenos-anticuerpos se detectan a simple vista y
la especificidad del método es del 99% (Chappuis et al. 2007; Mondal et al. 2010).
1.11. Tratamiento.
1.11.1. Desarrollo de vacunas contra la leishmaniasis.
Actualmente el tratamiento contra la leishmaniasis se basa en un reducido número de
agentes quimioterápicos, los cuales son de alto coste, presentan toxicidad y pueden generar
resistencia en los parásitos. El desarrollo de una vacuna efectiva sería el mejor método para
controlar todas las formas de la enfermedad, y es una prioridad para la Organización
Mundial de la Salud (Mutiso et al. 2013).
Introducción
25
Las vacunas de primera generación están formadas por parásitos muertos y presentan una
composición difícil de definir y estandarizar (Mutiso et al. 2013).
Las vacunas de segunda generación están constituidas por proteínas recombinantes, y por
parásitos modificados genéticamente (Kumar y Engwerda, 2014; Jain y Jain, 2015). La
forma nativa o recombinante de gp63 se usa como candidata para el desarrollo de vacunas
contra la LC y LV. En numerosos estudios, la inclusión de gp63 en liposomas confiere
inmunidad en ratones BALB/C infectados con L. donovani (Bhowmick et al. 2008;
Mazumder et al. 2011).
Las vacunas de ADN forman parte de la tercera generación de vacunas. Básicamente
consiste en clonar los genes de interés en vectores de expresión para mamíferos e
inyectarlos directamente bajo la piel o el músculo (Kumar y Engwerda, 2014; Jain y Jain,
2015), además son muy fáciles de obtener (Eric, 2007; Mutiso et al. 2013).
A pesar de los esfuerzos invertidos para la obtención de una vacuna frente a la
leishmaniasis en humanos, aún no existe ninguna que aporte la protección adecuada; sin
embargo, se han producido numerosos avances en las vacunas utilizadas para inmunizar a
los perros (Otranto y Dantas-Torres, 2013). En Brasil se está empleando una vacuna
preparada a partir de una glicoproteína (ligando de fucosa/manosa) de L. donovani
conocida como Leishmune®. La vacuna muestra una eficacia de protección del 92%
(Nogueira et al. 2005; Borja Cabrera et al. 2008).
Otra vacuna se ha obtenido mediante la purificación de productos excretados/secretados
(ES) en el sobrenadante de un cultivo de L. infantum, empleándose la saponina QA21 de
Quillaja saponaria como adyuvante. La vacuna se comercializa como CaniLeish® y un
prototipo de esta vacuna muestra una protección del 92% en estudios de campo realizados
en Francia (Lemesre, 2007). Recientemente, se ha demostrado que perros vacunados con
CaniLeish®, tienen una respuesta inmune eficaz frente al parásito un año después de la
primera vacunación (Martin et al. 2014; Moreno et al. 2014).
Introducción
26
También se han probado otras vacunas con resultados menos prometedores, como la
poliproteína Leish-111, formada por múltiples subunidades recombinantes de Leishmania
(Gradoni, 2005).
Aunque las vacunas supondrían un control más efectivo para la leishmaniasis canina y
humana, existen elevados costes económicos que dificultan la investigación y el uso de las
mismas (Otranto y Dantas-Torres, 2013).
1.11.2. Fármacos leishmanicidas.
Dado que actualmente no existen vacunas eficaces contra la leishmaniasis, una de las
medidas de control de la leishmaniasis se basa en el tratamiento quimioterápico que se
limita a un reducido número de fármacos. Los fármacos empleados para la leishmaniasis
presentan importantes problemas: baja eficacia, alta toxicidad, efectos secundarios graves,
larga duración, administración parenteral, generación de resistencias, etc. (Kobets et al.
2012; Monge-Maillo y López-Vélez, 2013). Además, los fármacos de primera elección
presentan un elevado coste, lo cual dificulta su acceso a la mayor parte de las regiones
endémicas. Es necesaria la búsqueda de fármacos más eficientes y baratos para poder seguir
luchando contra el parásito.
Entre los principales fármacos en uso frente a la leishmaniasis destacamos:
1) Antimoniales.
Las sales orgánicas del antimonio pentavalente constituyen el tratamiento clásico
empleado en la LV, LC, LMC y LCan. Actualmente presentan dos formulaciones químicas:
el antimoniato de N-metilglucamina (Glucantime) y estibogluconato de sodio
(Pentostam). Se administran por vía intravenosa o intramuscular a razón de 20 mg/kg/día
durante 30 días (WHO 2010). A pesar de que el antimonio se lleva usando como
tratamiento leishmanicida desde hace más de 70 años, el mecanismo de acción no está
totalmente claro. Se conoce que los antimoniales actúan influyendo en el metabolismo
Introducción
27
energético del parásito al inhibir la glucólisis, la β-oxidación de los ácidos grasos e impedir
la formación de ATP y GTP (Mishra et al. 2007). También se ha visto que interfieren en el
metabolismo del tripanotión mediante dos mecanismos: una rápida expulsión del glutatión
y tripanotión intracelular, y a través de la inhibición de la tripanotión reductasa (Ait-Oudhia
et al. 2011). Se ha observado un aumento de la actividad antioxidante en aislados clínicos
de Leishmania resistentes a antimoniales, asociada a la sobreexpresión de triparedoxina y
de triparedoxina peroxidasa (Wyllie et al. 2010). En aislados clínicos de L. donovani
resistente a los antimoniales se ha demostrado: i) la sobreexpresión del transportador
ABCC3, que transporta hacia el interior de vesículas tioles conjugados con SbIII; ii) una
disminución de la expresión o mutación de la aquagliceroporina 1 (AQP1), implicada en la
entrada de SbIII, y iii) el incremento de los niveles de tioles (Rai et al. 2013).
Uno de los principales problemas del uso de los antimoniales es la elevada toxicidad que
presentan, favoreciendo que aparezcan graves efectos secundarios como arritmias,
pancreatitis, anorexia, dolor abdominal, etc. (WHO 2010).
En ciertas regiones endémicas a LV, como Bihar (India), el parásito ha incrementado la
resistencia al antimonio pentavalente imposibilitando su uso como primera línea de
tratamiento (Hadighi et al. 2007; Stauch et al. 2012). Estudios recientes revelan que la
contaminación del agua de bebida con arsénico, ha jugado un papel importante en la
resistencia del parásito Leishmania al tratamiento antimonial en Bihar (Perry et al. 2013).
Existe alrededor de un 60% de resistencias al antimonio en India y un 20% en Perú. Se
recomienda el uso del antimonio en combinación con otros fármacos, destacando el tándem
antimonio/paromomicina empleado para tratar la LV en el Este de África; la posología
recomendada para este tratamiento es: antimonio pentavalente (20 mg SbV/kg/día), más 15
mg/kg/día de paromomicina durante 17 días (Monge-Maillo y López-Vélez, 2013).
Introducción
28
2) Anfotericina B.
Es un antibiótico macrólido poliénico empleado en regiones endémicas a LV en las que
no existe respuesta adecuada al tratamiento con antimonio. La anfotericina B se ha
convertido actualmente en el fármaco de primera elección frente al tratamiento de la
leishmaniasis. Su administración es por vía intravenosa en forma de desoxicolato y se
recomienda la dosis de 0.75/1 mg/kg en días alternos durante 30 días (Jha et al. 2013). Su
potencial acción leishmanicida se basa en su capacidad de unirse al ergosterol (principal
esterol en estos parásitos), originando la apertura de poros en la membrana del parásito que
producen colapso energético y muerte celular.
El tratamiento requiere hospitalización y presenta múltiples efectos secundarios como
flebitis, miocarditis, nefrotoxicidad, hipocalcemia, etc. Uno de los mayores inconvenientes
de su uso en países en vías de desarrollo es el alto coste del fármaco, que lo hace
inaccesible para la mayor parte de la población (Sundar y Chatterjee, 2006; Chappuis et al.
2007). Otras formulaciones aumentan su eficacia y han disminuido su toxicidad, entre estas
se encuentra la anfotericina B liposomal conocida como AmBisome (Gilead Sciences-
California), siendo la primera línea de tratamiento en Europa y Estados Unidos frente a la
LV (Chappuis et al. 2007). Otras preparaciones liposomales como Fungisome desarrollado
en la India son altamente efectivos contra la LV, con una curación del 90% tras seis meses
de tratamiento. Recientemente se ha demostrado que la anfotericina B es un tratamiento
seguro y efectivo contra la LV en áreas altamente endémicas de Bangladesh. Existe un
compromiso del gobierno del país para fortalecer las infraestructuras hospitalarias para que
el tratamiento llegue a la ciudadanía de manera ininterrumpida (Maintz et al. 2014).
La anfotericina B se puede emplear como monoterapia ya que es muy efectiva contra el
parásito; sin embargo, actualmente se emplea en combinación con otros fármacos para
aumentar su eficacia. La Organización Mundial de la Salud apoya el uso de anfotericina B
liposomal más miltefosina o paromomicina, ya que en estudios realizados en India contra la
LV se ha visto que son más activas contra el parásito y generan menos efectos adversos
(Sundar et al. 2011a; Sundar y Chakravarty, 2013).
Introducción
29
Aislados clínicos de L. donovani resistentes a la anfotericina B presentan modificaciones en
la composición de la membrana (ausencia de ergosterol) que disminuye la afinidad del
fármaco por el parásito. Además, existe una mayor expresión del transportador MDR1 que
podría estar implicado en la expulsión del fármaco al exterior de la célula, un incremento de
la expresión de genes relacionados con metabolismo de tioles y un aumento de los niveles
de tioles que ayuda a controlar el estrés oxidativo que origina el fármaco (Purkait et al.
2012).
3) Miltefosina.
La miltefosina (hexadecilfosfocolina) se desarrolló inicialmente como fármaco antitumoral.
El fármaco está comercializado (Impavido) para su administración oral frente a la LV, LC
y LMC. En India se usa frente a la LV a una concentración de 100 mg/día durante 28 días si
el peso corporal está entre 25-50 kg, y más de 150 mg/día durante 28 días si el peso supera
los 50 kg. El mecanismo de acción no está totalmente caracterizado pero se sabe que actúa
alterando la composición lipídica de la membrana del parásito e interfiere en la síntesis de
otras biomoléculas (Azzouz et al. 2007; Vincent et al. 2013). También se ha descrito que
altera el potencial de membrana mitocondrial produciendo la muerte por apoptosis, y
además tiene la capacidad de inhibir a la citocromo c oxidasa (Luque-Ortega y Rivas,
2007). La miltefosina tiene una vida media de 100 a 200 horas en el organismo. Datos de
pacientes con LC tratados con miltefosina, demuestran que el fármaco puede detectarse 5 ó
6 meses después del final del tratamiento (Dorlo et al. 2008), lo que facilitaría que el
parásito genere resistencias, por lo que es imprescindible que el tratamiento se desarrolle
correctamente.
Entre los principales efectos colaterales del fármaco destacamos trastornos
gastrointestinales como diarreas y vómitos e incluso afecciones pancreáticas graves que han
llegado a producir la muerte del paciente (Pandey et al. 2013). La principal desventaja de la
miltefosina es su alta teratogenicidad, quedando limitado su uso en mujeres embarazadas.
Además, ha disminuido su eficacia como tratamiento monoterápico (Jha et al. 2013). Al
Introducción
30
objeto de incrementar la eficacia, reducir la toxicidad y evitar futuras apariciones de
resistencias, se ha venido implementado su empleo en combinación con anfotericina B
liposomal o paromomicina en India (Sundar et al. 2011b).
4) Paromomicina.
La paromomicina (aminosidina) es un antibiótico aminoglicósido cuyo mecanismo de
acción leishmanicida se basa en la unión del antibiótico al ribosoma impidiendo una
adecuada traducción de las proteínas (Fernández et al. 2011). Se administra de forma
parenteral en la LV a razón de 15 mg/kg/día durante 3 semanas y de forma parenteral o
tópica en la LC (Sundar y Chatterjee, 2006; Chappuis et al. 2007). Es un fármaco muy
barato de producir, lo que aumenta su acceso a las regiones más empobrecidas, habiéndose
registrado en la India en 2006 como un medicamento de primer orden en la lucha contra la
LV (Sundar y Chakravarty, 2008; Davidson et al. 2009).
En L. donovani resistentes a la paromomicina se dilucidaron los principales mecanismos
biológicos que permiten que el parásito sea resistente al fármaco, entre los que destacamos:
1) Una mayor fluidez de la membrana acompañada de una menor acumulación intracelular
del fármaco, 2) Incremento en la expresión génica de transportadores ABC (MDR1 y
MRPA), y 3) Mayor capacidad de supervivencia, dado que estimula la producción de IL-10
en la célula hospedadora (Bhandari et al. 2014).
La combinación de paromomicina con otros fármacos frente a LV va a depender de la cepa
del parásito y de la región geográfica en la cual nos encontremos. Por ejemplo, en África se
utiliza la combinación paromomicina más antimonio, y en India se emplea el tándem
paromomicina/miltefosina (WHO 2010).
Introducción
31
3) Pentamidina.
Es una diamidina aromática que se emplea en el tratamiento de la LC, administrándose
mediante inyecciones intravenosas o intramusculares con una posología de 4 mg/kg/día
durante 3-7 días (David y Craft, 2009). El tratamiento se ha usado con éxito para tratar la
LC causada por L. tropica aunque actualmente no se utiliza de forma rutinaria (Jha et al.
2013).
La pentamidina interfiere en el metabolismo de las purinas, inhibe la biosíntesis de
poliaminas, altera el potencial de la membrana mitocondrial, y produce grandes cambios
conformacionales en el ADN (Amato et al. 2008).
Entre los principales efectos adversos que ocasiona el tratamiento con pentamidina destaca
la aparición de diabetes, náuseas, hipotensión e incluso se puede producir la muerte del
paciente. Debido a la poca eficacia y a la rápida generación de resistencias se abandonó su
uso frente a la LV en muchas regiones de la India (Sundar y Chatterjee, 2006).
1.11.3. Otros fármacos empleados en el tratamiento de la leishmaniasis.
1) Azoles.
Son fármacos antifúngicos entre los que destacamos al ketoconazol, metronidazol,
fluconazol e itraconazol. Su mecanismo de acción leishmanicida implica la inhibición de la
síntesis del ergosterol al inactivar enzimas de su ruta biosintética como a la C14α-
desmetilasa. Diversos estudios demuestran la actividad de los azoles sobre el parásito; sin
embargo, debido a la capacidad de Leishmania de capturar esteroles de su célula
hospedadora, los niveles de sensibilidad a estos compuestos pueden ser relativos (Croft et
al. 2006).
Introducción
32
Se ha demostrado que itraconazol y posaconazol presentan una potente actividad
leishmanicida. Los estudios fisiológicos sobre L. amazonensis revelan que ambos
inhibidores produjeron el colapso del potencial de membrana mitocondrial y la alteración
ultraestructural de dicho orgánulo; los resultados sugieren que estos fármacos podrían
representar una nueva línea de tratamiento contra la leishmaniasis, como monoterapia o
combinado con otros agentes (de Macedo-Silva et al. 2013).
2) Alopurinol.
Es un análogo de las purinas (hipoxantina) y su mecanismo de acción se basa en la
inhibición de determinadas enzimas del metabolismo de las purinas como la xanthina
oxidasa. En el parásito, la hipoxantina se metaboliza en distintos nucleósidos y nucleótidos
que ejercen toxicidad tras incorporarse al ARN y alterar su biosíntesis, y como
consecuencia se ven afectados los mecanismos de síntesis proteica (Singh y Sivakumar,
2004; Croft et al. 2006). Es un fármaco con baja eficacia en humanos, siendo más utilizado
en la LCan en combinación con el antimonio. También se puede combinar con miltefosina
y anfotericina B. La posología del tratamiento con alopurinol es de 20 mg/kg/día durante 1
semana cada mes. El perro mantendrá el tratamiento de por vida, ya que existe remisión del
cuadro clínico pero no hay curación parasitológica. Actualmente, la combinación de
antimoniales o de miltefosina con alopurinol ofrece la mejor eficacia en el tratamiento de la
LCan en cualquiera de sus fases clínicas (da Silva et al. 2012; Farca et al. 2012).
En numerosos estudios se ha determinado que los niveles plasmáticos de alopurinol en
humanos es muy inferior al alcanzado en perros, de ahí su ineficacia como tratamiento
monoterápico en humanos (Croft et al. 2006).
Introducción
33
Figura 10: Principales fármacos leishmanicidas.
1.12. Biología y bioquímica del parásito.
Organización genómica del parásito Leishmania.
El parásito Leishmania presenta una serie de particularidades genómicas que los hace
únicos entre los eucariotas: 1º) La mayoría de los genes carecen de intrones. Sólo dos genes
(LmjF 29.2600 que codifica para una poli(A) polimerasa y LmjF 07.0340 que codifica para
una helicasa) presentan intrones (Myler, 2008). 2º) Presentan una transcripción
policistrónica, dónde el proceso de trans-splicing es fundamental para la formación del
ARN mensajero (ARNm) y 3º) tienen un alto contenido en G+C, alrededor de un 60% (B
Kazemi, 2011).
Los genomas de varias especies de Leishmania tales como L. major, L. infantum, L.
braziliensis y L. donovani o L. mexicana se han secuenciado completamente
(http://www.genedb.org/Homepage). L. major es un organismo diploide y se han
identificado 911 genes que codifican ARN y 8272 genes codificantes de proteínas.
Introducción
34
El estudio genómico de varias especies de Leishmania distribuidas en el Viejo Mundo
como son L. donovani y L. major nos revela que constan de 36 pares de cromosomas,
mientras que las especies del Nuevo Mundo contienen de 34 a 35 pares de cromosomas. En
L. mexicana están fusionados los cromosomas 8+29 y 20+36, y en L. braziliensis están
fusionados los cromosomas 20+34 (Smith et al. 2007; Rogers et al. 2011).
En el caso de L. major (cepa Friendlin) se ha determinado que su genoma haploide consta
de un tamaño de 32.8 Mb distribuidos en 36 cromosomas. El genoma de L. major está
organizado en 133 agrupaciones de genes, cada uno de los cuales pueden contener de 10 a
100 genes codificantes de proteínas; estas agrupaciones originan largos transcritos
policistrónicos (100-300kb) que mediante trans-splacing y poliadenilación generan el
ARN monocistrónico o ARN maduro (Figura 11).
El mecanismo de trans-splicing se caracteriza por la adición en el extremo 5’ de una
secuencia de 39 nucleótidos denominada spliced leader o miniexón que constituirá el
extremo 5’ de todos los ARNs maduros, y la unión en posición 3’ de una cola de
poliadeninas. Ambos procesos están acoplados de manera que la inhibición de la unión del
miniexón bloquea la poliadenilación en transcritos situados corriente arriba (LeBowitz et
al. 1993). Los tripanosomátidos carecen de las secuencias consenso para la poliadenilación;
por tanto, este proceso depende de la posición del sitio aceptor del miniexón (formado por
el dinucleótido AG precedido por una secuencia rica en pirimidinas) (Requena et al. 2003).
Introducción
35
Figura 11: Transcripción en Leishmania: Mecanismo de trans-splicing y poliadenilación
(http://www.ricet.es/es/5/grp-grupo-de-biologia-molecular-de-parasitos tropicales.htm).
Las señales moleculares que subyacen a la mayoría de estos procesos siguen siendo objeto
de investigación; se sugiere la importancia de determinadas “curvaturas” de la estructura
secundaria del ADN en el inicio de la transcripción, ya que en estas regiones se han
encontrado marcadores típicos de la transcripción activa, como la histona H3, SNAP50, etc
(Pablo et al. 2013).
La regulación de la expresión génica es post-transcripcional, identificándose secuencias en
las regiones no traducidas (UTR) que median en el proceso de estabilización del ARNm y
de traducción (Gupta et al. 2013).
Una vez traducidas las proteínas, experimentan una serie de modificaciones post-
traduccionales que son necesarias para adquirir su funcionalidad, entre las que destacamos:
la glicosilación, fosforilación, acilación, etc.
Introducción
36
Kinetoplasto.
Se define como la estructura que alberga el ADN mitocondrial de parásitos del orden
Kinetoplástida que incluye al género Leishmania y Trypanosoma. El 30% del total del
ADN celular está representado por el ADN del kinetoplasto, el cual está constituido por una
serie de estructuras circulares concatenadas denominadas mini y maxicírculos. Los
minicírculos tienen un tamaño de 0,5-2,5 kb y existen aproximadamente unas 20.000 copias
por célula, mientras que los maxicírculos están menos representados (20-50 copias) y su
tamaño oscila entre 20-40 kb. A nivel estructural y funcional, el ADN de los maxicírculos
es análogo al ADN mitocondrial de células eucariotas no parásitas, codificando para ARNr
y elementos integrantes de la cadena respiratoria. Los minicírculos codifican para pequeños
ARNs guías (gRNAs) que están implicados en el proceso de corrección del ARN
mitocondrial conocido como RNA editing (Madina et al. 2014). Se trata de un tipo de
procesamiento post-transcripcional del ARN mediante el cual se insertan o eliminan
uridinas en dichas moléculas, con ello se originan codones de inicio o de terminación que
establecen la secuencia que se va a traducir. Dicho proceso se ejecuta sobre transcritos
codificados por los maxicírculos y se lleva a cabo por un complejo multiproteico conocido
como editosoma (de Souza et al. 2009).
Los acidocalcisomas son unos orgánulos conservados a lo largo de toda la escala evolutiva,
están presentes desde las bacterias a células de mamíferos (Docampo et al. 2005).
En Leishmania se caracterizan por ser de naturaleza ácida, electrodensos, y por contener
altas concentraciones de calcio, fósforo en forma de pirofosfatos (PPi) y polifosfatos
acomplejados con cationes. La morfología y tamaño de los acidocalcisomas es muy
variable, generalmente son esféricos y con un diámetro que puede oscilar desde los 0,2 μm
en Trypanosoma cruzi a los 0,6 μm en Leishmania sp (Docampo y Moreno, 2011).
Entre las principales funciones de estos orgánulos destacan: almacenamiento de calcio y
fósforo, osmorregulación y homeostasis, metabolismo de polifosfatos, mantenimiento del
pH intracelular, virulencia del parásito, etc. (Docampo y Moreno, 2011).
Introducción
37
Los glicosomas son orgánulos característicos de Kinetoplástidos. Evolutivamente tienen un
origen peroxisomal y se caracterizan por presentar una membrana simple y una densa
matriz proteica (Parsons, 2004). Son orgánulos en los que se realiza la mayor parte de la
glucólisis, ya que contienen las enzimas necesarias para dicho proceso. La
compartimentalización de la glucólisis en estos orgánulos es esencial para la regulación
de la propia ruta metabólica, y para la adaptación de la célula a cortos períodos de
anaerobiosis (Michels et al. 2006). En estos orgánulos también se localizan multitud de
enzimas implicadas en otros procesos celulares de gran importancia como son la ruta de las
pentosas-fosfato, β-oxidación de ácidos grasos, biosíntesis lipídica, recuperación de purinas
y síntesis de pirimidinas (Parsons et al. 2001).
El contenido enzimático del glicosoma varía a lo largo del ciclo biológico del parásito,
permitiendo una rápida y eficiente adaptación del parásito a las nuevas condiciones
ambientales (Michels et al. 2006).
La importancia metabólica del glicosoma hace de este orgánulo, y de las proteínas y/o
enzimas que lo integran una posible diana terapéutica a nuevos fármacos (Moyersoen et al.
2004).
Estudios sobre el metabolismo energético de la forma promastigote del parásito
Leishmania, revelan que utilizan glucosa y aminoácidos como principal fuente de energía.
Las vías metabólicas principales para obtener la energía necesaria para su fisiología son: la
glucólisis y la fosforilación oxidativa mitocondrial (Opperdoes y Coombs, 2007). La forma
amastigote del parásito presenta un metabolismo basado principalmente en la β-oxidación
de ácidos grasos; además, pueden utilizar a los aminoácidos como precursores para la
síntesis de glúcidos (Saunders et al. 2014).
Una particularidad metabólica del parásito Leishmania es que carece de la maquinaria
necesaria para la síntesis de novo de purinas, por tanto, depende exclusivamente de las
proporcionadas por el hospedador vertebrado. El parásito presenta una serie de
transportadores a nivel de la membrana que facilitan la incorporación de nucleósidos de
purinas y pirimidinas. Sin embargo, la biosíntesis de novo de pirimidinas en el parásito
Introducción
38
Leishmania se desarrolla por vías metabólicas similares a las de humanos (Carter et al.
2008). En la mayoría de los eucariotas las enzimas implicadas en la recuperación de purinas
presentan una localización citosólica, mientras que en tripanosomátidos se encuentran en
los glicosomas (Michels et al. 2006). La dependencia del parásito de las purinas exógenas
hace de las enzimas implicadas en el proceso de recuperación, un atractivo candidato al
diseño racional de fármacos.
Otra característica exclusiva de los parásitos del orden Kinetoplastida es que presentan un
metabolismo redox basado en el tripanotión (bisglutationil-espermidina), a diferencia del
resto de organismos eucariotas donde la homeostasis redox es llevada a cabo por el
glutatión. El tripanotión crea un ambiente intracelular reductor protegiendo al parásito del
estrés oxidativo procedente del metabolismo de la célula hospedadora o de los mecanismos
de defensa de la misma (Van Assche et al. 2011).
Componentes de la membrana de Leishmania.
Una característica importante en la composición lipídica de la membrana del parásito
Leishmania es que poseen ergosterol como principal esterol de membrana, como también
ocurre en hongos y plantas (Roberts et al. 2003). Las diferencias estructurales y
biosintéticas entre ergosterol y colesterol, promueven la búsqueda de inhibidores
enzimáticos que impidan el crecimiento y la expansión del parásito. Los parásitos
Leishmania y Trypanosoma presentan una ruta de síntesis de ergosterol muy similar a la
que desarrollan hongos patógenos. Se ha demostrado que la inhibición de la esterol 24-
metiltransferasa (24-SMT) impide la síntesis del ergosterol, y altera el crecimiento
fúngico y parasitario al modificar la proporción de esteroles en la membrana plasmática. Se
han desarrollado en los últimos años nuevos inhibidores de la 24-SMT de Leishmania y
Trypanosoma cruzi conocidos como azosteroles (Gigante et al. 2009). Se han sintetizado
dos series de compuestos derivados de los azosteroles que se diferencian en la posición (23
ó 25) del grupo amino dentro de la cadena lateral (Gigante et al. 2009). Se ha demostrado
que análogos derivados de la posición N-25 muestran una potente actividad antiparasitaria,
Introducción
39
sobre todo en T. brucei rhodesiense y L. donovani (Gigante et al. 2009). Con respecto a T.
cruzi, los nuevos compuestos mostraron poca actividad, aunque existen derivados que
podrían emplearse frente al mismo (Gigante et al. 2009).
El glicocálix de Leishmania está formado por un conjunto de moléculas ancladas a la
membrana a través de estructuras glicosilfosfatidilinositol (GPI). Dichas moléculas están
relacionadas con la capacidad invasiva e infectiva del parásito. Entre las principales
moléculas de este glicocálix encontramos el lipofosfoglicano (LPG), gp63,
proteofosfoglicanos (PPG), y un grupo de glicolípidos libres llamados
glicoinositolfosfolípidos (GIPLs) (Naderer et al. 2004). La expresión de estas moléculas
varía a lo largo del ciclo de desarrollo (promastigote/amastigote) de Leishmania (Figura
12).
Figura 12: Composición del glicocálix de la forma promastigote y amastigote del parásito Leishmania.
En la fase promastigote, el parásito presenta una gran densidad de macromoléculas ancladas a
glicosilfosfatidilinositol (GPI): lipofosfoglicanos (LPG), glicoproteínas y proteofosfoglicanos (PPG);
debajo de estos complejos macromoleculares existe una capa de GPIs libres. En la forma amastigote, el
principal componente de la superficie externa del parásito son los GPIs, mientras que el resto de
macromoléculas se ven reducidas. Tomado de Ilgoutz y McConville (2001).
Introducción
40
Lipofosfoglicano (LPG): polímero formado por la repetición de un disacárido (galactosa-
manosa) fosforilado; está anclado a la membrana del parásito a través de uniones tipo GPI.
El LPG constituye el principal antígeno de superficie de la forma promastigote del parásito
Leishmania, existiendo alrededor de cinco millones de copias por célula. En el proceso de
metaciclogénesis, en el cual el promastigote se transforma de la forma no infectiva a
infectiva, el LPG experimenta un proceso de elongación doblando el número de unidades
repetidas. El LPG es fundamental para la supervivencia del parásito tanto en el insecto
vector como en la infección de la célula hospedadora; sin embargo, la forma amastigote
presenta una baja expresión de LPG y gp63, aumentando otros glicoconjugados como los
proteofosfoglicanos (PPG) y GPIs que constituyen los principales componentes de la
membrana de la forma intracelular del parásito (Franco et al. 2012).
El LPG evita la degradación del parásito inhibiendo la fusión del lisosoma con el fagosoma,
al inactivar a Rab5/Rab7, proteínas esenciales en la regulación de la fusión endosoma-
lisosoma (Kaye y Scott, 2011); también está implicado en la evasión de la respuesta inmune
al modular la respuesta oxidativa del macrófago (Franco et al. 2012).
Gp63: es una metaloproteasa dependiente de Zinc anclada a la superficie del parásito
mediante enlace GPI. Esta proteasa no solo está presente en las diferentes especies de
Leishmania, sino que además se encuentra en Trypanosoma sp. y Trichomonas vaginalis
(Ma et al 2011a, b).
Gp63 se expresa tanto en promastigotes como en amastigotes, representa el 1% del total de
las proteínas celulares del promastigote en contraposición al amastigote donde sólo llega al
0,1%. Los análisis bioquímicos e inmunológicos indican que en el promastigote, la proteína
gp63 se distribuye por toda la superficie del parásito; sin embargo, en el amastigote, gp63
se localiza en el bolsillo flagelar, está soluble en el citosol y asociada a vesículas y
orgánulos (Hsiao et al. 2008).
Gp63 convierte C3b a C3bi inactivo, evitándose así la actividad citolítica del complemento
(Isnard et al. 2012). También actúa como una opsonina ya que al unirse a los receptores del
complemento del macrófago “cr1 o cr3”, favorece que el parásito sea fagocitado (Franco et
Introducción
41
al. 2012). Parece ser que la función de gp63 en el amastigote está relacionada con la
supervivencia del parásito en el macrófago, al evitar su degradación en el fagolisosoma
(Isnard et al. 2012; Olivier et al. 2012).
En el macrófago, gp63 tiene la capacidad de actuar sobre el factor de transcripción NF-κB,
más concretamente produce la escisión de la subunidad NF-κB p65RelA
, con la consecuente
liberación de p35RelA
, que migra al núcleo y heterodimeriza con NF-κB p50, potenciando la
expresión de genes relacionados con la síntesis de citoquinas que favorecen el
establecimiento de la infección (Gregory et al. 2008).
Se ha demostrado que gp63 activa a la proteína tirosina fosfatasa (SHP-1) que inhibe a la
ruta JAK/STAT implicada en la síntesis de INF-γ, alterando la respuesta inmune innata y
asegurando su supervivencia (Gómez et al. 2009).
Gp63 tiene la capacidad de modular la actividad microbicida de las células NK, ya que
altera la producción de INF-γ y reduce su expansión poblacional (Lieke et al. 2008), estos
resultados sugieren que gp63 podría tener un papel importante en la inhibición de la
respuesta Th1, la cual es crucial para controlar la infección del parásito (Lieke et al. 2008).
Tráfico vesicular en el parásito Leishmania: fenómenos de endocitosis y exocitosis.
Una de las características de la membrana del parásito Leishmania es la presencia de una
densa red de microtúbulos asociados a la cara citoplasmática de dicha membrana. Debido a
la rigidez que impone esta distribución del citoesqueleto, los fenómenos de endocitosis y
exocitosis quedan restringidos a una región de la membrana de la parte apical del parásito
denominada bolsillo flagelar, la cual carece de la red de microtúbulos. La membrana del
bolsillo flagelar representa entre el 0,4 y 3% de toda la superficie celular y consta de toda la
maquinaria necesaria para el desarrollo de los fenómenos de captación de nutrientes vía
endocitosis, secreción de proteínas al medio extracelular, así como factores de virulencia
necesarios para la interacción parásito/célula (Landfear y Ignatushchenko, 2001; Field y
Carrington, 2009).
Introducción
42
En los procesos mencionados anteriormente intervienen multitud de orgánulos celulares,
entre ellos destaca un retículo endoplasmático (RE) ampliamente distribuido en el
citoplasma. Existe un espacio entre la región terminal del retículo endoplasmático (REt) y
la cara cis del aparato de Golgi ocupado por vesículas de 30-50 nm; esto constituiría la
primera región de comunicación entre RE y Golgi. Un aparato de Golgi constituido por 4
ó 6 sáculos orientados a la región de mayor tránsito vesicular procedente del REt.
Adyacente al Golgi aparecen multitud de estructuras túbulovesiculares que constituyen la
región trans-Golgi (TGN); a este nivel aparecen una gran cantidad de vesículas de
aproximadamente 100 nm que establecen un intenso tráfico con el bolsillo flagelar del
parásito. Existe una estructura túbulovesicular que se extiende desde el TGN hasta la parte
posterior de la célula denominado MVT (multivesicular tubule), funcionando como
lisosoma. Finalmente, entre la región TGN y MVT, existe un conjunto de vesículas de un
diámetro de 290 nm, las cuales actúan como intermediarios del transporte entre el aparato
de Golgi y MVT, son los llamados cuerpos multivesiculares o MVBs (Landfear y
Ignatushchenko, 2001; Mullin et al. 2001; Field y Carrington, 2009) (Figura 13). En
Leishmania se ha demostrado la existencia de proteínas SNARE (soluble N-
ethylmaleimide-sensitive factor adaptor proteins receptors), las cuales facilitan la fusión de
las vesículas intracelulares con los orgánulos del parásito (Besteiro et al. 2006a).
Existen factores reguladores del tráfico vesicular; entre estos, tiene especial relevancia la
proteína ADP-ribosylation Factor Like protein 1 (ARL-1), con un tamaño de 20 kDa. Los
genes de la familia ARL están conservados en las distintas especies de Leishmania y
presentan un alto porcentaje de homología con los genes de mamíferos y levaduras. En
Leishmania ARL-1 se expresa en las dos formas biológicas del parásito (Sahin et al. 2008).
Dicha proteína se localiza a nivel del trans-Golgi y es esencial para el mantenimiento de la
integridad del aparato de Golgi y para el tráfico vesicular. La expresión de parásitos
dominantes negativos para la proteína produce alteraciones en el tráfico vesicular (Lu et al.
2001; Sahin et al. 2008).
Existen múltiples proteínas implicadas en la formación de vesículas autofágicas en
Leishmania, destacando a las cisteínas peptidasas ATG4 (ATG4.1 y ATG4.2). Ambas
Introducción
43
proteínas tienen funciones redundantes, aunque los parásitos mutantes nulos para ATG4.2
presentan una mayor reducción de la autofagia y una menor virulencia al compararlos con
parásitos mutantes nulos para ATG4.1 (Williams et al. 2013). Otras proteínas como ATG5
y ATG8 también están asociadas con la correcta biogénesis de los autofagosomas, los
cuales son necesarios para la remodelación celular y/o supervivencia del parásito (Williams
et al. 2012).
Figura 13: Representación esquemática de los orgánulos de Leishmania en las formas promastigote y
amastigote. MVT: túbulo-multivesicular, MVB: Cuerpos multivesiculares (Besteiro et al. 2007).
Introducción
44
Translocación de fosfolípidos en Leishmania.
Las membranas biológicas constituyen los límites de las células y de los orgánulos que la
integran. La composición y distribución lipídica va a depender del tipo celular y del
orgánulo de estudio. En la membrana plasmática de las células eucariotas, los lípidos se
distribuyen de manera asimétrica. En general, los aminofosfolípidos fosfatidilserina (PS) y
fosfatidiletanolamina (PE) se localizan en la cara citoplasmática de las membranas,
mientras que la fosfatidilcolina (PC) y esfingomielina (SM) se ubican fundamentalmente en
la cara externa o exocitoplasmática de la membrana (Van Meer et al. 2008).
El mantenimiento de la asimetría de la membrana en células eucariotas es el resultado de la
actuación de distintas translocasas (Figura 14). En primer lugar destacamos a las ATPasas
de tipo IV (P4-ATPasas), flipasas o fosfolípidos translocasas, estas proteínas se encargan de
transportar PS, PE y PC desde la cara externa a la interna de la membrana plasmática
(López Marques et al. 2014).
En levaduras se han identificado cinco fosfolípidos translocasas: Drs2p, Dnf1p, Dnf2p,
Dnf3p y Neo1p (Hua et al. 2002; Muthusamy et al. 2009). La eliminación de Dnf1p y
Dnf2p suprime la translocación de análogos fluorescentes de PC, PE y PS hacia la cara
interna de la membrana (Pomorski et al. 2003). Del mismo modo, mutaciones en la flipasa
LdMT (L. donovani Miltefosine Transporter) de L. donovani, impide la translocación de
fosfolípidos y del agente leishmanicida miltefosina (hexadecilfosfocolina) hacia el interior
del parásito confiriéndoles resistencia al fármaco (Pérez-Victoria et al. 2003; Pérez-
Victoria et al. 2006).
Estudios posteriores demostraron que LdMT junto con la proteína LdRos3 (perteneciente a
la familia de las Cdc50), forman un complejo estable cuya función principal es la del
mantenimiento de la asimetría de la membrana plasmática del parásito. Parásitos deficientes
para cualquiera de las dos proteínas tienen inhibidos el transporte de análogos de PE y PC
desde la cara externa a la interna de la membrana, obteniéndose como resultado un aumento
de PE en la cara externa de la membrana que rompe la asimetría de la misma (Weingärtner
et al. 2010).
Introducción
45
Figura 14: Translocación de fosfolípidos a través de la membrana. Las fosfolípidos translocasas (P4
ATPasas) transportan fosfolípidos desde la cara externa a la interna de la célula (actividad flipasa). Los
transportadores ABC, translocan fosfolípidos hacia el exterior de la célula (actividad flopasa). Las
escramblasas movilizan fosfolípidos bidireccionalmente. Col: Colesterol, GL: Glicolípidos, PC:
fosfatidilcolina, PE: fosfatidiletanolamina, PS: fosfatidilserina y SM: esfingomielina. Tomado de
Pomorski et al (2004).
En segundo lugar se encuentran los transportadores ABC que actúan como flopasas,
translocando lípidos desde la cara interna a la externa de la membrana plasmática. La
proteína ABCB4 también conocida como MDR3 en humanos y Mdr2 en roedores, fue una
de las primeras proteínas identificadas como flopasa, ya que transloca de forma específica
PC desde la cara interna a la externa de la membrana plasmática de los hepatocitos. La
función de ABCB4 es esencial para mantener los niveles adecuados de PC en la bilis y ésta
actúe de forma eficaz en la emulsión de la grasa (Sharom, 2011).
Existen 48 transportadores ABC de humanos, veinte de los cuales están implicados en el
transporte de lípidos o compuestos relacionados, entre los que destacamos el colesterol,
fosfolípidos, esfingolípidos y esteroles vegetales (Tarling et al. 2013).
Al igual que en el resto de células eucariotas, en el parásito Leishmania están presentes
transportadores ABC que están implicados en la translocación de fosfolípidos desde la cara
interna a la externa del parásito. En nuestro laboratorio se han identificado y caracterizado
transportadores ABC cuya función está relacionada con el tráfico de fosfolípidos; esta
Introducción
46
actividad influye en otros procesos celulares como infectividad y resistencia a fármacos.
Cabe señalar a los siguientes transportadores que serán descritos con mayor detalle en el
apartado de “transportadores ABC de Leishmania”: LtrABC1.1 (Parodi-Talice et al. 2003),
LiABCG4 (Castanys-Muñoz et al. 2007), LiABCG6 (Castanys-Muñoz et al. 2008), y
LABCG2 (Campos-Salinas et al. 2013).
Existe una tercera clase de proteínas implicadas en la movilidad de lípidos a través de la
membrana conocidas como escramblasas. Estas proteínas facilitan el movimiento
bidireccional de lípidos y no dependen del ATP para desarrollar su función; no obstante, su
actividad depende del incremento de los niveles citoplasmáticos de calcio (Bevers y
Williamson, 2010; Weingärtner et al. 2011; dos Santos et al. 2013). Se ha demostrado la
relación entre la exposición de PS en la cara externa de la membrana plasmática y la
actividad escramblasa. La exposición de PS es un mecanismo fundamental en procesos
como la apoptosis y la activación plaquetaria en la coagulación sanguínea (Hankins et al.
2014).
2. TRANSPORTADORES ABC.
Los transportadores ABC (ATP-binding cassette) constituyen una amplia familia de
proteínas altamente conservadas a lo largo de toda la escala evolutiva. Están presentes
desde las bacterias hasta los humanos, desarrollando multitud de funciones fisiológicas. La
resistencia a algunos antibióticos que desarrollan determinados microorganismos y la
multirresistencia a fármacos en células tumorales están relacionados con la actividad de
estos transportadores; sin embargo, la alteración de la función fisiológica de los
transportadores ABC en humanos originan graves patologías como la diabetes,
hipercolesterolemia, fibrosis quística, adrenoleucodistrofia, etc. (Sauvage et al. 2009;
Tarling et al. 2013).
Introducción
47
Los transportadores ABC transportan una gran diversidad de sustratos de forma
unidireccional, funcionan como proteínas importadoras o exportadoras. No existe ningún
ejemplo de transportador ABC que desarrollen ambas funciones.
Los transportadores de tipo importador son fundamentalmente procarióticos y están
implicados en la internalización de moléculas esenciales para la célula como azúcares,
aminoácidos, iones. En el caso de los exportadores, están presentes tanto en organismos
procariotas como en eucariotas y translocan multitud de sustratos, entre los que
destacamos: lípidos, péptidos, proteínas, carbohidratos, metales pesados, fármacos, toxinas,
etc. En eucariotas son proteínas con una ubicación muy diversa a nivel celular, lo que se
relaciona con la alta diversidad de funciones fisiológicas que realizan: transporte de
colesterol, regulación de canales iónicos, presentación antigénica, regulación de la
expresión génica y de la síntesis proteica, etc. (Rees et al. 2009; Sauvage et al. 2009).
2.1. Organización estructural.
Los transportadores ABC están formados por cuatro dominios estructurales: dos dominios
hidrofóbicos transmembrana (TMD) y dos dominios hidrofílicos citosólicos de unión a
ATP (NBD, por su denominación en inglés “Nucleotide Binding domain”) (Ter Beek et
al. 2014) (Figura 15).
Los dominios TMD están constituidos generalmente por seis α-hélices que atraviesan
múltiples veces a la membrana. Los TMDs constituyen la vía mediante la cual los sustratos
son transportados a través de la membrana, y determinan la especificidad del transportador
hacia un determinado sustrato (Wen y Tajkhorshid, 2011; Zolnerciks et al. 2011).
Los dominios NBDs están ubicados en la cara citosólica de la membrana y son
imprescindibles para la funcionalidad del transportador. En estos dominios se produce la
unión e hidrólisis del ATP que aportará la energía necesaria para que ejerzan su actividad.
Introducción
48
Figura 15: Esquema de la organización estructural de un transportador ABC. Se muestran los
dominios hidrofóbicos de transmembrana (en verde) y los dominios citosólicos de unión a ATP (en
rojo).
Dentro de cada NBD encontramos tres motivos muy conservados: los motivos Walker A y
Walker B, y el motivo C o LSGGQ. Además existen otros motivos como el D-loop, y Q-
loop (Wen y Tajkhorshid, 2011; Ter Beek et al. 2014).
El motivo Walker A, también denominado P-loop, está formado por la secuencia
(GXXGXGKS/T) donde X representa a cualquier aminoácido. A este nivel se produce la
unión electroestática del ATP. El motivo Walker B está constituido por Φ4DE/D (Φ
representa a un residuo hidrofóbico). Dicho motivo estabiliza la unión al Mg2+
que actúa
como cofactor en la hidrólisis del ATP, y además participa en el mantenimiento de la
configuración espacial del sitio activo. El motivo C o también denominado motivo sello de
la familia es característico y exclusivo de los transportadores ABCs y está altamente
conservado entre los NBDs. Esta región transmite la señal entre el NBD y el TMD; la
interacción entre el motivo C y el dominio Walker A es de suma importancia para que se
produzca la hidrólisis del ATP.
El motivo D-loop situado después de la región Walker B contiene una secuencia
aminoacídica “SALD” que interviene en la actividad catalítica, y en la intercomunicación
de ambos centros activos.
Introducción
49
La secuencia Q-loop cercana al motivo Walker A, interviene en la señalización entre el
TMD y el centro activo del NBD (Oswald et al. 2006).
Los estudios tridimensionales revelan que los NBDs formarían un dímero simétrico, en el
cual las moléculas de ATP están unidas a los motivos Walker A y Walker B de un NBD y
al motivo C del otro dominio NBD (Figura 16).
Figura 16: Representación esquemática de la interacción del ATP con los motivos Walker A y B del
NBD1 y el motivo C del NBD2 de un transportador ABC. Cis y trans-site hace referencia a la
orientación de los grupos funcionales dentro del complejo molecular. Tomado de Oswald et al. 2006.
2.2. Mecanismo de acción.
Los transportadores ABCs realizan un transporte dependiente de energía, puesto que
necesitan la hidrólisis de ATP para realizar su actividad biológica. La obtención de
estructuras cristalinas de alta resolución como la del transportador Sav1866 de
Staphylococcus aureus han permitido estudiar la disposición de sus dominios en el
transporte de sustratos (Dawson et al. 2007; Oliveira et al. 2011). El transportador Sav1866
consta de una unidad funcional dimérica. Las dos subunidades giran una sobre la otra, esto
Introducción
50
permite que los TMDs y los NBDs interaccionen de forma cercana en el espacio. La unión
del ATP a cada uno de los dominios NBD genera un cambio conformacional que se
transmite a los dominios TMDs. Los TMDs forman un bolsillo o cámara de extrusión
dentro del lado citoplasmático de la membrana que permite la entrada del sustrato, tras el
transporte del sustrato y la hidrólisis del ATP, el transportador vuelve a su configuración
original (Dawson et al. 2007).
El estudio de la estructura cristalina de Sav1866 y de otros transportadores ABCs de
eucariotas como los TAP (implicados en el procesamiento antigénico) han permitido
dilucidar como se efectúa el transporte de sustratos (Procko et al. 2009).
El ciclo de transporte de los transportadores ABCs comienza con la unión específica del
sustrato a regiones concretas de los dominios de TMD. La interacción del sustrato con los
TMDs disminuye la energía de activación necesaria para que se produzca la unión
cooperativa de las moléculas de ATP a los NBDs, favoreciéndose con ello la formación del
dímero cerrado (Procko et al. 2009; Locher, 2009; Zolnerciks et al. 2011). Además, dicha
unión origina un cambio conformacional en el TMD que se transmite a los NBDs para que
se inicie la hidrólisis del ATP. Se ha observado que la unión del ATP promueve la
reorganización del TMD dentro de la membrana (Higgins y Linton, 2004; Oswald et al.
2006; Procko et al. 2009); estos datos sugieren que es la unión del ATP y no su hidrólisis lo
que promueve los cambios conformacionales en los TMDs, quedando en el exterior celular
la región de unión al sustrato, con la consecuente liberación del mismo. Finalmente, la
hidrólisis secuencial de ambas moléculas de ATP devuelve al transportador a su
configuración basal, reestableciéndose el ciclo de transporte (Figura 17).
Existe un modelo alternativo que explica el ciclo catalítico de los transportadores ABCs, y
está basado en el estudio de la proteína Pgp humana. Dicho modelo propone que la
hidrólisis del ATP no se desarrolla al mismo tiempo en ambos NBDs, sino que se alternan
(Al Shawi y Omote, 2005; Jones y George, 2009).
Introducción
51
Figura 17: Esquema del ciclo de transporte de un transportador ABC. Los dominios transmembrana
(TMDs) se representan como cilindros que atraviesan la membrana. Los NBDs ubicados en el lado
citoplasmático se representan a modo de dímero de color verde y azul. El ciclo de transporte se inicia
con la unión del sustrato a su sitio de alta afinidad en el TMD, con ello se aumenta la afinidad del NBD
por el ATP, disminuyendo la energía de activación necesaria para formar el dímero cerrado (Paso 1).
Se unen dos moléculas de ATP y se genera el dímero cerrado (Paso 2). El dímero cerrado induce un
cambio conformacional en los TMDs, quedando el sitio de unión a fármaco expuesto en el exterior
celular, con ello se facilita la liberación del fármaco (Paso 2); seguidamente se hidroliza el ATP de
forma secuencial (Pasos 3 y 4). Finalmente, la liberación del ADP devuelve al transportador a su
configuración original (Paso 5). Tomado Procko et al (2009).
2.3. Transportadores ABC en tripanosomátidos.
2.3.1. Transportadores ABC en Leishmania.
Tras el análisis de la secuenciación del genoma de Leishmania sp, se han identificado 42
genes que codifican para proteínas ABC, lo que representa el 0.5% del total de los genes
(aproximadamente 8.300) existentes en L. major. Al igual que en humanos y plantas, estos
transportadores se han clasificado en distintas subfamilias comprendidas desde ABCA
hasta ABCI (Leprohon et al. 2006; Manzano et al. 2013) (Figura 18).
Introducción
52
Figura 18: Localización cromosómica de los genes que codifican para los transportadores ABC en
Leishmania. Los cromosomas están representados mediante líneas horizontales, y los genes codificantes
para proteínas ABC como rectángulos; los colores identifican a las distintas subfamilias de
transportadores ABC. Las líneas discontinuas debajo de los genes representan a genes que están
agrupados en tándem. Las líneas perpendiculares a los cromosomas separan a genes de una misma
familia que no se ubican en el mismo locus. Adaptado de Leprohon et al (2006).
Leishmania presenta un elevado número de transportadores ABC si la comparamos con
otros tripanosomátidos como Trypanosoma cruzi y Trypanosoma brucei, cuyos análisis de
los genomas revelan que poseen 28 y 22 genes que codifican para transportadores ABC,
respectivamente. Estos datos indican que existe una expansión de las distintas subfamilias
de transportadores ABC en Leishmania (Sauvage et al. 2009), que podrían facilitar la
adaptación del parásito a los distintos microambientes en los que se desarrolla.
Introducción
53
Subfamilia ABCA.
La subfamilia ABCA de mamíferos se compone de 12 transportadores. Dentro de esta
familia destaca ABCA1; una proteína integral de membrana implicada en el transporte de
los fosfolípidos PS, PC y SM, colesterol, y otras moléculas lipofílicas a través de la
membrana. En modelos experimentales se ha confirmado que ABCA1 es un factor
importante en la formación de HDL (lipoproteínas de alta densidad) y en el contenido de
colesterol de los macrófagos (Quazi y Molday, 2013). Una alteración en la función de
ABCA1 produce la enfermedad de Tangier, caracterizada por un acúmulo de colesterol en
los macrófagos, y por una ausencia de partículas de HDL maduras en el plasma (Lorkowski
et al. 2001; Quazi y Molday, 2013).
ABCA2: Es una proteína que presenta un 50% de homología con ABCA1. Se expresa
fundamentalmente en el sistema nervioso central, ovarios y macrófagos (Warren et al.
2009). Estudios recientes han demostrado que ABCA2 interviene en el tráfico del colesterol
derivado del LDL (lipoproteínas de baja densidad). La sobreexpresión de ABCA2 en
células tumorales neuronales disminuye los niveles totales de colesterol en dichas células;
estos resultados sugieren que ABCA2 juega un papel fundamental en la modulación del
colesterol en las neuronas, y está implicado en la regulación del metabolismo del colesterol
(Coleman et al. 2013).
ABCA3: Es un transportador que tiene una elevada expresión en las células del epitelio
alveolar del pulmón (Coleman et al. 2013). En estas células, ABCA3 se localiza en la
membrana de los cuerpos lamelares; orgánulos encargados de la secreción del surfactante
pulmonar (90% lípidos y 10% proteínas surfactantes) necesario para reducir la tensión
superficial del alveolo y que se produzca adecuadamente el intercambio de gases
(Matsumura et al. 2007). ABCA3 está implicado en la translocación de fosfolípidos (PC y
PE) al interior de los cuerpos lamelares. Mutaciones en ABCA3 se ha asociado con
deficiencia de surfactante en neonatos y con otras patologías pulmonares (Shulenin et al.
2004).
Introducción
54
Otro miembro importante es ABCA4, su expresión queda circunscrita a las células
fotorreceptoras. Su principal función es el transporte de PE y retinol conjugado con PE en
células de la retina. ABCA4 aparece mutado en la enfermedad de Stargardt, también
denominada distrofia macular de Stargardt, la cual se manifiesta con una pérdida progresiva
de la agudeza visual como consecuencia de una mayor acumulación de derivados tóxicos
del metabolismo del retinol en las células de la retina (Tsybovsky et al. 2010).
ABCA7: Es una proteína con una elevada expresión en múltiples tejidos: cerebro, riñones,
plaquetas, etc. (Kim et al. 2006). ABCA7 presenta una homología del 54% con ABCA1,
estando implicado en el transporte de PC y SM hacia apoA-1. Los transportadores ABCA1
y ABCA7 actúan transportando los fosfolípidos que serán empleados en la formación del
HDL (Quazi y Molday, 2013).
ABCA12: Se localiza en vesículas intracelulares de los queratinocitos de la piel, estando
implicado en el transporte de lípidos (glucosilceramida) hacia la capa córnea de la
epidermis (Ishibashi et al. 2013). ABCA12 es una proteína esencial para el desarrollo
normal de la piel; mutaciones en este transportador pueden generan graves patologías
dérmicas, como es el caso de la Ictiosis arlequín, caracterizada por una alteración en el
proceso de queratinización de la piel, apareciendo graves lesiones en la piel que son de
carácter crónico (Shibata y Akiyama, 2015).
En Leishmania, la subfamilia ABCA está integrada por diez miembros (ABCA1-ABCA10)
y están presentes en todos los genomas de las distintas especies de Leishmania. ABCA4 y
ABCA8 se han caracterizado en Leishmania tropica y originalmente se denominaron como
LtrABCA2 y LtrABC1.1 (Parodi-Talice et al. 2003; Araújo-Santos. et al 2005). La proteína
LtrABC1.1 se localiza en el bolsillo flagelar y en la membrana plasmática del parásito.
LtrABC1.1 está implicado en el tráfico de fosfolípidos a través de la membrana del
parásito, ya que los parásitos transfectados con LtrABC1.1 presentan una menor
acumulación de análogos fluorescentes de PC, PE y PS. Se ha demostrado que los parásitos
que sobreexpresan LtrABC1.1 tienen una menor exocitosis, fenómeno correlacionado con
una menor exposición de la fosfatasa ácida (SAP) en la superficie del parásito, además son
Introducción
55
menos infectivos (Parodi-Talice et al. 2003).
LtrABCA2 se localiza a nivel del bolsillo flagelar y en vesículas de la ruta endocítica; al
igual que la proteína LtrABC1.1, su función se relaciona con el tráfico de fosfolípidos. La
sobre-expresión de este transportador conlleva a una disminución en la acumulación de
análogos de PC, PE y PS, y a una menor infectividad de los parásitos; igualmente, se ha
observado que estos parásitos tienen incrementada la exocitosis (Araújo-Santos et al.
2005).
Estos transportadores LtrABC1.1 y LtrABCA2 no confieren un fenotipo de resistencia a
fármacos entre los que se incluye alquilfosfolípidos como miltefosina y edelfosina (Parodi-
Talice et al. 2003; Araújo-Santos. et al 2005).
Subfamilia ABCB.
La subfamilia ABCB de mamíferos está formada por cuatro transportadores completos y
siete hemitransportadores o “half-transporters” que necesitan homo u heterodimerizar para
ser funcionales. A esta subfamilia pertenece la glicoproteína Pgp (ABCB1), siendo su
función principal la de proteger a las células de agentes tóxicos. ABCB1 se encuentra
sobreexpresado en células tumorales confiriéndoles un fenotipo de multirresistencia a
fármacos (Li et al. 2010; Chen y Sikic, 2012). ABCB1 también está implicado en el
transporte de fosfolípidos. La purificación de ABCB1 y su posterior reconstitución en
proteoliposomas, reveló su participación en la translocación de análogos fluorescentes de
fosfolípidos NBD-PC, NBD-PE, NBD-PS, NBD-SM, y NBD-glicoesfingolípidos. Los
resultados sugieren que ABCB1 efectúa el transporte de fosfolípidos y fármacos de manera
similar (Romsicki y Sharom, 2001; Coleman et al. 2013).
El transportador ABCB4/MDR3 se expresa en la membrana apical de los hepatocitos y
transporta PC desde los hepatocitos al canalículo biliar (Nicolaou et al. 2012). Mutaciones
en ABCB4 puede conducir a una alteración hepática de carácter grave, la colestasis
intrahepática familiar progresiva tipo 3 (CIFP3), donde se produce una acumulación de
Introducción
56
sales biliares que dañan el epitelio biliar (Nicolaou et al. 2012).
En Leishmania esta subfamilia está constituida por dos transportadores completos y dos
“half-transporters“(Leprohon et al. 2006). ABCB4 o LdMDR1 fue el primer gen
identificado en L. donovani que presentaba mayor homología con la glicoproteína-
P/ABCB1/MDR1 de mamíferos. Al igual que la proteína de mamíferos, confiere resistencia
a múltiples fármacos (fenotipo MDR) como la vinblastina, puromicina, y a análogos de
fosfolípidos como miltefosina, edelfosina (Henderson et al. 1992; Pérez-Victoria et al.
2001). La proteína ABCB4 en L. enrietti y L. mexicana presenta una localización
intracelular, a nivel de compartimentos endocíticos y secretores, destacando el aparato de
Golgi, retículo endoplasmático y el lisosoma terminal o MVT (Dodge et al. 2004).
La localización subcelular de la proteína indica que el mecanismo de resistencia a fármacos
se desarrolla por vías diferentes al eflujo convencional del fármaco a través de la
membrana. Se ha comprobado que los fármacos se acumulan en los compartimentos
endocíticos y se eliminan vía exocitosis.
ABCB2 o LaMDR2 inicialmente se caracterizó en L. amazonensis. Presenta una
localización subcelular similar a la proteína ABCB4. La sobreexpresión de ABCB2
confiere resistencia a 5-fluorouracilo, especulándose que el transportador podría estar
implicado en la extrusión de xenobióticos (Katakura et al. 2004).
Los “half-transporters” ABCB1 y ABCB3 son intracelulares y están localizados en la
membrana de la mitocondria, retículo endoplasmático y lisosomas. No se tiene información
suficiente sobre la función de estos transportadores en la biología de Leishmania.
Subfamilia ABCC.
En la subfamilia ABCC de mamíferos encontramos a doce transportadores que realizan un
gran número de funciones fisiológicas, estando implicados en el transporte de aniones,
conjugados con glutatión, glucorónico y sulfato, ácidos biliares, esteroles, etc. (Dean et al
2001; Dean y Annilo, 2005).
Introducción
57
Un grupo importante de proteínas ABCC están implicadas en los fenómenos de resistencia
a múltiples drogas o MRPs. El fenotipo MRP promueve la eliminación de componentes
tóxicos acomplejados con glutatión y otros aniones orgánicos; este mecanismo se ha
observado en las proteínas ABCC1, ABCC2 y ABCC3 (Zhou et al 2008).
La proteína ABCC1 es uno de los transportadores ABC más estudiados; aunque
inicialmente se identificó por su implicación en la generación de resistencia a determinados
fármacos antitumorales en cáncer de pulmón; actualmente sabemos que su función
principal es la de proteger a los tejidos de agentes tóxicos (Cole, 2014b). ABCC1 se ha
relacionado con el transporte de agentes proinflamatorios como el cisteinil leucotrieno C4,
y existen evidencias que indican que otros mediadores lipídicos pueden ser sustratos de este
transportador (Cole, 2014a). A pesar de que su estructura y funciones se han estudiado con
detalle, existen algunas lagunas en el conocimiento de su fisiología y su posible aplicación
en clínica (Kunická y Soucek, 2014).
Dentro de esta subfamilia destacamos a la proteína ABCC7 también llamada Cystic
Fibrosis TM Conductance Regulator (CFTR); se trata de una proteína que actúa como un
canal de transporte para el cloro, y está regulado vía cAMP (Hunt et al. 2013). Alteraciones
en la función de esta proteína conduce al desarrollo de la fibrosis quística que afecta a
múltiples órganos, y se caracteriza por una secreción anómala de las glándulas exocrinas
del pulmón, hígado y páncreas fundamentalmente. Es una de las enfermedades genéticas
más frecuentes de la raza caucásica (Dean et al. 2001).
En Leishmania ABCC3 (PGPA/MRPA) fue el primer transportador descrito, habiéndose
detectado formando parte de un elemento extracromosómico, amplificado en cepas de
Leishmania resistentes a antimonio y arsenito (Ouellette et al. 1998). La proteína ABCC3
se localiza en vesículas intracelulares próximas al bolsillo flagelar, y confiere resistencia a
antimonio y arsenito en los parásitos, ya que dichos metales pesados son conjugados con
tioles (tripanotión) y secuestrados en el interior de estas vesículas (Legare et al. 2001; El
Fadili et al. 2005; Mandal et al. 2007; Rai et al. 2013).
Introducción
58
La sobreexpresión de ABCC3 en L. donovani, junto con la disminución de la expresión de
la acuagliceroporina 1 (AQP1) y el incremento de los niveles de tioles son usados como
marcadores de resistencia a los antimoniales en aislados clínicos de Leishmania (Rai et al.
2013).
Dentro de esta subfamilia, se ha descrito que el gen ABCC7 confiere resistencia a
pentamidina cuando se sobreexpresa en promastigotes y amastigotes de L. major y L.
amazonensis. ABCC7 presenta una localización subcelular similar a ABCC3; ambas
proteínas están en vesículas intracelulares y están vinculadas a las vías de exocitosis del
parásito (Coelho et al. 2006). La generación de resistencia a pentamidina se obtiene por
secuestro de la misma en el interior de vesículas a nivel del bolsillo flagelar (Coelho et al.
2006; Coelho et al. 2008).
Subfamilia ABCG.
La subfamilia ABCG en mamíferos presenta una organización estructural única, ya que la
disposición de sus dominios es inversa a la del resto de transportadores ABC, presentando
un único NBD en posición N-terminal y un TMD en el extremo C- terminal (Figura 19).
Se han descrito transportadores completos NBD-TMD-NBD-TMD en otros organismos
como S. cerevisiae y Arabidopsis thaliana (Klein et al. 2011; Sugiyama et al. 2006). La
subfamilia está constituida por cinco “half-transporters” (ABCG1, ABCG2, ABCG4,
ABCG5 y ABCG8) tipo NBD-TMD. Las proteínas ABCG deben dimerizar para ser
funcionalmente activas (Velamakanni et al. 2007).
Introducción
59
Figura 19: Organización estructural de un transportador ABCG. Se observa la inversión de sus
dominios, el NBD (rojo) en posición amino y los segmentos transmembrana en el extremo
carboxiterminal (verde).
El transportador ABCG1 humano presenta una elevada expresión en distintos tipos
celulares como adipocitos, macrófagos, hepatocitos, etc.
ABCG1 transporta PS, PC, SM y colesterol, y su función principal es la de mantener unos
niveles normales de esteroles en las vesículas endocíticas que lo distribuyen a nivel
subcelular (Tarling y Edwards, 2011; Hirayama et al. 2013). ABCG1 juega un papel
importante en la prevención del desarrollo de lesiones ateroscleróticas, ya que regula los
niveles de colesterol en el macrófago evitando que éste se transforme en las llamadas
células espumosas, las cuales son muy abundantes en las lesiones arteriales (Klucken et al.
2000; Vaughan y Oram, 2005; Westerterp et al. 2013).
La proteína ABCG2 transporta PS, PC, xenobióticos y antitumorales; presentando una
amplia distribución tisular, expresándose en placenta, glándulas mamarias, tracto
gastrointestinal, vías biliares, riñones, células madres hematopoyéticas, células gliales,
astrocitos, etc. (Kusuhara y Sugiyama, 2007).
ABCG2 presenta una elevada sobreexpresión en células de carcinoma gástrico humano. Se
ha observado que dichas células tumorales presentan una mayor exposición de PS en
superficie comparadas con células controles. Los resultados experimentales demuestran que
la expresión de ABCG2 produce cambios en la distribución de lípidos de la membrana
Introducción
60
plasmática y modifica la asimetría lipídica de la membrana. Estas modificaciones lipídicas
pueden afectar a la interacción celular (Woehlecke et al. 2003).
ABCG4 se expresa de manera abundante en el tejido nervioso cerebral y en la retina neural
(Koshiba et al. 2008; Kim et al. 2008), siendo una de las proteínas que regulan el transporte
de colesterol y otros lípidos en estos tejidos. Recientemente, se ha demostrado que ABCG4
está presente en megacariocitos, regulando los niveles de colesterol de estas células y
controlando la respuesta trombogénica (Westerterp et al. 2014).
Las proteínas ABCG5 y ABCG8 forman una unidad funcional heterodimérica (Graf et al.
2003), y presentan elevados niveles de expresión en la membrana de los hepatocitos. Su
función principal es la del transporte hepatobiliar del colesterol (Cuperus et al. 2014), y
limitar la absorción intestinal de esteroles. Mutaciones en ABCG5 o ABCG8 producen
sitosterolemia, un tipo de enfermedad autosómica recesiva, caracterizada por una
acumulación de esteroles vegetales (sitosterol, campesterol, estigmasterol) y animales
(colesterol) en el plasma y los tejidos (Berge et al. 2000; Lee et al. 2001). La deposición del
exceso de esteroles en las arterias aceleran los fenómenos de aterosclerosis,
incrementándose el riesgo de desarrollar patologías de tipo coronario y cardíaco
(Woodward et al. 2011).
En Leishmania se han descrito seis transportadores pertenecientes a la subfamilia ABCG,
mientras que en T. brucei y T. cruzi sólo existen cuatro.
ABCG4 o LiABCG4 se localiza en la membrana plasmática y bolsillo flagelar de
Leishmania. Una de las funciones de la proteína es el transporte de fosfolípidos y alquil-
fosfolípidos a través de la membrana del parásito. Los parásitos que sobreexpresan la
proteína muestran una menor acumulación del análogo fluorescente de PC, y desarrollan
una resistencia significativa a análogos de alquil-fosfolípidos como la miltefosina,
edelfosina y perifosina, así como a la aminoquinoleína sitamaquina (Castanys-Muñoz et al.
2007).
Introducción
61
ABCG5 o LABCG5 se localiza en cuerpos multivesiculares, y en otras vesículas asociadas
dispuestas entre el bolsillo flagelar y el núcleo. La función de la proteína está relacionada
con facilitar la disponibilidad del grupo hemo procedente de la hemoglobina endocitada por
el parásito. La sobreexpresión de un dominante negativo LABCG5K625M
produce una
disminución en el crecimiento de los parásitos. Este fenotipo puede ser rescatado al
eliminar la sobreexpresión de la versión inactiva de la proteína o suplementando el medio
de cultivo de los parásitos con hemina libre, pero no al añadir hemo en forma de
hemoglobina, de ahí la importancia de la función de LABCG5 en facilitar la disponibilidad
del grupo hemo procedente de la hemoglobina internalizada por el parásito. La
sobreexpresión de LABCG5 no confiere resistencia a los fármacos leishmanicidas y no
afecta al tráfico de fosfolípidos (Campos-Salinas et al. 2011).
ABCG6 o LiABCG6 se localiza en la membrana plasmática y bolsillo flagelar del parásito.
Al igual que LiABCG4, su función está relacionada con el tráfico de fosfolípidos,
observándose una menor acumulación de análogos fluorescentes de PC, PE y PS. También
se ha observado que la sobreexpresión de LiABCG6 genera resistencia a camptotecina,
miltefosina, sitamaquina y cloroquina. La sobreexpresión de LiABCG4 y LiABCG6 en
levaduras, les confieren una menor sensibilidad a los análogos de alquil-fosfolípidos, lo que
afianza el hecho de que estos análogos son sustratos de estas proteínas (Castanys-Muñoz et
al. 2008).
ABCG2 o LABCG2 Se trata de un gen triplicado en tándem en el cromosoma 6 de
Leishmania; presentando ABCG1 y ABCG2 una homología del 93,7%. ABCG3 es un gen
truncado, ya que carece del dominio Walker A, imprescindible para la funcionalidad del
transportador. Estudios preliminares realizados sobre Leishmania infantum mostraron que
la sobreexpresión de una versión inactiva de la proteína LABCG2 produce una menor
externalización de PS en la cara externa en los parásitos, y además presentan una menor
capacidad de infectar a macrófagos peritoneales de ratón (Tesis doctoral Jenny Campos
Salinas, Junio 2008).
Introducción
62
Miembros de las subfamilias ABCD, ABCE, ABCF y ABCH no se han caracterizado a
nivel funcional en el parásito Leishmania spp. En la subfamilia ABCI existen cuatro
transportadores; ABCI1, ABCI2, ABCI3 y ABCI4 que no presentan homología con otros
transportadores de mamíferos, siendo transportadores específicos de tripanosomátidos;
concretamente, ABCI2 es un transportador que únicamente está presente en Leishmania.
Recientemente, nuestro laboratorio ha confirmado que el transportador ABCI4 de L. major
está implicado en el eflujo de metales pesados asociados con tioles y porfirinas tóxicas
(Manzano et al. 2013).
El estudio funcional de estas subfamilias en otros organismos, podría aportar información
sobre las posibles funciones que estos transportadores pueden desarrollar en Leishmania.
2.3.2. Transportadores ABC en otros tripanosomátidos.
Los primeros estudios sobre transportadores ABC en tripanosomátidos se realizaron en
nuestro grupo de investigación en T. cruzi. Los genes caracterizados han sido Tcpgp2
(Dallagiovanna et al. 1994) y Tcpgp1 (Torres et al. 1999). Tcpgp2 presenta cuatro
dominios estructurales: dos dominios TMD y dos dominios NBD. Tcpgp1 carece del
segmento transmembrana 11 y 12, y además presenta en el segundo NBD la inserción de un
retrotransposón. Ambos genes pertenecen a la subfamilia ABCC y su sobreexpresión no
confiere resistencia a fármacos en estos parásitos. Los genes Tcpgp1 y Tcpgp2 son
homólogos de ABCC6 y ABCC2 de Leishmania (Leprohon et al. 2006).
TcABC1 es un gen de T. cruzi que presenta homología con la subfamilia de transportadores
ABCA. TcABC1 es homólogo al transportador ABCA3 de Leishmania que codifica para
una proteína que se localiza en la membrana plasmática y bolsillo flagelar del parásito. La
función del transportador TcABC1 se asocia con fenómenos de endocitosis y tráfico
vesicular (Torres et al. 2004).
En T. brucei, la sobreexpresión del transportador TbABCC2 confiere resistencia a
melarsoprol; sin embargo, la sensibilidad a otros fármacos como suramina o diamidina no
Introducción
63
estaba afectada (Delespaux y de Koning, 2007; Lüscher et al. 2006).
Igualmente, se ha demostrado que una elevada expresión del transportador TbABCC6 no
altera la sensibilidad de los parásitos al melarsoprol, pero si aumenta la resistencia a
suramina. Estudios de inmunofluorescencia en parásitos transfectados con TbABCC2 y
TbABCC6 revelan que TbABCC2 se localiza en la membrana plasmática mientras que
TbABCC6 se localiza en vesículas próximas al bolsillo flagelar. Estos datos sugieren que
los mecanismos de generación de resistencia mediada por estos transportadores son
diferentes; en el caso de TbABCC2 expulsaría el fármaco a través de la membrana,
mientras que TbABCC6 lo secuestraría en el interior de vesículas, fuera de su blanco de
acción.
OBJETIVOS
Objetivos
64
La leishmaniasis es un conjunto de enfermedades parasitarias con una amplia
distribución geográfica, constituyendo un grave problema de salud a nivel mundial. La
leishmaniasis ha experimentado una rápida expansión en las últimas décadas y a éste
fenómeno hay que añadir que la única herramienta de control de esta enfermedad es la
quimioterapia. Sin embargo, la quimioterapia frente a la leishmaniasis se enfrenta a
diferentes problemas como son: un reducido arsenal de fármacos disponibles, un coste
elevado del tratamiento junto con la toxicidad de los fármacos y su pérdida de eficacia
por la generación de resistencias. En este contexto, es urgente la búsqueda de nuevas
dianas terapéuticas que permitan una lucha eficaz contra el parásito.
Los transportadores ABC (ATP-binding cassette) constituyen una de las familias de
proteínas más amplias a lo largo de toda la escala biológica. Son proteínas capaces de
transportar diferentes sustratos a través de las membranas biológicas en un proceso
dependiente de la hidrólisis de ATP. Su implicación en diferentes procesos fisiológicos
les hace que puedan ser considerados como unos candidatos de interés para el desarrollo
racional de fármacos.
El genoma de Leishmania contiene 42 genes que codifican para proteínas ABC, con
miembros representativos de cada subfamilia (desde ABCA hasta ABCI). La subfamilia
ABCG engloba 6 genes (ABCG1-ABCG6) que poseen como característica común que
son hemi-transportadores que necesitan dimerizar para ser funcionalmente activos.
En los últimos años, nuestro grupo ha venido estudiando esta subfamilia de
transportadores, entre ellos el transportador ABCG2 de L. infantum. Los resultados
obtenidos han demostrado que ABCG2 está implicado en el transporte de
fosfatidilserina a la cara externa de la membrana plasmática del parásito. Estos
resultados han servido de base para profundizar en este transportador y determinar si
ABCG2 funciona como una flopasa de fosfatidilserina en otras especies de Leishmania,
y más concretamente en Leishmania major, y su implicación en procesos fisiológicos
relevantes para el parásito.
En la presente tesis doctoral, nos planteamos como objetivo general el análisis
funcional del transportador ABCG2 en L. major, determinando su actividad como
flopasa de fosfatidilserina y su implicación en la infectividad y virulencia del parásito.
Objetivos
65
Para ello desarrollamos los siguientes objetivos específicos:
a) Determinar la implicación de ABCG2 en el transporte de fosfolípidos y su
actividad flopasa de fosfatidilserina en L. major, empleando parásitos
dominantes negativos y mutantes nulos para ABCG2.
b) Estudiar la localización subcelular de ABCG2 en L. major y su relación con su
función biológica.
c) Conocer la implicación de ABCG2 en la infectividad de L. major en macrófagos
peritoneales de ratón y en el desarrollo de la enfermedad en un modelo murino
de leishmaniasis cutánea.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
66
1. MATERIALES.
1.1. Líneas celulares.
A) Parásitos.
Leishmania major clon VI (MHOM/IL/80/Friedlin).
B) Bacterias.
Todas las cepas empleadas en las diferentes técnicas de biología molecular
corresponden a Escherichia coli.
B.1) TOP10 con Genotipo: F- mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15
ΔlacX74 recA1 deoR araD139 Δ (ara-leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1
nupG (Invitrogen).
B.2) DH5α con Genotipo: supE44 ΔlacU169 (φ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1
endA1 gyrA96 thi-1 (Gibco).
1.2. Medios de cultivo para Leishmania.
El medio empleado para el cultivo in vitro de L. major es RPMI 1640 modificado,
suplementado con el 20% de suero bovino fetal (Invitrogen) inactivado por calor a 56ºC
durante 45 minutos (SBFi).
El medio está constituido por 8,2 gramos de RPMI 1640 (Gibco), 4,75 g de Hepes, 1,6 g
de bicarbonato sódico, 100 ml de solución de aminoácidos, azúcares y ácidos orgánicos
(SAA) 10X y 0,2 ml de vitaminas (1.000X) en 800 ml de H2O. El pH se ajusta a 7,2 y
se esteriliza por filtración. Se suplementa con SBFi al 20%.
La solución de aminoácidos, azúcares y ácidos orgánicos (SAA 10X) está compuesta
por arginina 4,4 mg/ml, cistina 0,8 mg/ml, glutamato 2,5 mg/ml, glutamina 16,4 mg/ml,
prolina 69 mg/ml, L-ornitina 1 mg/ml, glucosa 7 mg/ml, fructosa 4 mg/ml, malato 6,7
mg/ml, α-cetoglutarato 3,7 mg/ml, fumarato 0,55 mg/ml y succinato 0,6 mg/ml.
Materiales y Métodos
67
Las vitaminas (1000X) que complementan al medio son las siguientes: pantotenato
cálcico 1 mg/ml, cloruro de colina 1 mg/ml, ácido fólico 1 mg/ml, clorhidrato de
piridoxal 1 mg/ml, clorhidrato de tiamina 1 mg/ml, I-inositol 20 mg/ml, nicotinamida 1
mg/ml y riboflavina 0,1 mg/ml.
1.3. Medio de congelación para Leishmania.
Se compone de 90% de SBFi más 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
1.4. Antibióticos de selección para Leishmania.
1) Geneticina (G-418) (Gibco): Se utilizó para seleccionar a los parásitos transfectados
con vectores o cassettes de integración que contienen el gen de la neomicina
fosfotransferasa que confiere resistencia a varios antibióticos aminoglicósidos.
La selección se inicia con una concentración de 5 µg/ml de geneticina, incrementándose
la concentración en pases sucesivos (50 µg/ml, 100 µg/ml, 200 µg/ml). La máxima
concentración empleada para el mantenimiento de los parásitos seleccionados es de 500
µg/ml.
2) Higromicina B (Invitrogen): Antibiótico empleado para seleccionar a los parásitos
transfectados con vectores o cassettes de integración que contienen el gen de resistencia
a higromicina, la higromicina fosfotransferasa. Al igual que la geneticina, los parásitos
son sometidos a concentraciones crecientes de antibiótico y mantenidos en cultivo hasta
una concentración final de 500 µg/ml de antibiótico.
3) Nourseotricina (Werner BioAgents): Se utilizó para la selección de parásitos
transfectados con vectores específicos para Leishmania y que contienen el gen de
resistencia estreptotricina acetiltransferasa. En este caso, la concentración máxima de
antibiótico empleada para el mantenimiento de los cultivos fue de 100 µg/ml.
Materiales y Métodos
68
1.5. Medios de cultivo para bacterias.
1.5.1. LB líquido.
El medio se compone de 10 g de bactotriptona, 10 g de NaCl y 5 g de extracto de
levadura para 1 litro de agua bidestilada. El pH se ajusta a 7,5 y se esteriliza mediante
autoclavado.
1.5.2. LB Agar.
Constituido por Bacto Agar al 1,5% en LB líquido. Se esteriliza mediante autoclave.
1.6. Medio de congelación para bacterias.
Se emplea 15% de glicerol en LB líquido.
1.7. Tampones y soluciones generales.
1. Tampón fosfato salino (PBS): NaCl 130 mM, KCl 2,6 mM, KH2PO4 1,2 mM,
Na2HPO4 8,1 mM. Ajustar a pH 7.
2. Tampón HBS: NaCl 137 mM, KCl 5 mM, Na2HPO4 7 mM, glucosa 6 mM y
Hepes 21 mM. Ajustar a pH 7,4. Es el vehículo utilizado en los experimentos de
transfección de ADN a los parásitos.
3. Tampón HPMI: NaCl 132 mM, KCl 3,5 mM, MgCl2 0,5 mM, CaCl2 1 mM,
glucosa 5 mM y Hepes 20 mM. Ajustar a pH 7,4. Se emplea en los ensayos de
acúmulo de análogos de fosfolípidos.
4. Tampón Anexina V: NaCl 132 mM, KCl 3,5 mM, MgCl2 0,5 mM, CaCl2 5
mM, glucosa 10 mM y Hepes 20 mM. Ajustar a pH 7,4.
5. TAE 10X (1 litro): Tris 0,4 M, EDTA 10 mM, ácido acético glacial 11,42 ml.
Se emplea en la electroforesis de ADN.
Materiales y Métodos
69
6. Solución de carga para ADN 6X: azul de bromofenol 0,25%, xileno cianol
0,25%, glicerol 30%.
7. Tampón TE: Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM. Ajustar a pH 7,4. Se utiliza en la
elución de muestras de ADN (plásmidos, PCR, etc.).
1.8. Tampones de carga para electroforesis de proteínas.
1. Laemmli 2X: SDS 4%, glicerol 20%, β-mercaptoetanol 10%, azul de
bromofenol 0,004% y Tris-HCl 0,125 M. Ajustar a pH 6,8.
2. Cracking Buffer: NaH2PO4 10 mM, β-mercaptoetanol 1%, SDS 1%, urea 5 M.
Ajustar a pH 7,4 con NaOH 1 M.
1.9. Soluciones y reactivos para electroforesis de proteínas.
1. Tampón de electroforesis de proteínas (10X): Tris-HCl 0,25 M, glicina 1,92
M y SDS 1%. El pH se ajusta a 8,3 y se filtra.
2. Tampón concentrador: Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 y SDS 0,4%. Se emplea
filtrado.
3. Tampón separador: Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 y SDS 0,4%. Se emplea filtrado.
4. Acrilamida-bisacrilamida: (Bio-Rad).
5. Persulfato de amonio: Se prepara a una concentración de 100 mg/ml en agua y
se filtra.
6. N, N, N’, N’-tetrametiletilenediamina (TEMED): (Bio-Rad).
1.10. Soluciones y reactivos para Southern blot.
1. Solución de despurinización: HCl 0,25 M.
2. Solución de desnaturalización: NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M.
3. Solución de neutralización: Acetato de sodio 3 M pH 5,5.
Materiales y Métodos
70
4. Solución de transferencia: SSC 20X: NaCl 3 M y citrato de sodio 0,3 M.
Ajustar a pH 7.
5. Solución de maleico: NaCl 150 mM y ácido maleico 100 mM, pH 7,5.
6. Tampón de lavado: Solución de maleico más Tween-20 al 3%.
7. Reactivo de bloqueo Southern: Solución comercial. (Roche).
8. Solución de bloqueo: 10 ml Reactivo de bloqueo más 90 ml de solución de
maleico.
9. Solución de prehibridación e hibridación para Southern (DIG Easy Hyb
Granules): Se utiliza para diluir la sonda previamente marcada. (Roche).
10. DIG DNA Labeling Mix 10X: Buffer de marcaje para sondas a usar en
Southern blots. (Roche).
11. Hexanucleótidos Mix 10X: Empleados en el marcaje de sondas para Southern
blots con digoxigenina. (Roche).
12. Enzima Klenow (2U/µl): Enzima utilizada en el marcaje de sondas para
Southern con digoxigenina. (Roche).
13. Deoxiuridintrifosfato unido a digoxigenina (DIG-11-dUTP): (Roche).
14. Anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina: (Roche).
15. Tampón de detección: Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCl2 50 mM. Ajustar a
pH 9,5.
16. Nitroazul de tetrazolio (NBT) y 5-bromo-4-cloro-3’-indolfosfato (BCIP):
(Roche).
17. Solución de revelado: 10 ml de tampón de detección más 200 µl de NBT/BCIP.
1.11. Vectores plasmídicos y construcciones.
1.11.1. Vectores de clonaje.
1. pGEMT: Vector de clonaje que posee residuos libres de desoxitimidina en los
extremos 3’. Se utiliza para subclonar fragmentos de ADN amplificados por
PCR. (Promega).
Materiales y Métodos
71
1.11.2. Vectores de expresión para Leishmania.
1. pUCNeoPlus: Se trata de un vector de expresión para Leishmania y es un
derivado del vector pX al que se le modificó la región de clonación múltiple
(polylinker) (Parodi-Talice et al. 2003). El vector contiene un cassette neo que
codifica para la neomicina fosfotransferasa que confiere resistencia a la
geneticina (LeBowitz et al. 1990).
2. pIR1SAT: Vector de expresión para el parásito Leishmania (Andreas y
Beverley. 1998). Este vector consta del gen de resistencia a la estreptotricina
acetiltransferasa (SAT) y confiere resistencia a la nourseotricina.
3. pXG-’GFP+: Vector derivado del pX que permite crear proteínas fusionadas
con la proteína verde fluorescente GFP en el extremo carboxilo terminal (Ha et
al. 1996).
4. pXG-GFP2+’: Este vector de expresión nos permite crear proteínas de fusión
marcadas con GFP en el extremo amino terminal. (Ha et al. 1996).
Estos vectores ampliamente utilizados para el estudio funcional de múltiples proteínas
fueron cedidos a nuestro laboratorio por el Dr. Stephen M. Beverley, (Washington
University, School of Medicine, USA).
En el laboratorio ya estaban disponibles las siguientes construcciones:
1. pUCNeoABCG2. Construcción que contiene el gen ABCG2 clonado en el
vector pUCNeoPlus.
2. pUCNeoABCG2K108M
. Contiene la versión mutada del gen ABCG2
(ABCG2K/M
), para ello se realizó una mutagénesis dirigida sobre
pUCNeoABCG2, mediante la cual se sustituyó un residuo de lisina por una
metionina en el motivo Walker A (posición 108) del NBD. La construcción
resultante se denominó ABCG2K/M
.
Materiales y Métodos
72
1.12. Oligonucleótidos.
1.12.1. Oligonucleótidos empleados para el clonaje de ABCG1 y ABCG2 en vectores
de expresión para Leishmania.
1.12.2. Oligonucleótidos utilizados en la mutagénesis de ABCG2
1.12.3. Oligonucleótidos empleados para el análisis de la expresión de ABCG1 y
ABCG2 mediante RT-PCR en parásitos transfectados.
Materiales y Métodos
73
1.12.4. Oligonucleótidos empleados para la construcción del cassette utilizado en la
generación de parásitos mutantes nulos para ABCG1 y ABCG2 mediante
recombinación homóloga.
1.12.5. Oligonucleótidos empleados para la obtención de sondas de ADN empleadas
para confirmar la deleción de los genes ABCG1 y ABCG2.
Todos los oligonucleótidos utilizados para el clonaje de ABCG1 y ABCG2 y los
empleados en otras técnicas de biología molecular (RT-PCR, Southern blots) se
sintetizaron en el Servicio de Síntesis de Oligonucleótidos del Instituto de Parasitología
y Biomedicina López-Neyra (CSIC), Granada. Las letras minúsculas corresponden a
secuencias no presentes en el ADN genómico del parásito y se corresponden a sitios de
restricción. En los oligonucleótidos diseñados para mutagénesis dirigida, las letras en
minúscula y de color rojo representan el lugar en el que se han introducido las
mutaciones.
Materiales y Métodos
74
1.13. Reactivos para el estudio funcional del transportador ABCG2 de L. major.
1. Bromuro de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium] (MTT): Se
emplea para evaluar la viabilidad de las células. Se prepara a una concentración
de 5 mg/ml en PBS y se filtra. Se almacena a -20ºC. (Sigma).
2. Resazurina: Es un colorante vital usado para determinar la viabilidad de las
células. (Sigma).
3. Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF): Utilizado como inhibidor de lipasas.
Se disuelve en isopropanol a una concentración de 100 mM. Se utilizó en los
ensayos de acumulación de análogos fluorescentes de fosfolípidos. (Sigma).
4. Diisopropilfluorofosfato (DFP): Empleado como inhibidor de lipasas. Se
disolvió en isopropanol a una concentración de 1 M. Al igual que el PMSF, se
empleó en los ensayos de acumulación de análogos fluorescentes de
fosfolípidos. (Sigma).
5. C6-NBD-fosfolípidos: Son análogos de fosfolípidos fluorescentes de cadena
corta. La fluorescencia es aportada por el grupo nitrobenzoxadiazol. Se
utilizaron los siguientes análogos: fosfatidilcolina (C6-NBD-PC),
fosfatidiletanolamina (C6-NBD-PE), fosfatidilserina (C6-NBD-PS) y
esfingomielina (C6-NBD-SM). (Avanti Polar Lipids).
6. Anexina V-Alexa Fluor 488: Se utilizó para determinar la exposición de PS en
la cara externa de la membrana de los parásitos. (Invitrogen).
7. Diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina (H2DCF-DA): Sonda
fluorescente empleada para detectar la producción de ROS (peróxido de
hidrógeno, radicales hidroxilo y peroxinitrito). (Invitrogen).
8. Péptido-Ro (Ro09-0198): Proporcionado por el Dr. Masato Umeda, (The
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, Japan). Se trata de un
péptido tetracíclico con función antibiótica. Se une de forma específica a la
fosfatidiletanolamina expuesta en la cara externa de la membrana plasmática de
las células alterando la permeabilidad celular (Aoki et al. 1994; Kato et al.
2002).
9. Papuamide B: Cedido al laboratorio por el Dr. Thomas Gunther Pomorski y la
Dra. Rosa López (Department of Plan Biology and Biotechnology, University
of Copenhagen, Denmark). Es un péptido antibiótico obtenido de extractos de
Materiales y Métodos
75
esponjas marinas y tiene la capacidad de unirse a la fosfatidilserina expuesta en
la cara externa de la membrana plasmática de las células alterando la
permeabilidad celular (Parsons et al. 2006).
10. Anfotericina B: Antifúngico que se une de forma específica al ergosterol de las
células. (Sigma).
11. Aglutinina de cacahuete (PNA): Lectina que se une al lipofosfoglicano (LPG)
de las formas promastigotas de L. major. Se utiliza en la purificación de
parásitos metacíclicos mediante selección negativa de las formas metacíclicas
del parásito (PNA-). (Vector Laboratories).
12. Aglutinina de ricino conjugada con fluoresceína: Empleada para el análisis
cuantitativo del LPG de los parásitos. (Vector Laboratories).
13. Dimetilsulfóxido (DMSO): Se usa para la congelación de las distintas líneas de
parásitos. Nos permite tener un stock de parásitos que pueden ser utilizados en
experimentos futuros. (Sigma).
1.14. Sondas empleadas para el marcaje de los orgánulos subcelulares de
Leishmania.
1. FM4-64 y Concanavalina A-Alexa Red: Empleados para el marcaje de
endosomas, lisosomas y membrana plasmática del parásito. (Invitrogen).
2. MitoTracker Deep Red 633: Marcador específico de la mitocondria.
(Invitrogen).
3. Cell Tracker Green: Empleado para el marcaje fluorescente de células vivas.
(Invitrogen).
4. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI): Se une a regiones del ADN ricas en AT.
Utilizado en microscopía de fluorescencia para visualizar el material genético de
las células. (Invitrogen).
Materiales y Métodos
76
1.15. Reactivos para la inmunodetección mediante Western blot y citometría de
flujo.
1. Solución de bloqueo: Leche desnatada en polvo al 5% en PBS. También se
puede emplear BSA al 1% y Tween-20 al 0,05% en PBS.
2. Solución de transferencia: Tris base 25 mM y glicina 192 mM.
3. Kaleidoscope prestained standards: Marcador de peso molecular. (Bio-Rad).
4. Rojo de Ponceau: Solución de Rojo de Ponceau-S al 0,5% y ácido acético al
1%. Esta solución tiñe las proteínas y se utiliza para verificar que la
transferencia de proteínas desde el gel a la membrana se haya efectuado
correctamente. (Bio-Rad).
5. Membranas de transferencia Immobilon-P (PVDF): Membranas de
polifluoruro de vinilideno. Utilizadas en Western blot. (Millipore).
6. Pierce ECL Western Blotting Substrate: Sistema de revelado de Western-blot
mediante la enzima peroxidasa. Se compone de dos soluciones: 1: Detection
Reagent peroxidase solution y 2: Detection Reagent Luminol Enhancer
solution. (Thermo Scientific).
7. Anticuerpo policlonal anti-GFP de conejo: (Rockland Company).
8. Anticuerpos anti-IgG de conejo y ratón conjugados con peroxidasa: (Dako).
9. Anticuerpo policlonal para el marcador específico de parásitos metacíclicos
(HASPB): Proporcionado por la Dra. Deborah F. Smith (University of York,
UK).
10. Anticuerpo frente a la proteína mitocondrial HMGCoA sintasa (HMGS):
Cedido por los Dres. D. González-Pacanowska y L.M. Ruiz-Pérez (Instituto de
Parasitología y Biomedicina López-Neyra, IPBLN-CSIC, Granada) (Carrero-
Lérida et al. 2008).
11. Anticuerpo monoclonal anti-α-tubulina: (Sigma).
12. Anticuerpo monoclonal anti-gp63: (Life Span BioSciences). Empleado para
detectar la expresión de gp63 en la superficie del parásito mediante citometría de
flujo.
13. Anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína
(FITC): (Sigma).
Materiales y Métodos
77
14. Anticuerpo anti-histona H2A: Cedido por el Dr. Stephen M. Beverley,
(Washington University, School of Medicine, USA).
15. Albúmina de suero bovino (BSA): (Sigma).
16. Albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos: (Sigma).
17. Tween-20: (Merck).
1.16. Reactivos utilizados en biología molecular.
1. Agarosa: (Pronadisa y Electran-VWR).
2. Bromuro de etidio: (Sigma).
3. Marcadores de peso molecular: Lambda DNA/HindIII y phi174
DNA/HaeIII. (Promega).
4. Isopropil-β-D-tiogalacto-piranósido (IPTG): Disuelto en agua a una
concentración de 0,5 M. (Roche).
5. 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-galactopiranósido (X-Gal): Disuelto en
dimetilformamida a 20 mg/ml. (Roche).
6. Ampicilina: Solución stock a 100 mg/ml en agua. (Sigma).
7. Fenol: (Sigma).
8. Filtros de nilón Amersham Hybond-N®: Membranas para Southern. (GE
Healthcare).
9. Enzimas de restricción: (Roche y Fermentas).
10. Desoxinucleótidos: (Roche).
11. Fosfatasa alcalina: (Roche).
12. Plasmid DNA Mini Kit I: Kit de extracción de plásmidos (miniprep). (VWR-
OMEGA).
13. PureGene™: Kit de extracción de ADN genómico. (Gentra Systems).
14. Gel extraction Kit: Kit de purificación de fragmentos de ADN en geles de
agarosa. (VWR-OMEGA).
15. Elute Gel Extraction Kit: Kit para la purificación con alta eficiencia de
fragmentos de ADN en geles de agarosa. (QIAGEN).
16. AmaxaTM
Human T cell Nucleofector TM
Kit: Empleado para la transfección
de ADN lineal y plasmídico a los parásitos. (Lonza).
Materiales y Métodos
78
17. Quick Change® III XL site-directed mutagénesis kit: Utilizado para realizar
mutagénesis dirigida in vitro. (Stratagene).
18. T4 DNA ligasa: Utilizada para incorporar secuencias de ADN en determinados
vectores (plásmidos). (Invitrogen).
19. TripleMaster® PCR System: Kit utilizado para amplificar determinadas
secuencias de ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa.
(Eppendorf).
Materiales y Métodos
79
2. MÉTODOS.
2.1. Parásitos.
2.1.1. Cultivo in vitro de Leishmania.
Los promastigotes de L. major clon VI (MHOM/IL/80/Friedlin), se cultivaron in vitro a
28 ºC en RPMI modificado suplementado con 20 % de SBFi. Los parásitos se
mantienen en cultivo mediante pases realizados tres veces por semana. Estos pases
consisten en la resiembra de 4 x 106
promastigotes/ml en un volumen final de 5 ml de
medio fresco. Se emplean frascos de cultivos estériles de 25 cm2. El parásito
Leishmania también puede crecer en medio semisólido formando colonias, para ello se
adiciona agar a una concentración final del 1% en RPMI modificado (pH 6,5) y
suplementado con 20% de SBFi. El medio se deja solidificar en placas de Petri y se
siembran de 500 a 1000 parásitos por placa. Este método de cultivo se emplea para
subclonar poblaciones de parásitos.
2.1.2. Criopreservación y descongelación de parásitos.
El volumen total de un cultivo de Leishmania en fase logarítmica de crecimiento se
centrifuga a 2000 x g y a una temperatura de 4 ºC. El pellet se resuspende en 1 ml de
medio de congelación (90% SBFi + 10% DMSO); posteriormente se distribuye en
viales de congelación que se depositaran en “tanques” de isopropanol, con ello se
facilita que la congelación a -80ºC se realice de forma gradual. Posteriormente, las
muestras pueden ser introducidas en nitrógeno líquido para su almacenaje.
La descongelación se efectúa de forma rápida, para ello los viales de congelación se
introducen en un baño a 37ºC, posteriormente se centrifugan para eliminar los restos de
DMSO y el pellet se resuspende en 5 ml de RPMI modificado con un 20% SBFi. De
este modo, los parásitos ya están preparados para ser cultivados a 28 ºC.
Materiales y Métodos
80
2.1.3. Transfección de parásitos mediante electroporación.
La electroporación es una técnica mediante la cual introducimos material genético en las
células usando un campo eléctrico. Promastigotes de L. major en fase logarítmica tardía
de crecimiento se lavan dos veces con PBS y una vez con HBS. Tras el último lavado
con HBS, los parásitos se resuspenden a una concentración de 25-30 x 106
en 400 µl de
HBS y se mezclan con 15 ó 20 µg de ADN plasmídico, depositado previamente en la
cubeta de electroporación; esta mezcla se incuba durante 10 minutos en hielo. La
transfección se realiza mediante electroporación en el sistema ECM 600 de BTX,
utilizando como condiciones 450 V y 500 µF. Finalizada la electroporación, los
parásitos se incubaron 10 minutos en hielo y se transfirieron a 5 ml de medio RPMI
modificado con un 20% SBFi, incubándose a 28 ºC. A las 24 horas se añade el
antibiótico de selección, en el caso de la geneticina (G418) y nourseotricina se emplea
una concentración inicial de 5 µg/ml. Tras sucesivos pases en medio con
concentraciones crecientes de antibióticos, los parásitos controles (electroporados con el
vehículo de la transfección o HBS) se mueren, mientras que los parásitos transfectados
con el vector suelen mantenerse en 100 µg/ml de G418 y en 50 µg/ml de nourseotricina.
Los parásitos transfectados con ABCG2 fusionado a GFP se mantienen en cultivo a
concentraciones máximas de 500 µg/ml de G418.
El protocolo de transfección para obtener parásitos mutantes nulos para ABCG1 y
ABCG2 (ABCG1+G2) presenta una serie de modificaciones: 1º- Se centrifugaron 5 x
107
de parásitos y se resuspendieron en 100 µl de Human T Cell Nucleofector Solution
(Amaxa Nucleofector System). 2º- La construcción (cassette de resistencia a
higromicina o geneticina, ambos flanqueados por 1,5 Kb de la región 5’ UTR del gen
ABCG2 y 1,5 Kb de la zona 3’ UTR del gen ABCG1) diseñada para sustituir a los genes
ABCG1 y ABCG2 se linearizó con las enzimas NotI/BamHI. 3º- Se incubaron 5 x 107
parásitos con 2 µg de la construcción lineal durante 10 minutos en hielo. 4º-
Electroporación de los parásitos usando el programa U-033 del Nucleofector. 5º-
Transferencia de los parásitos a 5 ml de medio RPMI modificado con un 20% de SFBi.
6º- Por dilución límite, se seleccionaron diversos clones en presencia de 20 µg/ml de
higromicina. La integración de la construcción en el genoma se comprobó mediante
Materiales y Métodos
81
Southern blot. El método de obtención de parásitos mutantes nulos se describe
exhaustivamente en el apartado 2.8.2.
2.1.4. Ensayos de viabilidad celular en Leishmania mediante el método
colorimétrico MTT.
Mediante esta técnica podemos determinar la resistencia o susceptibilidad de los
parásitos a determinados compuestos o fármacos. Se basa en la capacidad que tienen las
deshidrogenasas mitocondriales y citosólicas del parásito de transformar el sustrato
bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2yl]-2,5-difeniltetrazolio (MTT), soluble y de color
amarillo, en el producto formazán de coloración violácea e insoluble. La cantidad de
producto obtenido es directamente proporcional al número de células viables. Para
realizar ensayos frente a compuestos leishmanicidas, los parásitos se siembran a
300.000/pocillo en un volumen final de 100 µl de RPMI + 20% de SBFi en una placa de
microtitulación de 96 pocillos. En el caso de los ensayos de susceptibilidad a péptidos
tóxicos (papuamide B y péptido Ro) se inicia el cultivo con 50.000 parásitos/pocillo.
Posteriormente, los parásitos se incubaron durante 72 horas a 28 ºC con las diferentes
concentraciones de fármacos y péptidos. Transcurrido este tiempo, se añadieron 10 µl
de la solución de MTT, y se incubaron las placas durante 4 horas en oscuridad a 28 ºC
para facilitar la formación de los cristales de formazán. Finalmente, los cristales se
solubilizan con SDS al 20%, cuantificándose la reducción del compuesto MTT
mediante un lector de ELISA leyendo a una DO540.
A partir de los ensayos colorimétricos de MTT podemos determinar la concentración
inhibitoria 50 (IC50), la cual se define como la concentración de inhibidor que reduce
en un 50 % el crecimiento de los parásitos. El porcentaje de crecimiento se calcula
dividiendo la absorbancia a una determinada concentración de inhibidor entre la
absorbancia de las células control crecidas en ausencia del mismo.
Materiales y Métodos
82
2.2. Bacterias.
2.2.1. Cultivo de bacterias.
Para el mantenimiento y expansión de Escherichia coli se emplea medio LB. En LB
líquido, las bacterias se cultivaron en agitadores orbitales a 37 ºC y 180 rpm en
presencia del antibiótico de selección. También se cultivaron en placas de Petri de 90
mm que contenían medio LB sólido; dicho medio se prepara añadiendo agar a una
concentración final del 1,5%. Las placas se incuban en la estufa a 37 ºC durante 14-16
horas. Las bacterias se conservan a -80 ºC en medio LB líquido suplementado con 15%
de glicerol.
2.2.2. Preparación de células competentes y transformación por choque térmico.
Se crecieron 5 ml de bacterias en medio LB líquido y en agitación a 37 ºC durante 16
horas. Se inoculó 1 ml del pre-cultivo anterior en 200 ml de LB y se deja crecer hasta
que el cultivo alcanza una DO600 de 0,375. Seguidamente, el cultivo se deja enfriar en
hielo durante 15 minutos y se centrifugó durante 10 minutos a 3500 x g a 4 ºC.
Desechamos el sobrenadante y resuspendemos las células en 1/5 del volumen inicial en
MgCl2 0,1 M estéril y frío e incubamos la suspensión en hielo durante 15 minutos.
Nuevamente se volvió a centrifugar durante 10 minutos a 3500 x g a 4 ºC y se eliminó
el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 1/50 del volumen inicial con CaCl2
0,1 M estéril y frío, y esta suspensión se incubó durante una hora en hielo. A
continuación se añadió glicerol hasta obtener una concentración final del 15%. Las
células se alicuotearon en 200 µl en tubos eppendorf enfriados previamente y se
guardaron a -80 ºC hasta su uso.
Para la transformación, las células competentes se descongelaron y se les añadió el
plásmido o la correspondiente mezcla de ligación de ADN. A continuación se realizó un
choque térmico, para ello las células se incubaron durante 30 minutos en hielo, 45
segundos a 42 ºC y 2 minutos en hielo. Se añadió 500 µl de LB y las células se
incubaron durante 1 hora a 37 ºC y en agitación orbital a 180-200 rpm. Finalmente, una
alícuota de la mezcla anterior se sembró en medio LB sólido con el correspondiente
antibiótico de selección (ampicilina) y se incubó a 37 ºC durante 14-16 horas.
Materiales y Métodos
83
2.3. Extracción de ácidos nucleicos.
2.3.1. Aislamiento de ADN genómico de L. major.
Se realizó siguiendo el protocolo del kit PureGene™, empleando aproximadamente 1 x
108 parásitos. El ADN extraído se resuspendió en agua milliQ estéril y se midió su
concentración usando un espectrofotómetro tipo Nanodrop.
2.3.2. Aislamiento de ADN plasmídico procedente de cultivos bacterianos.
Para extraer ADN plasmídico procedente de cultivos bacterianos (5 ml), se empleó el kit
de miniprep Plasmid DNA Mini Kit. El método de extracción se basa en una lisis
alcalina. El sobrenadante procedente de la lisis bacteriana se pasa por una resina y el
ADN plasmídico retenido en la misma se eluye con tampón TE o agua milliQ estéril. El
protocolo se realizó según las recomendaciones del fabricante.
2.3.3. Purificación de ADN procedente de una electroforesis en geles de agarosa.
El fragmento de ADN se extrae del gel mediante un corte con bisturí, posteriormente la
agarosa se disuelve en un tampón proporcionado por el kit Gel extraction (VWR-
OMEGA) a una temperatura de 60 ºC durante 10 minutos. Una vez disuelta la agarosa,
se deposita sobre una columna que retiene el ADN, finalmente se lavan las columnas
con etanol para eliminar impurezas, y el ADN se eluye en tampón TE o agua estéril.
Para purificar fragmentos de ADN con alta eficiencia usamos el kit Elute Gel Extraction
(QIAGEN).
2.3.4. Digestión del ADN con enzimas de restricción.
Las enzimas y los tampones necesarios para el tratamiento enzimático del ADN se
utilizaron en base a las recomendaciones de la casa comercial. Se utilizó de 1 a 10 U de
enzimas por cada microgramo de ADN a digerir, en un volumen final de reacción de 30
µl. La reacción se incubó de 2 a 4 horas a la temperatura de máxima actividad para la
Materiales y Métodos
84
enzima. Finalizada la incubación, las enzimas se inactivan de acuerdo a la casa
comercial. Los vectores de clonación que son digeridos con una única enzima de
restricción pueden ser tratados con la fosfatasa alcalina, ya que con esta enzima
evitamos que los vectores se religuen. La reacción se realizó agregando 1U de enzima a
la digestión con la enzima de restricción, y esta mezcla se incubó durante 30 minutos a
37ºC.
2.3.5. Reacción de ligación.
Mediante la ligación conseguimos la unión de distintos fragmentos de ADN. Estas
reacciones se realizaron con la enzima T4 DNA ligasa ( 1U/ µg de ADN) en el tampón
suministrado por la casa comercial, alcanzando un volumen final de reacción de 10 µl.
Se emplearon relaciones molares inserto: vector de 3:1 ó 4:1, aunque dichas relaciones
pueden optimizarse en cada experimento. La reacción se incuba durante 16-20 horas a
una temperatura de 16-20 ºC. Finalizado el tiempo de incubación, la mezcla resultante
se utilizó para transformar bacterias de E. coli competentes.
2.4. Amplificación de ácidos nucleicos.
2.4.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La amplificación de fragmentos de ADN a partir de ADN genómico o plasmídico se
obtuvo a través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La mezcla
de reacción contenía: 10-100 ng de ADN molde, 2,5 U de ADN polimerasa, 400 µM de
dNTPs, 20 pmoles de cada cebador, 1x de tampón de reacción (10x PCR reaction
buffer) y agua milliQ estéril hasta completar el volumen final de 50 µl. Las condiciones
de la PCR se establecieron en función del experimento.
Los genes del parásito se amplificaron mediante PCR y posteriormente se subclonaron
en los vectores de expresión para Leishmania.
Materiales y Métodos
85
2.4.2. RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polimerase Chain Reaction) .
Es una técnica que nos permite retrotranscribir ARN en ADNc usando la enzima
transcriptasa reversa; el ADNc obtenido se amplifica mediante PCR. Se empleó el
Superscript II TM RNaseH Reverse Transcriptase kit (Invitrogen). Las reacciones se
llevaron a cabo en volúmenes de 50 µl y se siguieron las recomendaciones del
fabricante. Las condiciones para la PCR se ajustaron según el experimento. Se empleó
esta técnica para analizar la expresión génica de ABCG1 y ABCG2 en los parásitos
salvajes, ABCG2K/M
y ABCG1+G2 transfectados con ABCG1, ABCG2 y con ambos
genes. Se utilizó la expresión de GADPH como control interno de carga.
2.4.3. Mutagénesis dirigida.
A través de la mutagénesis dirigida podemos sustituir un nucleótido en una determinada
posición y generar una mutación puntual en un gen clonado en un plásmido. El objetivo
de esta técnica es obtener el dominante negativo ABCG2K/M
que será transfectado al
parásito Leishmania. Para ello se empleó el protocolo del kit de mutagénesis Quick
Change XL-Sited-Directed (Stratagene). Se utiliza un par de oligonucleótidos que
contienen la mutación y son complementarios entre sí. Se realiza una reacción de PCR
con la enzima Pfu Ultra High Fidelity DNA Polimerasa obteniéndose como resultado
dos hebras completas y complementarias del plásmido amplificado. Finalmente,
eliminamos el ADN de partida usando la enzima DpnI que hidroliza el ADN metilado y
transformamos a las bacterias con el producto de la amplificación. Los plásmidos
obtenidos de las bacterias transformadas son analizados para corroborar la existencia de
la mutación génica mediante secuenciación.
2.5. Electroforesis de ADN en geles de agarosa.
La electroforesis en geles de agarosa se utiliza para separar y purificar fragmentos de
ADN. La concentración de agarosa y el voltaje con los que trabajamos depende del
tamaño del segmento de ADN que se quiera visualizar. Para ADN de gran tamaño
(procedente de una extracción de ADN genómico de los parásitos) debemos trabajar con
Materiales y Métodos
86
una concentración de agarosa del 0,7% y un voltaje de 20-25 V para facilitar un buen
desarrollo del mismo. Para segmentos de 1500 pb en adelante utilizamos geles al 1%, y
para fragmentos pequeños (500-1000 pb) empleamos geles al 1,5-2%. La agarosa se
disuelve en TAE 1X y se adiciona 0,5 µg/ml de bromuro de etidio para poder visualizar
el ADN tras exponerlo a la luz UV. Para comprobar que el fragmento de ADN tiene el
tamaño correcto lo comparamos con los marcadores de peso molecular λHindIII y
phiX174 HaeIII.
2.6. Transferencia de ADN mediante Southern blot.
Se procede a la digestión enzimática de 5 µg de ADN genómico de los parásitos. Tras la
digestión, los fragmentos de ADN generados se separan mediante electroforesis en geles
de agarosa al 0,7% a 20-25 V durante toda la noche. Finalizada la electroforesis, los
geles se incuban 3 minutos en solución de despurinización, y seguidamente se incuban
30 minutos en solución de desnaturalización y el mismo tiempo en solución de
neutralización. Tras la neutralización, el ADN se transfiere desde los geles a las
membranas de nylon Hybond-N® de GE-Healthcare, según la técnica descrita por
Edward Southern (1974). La transferencia se realizó durante toda la noche mediante
capilaridad en tampón de transferencia SSC 20X. Terminada la transferencia, las
membranas se lavan en tampón SSC 2X durante 10 minutos. Las membranas se dejan
secar 15 minutos a temperatura ambiente y el ADN se fija de manera covalente a la
membrana por irradiación ultravioleta a 250 nm durante 2 minutos.
2.6.1. Marcaje de sondas de ADN para Southern blot con digoxigenina.
Para el marcaje de sondas de ADN con digoxigenina, empleamos el protocolo descrito
en Molecular cloning (Green y Sambrook, 2012), el cual se adaptó a nuestro laboratorio,
consistente en: 1º). Obtención del fragmento de ADN que vamos a usar como sonda
mediante PCR. 2º) Cuantificamos la amplificación obtenida mediante un
espectrofotómetro tipo Nanodrop y tomamos entre 50-100 ng del producto de PCR. 3º)
Hervir la muestra a 100 ºC durante 10 minutos y enfriar otros 10 minutos en hielo. 4º)
Materiales y Métodos
87
Añadir 2 µl de hexanucleótidos, 2 µl de deoxiuridintrifosfato unido a digoxigenina
(DIG-11-dUTP) y 1 µl de la enzima Klenow. 5º) Incubar a 37 ºC durante 4 horas. 6º)
Adicionar 2 µl de EDTA 0.2 M pH 8, 2 µl LiCl 4M y 60 µl de etanol absoluto. 7º)
Incubar 30 minutos a -80 ºC y centrifugar 15 minutos a 4 ºC a 10.000 x g. 8º) Eliminar
el sobrenadante y lavar con 400 µl de etanol al 70 %. 9º) Centrifugar 2 minutos a 4 ºC y
eliminar el sobrenadante. 10º) Eliminar los restos de etanol por evaporación. 11º)
Resuspender la sonda en 50 µl de tampón TE.
2.6.2. Hibridación y revelado de ácidos nucleicos mediante sondas marcadas con
digoxigenina.
Las membranas con el ADN fijado covalentemente se lavan en tampón SSC 2X, y
posteriormente se incuban en 8 ml de solución de prehibridación a 42 ºC durante 2
horas. Seguidamente se procede a la hibridación de las membranas con la sonda
marcada con digoxigenina, para ello en un volumen final de 8 ml de solución de
hibridación se añade una concentración final de sonda (previamente desnaturalizada
durante 10 minutos a 100 ºC y 10 minutos en hielo) a 15 ng/ml. La incubación con la
sonda se realiza a 42 ºC durante toda la noche. Finalizada la hibridación, las membranas
se lavan 2 veces durante 5 minutos en solución de lavado I (SSC 2X + 0,1% SDS) a
temperatura ambiente. A continuación, las membranas se lavan 2 veces durante 15
minutos en la solución de lavado II (SSC 0,1X + 0,1 SDS) a temperatura ambiente.
Posteriormente, las membranas se lavan en tampón de lavado III (solución de ácido
maleico + 3 % Tween-20). Seguidamente, las membranas se incuban en solución de
bloqueo durante 30 minutos. Finalizado el bloqueo, las membranas se sumergen en
solución de bloqueo más 5 µL de anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa
alcalina. A continuación se realizaron dos lavados de 15 minutos con el tampón de
lavado. Posteriormente, las membranas se incubaron durante 5 minutos en solución de
detección. Finalmente, las membranas se introducen en una “bolsa de plástico” y se
adiciona 10 ml de solución de detección más 200 µl de NBT/BCIP. La bolsa es
termosellada y se incuba en oscuridad hasta que aparezcan las bandas marcadas de
ADN. La reacción se paró añadiendo H20 destilada sobre las membranas.
Materiales y Métodos
88
2.7. Electroforesis de proteínas en geles SDS-PAGE e inmunodetección por
Western blot.
Las proteínas se van a separar en base a su tamaño molecular usando la electroforesis en
geles desnaturalizantes de poliacrilamida y SDS (SDS-PAGE). La separación
electroforética se desarrolla en dos geles con diferente pH y composición. Un gel
superior o concentrador con un porcentaje de acrilamida/bisacrilamida del 3-4,5 % y un
pH de 6,8, y un gel inferior o separador al 10-14 % y un pH de 8,8. El porcentaje de
acrilamida de los geles se establece en función del tamaño de la proteína a separar. La
migración electroforética se lleva a cabo empleando la cubeta mini-PROTEIN de
Biorad utilizando un voltaje de 20 mA/gel.
Finalizada la separación electroforética de las proteínas, éstas se transfieren a
membranas de PVDF immobilon-P (Millipore); para ello, los geles de acrilamida se
sumergen en tampón de transferencia durante 15 minutos aproximadamente. La
membrana se prepara sumergiéndola en metanol absoluto durante 15 segundos,
posteriormente se transfiere a agua bidestilada durante 2 minutos y finalmente se incuba
en tampón de transferencia durante 5 minutos. El “sándwich” de transferencia está
constituido por la membrana en contacto con el gel y ambos contenidos entre papeles
Whatman humedecidos en tampón de transferencia. La transferencia semiseca se
efectuó con un Trans-blot SD Semi-dry transfercell de Bio-Rad durante 45 minutos a 23
V. Finalizada la transferencia, la membrana se tiñe con una solución de 0,5% Rojo
Ponceau/1% ácido acético en agua, con ello visualizamos a las proteínas y
determinamos si la transferencia se ha realizado correctamente. A continuación,
desteñimos la membrana con agua destilada y la bloqueamos con una solución de leche
desnatada al 5% en PBS durante toda la noche a 4 ºC.
Para la inmunodetección, las membranas de PVDF se incuban a temperatura ambiente
durante una hora con las diluciones correspondientes del anticuerpo primario en tampón
de bloqueo 1% BSA/0,05% Tween 20. Las diluciones empleadas son las siguientes:
1/2000 para el anticuerpo contra la proteína específica de parásitos metacíclicos
(HASPB) y 1/5000 para detectar GFP. Se lava 3 veces durante 5 minutos y en agitación
con la solución de bloqueo. Seguidamente, se procede a la incubación con el anticuerpo
Materiales y Métodos
89
secundario anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa (HRP) a 1/5000 para detectar
la proteína HASPB y la proteína de fusión GFP.
También se emplearon anticuerpos monoclonales contra la α-tubulina o la histona H2A
(1/10.000 y 1/5000) usados para confirmar la equivalencia entre las muestras de
proteínas cargadas en el gel.
Finalmente, la membrana se lava 3 veces durante 5 minutos y en agitación con la
solución de bloqueo, y se procede al revelado usando un método de
quimioluminiscencia vía kit Pierce ECL, para ello se mezclan 500 µl de la solución 1
(Detection Reagent peroxidase solution) y 2 (Detection Reagent Luminol Enhancer
solution) para una membrana de 0,125 ml/cm2.
2.8. Técnicas para el estudio funcional del transportador ABCG2 de L. major.
2.8.1. Clonaje en vectores de expresión.
En el laboratorio disponíamos de las construcciones pUCNeoABCG2 y
pUCNeoABCG2K108M
(pUCNeoABCG2K/M
), las cuales se utilizaron en esta tesis
doctoral (apartado 1.11.2).
Para obtener parásitos que expresen el gen ABCG1, realizamos el clonaje del gen
ABCG1 flanqueado por las secuencias no codificantes 5’UTR y 3’UTR en el vector de
expresión específico para Leishmania pIR1SAT. Los pasos seguidos en el clonaje
fueron los siguientes:
1. Amplificación por PCR del gen ABCG1 empleando los
oligonucleótidos 5’UTR ABCG1 y 3’UTR ABCG1 (apartado 1.12.1),
los cuales nos permitieron añadir las dianas de restricción AgeI/XbaI;
el fragmento obtenido se subclonó en pGEM- T.
2. Digestión de la construcción anterior con las enzimas AgeI/XbaI y
clonaje del fragmento liberado en el vector de expresión pIR1SAT,
previamente digerido con XmaI/XbaI. El plásmido resultante se
denominó pIR1SATABCG1 (Figura 1).
Materiales y Métodos
90
Figura 1: Clonaje del gen ABCG1. El gen ABCG1 junto con las secuencias 5’ y 3’ no codificantes se
clonó en el vector de expresión para Leishmania pIR1SAT, obteniéndose la construcción
pIR1SATABCG1.
Para el estudio de la localización subcelular de la proteína ABCG2 en el parásito
Leishmania, obtuvimos proteínas quiméricas fusionadas a la proteína verde fluorescente
(GFP).
Utilizamos los vectores pXG-GFP+2’ y pXG’-GFP+ mediante los cuales podemos
obtener la proteína fusionada a GFP en el extremo amino y carboxilo, respectivamente.
Para obtener la proteína y fusionarla a GFP en el extremo amino terminal, amplificamos
mediante PCR el marco abierto de lectura de ABCG2 utilizando los oligos ABCG2gfp-
N5’ y ABCG2gfp-N3’(apartado 1.12.1) que adicionan el sitio de corte NotI en ambos
extremos del gen, dado que es la única diana de restricción que nos permite clonar el
gen en el vector de expresión pXG-GFP+2’.
El fragmento amplificado se subclonó en pGEM-T, posteriormente mediante digestión
enzimática liberamos el inserto y lo clonamos en el vector pXG-GFP+2’ y obtuvimos la
construcción GFP-ABCG2 que se transfectó en los parásitos. A partir de la construcción
GFP-ABCG2 y utilizando la técnica de mutagénesis dirigida, se sustituyó una lisina por
una metionina en la posición 108 del motivo Walker A del NBD, obteniéndose la
construcción GFP-ABCG2K/M
que se transfectó a los parásitos (Figura 2).
Materiales y Métodos
91
Figura 2: Clonaje del gen ABCG2 en el vector de expresión de Leishmania pXG-GFP+2’. La
secuencia codificante de ABCG2 (azul) se clonó en el vector pXG-GFP+2’ que contiene la secuencia de
GFP (verde). Se obtiene la construcción GFP-ABCG2 donde el gen está fusionado con la GFP en
posición N-terminal (1). Mediante mutagénesis dirigida sobre GFP-ABCG2, obtuvimos la construcción
GFP-ABCG2K/M
(2).
En el caso de la proteína de fusión a GFP en el extremo carboxilo, amplificamos el
marco de lectura de ABCG2 (sin el stop codón) mediante PCR, empleando los oligos
ABCG2gfp-C5’ y ABCG2gfp-C3’ (apartado 1.12.1) que adicionan los sitios de corte
AgeI y EcoRV. El fragmento obtenido por PCR se subclonó en pGEM-T y previa
digestión se transfirió y clonó en el vector pXG-‘GFP+, obteniéndose la construcción
ABCG2-GFP. Se realizó mutagénesis dirigida sobre ABCG2-GFP, obteniéndose la
construcción ABCG2K/M
-GFP (Figura 3).
Materiales y Métodos
92
Figura 3: Clonaje del gen ABCG2 en el vector de expresión pXG-‘GFP+. La secuencia codificante de
ABCG2 (azul) se clonó en el vector pXG-‘GFP+ que incorpora la secuencia de GFP (verde). Se fusiona el
gen con la GFP en posición C-terminal, obteniéndose la construcción ABCG2-GFP (1). Mediante
mutagénesis dirigida sobre ABCG2-GFP, obtuvimos la construcción ABCG2K/M
-GFP (2).
El clonaje correcto del gen ABCG2 así como la mutación puntual en ambos vectores se
verificó mediante análisis del patrón de restricción enzimática y secuenciación. Tras
comprobar que las secuencias son correctas, las construcciones anteriores se emplearon
para transfectar promastigotes de L. major, junto con el vector pXG-‘GFP+, con el cual
se expresa la proteína GFP no fusionada que se utilizó como control.
2.8.2. Generación de parásitos mutantes nulos para los genes ABCG1 y ABCG2.
Para dirigir la eliminación de los genes ABCG1 y ABCG2, se subclonaron de forma
independiente la región 5’ no codificante (UTR) del gen ABCG2 (1500pb) (Figura 4.1),
la región 3’UTR del gen ABCG1 (1500pb) (Figura 4.2) y el cassette que contiene el
gen de resistencia a higromicina (2000pb) y geneticina (2035pb) (Figura 4.3) en el
vector pGEMT.
Materiales y Métodos
93
Tras la digestión de las construcciones 5’UTR y 3’UTR con las enzimas de restricción
XbaI y BamHI y posterior ligamiento, clonamos ambos fragmentos en el mismo vector
pGEMT, obteniéndose la construcción 5’UTR-3’UTR pGEMT (Figura 4.4).
Seguidamente, digerimos el cassette de higromicina y geneticina (Figura 4.3) y la
construcción 5’UTR-3’UTR pGEMT con las enzimas SwaI/XbaI, con ello permitimos
que el cassette de resistencia a higromicina y geneticina queden flanqueados por las
regiones 5’UTR y 3’UTR de ambos genes (Figura 4.5). Finalmente, la construcción se
linearizó mediante la digestión enzimática con NotI/BamHI (Figura 4.6).
Una vez transfectados los promastigotes de L. major (apartado 2.1.3), se procedió a la
selección de clones en medio líquido:
1. Se toman 4 ml de los parásitos transfectados y se adicionan 20 ml de medio de
cultivo con una concentración final de 15-20 µg/ml de higromicina.
2. Se toman 2 ml de la dilución anterior y se le añaden 22 ml de medio de cultivo con
una concentración final de 15-20 µg/ml de higromicina.
3. Nuevamente tomamos 2 ml de la dilución 2 y le añadimos 22 ml de medio de cultivo
con una concentración final de 15-20 µg/ml de higromicina.
Seguidamente, procedemos a la disposición de las tres diluciones en placas de 96
pocillos (una placa por dilución). Los transfectantes obtenidos se crecieron en medio de
cultivo (RPMI + 20% de SBFi) y se analizaron mediante Southern blot (apartado 2.6).
Los clones positivos para la sustitución de un alelo con el cassette hygro se sometieron a
un incremento de la concentración del antibiótico hasta 500 µg/ml, al objeto de obtener
el doble reemplazamiento. Al mismo tiempo, sobre los parásitos mutantes simples se
realizó una segunda transfección con el cassette de resistencia a geneticina (Neo), como
una segunda estrategia para obtener la doble sustitución alélica; sin embargo, los
parásitos no se adaptaron a la presencia de la geneticina, no obteniéndose ningún clon.
Los parásitos mutantes nulos (ABCG1+G2) adaptados a 500 µg/ml de higromicina se
Materiales y Métodos
94
subclonaron en medio semisólido y se recomprobó la sustitución alélica mediante
Southern blot.
Figura 4: Generación de la construcción de ADN necesaria para la sustitución de los genes
ABCG1/ABCG2. Se subclonaron las regiones 5’UTR (1), 3’UTR (2) y el cassette de higromicina y
geneticina (3) en pGEMT. Mediante la digestión con XbaI/BamHI y posterior ligamiento obtenemos la
construcción 5’UTR-3’UTR pGEMT (4). Tras digerir el cassette de higro y neo (3) y 5’UTR-3’UTR
pGEMT (4) con SwaI/XbaI y ligamiento de los fragmentos, obtenemos el cassette de resistencia a
higromicina y geneticina flanqueados por ambas regiones UTR (5). Finalmente, mediante la digestión con
NotI/BamHI linearizamos la construcción que será transfectada a los parásitos (6).
2.8.3. Marcaje de L. major con análogos fluorescentes de fosfolípidos de cadena
corta.
La totalidad de los transportadores pertenecientes a la subfamilia ABCG de humanos
están relacionados con el transporte de fosfolípidos y/o esteroles. Nos propusimos deter-
Materiales y Métodos
95
minar la posible implicación de ABCG2 en el transporte de fosfolípidos en el parásito.
Se usaron análogos de fosfatidilcolina (palmitoil-(nitrobenzoxadiazol-haxanoil)-PC
(C6-NBD-PC), fosfatidiletanolamina (C6-NBD-PE), fosfatidilserina (C6-NBD-PS) y
esfingomielina (C6-NBD-SM) marcados con el grupo fluorescente nitrobenzoxadiazol
en un ácido graso de cadena corta (n=6) situado en la posición 2 de la molécula de
glicerol.
En los ensayos de acumulación de análogos de fosfolípidos se utilizaron parásitos en
fase estacionaria de crecimiento. Se lavaron 2 veces con 10 ml de PBS a 4 ºC mediante
centrifugación a 2500 x g durante 10 minutos. Posteriormente, los parásitos controles
(transfectados con el plásmido vacío y salvajes), parásitos transfectados con la versión
inactiva de ABCG2 (ABCG2K/M
), parásitos ABCG1+G2 y ABCG1+G2
transfectados con los genes ABCG1 y/o ABCG2 se resuspendieron a una concentración
de 107
parásitos/ml en tampón A: HPMI suplementado con 0,3% (w/v) de BSA libre de
ácidos grasos y 500 µM de PMSF o 5 mM de DFP (inhibidores del catabolismo de
NBD-fosfolípidos) (Araújo Santos et al. 2003). Los parásitos se incuban durante 30
minutos a 28ºC en agitación. Finalizada la incubación, se adiciona un volumen de una
concentración 2X del correspondiente fosfolípido diluido en tampón A.
La concentración empleada fue de 10 µM para C6-NBD-PC, C6-NBD-PE, C6-NBD-SM
y de 30 µM para C6-NBD-PS. Los parásitos se incubaron durante 30 minutos a 28 ºC en
oscuridad. Tras la incubación, se realizan 2 lavados en PBS 0,3% BSA a 4 ºC para
eliminar los análogos no translocados al interior del parásito. Finalmente, los parásitos
se resuspenden en PBS a 4 ºC y se mide la fluorescencia asociada a la célula (10.000
eventos) usando un citómetro de flujo Beckton Dickinson FACScan equipado con un
láser de argón de 488 nm.
2.8.4. Medidas del eflujo de C6-NBD-PS en líneas de L. major.
En este ensayo se pretende evaluar el transporte de C6-NBD-PS desde la cara
citoplasmática a la cara externa de la membrana plasmática de promastigotes de
Leishmania en fase estacionaria de crecimiento. Para ello, 107
parásitos/ml se marcaron
Materiales y Métodos
96
con 30 µM de C6-NBD-PS para los parásitos control (transfectados con el plásmido
vacío) y 15 µM para los parásitos ABCG2K/M
durante 30 minutos a 28ºC en buffer
HPMI suplementado con 0,1% BSA y 500 µM de PMSF. Debido a que los parásitos
ABCG2K/M
presentan una mayor acumulación de C6-NBD-PS, bajamos la concentración
de marcaje a usar en los parásitos ABCG2K/M
con la finalidad de que ambas líneas
partan inicialmente con la misma internalización de C6-NBD-PS (Woehlecke et al.
2003). Tras el marcaje, se procede a extraer el exceso de C6-NBD-PS no translocado al
interior del parásito mediante una incubación con la solución HPMI + 2% BSA libre de
ácidos grasos + 500 µM PMSF durante 5 minutos en hielo. A continuación, los
parásitos se lavan en PBS a 4 ºC y se resuspenden en la misma solución, constituyendo
el tiempo cero del experimento. El transporte de C6-NBD-PS se realizó a 28 ºC y se
monitorizó a distintos tiempos (5, 15, 30 y 60 minutos) midiendo la fluorescencia
liberada al sobrenadante. Las muestras se analizaron mediante un espectrofluorímetro
SLM-Aminco 8000C.
2.8.5. Ensayos de unión a Anexina V en Leishmania.
Con este ensayo pretendemos demostrar si existen variaciones cuantitativas en la
exposición de PS en la cara externa del parásito a lo largo de su curva de crecimiento.
Para ello, los parásitos en fase logarítmica y estacionaria de crecimiento se lavan 2
veces con PBS y 1 vez con el tampón Anexina V. Posteriormente, los parásitos se
resuspenden en el tampón Anexina V y se marcan con Anexina V-Alexa Fluor 488
diluida 1/20 (dilución recomendada por la casa comercial) durante 15 minutos a 4 ºC.
En el experimento se emplearon los siguientes controles: 1º) Para confirmar que las
células no presentan necrosis usamos un doble marcaje con Anexina V-Alexa Fluor 488
e ioduro de propidio (0,4 g/ml) en tampón Anexina V (Materiales). La incubación con
ioduro de propidio se realiza a 4 ºC durante 5 minutos. 2º) Incubación de los parásitos
con Anexina V-Alexa Fluor 488 en ausencia de calcio, para ello incubamos con EGTA
8 mM, y 3º) Los parásitos se incuban en el tampón Anexina V en ausencia de Anexina
V-Alexa Fluor 488. Finalmente, los parásitos se lavan y resuspenden a una densidad de
4 x 106
promastigotes/ml. La fluorescencia de las células (10.000 eventos) se midió me-
Materiales y Métodos
97
diante citometría de flujo y los resultados se analizaron usando la aplicación informática
Cell Quest Pro.
2.8.6. Infección in vitro de macrófagos peritoneales de ratón con líneas de L. major.
Los macrófagos procedentes de ratones BALB/c (Charles River Ltd) se extraen
mediante masaje y lavado peritoneal con RPMI 1640 a 4 ºC. Las células se centrifugan
a 2500 x g a 4 ºC y se resuspenden en medio RPMI 1640 con un 10% de SBFi.
Posteriormente, los macrófagos se siembran a una densidad de 5 x 105
macrófagos/pocillo en placas de 24 pocillos provistas de un cristal de 22 mm2. Las
células se incuban a 37 ºC y 5% de CO2 durante 4 ó 6 horas para facilitar la adherencia
de los macrófagos a la superficie del cristal (Parodi-Talice et al. 2003; Araújo-Santos et
al. 2005). Transcurrido el tiempo de adherencia, las células se lavan varias veces con
RPMI 1640 con un 10% de SBFi para eliminar células en suspensión y se incuban hasta
el día siguiente en el mismo medio y bajo las mismas condiciones de temperatura y
CO2.
Los macrófagos se infectan a 35 ºC con las siguientes líneas de parásitos en fase
estacionaria de crecimiento: controles (salvajes y transfectados con el plásmido vacío),
ABCG2K/M
, ABCG1+G2 y ABCG1+G2 transfectados con los genes ABCG1 y/o
ABCG2.
El número total de parásitos se determina mediante el recuento en una cámara de
Neubauer. El ratio parásito/célula usado en la infección es de 5:1 y se utiliza medio
RPMI 1640 suplementado con 5% de SBFi.
El tiempo empleado en la infección es de 4 horas, transcurridas las cuales los parásitos
no fagocitados se eliminan mediante lavados con medio RPMI1640 libre de suero. Los
macrófagos infectados se incuban en RPMI 1640 10% de SBFi durante 24 horas a 37 ºC
y 5% de CO2. Al día siguiente, los cultivos se fijan con paraformaldehido al 2% en PBS
suplementado con 1 mM de glucosa (facilita una incorporación progresiva del fijador en
las células) durante 30 minutos a 4 ºC, se lavan dos veces con PBS, y se incuban 30 mi-
Materiales y Métodos
98
nutos con glicina 0,5 M en PBS y otra media hora con Tritón X 100 al 0,2% en PBS
para permeabilizar las células.
Finalmente, las células se tiñen con DAPI y se depositan en portas para ser visualizadas
en el microscopio Olympus IX81. La infección se cuantifica usando el programa Image
J software (http.//rsb.info.nih.gov/ij/). El porcentaje de macrófagos infectados se
calcula dividiendo el número de macrófagos infectados entre el número total de
macrófagos. El número medio de amastigotes por célula se obtiene al dividir el total de
amastigotes contados entre los macrófagos infectados.
2.8.7. Ensayos de interacción parásito/célula.
La metodología empleada ha sido similar a la descrita previamente (Weingartner et al.
2010). Macrófagos peritoneales de ratón (5 x 105
macrófagos/pocillo) cultivados en
RPMI 1640 y 10% de SBFi a 37 ºC y 5% de CO2 se tiñeron con 5 µM de FM4-64
durante 30 minutos a temperatura ambiente en medio RPMI 1640. Los parásitos
controles y ABCG2K/M
a una concentración de 107 y en fase estacionaria de crecimiento
se marcaron con 1 µM de Cell Tracker Green durante 40 minutos a 28 ºC en medio
RPMI 1640. Parásitos y macrófagos peritoneales se lavan con RPMI 1640 y finalmente
se resuspenden en RPMI 1640 con un 5% de SBFi. El ratio parásito/célula usado en el
ensayo de interacción es de 5:1. Los parásitos marcados con Cell Tracker Green se
adicionan a la monocapa de macrófagos previamente teñidos con FM4-64 y se deja un
tiempo de interacción de 4 horas a 35 ºC. Finalmente, las células se lavan 4 veces con
RPMI 1640 para eliminar los parásitos no adheridos. La interacción parásito/célula se
cuantificó usando el microscopio Confocal Leyca SP5.
2.8.8. Análisis de la expresión de moléculas de superficie: LPG y gp63.
Para determinar si existen diferencias cuantitativas en la expresión de LPG entre ambas
líneas, parásitos controles (transfectados con el plásmido vacío) y ABCG2K/M
en fase
estacionaria de crecimiento se lavan 2 veces con PBS y se resuspenden a una
concentración de 107 promastigotes/ml. Los parásitos se incuban durante 10 minutos a
Materiales y Métodos
99
28 ºC en PBS con 5 g/ml de aglutinina de ricino conjugada con fluoresceína,
finalmente las células se lavan con PBS y se analizan mediante citometría de flujo
usando un FACSCalibur (Beckton Dickinson).
Para cuantificar la expresión de gp63, los parásitos se incuban con el anticuerpo
monoclonal anti-gp63 dilución 1:500 en tampón de bloqueo (0.1% BSA y 0,01% de
Tween-20 en PBS) durante 30 minutos en hielo. Los parásitos se lavan con PBS
suplementado con 0,1% BSA y se fijan con paraformaldehido al 2% en PBS a 4 ºC
durante 20 minutos. Se vuelven a lavar 2 veces con PBS y se incuban con el anticuerpo
secundario (anti-IgG de raton conjugada con FITC) en una dilución 1:500 en tampón de
bloqueo durante 30 minutos en hielo.
Finalmente, los parásitos se lavan 3 veces en PBS con 0,1% BSA y se analiza la
fluorescencia asociada a la célula mediante citometría de flujo usando un FACSCalibur
(Beckton Dickinson).
2.8.9. Purificación de parásitos metacíclicos.
Los parásitos metacíclicos se purifican de cultivos de parásitos en fase estacionaria
mediante selección negativa con la lectina PNA (Sacks et al. 1985). Los parásitos
controles (transfectados con el plásmido vacío) y ABCG2K/M
procedentes del 4º día de
cultivo, y los parásitos controles (salvajes), ABCG1+G2, ABCG1+G2 transfectados
con los genes ABCG1 (ABCG1+G2:G1) o ABCG2 (ABCG1+G2:G2) y
cotransfectados con ABCG1 y ABCG2 (ABCG1+G2:G1+G2) procedentes del 5º y 10º
día de cultivo, se lavan con PBS y se incuban con 100 µg de PNA por cada 108 parásitos
en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras el tiempo de incubación, los
parásitos se centrifugan a 500 x g durante 10 minutos. Los parásitos aglutinados, no
metacíclicos, quedan en el fondo del frasco de cultivo (PNA+), mientras que en el
sobrenadante quedan los parásitos metacíclicos (PNA-).
Materiales y Métodos
100
2.8.10. Estudios de colocalización subcelular de ABCG2.
Los parásitos que expresan las proteínas ABCG2 y ABCG2K/M
fusionadas con la
proteína GFP se lavaron 2 veces con PBS y el pellet se resuspendió en 1 ml de RPMI
modificado a una concentración de 107 promastigotes/ml. Para el análisis de
colocalización subcelular de las proteínas ABCG2 y ABCG2K/M
con marcadores del
tráfico vesicular (membrana plasmática, endosomas y lisosomas) se utilizó
concanavalina A Alexa Red (stock 2,5 mg/ml en PBS) a una concentración de 50 µg/ml
durante 2 horas a 28 ºC y la sonda FM4-64 (stock 2 mM en DMSO) a una
concentración de 1 µM durante 30 minutos a 28 ºC en RPMI modificado. Para evitar la
endocitosis de la sonda FM4-64 y así teñir exclusivamente la membrana plasmática, los
parásitos se incubaron con 1 µM de la sonda durante 30 minutos a 4 ºC.
Para determinar si existe colocalización de la proteína ABCG o ABCG2K/M
con la
mitocondria del parásito, marcamos 107 promastigotes/ml con una sonda específica de
dicho orgánulo denominada Mitotracker Deep Red 633 a una concentración de 50 nM
en RPMI modificado durante 30 minutos a 28 ºC.
Finalizado el tiempo de incubación con las diferentes sondas, los parásitos se lavan 2
veces con PBS y se procede a su fijación con paraformaldehido al 2% en PBS a 4 ºC
durante 30 minutos. Los parásitos se analizan y fotografían en un microscopio Olympus
IX81. Las imágenes obtenidas se deconvolucionaron usando el programa Huygens
Professional.
2.8.11. Determinación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las
diferentes fases de crecimiento de las distintas líneas de Leishmania.
Para el estudio de los niveles de ROS (Williams et al. 2013), promastigotes (1 x 107) en
las diferentes fases de crecimiento: logarítmica temprana, logarítmica media,
estacionaria temprana y estacionaria, se lavaron con medio RMPI 1640. Posteriormente,
2 x 106
parásitos se incuban en 200 µl de medio con 0,1 mM de H2DCF-DA; tras 2
horas de incubación a 28 ºC, la fluorescencia se determinó mediante citometría de flujo
(excitación 488 nm) usando un FACSCalibur (Beckton Dickinson).
Materiales y Métodos
101
2.8.12. Sensibilidad de las distintas líneas de L. major a la lisis mediada por
complemento.
La sensibilidad de los parásitos a la lisis del complemento se evaluó mediante la
adaptación del protocolo de Besteiro et al. (2006b). Para ello, promastigotes (1 x
107/ml) en fase logarítmica y estacionaria de crecimiento se incuban con
concentraciones crecientes de suero fresco humano durante 30 minutos a 37 ºC. Tras
dicha incubación, se adiciona a los parásitos el colorante vital resazurina y se incuban a
28 ºC durante 24 horas. La resazurina (compuesto de color azulado) es reducida por los
parásitos viables generándose resorufina (color rosado; fluorescencia roja). La
fluorescencia generada se determinó mediante excitación a 550 nm y emisión a 590 nm
en un lector de placas TECAN.
2.8.13. Estudio de la infección in vivo de diferentes líneas de L. major en un modelo
murino de leishmaniasis.
Se emplearon ratones hembras BALB/c de 6 semanas de vida proporcionadas por
Charles River Ltd. Los animales se mantienen en un ambiente libre de patógenos en el
Servicio de Animalario del Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra. Se
usaron grupos de 10 ratones por cada condición experimental. En la almohadilla plantar
del ratón (pata izquierda/extremidades inferiores) se inyectaron subcutáneamente 104
parásitos metacíclicos controles (transfectados con el plásmido vacío) y ABCG2K/M
purificados (PNA-). La progresión de la enfermedad se evaluó mediante dos parámetros:
1º) evolución del proceso inflamatorio (edema) y 2º) aparición de lesiones cutáneas en
la pata infectada. El tiempo de monitorización de ambos parámetros es de 5 semanas;
empleando como instrumento de medida un calibre digital (digital caliper Mitutoyo,
Japón).
Los valores obtenidos se comparan con los procedentes de la pata contralateral no
infectada. A partir de la 5ª semana, los ratones son sacrificados por asfixia con dióxido
de carbono y homogeneizamos los tejidos (patas infectadas, bazo y ganglios linfáticos),
utilizando un bisturí para disgregar y separar la musculatura del hueso y dos porta
objetos estériles para triturar bazo y ganglios. El homogeneizado total de los distintos
Materiales y Métodos
102
tejidos se diluye y se distribuyen en placas de 96 pocillos en medio de cultivo RPMI
1640 modificado con 20% de SBFi, con ello pretendemos revelar la presencia de formas
amastigotes y calcular la carga parasitaria tisular vía diluciones seriadas 1/10 (von
Stebut et al. 2000).
RESULTADOS
Resultados
103
1. Características de la secuencia génica del transportador ABCG2.
ABCG2 (GeneDB-L major código de acceso LmjF06.0090) se localiza en el
cromosoma 6 y es un gen triplicado en tándem, siendo la repetición imperfecta.
Leprohon (Leprohon et al. 2006) denominó a estos genes como ABCG1 (LmjF06.0080),
ABCG2 (LmjF06.0090), y ABCG3 (LmjF06.0100). Todos ellos son “hemi-
transportadores” que presentan un único dominio de unión a nucleótidos (NBD) en
posición N-terminal con respecto a un dominio transmembrana hidrofóbico (TMD)
localizado en la región C-terminal del transportador (Figuras 1 y 2).
ABCG1 -----MPRLRNEPICNGISIDAEDQEGTSNHGHQTLSYGKVDSQLHGSIAESDSSTRRAI ABCG2 MPPPAATRAPTEDTYTDYSFTPISIDEPDVHHHQRRDSGKVDSQLHGSIAEFDSSTQRAI ABCG3 ------------------------------------------------------------ ABCG1 GVPSSYSLPLSWHRLSYSVGKKRILCGLTGTALPGRCLAILGSSGAGKTTFLNAICDRLA ABCG2 GVPSSYSLPLSWHRLSYSVGKKRILCGLTGTALPGRCLAILGSSGAGKTTFLNAICDRLA ABCG3 ------------------------------------------------------------ ABCG1 SGGELRLSGRRQLGDCEFERHFRKAMGFVAQDDIISPLSTPYDALWFSLRTRRGTSRAET ABCG2 SGGELRLSGRRQLGDCEFERHFRKAMGFVAQDDIISPLSTPYDALWFSLRTRRGTSRAET ABCG3 -------------------------MGFVAQDDIISPLSTPYDALWFSLRTRRGTSRAET *********************************** ABCG1 EERVQEMLNVLRLQHCRDTKVGIPGLESGLSGGERKRCSIGIELICDLKILLLDEPTSGL ABCG2 EERVQEMLNVLRLQHCRDTKVGIPGLESGLSGGERKRCSIGIELICDLKILLLDEPTSGL ABCG3 EERVQEMLNVLRLQHCRDTKVGIPGLESGLSGGERKRCSIGIELICDLKILLLDEPTSGL ************************************************************
ABCG1 DSVTSAKVVHLLRQLSRTGRTVIYTIHQPTAEVLSYFDDVMLMTQGRIAYHGTMAASLDY ABCG2 DSVTSAKVVHLLRQLSRTGRTVIYTIHQPTAEVLSYFDDVMLMTQGRIAYHGTMAASLDY ABCG3 DSVTSAKVVHLLRQLSRTGRTVIYTIHQPTAEVLSYFDDVMLMTQGRIAYHGTMAASLDY ************************************************************
ABCG1 FESIGFSCPSKYTPTDYYMVLLQDSVTSKVLIKRWRKYLKNGPRTPHTAAVRLAKSRGES ABCG2 FESIGFSCPSKYTPTDYYMVLLQDSVTSKVLIKRWRKYLKNGPRTPHTAAVRLAKSRGES ABCG3 FESIGFSCPSKYTPTDYYMVLLQDSVTSKVLIKRWRKYLKNGPRTPHTAAVRLAKSRGES
************************************************************ ABCG1 SAARFLDAYIAKFGSSPAVQLYELTRRTMTEISRDYLYLFSYMAQAIFFAIVVGLIFLNV ABCG2 SAARFLDAYIAKFGSSPAVQLYELTRRTMTEISRDYLYLFSYMAQAIFFAIVVGLIFLNV ABCG3 SAARFLDAYIAKFGSSPAVQLYELTRRTMTEISRDYLYLFSYMAQAIFFAIVVGLIFIVF *********************************************************: . ABCG1 RANVEGIQDRQGVLFMTVMNRAMSSTFIMINTFNNVRAVFMREQQAGAYSPLMFFLGRSF ABCG2 RANVEGIQDRQGVLFMTVMNRAMSSTFIMINTFNNVRAVFMREQQAGAYSPLMFFLGRSF ABCG3 SCVHVDSAP--------------------------------------------------- . .
Resultados
104
ABCG1 AEFPVQILAVLVESCILYWMVGLHRHPGSFFYYFGVIALLSQVATGLGFAISASCPSVVV ABCG2 AEFPVQILAVLVESCILYWMVGLHRHPGSFFYYFGVIALLSQVATGLGFAISASCPSVVV ABCG3 ----------------------------SFFSILPLTLSVWAVWCGVSLDRCLSVLSVRC *** : : : * *:.: . * ** ABCG1 SSALASVSLMVLYLGGGLLASTDRLRPYWYWLEKPSFMRHAYILVLRNELHNVPHIACDY ABCG2 SSALAPLVLIPLALGGGLLASTDRLRPYWYWLEKPSFMRHAYILVLRNELHNVPHIACDY ABCG3 PLRITACASLSRYLHSYMSG---------------------------------------- . ::. : * . : . ABCG1 YRWGDGYCINQARDGRTVMRLLGFDGDPQSASVYMWVSLAIMFFLLRSISVIVLMVAARE ABCG2 YRWGDGYCINQARDGRTVMRLLGFDGDPQSVSVYMWVSLAIMFFLLRSISVIALTVASCA ABCG3 -------------------KCTGSSTAPCGLAVMWWREVCRRALL--------------- : * . * . :* * .:. :* ABCG1 KT- ABCG2 RTA ABCG3 ---
Figura 1. Secuencia aminoacídica y alineamiento (Clustal W) de los transportadores ABCG1,
ABCG2 y ABCG3 de L. major. Los segmentos transmembrana predichos por los programas: TMHMM
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) y TMRPres2D
(http://biophysics.biol.uoa.gr/TMRPres2D/) están indicados en rojo. Las secuencias características del
dominio NBD se indican de la siguiente manera: Walker A (azul), Walker B (celeste) y el motivo C
(verde). Los aminoácidos presentes en las tres secuencias se indican mediante *, la similitud entre
aminoácidos se indica mediante dos puntos, los aminoácidos débilmente conservados se muestran
mediante un punto. Los huecos introducidos en el alineamiento de las secuencias se representan mediante
–. Con fondo amarillo y turquesa se señala la discontinuidad en la identidad de secuencias de ABCG1 y
ABCG2 a nivel de los extremos N- y C- terminales, respectivamente.
Figura 2: Modelo topológico de los transportadores ABCG1, ABCG2 y ABCG3 del parásito
Leishmania. El dominio de unión a nucleótidos (NBD) se encuentra en posición N-terminal con respecto
al dominio de transmembrana (TMD). Los segmentos transmembrana (α-hélices) del TMD se representan
como cilindros que atraviesan la bicapa lipídica. Los motivos esenciales del NBD (Walker A, Walker B y
motivo sello) están representados en las casillas A, B y C, respectivamente. La flecha indica la mutación
que hemos inducido en el sitio catalítico del Walker A (cambio de una lisina por una metionina en la
posición 108 = K108M).
Resultados
105
El gen ABCG1 codifica para una proteína de 657 aminoácidos y un peso molecular
predicho de aproximadamente 73,4 kDa. En el caso del gen ABCG2 codifica para una
proteína de 663 aminoácidos con un peso molecular estimado de 74 kDa. Los genes
ABCG1 y ABCG2 son muy similares a nivel de secuencia nucleotídica (93,7%),
diferenciándose tan solo en 94 pb en la posición amino terminal del gen ABCG2, y 33
pb en la posición carboxilo terminal del mismo (Clustal Omega Nucleotide:
http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/embossneedle/nucleotide.html).
ABCG3 codifica para una proteína de 278 aminoácidos. ABCG3 es un transportador
truncado, ya que carece del motivo Walker A, el cual es imprescindible para la
funcionalidad del transportador, además faltan cuatro segmentos transmembrana del
dominio TMD (Figuras 1 y 2).
El alineamiento de la secuencia aminoacídica de ABCG2 de L. major con otras
proteínas pertenecientes a la subfamilia ABCG de humanos, nos permitió determinar
que la identidad es del 25,7% con la proteína ABCG1, 23,3% respecto a ABCG2
(BCRP), 25,6% para ABCG4, 24,8% para ABCG5 y 24,6 % para ABCG8. También
observamos una identidad del 27% con la proteína ABCG White de Drosophila
melanogaster (Clustal Omega: http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/embossneedle/).
La organización genómica de estos transportadores es similar en otras especies de
Leishmania como L. infantum y L. mexicana, donde se mantiene la repetición en
tándem en el cromosoma 6; sin embargo, L. donovani tiene los genes ABCG1, ABCG2 y
ABCG3 interrumpidos (anotación del genoma incompleta y repleta de huecos). En una
cepa de L. braziliensis está identificado en el mismo locus un gen ABCG similar al
ABCG2, dicho gen está duplicado y se describe como el primer gen del cromosoma 6.
En otra cepa de L. braziliensis existen problemas de anotación del genoma (múltiples
huecos) y solo está presente en el mismo extremo del cromosoma 6 una secuencia
truncada e idéntica a la de la otra cepa (TriTrypDB: Kinetoplastid Genomics Resource).
Los porcentajes de identidad aminoacídica de ABCG2 de L. major con respecto al resto
de especies de Leishmania se recogen en la Tabla 1.
Resultados
106
Tabla 1: Porcentajes de identidad aminoacídica entre el transportador ABCG2 de L. major y el
transportador ABCG2 de otras especies de Leishmania.
Los porcentajes de identidad se determinaron mediante el programa EMBOSS de alineamiento de
secuencias de proteínas (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss needle/).
2. Caracterización funcional del transportador ABCG2 en L. major.
Los resultados preliminares obtenidos sobre ABCG2 en L. infantum han servido de base
para profundizar en la caracterización de la proteína y estudiar su papel en la virulencia,
empleando para ello un modelo murino de leishmaniasis cutánea producida por L.
major.
Realizamos este abordaje mediante dos estrategias: 1- Obtención de parásitos que
expresen un dominante negativo para ABCG2 y 2- mediante la obtención de
parásitos mutantes nulos para ABCG2 y su repetición en tándem, ABCG1.
En primer lugar, se transfectaron formas promastigotas de L. major con la construcción
que contiene el gen ABCG2 mutado en la lisina (posición 108) del motivo Walker A del
dominio de unión a nucleótidos (ABCG2K/M
), residuo necesario para la hidrólisis del
ATP en las proteínas ABC.
La expresión del gen ABCG2K/M
en los parásitos transfectados se verificó mediante RT-
PCR (Figura 3-A). Además, la tasa de crecimiento de estos parásitos no presenta
ninguna modificación al compararla con el crecimiento de los parásitos controles
(Figura 3-B).
Resultados
107
Figura 3: Análisis de la expresión de ABCG2
K/M y curva de crecimiento de las distintas líneas de
Leishmania. (A) Panel superior: La expresión de ABCG2K/M
se analizó mediante RT-PCR. El ADNc se
obtuvo a partir de 1 µg de ARN. La reacción se realizó en un volumen final de 50 µl y se usaron las
siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 ºC durante 5 minutos y a continuación 35 ciclos que
contienen: una desnaturalización a 95 ºC durante 1 minuto, hibridación a 54 ºC durante 30 segundos,
extensión a 68 ºC durante 35 segundos y una extensión final de 5 minutos. Se amplificó un fragmento de 280 pb tanto de ABCG2 como del mutante ABCG2
K/M. Panel inferior: Expresión génica de GADPH,
utilizado como control de transcripción. Las condiciones para la PCR fueron las descritas anteriormente.
En el panel superior e inferior, los carriles se corresponden con las siguientes muestras: carril 1-
marcador de peso molecular phiX174 HaeIII; carril 2- parásitos controles transfectados con el vector
vacío pUCNeoPlus y carril 3- parásitos transfectados con ABCG2K/M
. El producto de amplificación
obtenido se sometió a una electroforesis en un gel de agarosa al 2%. (B) Curva de crecimiento de
parásitos controles (círculos azules) y ABCG2K/M
(cuadrados rojos) a diferentes intervalos de tiempo. Los
resultados representan la media ± SD de tres experimentos independientes.
2.1. ABCG2 está implicado en la exposición de fosfatidilserina (PS) en la cara
externa de la membrana plasmática de Leishmania.
Se evaluó la actividad flopasa de ABCG2 en formas promastigotas de L. major en fase
estacionaria de crecimiento (4 días de cultivo), ya que en fase estacionaria existe una
mayor exposición de PS a la cara externa de la membrana plasmática que facilita la
invasión del parásito a las células (Wanderley et al. 2012; Wanderley et al. 2006; van
Zandbergen et al. 2006; van Zandbergen et al. 2007; Tripathi y Gupta. 2003).
Resultados
108
El ensayo de acumulación de análogos fluorescentes de fosfolípidos se llevó a cabo en
parásitos controles y parásitos que expresan ABCG2K/M
(parásitos ABCG2K/M
).
Los resultados revelan que los parásitos ABCG2K/M
presentan una mayor acumulación
de NBD-PS (aproximadamente entre 3-3,5 veces más, en dos eventos de transfección
independientes) que los parásitos controles (Figura 4-A y 4-E); sin embargo, no existen
diferencias significativas en el acúmulo del resto de fosfolípidos entre parásitos
controles y ABCG2K/M
(Figuras 4 B-D).
El mayor acúmulo de NBD-PS de los parásitos ABCG2K/M
no se debe a alteraciones en
el proceso de endocitosis ya que no se ve afectada la internalización del análogo
fluorescente de esfingomielina (NBD-SM), un marcador del proceso de endocitosis
(Araújo-Santos et al. 2003) (Figura 4-D).
Mediante un segundo evento de transfección confirmamos el mayor acúmulo de NBD-
PS que presentan los parásitos ABCG2K/M
, descartando con ello que el fenotipo se deba
a características intrínsecas de la población seleccionada (Figura 4-E).
Para verificar que realmente el mayor acúmulo de NBD-PS en los parásitos ABCG2K/M
se debe a la inhibición de la actividad de la proteína ABCG2, a los parásitos ABCG2K/M
se les retiró la presión de antibiótico para facilitar la eliminación del vector de expresión
pUCNeoABCG2K/M
. Transcurrido tres meses se produjo tal evento y los niveles de
acúmulo de NBD-PS de estos parásitos eran similares al de los parásitos controles,
obteniéndose con ello la línea revertida (Figura 4-F).
Resultados
109
Figura 4: Acumulación de análogos fluorescentes de fosfolípidos en distintas líneas de L. major.
Promastigotes de parásitos control (transfectados con el vector vacío) y ABCG2K/M
en fase estacionaria de
crecimiento se incubaron con los distintos análogos fluorescentes de fosfolípidos: NBD-PS (A), NBD-PC
(B), NBD-PE (C) y NBD-SM (D) durante 30 minutos a 28 ºC. Después de la extracción con BSA de los
análogos de fosfolípidos expuestos en la superficie del parásito y un lavado con PBS, la fluorescencia
asociada a la célula se midió mediante citometría de flujo. El histograma de color gris representa a los
parásitos controles transfectados con el vector de expresión vacío, el histograma de línea negra representa
a los parásitos que expresan ABCG2K/M
y el histograma de línea discontinua representa a las células no
incubadas con los fosfolípidos fluorescentes. (E) Acumulación de NBD-PS en un segundo evento de
transfección en parásitos L. major con el vector pUCNeoABCG2K/M
. (F) Acumulación de NBD-PS en la
línea revertida, obtenida tras tres meses de cultivo de la línea ABCG2K/M
en ausencia del antibiótico de
selección. En la parte superior de las figuras A y E se indican las medias geométricas de fluorescencia
(u.a.) ± SD. Los resultados son histogramas representativos de varios experimentos.
Resultados
110
Seguidamente nos planteamos confirmar si la mayor acumulación de NBD-PS en
parásitos ABCG2K/M
es consecuencia de una reducida actividad flopasa; para ello
determinamos la presencia de NBD-PS en la cara externa de la membrana plasmática de
los parásitos tras la extracción con BSA y posterior fluorometría. Los resultados
confirman la hipótesis dado que los parásitos controles presentan una mayor exposición
de dicho fosfolípido con respecto a los parásitos ABCG2K/M
(Figura 5).
Figura 5: Exposición de NBD-PS en la cara externa de la membrana plasmática de las distintas
líneas de Leishmania. El eflujo de NBD-PS en parásitos controles está representado en la gráfica por
círculos azules y el eflujo en los parásitos ABCG2K/M
por cuadrados rojos. Los parásitos en fase
estacionaria de crecimiento (4 días) se incuban durante 30 minutos a 28 ºC con C6-NBD-PS; tras el
marcaje, se extrae el C6-NBD-PS no interiorizado usando el buffer HPMI/2% BSA libre de ácidos
grasos/500 µM PMSF durante 5 minutos en hielo. Finalmente, los parásitos se lavan en PBS y se
resuspenden en HPMI/2% BSA libre de ácidos grasos/500 µM PMSF. La medida de transporte al exterior
celular de C6-NBD-PS se realizó a 28 ºC y se monitorizó a distintos tiempos (5, 15, 30 y 60 minutos) en
el sobrenadante (excitación-emisión: 488 nm-525 nm). Los resultados representan la media ± SD de cinco
experimentos por duplicado. El 100% corresponde al máximo de fluorescencia detectada. La significancia
estadística con respecto al control se determinó mediante la t de Student (*: p< 0,05).
Para evaluar si la actividad de transporte a la cara externa de la membrana plasmática
del parásito también se lleva a cabo sobre PS endógena, realizamos un ensayo de unión
a Anexina V-Alexa Fluor 488. En primer lugar, se realizó un ensayo control para
determinar la especificidad de la unión a la PS expuesta en la cara externa de los
parásitos controles, en presencia y ausencia de calcio, necesario para la interacción.
0 10 20
25
75
30 40 50 60
50
100
Flu
ore
sc
en
cia
(%
)
Tiempo (min)
* *
Resultados
111
Los resultados demuestran que en nuestras condiciones experimentales, la unión es
específica, ya que en presencia de un quelante del calcio (EGTA) solo se marcan un
10% de las células.
El análisis sobre la exposición de PS en parásitos controles y ABCG2K/M
reveló que
existen diferencias en función de la fase de crecimiento de las formas promastigotas del
parásito. Observamos que existe un marcaje con Anexina V-Alexa Fluor 488 similar
entre parásitos controles y ABCG2K/M
(10,97% ± 0,43 vs 11,06% ± 0,61 Anexina V
positivo /Ioduro de propidio
negativo), en fase logarítmica de crecimiento (2 días) (Figura 6).
Sin embargo, las diferencias entre ambas líneas de parásitos se hace notable ya en el
inicio de la fase logarítmica tardía (3 días), donde se obtiene un incremento en el
número de eventos exponiendo PS endógena en los parásitos control respecto a
ABCG2K/M
(21,30% ± 0,38 vs 13,41% ± 0,29 Anexina V positivo
/Ioduro de propidio
negativo) (Figura 6).
Figura 6: Análisis de la exposición de PS endógena en la cara externa de la membrana plasmática
de parásitos en diferentes fases del crecimiento. Parásitos control (transfectados con el vector vacío) y
ABCG2K/M
en fase logarítmica (2 días), logarítmica tardía (3 días) y fase estacionaria (4 días) de
crecimiento se marcaron con Anexina V-Alexa Fluor 488; la fluorescencia asociada a las células se
cuantificó mediante citometría de flujo, como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados
representan la media ± SD de tres experimentos independientes. La significancia estadística con respecto
al control se determinó mediante la t de Student (*: p< 0,05).
Resultados
112
Las diferencias en el número de parásitos que exponen PS se acentúan entre parásitos
controles y ABCG2K/M
en fase estacionaria de crecimiento (4 días). Los resultados
demuestran que hay más parásitos controles que exponen PS en la cara externa de la
membrana plasmática si lo comparamos con los parásitos ABCG2K/M
(52,73% ± 2,11
vs 20,14% ± 1,80 Anexina V positivo
/Ioduro de propidio negativo
) (Figura 6). La viabilidad
de los parásitos controles y ABCG2K/M
se determinó mediante microscopía óptica,
observándose que los parásitos eran perfectamente móviles y no se apreció ningún daño
en la membrana de los mismos ni ningún tipo de alteración morfológica.
Adicionalmente, se determinó la densidad de moléculas de PS en la superficie del
parásito en fase estacionaria de crecimiento en base a la intensidad de la fluorescencia
emitida por la Anexina V-Alexa Fluor 488 unida, y se observa que los parásitos
controles presentan una mayor densidad de PS en la cara externa de la membrana
plasmática comparados con los parásitos ABCG2K/M
(53,35 ± 6,12 vs 38,10 ± 3,49
unidades arbitrarias de fluorescencia; media geométrica) (Figura 7).
Figura 7: Determinación de la densidad de moléculas de PS (media geométrica) en la superficie de
las distintas líneas de Leishmania. Promastigotes de Leishmania en fase estacionaria de crecimiento:
parásitos control y parásitos ABCG2K/M
se marcaron con Anexina V-Alexa Fluor 488; la fluorescencia
asociada a las células se cuantificó mediante citometría de flujo, como se describe en Materiales y
Métodos. El histograma gris representa a parásitos controles (transfectados con el vector vacío). El
histograma remarcado con línea negra simboliza a los parásitos ABCG2K/M
y el histograma con línea
discontinua representa a los parásitos no marcados con Anexina V-Alexa Fluor 488. El resultado es un
histograma representativo y similar al obtenido en otros tres experimentos independientes.
Resultados
113
Estos resultados se correlacionan con la mayor expresión del ARN mensajero de
ABCG2 conforme se alcanza la fase estacionaria de crecimiento (Figura 8).
La menor exposición de PS en la superficie de parásitos ABCG2K/M
, se debería en parte
a la inactivación del transportador ABCG2 al dimerizar con la proteína mutada, ya que
la proteína mutada también podría inactivar a ABCG1 (92 % de identidad aminoacídica)
y actuar sobre otros factores implicados en la exposición de PS a la cara externa de la
membrana plasmática del parásito que aún están por determinar.
Figura 8: Análisis de la expresión génica de ABCG2 en L. major. (A): Evaluación de la expresión
génica de ABCG2 en L. major mediante RT-PCR a lo largo de las distintas fases de la curva de
crecimiento: logarítmica temprana (2 días), logarítmica tardía (3 días), estacionaria (4 días) y estacionaria
tardía (5 días). La RT-PCR se realizó sobre el ADNc obtenido a partir de 1 µg de ARN de parásitos
salvajes. Las condiciones utilizadas fueron: desnaturalización inicial de 95 ºC durante 5 minutos y 35
ciclos de amplificación que comprenden las siguientes etapas: desnaturalización a 95 ºC durante 1
minuto, hibridación a 54 ºC durante 30 segundos, extensión a 68 ºC durante 35 segundos y una extensión
final de 5 minutos. El producto final se sometió a una electroforesis en un gel de agarosa al 2%, como se
describe en Materiales y Métodos. El panel inferior muestra la expresión de GADPH, usado como control
de normalización de la expresión. Las flechas indican la amplificación de un fragmento de ABCG2 (280
pb) y de GADPH (227 pb). (B): Nivel de expresión de ABCG2 normalizado con GADPH a lo largo de
los diferentes estadios de la curva de crecimiento. Los resultados representan la media ± SD de tres
experimentos independientes.
Resultados
114
Para validar las diferencias obtenidas en la exposición de PS entre parásitos controles y
parásitos ABCG2K/M
en los experimentos de unión a Anexina V, realizamos un ensayo
de citotoxicidad al péptido papuamide B (pau B). Pau B es un péptido antibiótico que
presenta una elevada afinidad por la PS. Se ha observado que cepas de S. cerevisiae
deficientes en aminofosfolípidos translocasas presentan una mayor exposición de PS en
la superficie de la membrana plasmática con respecto a las cepas control, confiriéndoles
hipersensibilidad a pau B; sin embargo, mutantes de S. cerevisiae para CHO1 (enzima
principal de la ruta biosintética de PS en levaduras) son menos sensibles al péptido.
Además, pau B permeabiliza 100 veces más liposomas que contienen PS (Parsons et al.
2006). Cuando se produce la interacción de pau B con la PS, se genera un poro en la
membrana plasmática de la célula que provoca la muerte por colapso osmótico.
Nuestros resultados revelan que los parásitos ABCG2K/M
son significativamente menos
sensibles al péptido pau B que los parásitos controles (EC50 3,26 ± 0,67 µM vs EC50
2,12 ± 0,33 µM), corroborando con ello que los parásitos ABCG2K/M
presentan una
menor exposición de PS en su superficie (Figura 9-A). Como control del experimento
realizamos un ensayo de sensibilidad al péptido Ro09-0198 que se une de forma
específica a la PE de la membrana. Los resultados indican que no existen diferencias de
sensibilidad al péptido Ro09-0198 entre parásitos ABCG2K/M
y controles (EC50 1,58 ±
0,09 µM vs EC50 1,64 ± 0,12 µM) (Figura 9-B); estos datos se correlacionan con los
resultados obtenidos para el acúmulo de NBD-PE, en el cual no existen diferencias
significativas entre parásitos ABCG2K/M
y parásitos controles.
Las diferencias de sensibilidad al péptido pau B pueden deberse indirectamente a
alteraciones de la organización lipídica de la membrana de los parásitos ABCG2K/M
.
Existen múltiples transportadores ABCG implicados en el transporte de esteroles que
influyen en la composición y/o organización de la membrana plasmática. En este
sentido, nos propusimos realizar un ensayo de toxicidad frente a anfotericina B que se
une a ergosterol, el principal esterol de la membrana de los parásitos. Los resultados
muestran que no existen diferencias significativas entre ambas líneas para la
anfotericina B (EC50 0,16 ± 0,01 µM vs EC50 0,15 ± 0,04 µM) (Figura 9-C). Todos
estos datos sugieren que ABCG2 no contribuye de forma significativa a la distribución
de ergosterol en la membrana plasmática.
Resultados
115
Figura 9: Estudio de la sensibilidad a los péptidos pau B, Ro09-0198 y anfotericina B en las
distintas líneas de L. major.
Sensibilidad de los parásitos controles y ABCG2K/M
al péptido pau B (A), al péptido Ro09-0198 (B) y a la
anfotericina B (C). Los parásitos en fase logarítmica de crecimiento se diluyen en RPMI suplementado
con 10% de suero, y se siembran 50.000 parásitos/pocillo en un gradiente de concentraciones de péptidos
también disueltos en RPMI 10% de suero (volumen final de 100 µl/pocillo). Se emplea 10% de suero, ya
que un exceso de albúmina sérica, puede interaccionar con el péptido e inhibirle su capacidad citolítica.
(Andreu y Rivas, 1998; Torrent et al. 2012). Para el análisis de la anfotericina B se siembran 300.000
parásitos/pocillo y se emplea RPMI suplementado con 20% de suero. Las placas de microtitulación de 96
pocillos se incuban durante 72 horas a 28 ºC y se analiza la viabilidad celular mediante MTT (Materiales
y Métodos). Los resultados representan la media ± SD de cuatro experimentos duplicados e
independientes. La significancia estadística con respecto al control se calculó usando la t de Student (*:
p< 0,05).
2.2. Localización subcelular del transportador ABCG2.
Para el estudio de la localización subcelular de la proteína ABCG2 en el parásito
Leishmania, obtuvimos proteínas quiméricas fusionadas a la proteína verde fluorescente
(GFP) tanto en N- como en C-terminal.
Previo a los estudios de localización, se determinaron los niveles de expresión de
nuestras proteínas de fusión en los parásitos seleccionados, para ello se realizó un
Western blot empleando un anticuerpo policlonal frente a la GFP; como era de esperar,
la banda correspondiente a GFP-ABCG2 y al mutante GFP-ABCG2K/M
tiene un tamaño
de alrededor de 100 kDa (Figura 10).
Resultados
116
Bandas de mayor peso molecular podrían corresponder a formas diméricas de la
proteína o agregados, como también se ha descrito para otras proteínas ABCG tales
como LABCG5 (Campos-Salinas et al. 2011). Las bandas de menor peso molecular
probablemente se corresponden con productos de degradación (Figura 10).
Figura 10: Expresión de las proteínas quiméricas GFP-ABCG2 y GFP-ABCG2K/M
en distintas
líneas de L. major. El extracto proteico total de las distintas líneas de L. major se analizó mediante
Western blot e inmunodetección con los anticuerpos anti-GFP y anti-H2A (recuadro inferior, control de
carga) a una dilución 1:5000. Carril 1: Parásitos controles que expresan la proteína GFP. Carril 2:
Parásitos que expresan la proteína GFP-ABCG2 y Carril 3: Parásitos que expresan la proteína GFP-
ABCG2K/M
. El marcador de peso molecular (kDa) está indicado en la parte izquierda de la figura. Las
flechas situadas en el lado derecho de la figura indican el tamaño de la proteína fusión (100 kDa), GFP
(29 kDa) y H2A (18 kDa). La figura es representativa de tres experimentos independientes.
Los estudios de localización mediante microscopía de fluorescencia mostraron que la
proteína GFP-ABCG2 de promastigotes en fase estacionaria de crecimiento presenta
colocalización parcial con los marcadores de vesículas endocíticas y del lisosoma
(FM4-64 y Concanavalina A-Alexa Red) (Figuras 11 A-C). El patrón de localización
no cambia en los parásitos que expresan la proteína GFP-ABCG2K/M
(Figuras 11 B-D).
Los experimentos llevados a cabo a 4 ºC, temperatura a la cual se inhibe el tráfico
vesicular, mostraron que GFP-ABCG2K/M
colocaliza con la sonda FM4-64 a nivel del
bolsillo flagelar de los parásitos (región de la célula donde se desarrollan los fenómenos
de endo y exocitosis) (Figura 11-E). Ambas proteínas (GFP-ABCG2 y GFP-
ABCG2K/M
) también se detectaron en la parte apical de la célula y en el polo aflagelar
del parásito (Figura 11 C-D): una de las regiones implicadas en la interacción del
parásito con la célula hospedadora (macrófagos).
Resultados
117
Figura 11: ABCG2 se localiza en vesículas intracelulares del parásito Leishmania. Promastigotes de
L. major transfectados con GFP-ABCG2 (A-C)
y GFP-ABCG2K/M
(B-D)
en fase estacionaria de
crecimiento, se incubaron a 28 ºC con 1 µM de FM4-64 durante 30 minutos (A-B) y con 50 µg/ml de
Concanavalina A-Alexa Red durante 120 minutos (C-D). (E) GFP-ABCG2K/M
se localiza en el bolsillo
flagelar del parásito Leishmania. Los parásitos tras el marcaje se fijaron durante 10 minutos en 2% de
paraformaldehido a 4 ºC. (a): Nomarski de las imágenes b, c y d. (f): Imagen ampliada de la zona de
colocalización, se indica con flecha amarilla el solapamiento de las imágenes. N (Núcleo) y K
(Kinetoplasto) se tiñeron con DAPI, FP (bolsillo flagelar), AP (polo aflagelar). Tamaño de escala 5 µm.
Las figuras son representativas de al menos tres experimentos independientes.
Resultados
118
La proteína ABCG2K/M
fusionada a GFP en C-terminal (ABCG2K/M
-GFP) mostró un
patrón de localización similar a la obtenida con la proteína de fusión GFP-ABCG2K/M
(Figura 12); sin embargo, su expresión es inestable y no pudimos realizar los estudios
de colocalización al igual que los efectuados sobre ABCG2 fusionada a GFP en N-
terminal. Estos datos sugieren que la región C-terminal del TMD es fundamental para el
mantenimiento de la estabilidad de la proteína.
Figura 12: Localización subcelular de la proteína ABCG2K/M
-GFP en el parásito Leishmania. (a) y
(c) Nomarski de las imágenes (b) y (d), respectivamente. (b) Muestra la localización citoplasmática de la
proteína GFP (control) y (d) localización de la proteína ABCG2K/M
-GFP (flechas blancas). FP (bolsillo
flagelar) y AP (polo aflagelar). Tamaño de escala 5 µm. La figura muestra un parásito representativo de
una población total de parásitos con un patrón de fluorescencia similar.
Todos estos resultados muestran que GFP-ABCG2 y GFP-ABCG2K/M
, se localizan en
vesículas intracelulares de la vía endosomal, en el bolsillo flagelar y a nivel del polo
aflagelar de Leishmania.
Para demostrar que la fusión con GFP no altera la interacción del mutante con la
proteína nativa ABCG2, realizamos un ensayo de citotoxicidad a pau B con parásitos
que expresan GFP-ABCG2K/M
y parásitos que solo expresan GFP (control). Observamos
que estos parásitos también son significativamente menos sensibles al péptido
comparados con los parásitos controles (EC50 2,45 ± 0,06 µM vs EC50 1,66 ± 0,03 µM)
(Figura 13).
Resultados
119
Figura 13: Ensayo de sensibilidad al péptido pau B en los parásitos que expresan la proteína
fusionada a GFP. Parásitos controles (transfectados con el vector que expresa la GFP) y parásitos que
expresan GFP-ABCG2K/M
se sometieron a un tratamiento con el péptido pau B y se procesaron tal y como
se describe en la Figura 9. Los resultados representan la media ± SD de cuatro experimentos duplicados e
independientes. La significancia estadística con respecto al control se determinó usando la t de Student (*:
p< 0,05).
2.3. Los parásitos ABCG2K/M
presentan una menor infectividad en macrófagos
peritoneales.
Se ha demostrado que la exposición de PS en la cara externa de la membrana plasmática
de los parásitos constituye un factor de virulencia necesario para poder interaccionar e
invadir las células hospedadoras como macrófagos y células polimorfonucleares.
Nos propusimos evaluar cómo afecta al proceso de infección celular la menor
exposición de PS que tienen los parásitos ABCG2K/M
. Realizamos un experimento de
infección con macrófagos peritoneales de ratón y medimos la capacidad de infección de
parásitos controles y parásitos ABCG2K/M
en fase estacionaria de crecimiento.
Los resultados muestran que el porcentaje de infección de los parásitos controles es de
un 79,60% ± 1,96 tras 24 horas post-infección, mientras que en los parásitos ABCG2K/M
el porcentaje de infección fue del 19,93% ± 1,55 (Figura 14-A). Estos datos sugieren
que la menor capacidad infectiva de los parásitos ABCG2K/M
se asocia a su reducida
exposición de PS en la cara externa de la membrana plasmática; sin embargo, el número
medio de amastigotes por célula es similar en ambas líneas (Figura 14-B).
Resultados
120
Figura 14: Infección de macrófagos peritoneales de ratón con las distintas líneas de L. major. La
infección de macrófagos peritoneales de ratón con parásitos controles y ABCG2K/M
en fase estacionaria de
crecimiento, se ha descrito en Materiales y Métodos. El porcentaje de infección de macrófagos
peritoneales se calculó dividiendo el número de macrófagos infectados entre el número total de
macrófagos contabilizados y multiplicado por cien (A). El número medio de amastigotes por célula se
determinó dividiendo el número total de amastigotes entre los macrófagos infectados (B). El análisis se
realizó contabilizando el número de kinetoplastos por núcleo de macrófago (ambos teñidos con DAPI); el
cálculo se determinó usando un contador de células informático (programa Image J). Los resultados
representan la media ± SD de tres experimentos independientes. La significancia estadística con respecto
al control se determinó usando la t de Student (*: p< 0,05).
Seguidamente estudiamos si las diferencias de infección se deben a modificaciones del
proceso inicial de interacción parásito/macrófago, para ello realizamos un ensayo de
unión parásito/célula durante 4 horas y observamos que no existen diferencias
significativas en el porcentaje de interacción de los parásitos controles (80,50 ± 5,77)
comparado con el de los parásitos ABCG2K/M
(84,33 ± 7,35) (Figura 15).
Resultados
121
Figura 15: Ensayo de interacción de las distintas líneas de L. major con los macrófagos peritoneales
de ratón. (A) Análisis de la interacción de promastigotes controles y ABCG2K/M
en fase estacionaria de
crecimiento (4 días) con macrófagos peritoneales de ratón. El porcentaje de interacción
parásito/macrófago tras 4 horas de incubación, se determinó contando el número de parásitos por 100
macrófagos/pocillo mediante microscopía de fluorescencia. Los resultados representan la media ± SD de
tres experimentos independientes. (B) Microfotografía que muestra la interacción de promastigotes en
fase estacionaria de crecimiento con los macrófagos peritoneales de ratón. Los parásitos se marcan con
Cell Tracker (marcaje verde) y se incuban con macrófagos previamente teñidos con FM4-64 (marcaje
rojo), descrito en Materiales y Métodos. La imagen (a) y (c) corresponde a Nomarski y las imágenes (b) y
(d) representan la interacción de parásitos controles y ABCG2K/M
respectivamente. Escala de medida 10
µm.
A continuación nos planteamos estudiar si en los parásitos ABCG2K/M
está alterada la
expresión de otros factores de virulencia de Leishmania, fundamentalmente el
lipofosfoglicano (LPG) y la gp63. La expresión de estas moléculas varía a lo largo del
ciclo de desarrollo de Leishmania (promastigote/amastigote) (Nederer et al. 2004;
Franco et al. 2012), a medida que experimenta el proceso de metaciclogénesis se elonga
y modifica el LPG (Figura 16-A) y presentan una mayor expresión de gp63 (Hsiao et
al. 2008; Isnard et al. 2012).
Resultados
122
Empleamos la lectina de Ricinus communis conjugada con fluoresceína para
determinar si hay variaciones en el LPG de nuestras líneas, ya que tiene la capacidad de
unirse a residuos β-galactósidos del LPG, pudiendo evaluarse con ello variaciones del
LPG a nivel cuantitativo. Mediante citometría de flujo observamos que no existen
diferencias significativas entre ambas líneas de parásitos (Figura 16-B).
Figura 16: Análisis cuantitativo del lipofosfoglicano (LPG) en las distintas líneas de Leishmania.
(A): Representación gráfica de las diferencias que existen en el LPG entre parásitos procíclicos y
metacíclicos (Spath y Beverley. 2001; Franco et al. 2012). (B): La expresión del LPG se analizó en
parásitos controles y ABCG2K/M
en fase estacionaria de crecimiento (4 días) mediante un marcaje con la
lectina de Ricinus communis conjugada con fluoresceína. La fluorescencia se analizó mediante citometría
de flujo, descrito en Material y Métodos. Los datos representan las medias ± SD de los valores medios
geométricos del canal de fluorescencia (g.m.) de tres experimentos independientes.
Para el estudio de la expresión de gp63 empleamos un anticuerpo monoclonal específico
de esta proteína y mediante citometría de flujo comprobamos que no existen variaciones
significativas en la expresión de esta molécula de superficie entre parásitos controles y
parásitos ABCG2K/M
en fase estacionaria de crecimiento (Figura 17).
Resultados
123
Figura 17: Análisis de la expresión de gp63 en las distintas líneas de L. major.
Los parásitos controles y ABCG2K/M
en fase estacionaria de crecimiento, se incubaron con un anticuerpo
específico frente a gp63 y se cuantificó la expresión de gp63 en ambas líneas mediante citometría de
flujo. Los datos representan las medias ± SD de los valores medios geométricos del canal de fluorescencia
(g.m.) de tres experimentos independientes.
En base a estos resultados podemos concluir que las diferencias de infección obtenidas
entre parásitos controles y parásitos ABCG2K/M
no se deben a alteraciones en las
moléculas analizadas anteriormente, obteniendo una mayor importancia la diferente
exposición de PS entre ambas líneas.
Para comprobar que las diferencias en infectividad no sean debidas a alteraciones en el
desarrollo de los parásitos, procedimos a la purificación de metacíclicos de parásitos
controles y parásitos ABCG2K/M
. Para ello utilizamos la lectina de cacahuete PNA que
produce la aglutinación de las formas promastigotas por unión a los residuos de β-
galactósidos del LPG. Las formas metacíclicas de los parásitos presentan dichos
residuos enmascarados por arabinosa impidiendo que sean reconocidos por PNA, lo
cual nos permite separar los parásitos metacíclicos (no aglutinados) de los
promastigotes (aglutinados). Observamos que no existen diferencias significativas a
nivel del porcentaje de metacíclicos purificados en ambas líneas (Figura 18-A);
además, el tamaño de los metacíclicos es similar en ambas líneas (Figura 18-B). Por
otra parte, la movilidad se analizó mediante microscopía óptica y no se observaron
diferencias entre parásitos controles y ABCG2K/M
.
Resultados
124
Figura 18: Análisis de la capacidad de las distintas líneas de L. major para transformarse en
parásitos metacíclicos. (A) Porcentaje de promastigotes PNA-
de parásitos controles y ABCG2K/M
,
descrito en Materiales y Métodos. Los resultados representan la media ± SD de cuatro experimentos
independientes. (B) Análisis del tamaño (FSC-H) de parásitos metacíclicos (controles y ABCG2K/M
). La
flecha indica el análisis correspondiente a los parásitos ABCG2K/M
. El panel derecho de la figura muestra
el Nomarsky realizado a formas metacíclicas obtenidas tras la selección negativa con PNA. Escala de
medida 5 µm.
Para complementar los resultados anteriores realizamos un Western blot usando un
anticuerpo policlonal frente a una proteína expresada exclusivamente en parásitos
metacíclicos y amastigotes denominada HASPB (Hydrophilic acylated surface protein
B); la proteína HASPB es esencial para la infectividad y supervivencia del parásito en el
macrófago (Sádlová et al. 2010). Los resultados obtenidos nos permitieron comprobar
que los niveles de expresión de HASPB son similares en la fase estacionaria del
crecimiento en las líneas control y ABCG2K/M
(Figura 19).
Resultados
125
Figura 19: Análisis de la expresión de la proteína específica de metacíclicos HASPB en líneas de
Leishmania. La expresión de HASPB en parásitos controles y ABCG2K/M
en fase estacionaria de
crecimiento se analizó mediante Western blot empleando un anticuerpo específico. Un anticuerpo frente a
la α-tubulina se utilizó como control de carga. Los marcadores de peso molecular (kDa) se indican a la
izquierda de la figura. El resultado presentado es representativo de cuatro experimentos independientes.
2.4. El transportador ABCG2 está implicado en el desarrollo de la enfermedad en
un modelo murino de leishmaniasis cutánea.
Debido a que los resultados muestran que la inactivación de ABCG2 conlleva a una
menor infección de macrófagos peritoneales, analizamos si este fenómeno se
correlaciona con una menor virulencia de los parásitos ABCG2K/M
en un modelo murino
de leishmaniasis cutánea.
Durante el proceso de curación del plásmido en los parásitos ABCG2K/M
para obtener la
línea revertida, observamos que el incremento en la acumulación de NBD-PS respecto
al control permaneció inalterada durante aproximadamente 5-6 semanas en ausencia del
antibiótico de selección, lo cual podría posibilitarnos la utilización de estos parásitos en
el modelo in vivo de leishmaniasis cutánea sin que pierda su fenotipo, teniendo en
consideración de que en los ratones los parásitos están libres de la presión de
antibiótico.
El modelo de leishmaniasis cutánea se realizó en hembras de ratones BALB/c,
inoculando subcutáneamente en la almohadilla plantar promastigotes metacíclicos
control y ABCG2K/M
purificados mediante selección negativa con PNA. Tras la
infección, se procedió semanalmente a la monitorización de la inflamación y de las le-
Resultados
126
siones dérmicas hasta un máximo de cinco semanas; a partir de este tiempo, los
animales infectados con parásitos controles y ABCG2K/M
son sacrificados y evaluamos
la carga parasitaria en los tejidos.
A la tercera semana post-infección, los ratones infectados con parásitos controles
muestran una patente inflamación (edema) y aparecen lesiones tisulares (Figuras 20 A-
C); sin embargo, los infectados con parásitos ABCG2K/M
presentan una reducida
inflamación y no aparecen lesiones durante todo el proceso de monitorización de las
mismas (Figuras 20 A-C).
Figura 20: Infectividad de las distintas líneas de L. major en un modelo murino de leishmaniasis
cutánea. Ratones BALB/c se infectaron con 104 parásitos metacíclicos (controles y ABCG2
K/M, descrito
en Materiales y Métodos). La progresión de la enfermedad se monitorizó semanalmente midiendo la
inflamación (A) y el tamaño de la lesión (B). Los resultados representan la media ± SD de tres
experimentos independientes (10 ratones por condición experimental). La figura (C) muestra la lesión
originada a la quinta semana post-infección.
Resultados
127
A partir de la quinta semana, los ratones son eutanasiados, se les extirpa las patas
afectadas y evaluamos mediante dilución límite la carga parasitaria. Observamos que los
ratones infectados con las formas metacíclicas control presentan una cantidad de
parásitos significativamente mayor a la de los ratones infectados con metacíclicos
ABCG2K/M
(Figura 21-A).
También se extrajeron el bazo y los ganglios linfáticos de los ratones infectados por
ambas líneas, observando que los parásitos ABCG2K/M
no experimentan migración
hacia estos órganos, mientras que los parásitos controles si se diseminan a ganglios
linfáticos y bazo (Figura 21-B).
Figura 21: Estimación de la carga parasitaria en ratones infectados con las distintas líneas de L.
major. Los ratones se infectaron con parásitos controles y ABCG2K/M
. La carga parasitaria se determinó
en patas (A), y tejidos (B): ganglios linfáticos y bazo mediante dilución límite. Los ratones se sometieron
a eutanasia cuando las lesiones en los ratones controles alcanzan un tamaño de 50-70 mm2. n.d: no
detectado. Los resultados representan las medias de tres experimentos independientes ± SD (10 ratones
por condición experimental). La significancia estadística con respecto al control se calculó usando la t de
Student (*: p< 0,05).
Las formas amastigotes intracelulares de ambas líneas obtenidas de las patas infectadas
se cultivan in vitro hasta que se transforman en promastigotes (aproximadamente 7-10
días), evaluándose posteriormente la expresión de ABCG2K/M
mediante RT-PCR. Los
resultados revelan que los parásitos ABCG2K/M
aislados de las lesiones siguen
expresando altos niveles del gen mutado, (Figura 22-A) y además estos parásitos
mantienen incrementada la acumulación de NBD-PS con respecto a los controles:
(83,38± 1,66 vs 46,09 ± 0,70 unidades arbitrarias de fluorescencia; media geométrica).
(Figura 22-B).
Resultados
128
Figura 22: Estudio de la expresión génica de ABCG2 y de la acumulación de NBD-PS en las
distintas líneas de L. major aisladas de ratones infectados. (A) Análisis de la expresión génica de
ABCG2 (control y mutado) en parásitos controles y ABCG2K/M
aislados de las patas de ratones
infectados. El panel inferior muestra la expresión de GADPH usado como control interno de carga. La
RT-PCR se realizó sobre el ADNc obtenido a partir de 1 µg de ARN de parásitos controles y ABCG2K/M
.
Las condiciones utilizadas fueron: desnaturalización inicial de 95 ºC durante 5 minutos y 35 ciclos de
amplificación que comprenden las siguientes etapas: desnaturalización a 95 ºC durante 1 minuto,
hibridación a 54 ºC durante 30 segundos, extensión a 68 ºC durante 35 segundos y una extensión final de
5 minutos. El producto final se sometió a una electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Los marcadores
de tamaño molecular (pb) están indicados a la izquierda de la figura y a la derecha los tamaños esperados.
(B) Acumulación de NBD-PS en parásitos controles (histograma gris) y ABCG2 K/M
(histograma línea
negra, indicado con flecha). El histograma con línea discontinua representa a parásitos no marcados con
los fosfolípidos fluorescentes. Parásitos controles y ABCG2K/M
procedente de ratones infectados y
mantenidos en cultivo, se emplearon en un ensayo de acúmulo de NBD-PS en fase estacionaria de
crecimiento, durante 30 minutos a 28 ºC. Después de la extracción con BSA, se mide la fluorescencia
asociada a las células mediante citometría de flujo; descrito en Materiales y Métodos. Experimento
representativo de tres independientes.
Hemos confirmado los bajos niveles de virulencia que presentan los parásitos
ABCG2K/M
en el modelo in vivo, al repetir los experimentos con parásitos ABCG2K/M
obtenidos tras un segundo evento de transfección (Figuras 23 A-C).
Al igual que en el primer experimento, a la tercera semana post-infección, los ratones
infectados con parásitos controles muestran una patente inflamación (edema) y aparecen
lesiones tisulares a la cuarta semana (Figuras 23 A-C); sin embargo, los ratones
infectados con parásitos ABCG2K/M
obtenidos en el segundo evento de transfección,
también presentan una reducida inflamación y no aparecen lesiones durante todo el
proceso de monitorización de las mismas (Figuras 23 A-C).
Resultados
129
Figura 23: Infectividad de las distintas líneas de L. major en un modelo murino de leishmaniasis
cutánea. Segundo evento de transfección. Ratones BALB/c se infectaron con 104 parásitos metacíclicos
(controles y ABCG2K/M
, descrito en Materiales y Métodos). La progresión de la enfermedad se
monitorizó semanalmente midiendo la inflamación (A) y el tamaño de la lesión (B). Los resultados
representan la media ± SD de tres experimentos independientes (10 ratones por condición experimental).
La figura (C) muestra la lesión originada en el ratón a la quinta semana post-infección.
También se analizó la carga parasitaria en las patas y tejidos (ganglios y bazo) de los
ratones BALB/c empleados en el experimento de infección. Los resultados demuestran
que los ratones infectados con parásitos controles presentan unas tasas de parasitación
muy superiores a la de los infectados con parásitos ABCG2K/M
(Figura 24-A); además,
los parásitos ABCG2K/M
no experimentan migración hacia otros tejidos (Figura 24-B).
Resultados
130
Figura 24: Estimación de la carga parasitaria en ratones infectados con las distintas líneas de L.
major. Segundo evento de transfección. Los ratones se infectaron con parásitos controles y ABCG2K/M
.
La carga parasitaria se determinó en patas (A), y tejidos (B): ganglios linfáticos y bazo. Los resultados
representan las medias ± SD de tres experimentos independientes con 10 ratones por condición
experimental. Los ratones se sometieron a eutanasia cuando las lesiones en los ratones controles alcanzan
un tamaño de 50-70 mm2. n.d: no detectado. La significancia estadística con respecto al control se calculó
usando la t de Student (*: p< 0,05).
Estos resultados demuestran que las diferencias a nivel de virulencia entre ambas líneas
se deben fundamentalmente a la inactivación de la proteína ABCG2; por lo tanto el gen
ABCG2 de Leishmania es esencial para el desarrollo y la progresión de la
enfermedad.
2.5. Generación de parásitos mutantes nulos para los genes ABCG1 y ABCG2.
Para validar el fenotipo observado en los parásitos ABCG2K/M
, nos propusimos obtener
parásitos mutantes nulos para los genes ABCG1 y ABCG2. En relación al transportador
ABCG3, al estar truncado suponemos que la proteína es afuncional a nivel del
transporte de sustrato, y por ello, decidimos no sustituirlo del genoma de L. major. Los
parásitos mutantes nulos para ambos genes se obtuvieron mediante un proceso de doble
recombinación homóloga tras electroporación con una construcción que contiene el
cassette de resistencia a higromicina (Hygro) flanqueado por 1500 pb de la secuencia 5’
no codificante del gen ABCG2 y por 1500 pb de la secuencia 3’ no codificante del gen
ABCG1 (Figura 25). Los clones obtenidos tras la electroporación del cassette de
resistencia a higromicina se analizaron mediante Southern blot para determinar la susti-
Resultados
131
tución del primer alelo (Figura 26-C). Los parásitos mutantes simples se sometieron a
un incremento progresivo de la concentración de higromicina B hasta una nivel máximo
de 500 µg/ml, con ello pretendemos forzar la eliminación del segundo alelo y obtener el
doble reemplazamiento. De forma paralela, utilizamos una segunda estrategia para
conseguir la doble sustitución alélica, para ello se realizó una segunda transfección con
el cassette de resistencia a geneticina (Neo) en los parásitos mutantes simples; sin
embargo, los parásitos no se adaptaron a la presencia de la geneticina, no obteniéndose
ningún clon. Los parásitos mutantes simples adaptados a 500 µg/ml de higromicina se
analizaron mediante Southern blot. Se analizaron 30 clones de los cuales 29 presentaron
uno de los alelos sustituidos, y un clon con doble reemplazamiento con el cassette
Hygro. Finalmente, el clon con doble reemplazamiento se subclonó en medio de cultivo
semisólido y se comprobó nuevamente la doble sustitución alélica mediante Southern
blot.
Figura 25: Representación esquemática de la construcción diseñada para delecionar los genes
ABCG1 y ABCG2 de L. major. La construcción linearizada con las enzimas NotI/BamHI se empleó para
la transfección en L. major.
Para llevar a cabo el análisis de los diferentes clones, digerimos el ADN genómico con
el enzima AgeI que presenta un sitio de corte fuera del locus de los tres genes,
obteniéndose un fragmento de 15,7 Kb para la secuencia nativa (Figura 26-A). Al
sustituir los genes ABCG1 y ABCG2 (fragmento de 10 Kb) por el cassette Hygro
(fragmento de 5 Kb), la digestión con AgeI genera un fragmento de 10,7 Kb (Figura
26-B). Tras la digestión y electroforesis, el ADN se transfirió a membranas de nylon y
posteriormente se hibridó con dos sondas de ADN marcadas con digoxigenina: la sonda
Resultados
132
5’ UTR-ABCG2 y una sonda de la región intergénica entre ABCG1 y ABCG2 (Figura
26 C-E).
Figura 26: Mapa de restricción AgeI del locus ABCG1/ABCG2 y del recombinante. Análisis
mediante Southern blot de parásitos mutantes. (A): Disposición de los genes ABCG1, ABCG2 y
ABCG3 en el cromosoma 6 de Leishmania. (B): Cassette Hygro integrado. Se indican las sondas
empleadas para la confirmación de la recombinación mediante Southern blot.
Southern blot de ADN genómico digerido con AgeI e hibridado con la sonda 5’UTR-ABCG2. (C):
parásitos control (+/+), un clon con un alelo delecionado (+/-) y un clon con los dos alelos delecionados,
mutante nulo (-/-). (D): parásitos control y un subclon obtenido a partir del mutante nulo. (E): Southern
blot realizado con las mismas muestras que en el apartado D e hibridado con una sonda que reconoce la
región intergénica entre ABCG1 y ABCG2. La figura es representativa de tres experimentos
independientes.
Para confirmar la implicación de estos genes ABCG en el transporte de PS realizamos
un ensayo de acúmulo del análogo fluorescente (NBD-PS) en parásitos control y en
aquellos con uno (+/-) o los dos alelos delecionados (-/-) de la repetición
ABCG1/ABCG2.
Resultados
133
Los resultados revelan que los parásitos mutantes nulos (-/-) para los genes ABCG1 y
ABCG2 (parásitos ABCG1+G2), presentan una mayor acumulación de NBD-PS
(aproximadamente 3 veces más; n=3) que los parásitos control. Los parásitos (+/-)
tienen una acumulación intermedia entre los parásitos control y los parásitos
ABCG1+G2 (Figura 27).
Figura 27: Acumulación del análogo fluorescente de fosfatidilserina (NBD-PS) en distintas líneas de
Leishmania. Promastigotes de Leishmania en fase estacionaria de crecimiento: parásitos control (c),
mutante (+/-) y parásitos ABCG1+G2 (-/-), se incubaron con el análogo fluorescente de PS (NBD-PS)
durante 30 minutos a 28 ºC. Después de la extracción con BSA del análogo expuesto en la superficie del
parásito y un lavado con PBS, la fluorescencia intracelular se determinó mediante citometría de flujo. El
histograma de línea negra (indicado con flecha) representa a parásitos ABCG1+G2 (-/-). El histograma
de línea discontinua simboliza a los parásitos mutantes (+/-). Finalmente, el histograma de línea gris
representa a los parásitos control (c). Histograma representativo de 3 experimentos independientes.
2.6. Rescate del fenotipo de parásitos ABCG1+G2 mediante transfección de los
genes ABCG1 y ABCG2: Caracterización funcional.
Estudiamos la contribución de ambos genes ABCG1 y ABCG2 en parásitos
ABCG1+G2 mediante transfección con cada uno de ellos y en combinación.
En primer lugar, verificamos la expresión de ABCG1 y ABCG2 en los parásitos
ABCG1+G2 transfectados con dichos genes mediante RT-PCR empleando
oligonucleótidos específicos y posterior electroforesis en geles de agarosa de los
fragmentos amplificados (Figura 28).
Resultados
134
Figura 28: Análisis de la expresión génica de ABCG1 y ABCG2 en las distintas líneas de L. major. Se
determinó la expresión de los genes ABCG1 y ABCG2 en parásitos control, parásitos ABCG1+G2,
ABCG1+G2 transfectados con ABCG1 (ABCG1+G2:G1) o ABCG2 (ABCG1+G2:G2) y
cotransfectados con ABCG1 y ABCG2 (ABCG1+G2:G1+G2). Amplificación con oligonucleótidos
específicos para ABCG1 (A) y para ABCG2 (B). La expresión de GADPH se empleó como control (C).
El ADNc se empleó para una PCR con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 ºC
durante 5 minutos y 35 ciclos de amplificación que comprende una desnaturalización a 95 ºC durante 1
minuto, hibridación a 54 ºC durante 30 segundos, extensión a 68 ºC durante 35 segundos y una extensión
final de 5 minutos. El producto final se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 4%
(mezcla 1/1 de agarosa y agarosa de bajo punto de fusión). El peso molecular (pb) está indicado a la
izquierda de la figura. La figura es representativa de tres experimentos independientes.
Por otra parte, la deleción de los dos genes ABCG1 y ABCG2, o la reintroducción de
copias episomales de ambos, no produjo importantes alteraciones en el crecimiento de
las diferentes líneas como lo reflejan sus curvas de crecimiento (Figura 29).
Resultados
135
Figura 29: Curva de crecimiento de las distintas líneas de Leishmania. Los parásitos son cultivados a
una concentración inicial de (1x106/ml). El estudio se realizó durante 240 horas de cultivo,
determinándose cada 24 horas el número de parásitos de cada línea: Control (cepa salvaje),
ABCG1+G2, y ABCG1+G2 transfectados con ambos genes (ABCG1+G2:G1+G2). Los resultados
mostrados son las medias ± SD de tres experimentos independientes. No existen diferencias significativas
entre parásitos ABCG1+G2 y el resto de las líneas.
Seguidamente evaluamos el transporte de análogos fluorescentes de fosfolípidos de
cadena corta en los parásitos ABCG1+G2 transfectados con los genes ABCG1 y
ABCG2. Los resultados mostraron que tanto la expresión independiente como conjunta
de ambos genes da lugar a la recuperación de los niveles de acumulación de NBD-PS,
alcanzando tasas similares a las del control sin verse afectada la acumulación del resto
de fosfolípidos (Figura 30; Tabla 2); igualmente, estos resultados nos confirman la
implicación tanto de ABCG1 como ABCG2 como flopasas de PS y avalan los
resultados obtenidos en los parásitos ABCG2K/M
.
Resultados
136
Figura 30: Acumulación de análogos fluorescentes de fosfolípidos en distintas líneas de Leishmania.
Promastigotes de Leishmania en fase estacionaria de crecimiento: parásitos control (salvajes), parásitos
ABCG1+G2, ABCG1+G2 transfectados con ABCG1 (ABCG1+G2:G1) o ABCG2
(ABCG1+G2:G2) y cotransfectados con ABCG1 y ABCG2 (ABCG1+G2:G1+G2), se incubaron con
los distintos análogos fluorescentes de fosfolípidos NBD-PC (A), NBD-PE (B), NBD-PS (C) y NBD-SM
(D) durante 30 minutos a 28 ºC. Después de la extracción con BSA del análogo expuesto en la superficie
del parásito y un lavado con PBS, la fluorescencia intracelular se determinó mediante citometría de flujo.
Los resultados mostrados son las medias ± SD de tres experimentos independientes. Las diferencias
significativas en comparación con la línea control se determinaron mediante la t de Student (*: p< 0,05).
Resultados
137
Tabla 2: Cuantificación de la acumulación de NBD-PS en distintas líneas de Leishmania.
Promastigotes de Leishmania en fase estacionaria de crecimiento: parásitos control (salvajes),
ABCG1+G2, ABCG1+G2 transfectados con ABCG1 (ABCG1+G2:G1) o ABCG2
(ABCG1+G2:G2) y cotransfectados con ABCG1 y ABCG2 (ABCG1+G2:G1+G2), se incubaron con el
análogo fluorescente de fosfolípido NBD-PS durante 30 minutos a 28 ºC. Después de la extracción con
BSA del análogo expuesto en la superficie del parásito y un lavado con PBS, se analizó la fluorescencia
asociada a las células. Los valores son las medias geométricas de fluorescencia (u.a.) ± SD de tres
experimentos independientes obtenidas mediante citometría de flujo.
Dado que los parásitos ABCG1+G2 presentan un fenotipo de acumulación de NBD-
PS similar al de los parásitos ABCG2K/M
, nos propusimos evaluar si se ve afectada
también la infección de macrófagos peritoneales de ratón; para ello, parásitos
ABCG1+G2 y transfectados con los genes ABCG1 y ABCG2 en fase estacionaria de
crecimiento, se adicionaron a cultivos de macrófagos peritoneales de ratón.
Los resultados muestran que el porcentaje de infección de los parásitos ABCG1+G2 es
de un 54,21% ± 1,50 tras 24 horas post-infección, mientras que en los parásitos
controles (línea salvaje) el porcentaje de infección fue del 89,90% ± 3,50. Los parásitos
ABCG1+G2 transfectados con ABCG1 y/o ABCG2 presentaron un porcentaje de
infección similares al del control (Figura 31-A).
Por otra parte, los parásitos ABCG1+G2 tienen un número medio de 1,10 ± 0,10
amastigote por célula, indicando una significativa menor entrada del parásito en los
macrófagos al compararlo con el resto de las líneas. Los parásitos ABCG1+G2:G1,
ABCG1+G2:G2 y ABCG1+G2:G1+G2 tienen una media de amastigotes por célula
muy similar a la obtenida en los parásitos control (salvajes). Específicamente, los
valores obtenidos fueron: 3,70 ± 0,80 en los parásitos ABCG1+G2:G1, 2,40 ± 0,90 en
los parásitos ABCG1+G2:G2, 3,10 ± 0,70 en ABCG1+G2:G1+G2, y 3,30 ± 0,20 en
los parásitos control. La transfección de ABCG1 y/o ABCG2 en los parásitos
ABCG1+G2, promueve que los parásitos se internalicen en los macrófagos de manera
similar a la de los parásitos control (Figura 31-B).
Resultados
138
Figura 31: Infección de macrófagos peritoneales de ratón con las distintas líneas de Leishmania.
Macrófagos peritoneales de ratón se infectaron con parásitos control (salvajes), parásitos ABCG1+G2,
ABCG1+G2 transfectados con ABCG1 (ABCG1+G2:G1) o ABCG2 (ABCG1+G2:G2) y
cotransfectados con ABCG1 y ABCG2 (ABCG1+G2:G1+G2), en fase estacionaria de crecimiento, en
una relación parásito: célula 5:1 durante 4 horas a 35 º C. A las 24 horas post-infección se determinó el
porcentaje de infección (A) y la media de amastigotes/célula (B). Los resultados mostrados son las
medias ± SD de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas en comparación con la
línea control se determinaron mediante la t de Student (*: p< 0,05).
Seguidamente, evaluamos la capacidad de las diferentes líneas de parásitos para
diferenciarse a metacíclicos. Para ello, procedimos a la purificación de los parásitos
metacíclicos al quinto día (fase estacionaria tardía) y al décimo día (fase estacionaria
muy tardía) de cultivo (Figura 32).
Resultados
139
Figura 32: Purificación de parásitos metacíclicos (PNA-) en las distintas líneas de Leishmania.
Promastigotes metacíclicos de parásitos control (salvajes), parásitos ABCG1+G2, ABCG1+G2
transfectados con ABCG1 (ABCG1+G2:G1) o ABCG2 (ABCG1+G2:G2) y cotransfectados con
ABCG1 y ABCG2 (ABCG1+G2:G1+G2), se purificaron a los 5 y 10 días de cultivo mediante selección
negativa con la lectina PNA, descrito en Materiales y Métodos. Los resultados representan las medias ±
SD de cuatro experimentos independientes. La significancia estadística con respecto al control se calculó
usando la t de Student (*: p< 0,05).
Los resultados mostraron que a diferencia de los parásitos ABCG2K/M
, los parásitos
ABCG1+G2 presentan una reducción significativa en el porcentaje de metacíclicos
PNA- (Figura 32). La introducción en los parásitos ABCG1+G2 de los genes ABCG1
y ABCG2 incrementa la producción de formas metacíclicas, presentando mayor
similitud con la cepa salvaje los parásitos ABCG1+G2 transfectados con ambos genes
(Figura 32). Para comprobar si este fenotipo coincide con la pérdida de expresión de
algún otro marcador específico de formas metacíclicos, realizamos un Western blot
contra la proteína HASPB considerada como una proteína específica de metacíclicos
(Figura 33).
Resultados
140
Figura 33: Análisis de la expresión de la proteína específica de metacíclicos HASPB en las distintas
líneas de Leishmania. 1 x 107
(A, B) y 2 x 107
(C, D) de parásitos se lisaron al quinto (A, C) y décimo
día (B, D), y se procesaron para Western blot. Líneas: 1: Control, 2: ABCG1+G2, 3: ABCG1+G2:G1,
4: ABCG1+G2:G2 y 5: ABCG1+G2:G1+G2. La expresión de HASPB se analizó mediante un
anticuerpo específico a una dilución 1/2000. Como control de carga se utilizó la expresión de la proteína
de la matriz mitocondrial HMGCoA sintasa (HMGS) a una dilución 1/ 25.000. Los marcadores de peso
molecular (kDa) se indican a la derecha de la figura. La figura es representativa de tres experimentos
independientes.
Los resultados revelaron que no existe diferencia de expresión de HASPB entre ninguna
de las líneas analizadas (Figura 33).
La escasa presencia de metacíclicos PNA- en parásitos ABCG1+G2 podría deberse a
una reducción en la modificación estructural de las moléculas de LPG que se produce en
la metaciclogénesis. En la diferenciación de formas promastigotas a metacíclicos, los
residuos de galactosa terminales que presenta la LPG se bloquean con arabinosa, lo cual
da lugar a una pérdida de interacción con la lectina.
En base a ello, decidimos realizar un ensayo de sensibilidad de las diferentes líneas de
parásitos a la lisis del complemento de suero humano, ya que la elongación y
modificación que presenta en su estructura el LPG en las formas metacíclicas es
fundamental para resistir la lisis mediada por complemento (Franco et al. 2012). Para
realizar el experimento se utilizaron formas promastigotes en fase logarítmica y en fase
estacionaria del crecimiento.
Resultados
141
Figura 34: Sensibilidad de las distintas líneas de Leishmania a la lisis mediada por complemento.
Promastigotes (1x107/ml) de parásitos control (salvajes), parásitos ABCG1+G2, ABCG1+G2
transfectados con ABCG1 (ABCG1+G2:G1) o ABCG2 (ABCG1+G2:G2) y cotransfectados con
ABCG1 y ABCG2 (ABCG1+G2:G1+G2), en fase logarítmica (A) y estacionaria (B), se expusieron a
concentraciones crecientes de suero humano a 37 ºC durante 30 minutos. Seguidamente, los parásitos se
incubaron con resazurina durante 24 horas a 28 ºC midiendo la viabilidad celular. Los resultados
representan la media ± SD de tres experimentos independientes. La significancia estadística con respecto
al control se determinó mediante la t de Student (*: p< 0,05).
Resultados
142
Los resultados obtenidos revelan que las distintas líneas de parásitos en fase logarítmica
de crecimiento (Figura 34-A), presentan una sensibilidad similar a la lisis mediada por
complemento de suero humano; sin embargo, en los parásitos en fase estacionaria de
crecimiento, observamos que los parásitos ABCG1+G2 presentan una significativa
mayor sensibilidad a la lisis por complemento incluso a bajas concentraciones de suero
humano (Figura 34-B). Estos resultados junto con los obtenidos en el ensayo de
aglutinación con PNA, sugieren que la pérdida de expresión de ABCG1 y ABCG2 da
lugar a que no se produzcan las modificaciones estructurales del LPG llevadas a cabo en
la metaciclogénesis.
Los parásitos ABCG1+G2 transfectados con ABCG1 o ABCG2 presentan una
sensibilidad similar a la lisis por complemento, mostrando una resistencia menor a la
lisis que la cepa salvaje aunque la diferencia no es significativa; sin embargo, los
parásitos ABCG1+G2 cotransfectados con ABCG1 y ABCG2 muestran una
sensibilidad similar a los parásitos control.
Finalmente, nos propusimos determinar si se producen cambios en los niveles de
especies reactivas del oxígeno (ROS) en las diferentes líneas a lo largo del crecimiento.
El interés de este estudio radica en que en el proceso de metaciclogénesis,
fundamentalmente desencadenado por estrés nutricional, existe una mayor producción
de ROS, asociado al proceso de autofagia que experimenta el parásito como
consecuencia de dicho estrés.
Se ha demostrado que parásitos mutantes nulos para genes implicados en los procesos
de autofagia como Δatg4.2, son más susceptibles al estrés oxidativo, y presentan niveles
más altos de ROS en fase estacionaria de crecimiento al compararlos con los parásitos
control (Williams et al. 2013).
Los análisis llevados a cabo indican que los parásitos ABCG1+G2 presentan una
mayor producción de ROS desde su entrada en la fase estacionaria tardía de crecimiento
(6 días) en comparación con el resto de líneas de parásitos. Observamos que los
parásitos ABCG1+G2 tienen una producción de ROS significativamente superior al de
los parásitos control (salvajes) en la fase estacionaria tardía (65,68 ± 4,19 vs 38,12 ±
Resultados
143
1,12 unidades arbitrarias de fluorescencia; media geométrica), y estacionaria muy tardía
de crecimiento (73,22 ± 0,26 vs 29,19 ± 0,15 unidades arbitrarias de fluorescencia;
media geométrica) (Figura 35). Los parásitos ABCG1+G2 transfectados con ABCG1
(ABCG1+G2:G1) o ABCG2 (ABCG1+G2:G2) y cotransfectados con ABCG1 y
ABCG2 (ABCG1+G2:G1+G2) tienen un estrés oxidativo similar al obtenido en los
parásitos control (Figura 35). Estos resultados sugieren que los parásitos ABCG1+G2
presentan un mayor estrés oxidativo en las fases finales de su crecimiento debido a una
deficiencia en la metaciclogénesis.
Figura 35: Niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) a lo largo de las diferentes fases de
crecimiento del parásito Leishmania. Se utilizó una concentración de 1x107/ml promastigotes de las
distintas líneas de Leishmania: parásitos control, parásitos ABCG1+G2, parásitos ABCG1+G2
transfectados con ABCG1 (ABCG1+G2:G1) o ABCG2 (ABCG1+G2:G2) y cotransfectados con
ABCG1 y ABCG2 (ABCG1+G2:G1+G2), para determinar la producción de ROS. Se aislaron en fase
logarítmica (L= 2 días), estacionaria (S= 4 días), estacionaria tardía (LS= 6 días) y estacionaria muy
tardía (VLS= 10 días), y se midió la producción de ROS mediante la sonda diacetato de 2,7-
diclorodihidrofluoresceína (H2DCF-DA). Los resultados mostrados son las medias geométricas de
fluorescencia (u.a.) ± SD de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas en
comparación con la respectiva línea control se determinaron mediante la t de Student (*: p< 0,05).
DISCUSIÓN
Discusión
144
DISCUSIÓN.
1. Situación actual de la leishmaniasis.
La leishmaniasis junto a otras infecciones de las regiones tropicales y subtropicales
como la tripanosomiasis africana, y la enfermedad de Chagas se integran dentro de las
llamadas enfermedades “olvidadas”, debido a la escasa inversión sanitaria y/o científica
que hacen los países desarrollados para encontrar herramientas de lucha para combatir
dichas enfermedades, que afectan fundamentalmente a países en vías de desarrollo y a
poblaciones de escasos recursos económicos (Beyrer et al. 2007).
El 90% de los casos de leishmaniasis visceral (LV) se producen en países en vías de
desarrollo con elevados niveles de pobreza como la India, Sudán, Nepal, etc. (Alvar et
al. 2012). En estos países, el crecimiento demográfico y económico facilita que la
población entre en contacto con regiones donde existe una mayor exposición al vector
transmisor de la enfermedad.
En Europa, la leishmaniasis es endémica en todos los países de la cuenca Mediterránea.
En España es una enfermedad parasitaria de declaración obligatoria a las autoridades
sanitarias; siendo la forma visceral la más habitual en los centros hospitalarios. Se ha
estimado que el 42% de los casos de LV corresponden a pacientes coinfectados con
VIH (Valcárcel et al. 2008). Recientemente, en Fuenlabrada (Madrid) se ha producido
un brote de leishmaniasis en humanos; cuyo origen epidemiológico se centra en las
zonas verdes de Fuenlabrada (Parque de Bosquesur) y Leganés (Parque de Polvoranca),
como consecuencia de la superpoblación de liebres (Molina et al. 2012; Ruiz-Fons et al.
2013; Jiménez et al. 2013). Numerosos estudios asocian este brote a la existencia de un
ciclo selvático dónde la liebre actúa como reservorio principal de L. infantum. En este
contexto, la liebre facilita la transmisión del parásito a los humanos, y adquiere un
importante papel en la epidemiología de L. infantum en España (Molina et al. 2012;
Ruiz-Fons et al. 2013; Jiménez et al. 2013).
Discusión
145
La leishmaniasis se ha convertido en una enfermedad oportunista en pacientes que
presentan algún tipo de inmunosupresión; una situación alarmante es la de los enfermos
con VIH, cuya probabilidad de desarrollar LV en áreas endémicas aumenta de manera
exponencial (Alvar et al. 2008). Sin embargo, la leishmaniasis en pacientes
inmunodeprimidos no-VIH cada vez más está adquiriendo mayor relevancia; este grupo
engloba a una heterogeneidad de pacientes sometidos a inmunodepresión y cuya
situación promueve la reactivación de una infección latente o el fallo para poder
controlar una nueva infección. Se han descrito casos de co-infección con Leishmania en
pacientes trasplantados, con artritis reumatoide y pacientes con diferentes tipos de
cáncer (van Griensven et al. 2014).
Actualmente, el tratamiento frente a la leishmaniasis se enfrenta a una serie de factores
que limitan su eficacia, entre los que destacamos:
1) Un escaso control epidemiológico del vector transmisor.
2) La ausencia de vacunas eficaces.
3) Un reducido número de fármacos leishmanicidas.
4) El elevado coste de los fármacos que los hacen inaccesibles a las poblaciones
más pobres de las regiones endémicas.
5) La frecuente aparición de fallo terapéutico en el tratamiento, entre otros factores
por la aparición de resistencias en los parásitos.
Debido a la dificultad que plantea el tratamiento y control de la leishmaniasis,
actualmente se están buscando nuevas dianas terapéuticas que faciliten la eliminación
del parásito; consideramos que unos candidatos atractivos serían los transportadores
ABC, ya que se ha observado que algunos transportadores están implicados en la
resistencia a determinados fármacos leishmanicidas. La inactivación farmacológica de
los transportadores ABC combinado con fármacos leishmanicidas de nueva generación,
podría ser una estrategia alternativa para el control de la infección por Leishmania.
Discusión
146
2. Transportadores ABC en Leishmania.
La caracterización funcional de los transportadores ABC de Leishmania demuestra que
estas proteínas están implicadas en el transporte de lípidos, resistencia a fármacos y
virulencia (Parodi-Talice et al. 2003; Araújo-Santos et al. 2005; Castanys-Muñoz et al.
2007; Castanys-Muñoz et al. 2008; Pérez-Victoria et al. 2001; Pérez-Victoria et al.
2002; Pérez-Victoria et al. 2003; Pérez-Victoria et al. 2006).
Los transportadores ABC de Leishmania se agrupan en un total de 9 subfamilias (desde
la subfamilia A hasta la I) (Leprohon et al. 2006; Manzano et al. 2013), siendo un
miembro de la subfamilia ABCG objeto de estudio en este trabajo. La subfamilia de
transportadores ABCG tiene como principal característica el que todos sus miembros
son hemi-transportadores que necesitan homo/heterodimerizar para ser funcionalmente
activos. Dentro de esta subfamilia se han estudiado los siguientes transportadores: i)
ABCG4 o LiABCG4 se localiza en la membrana plasmática y en el bolsillo flagelar del
parásito. Los parásitos que sobreexpresan LiABCG4 presentan una menor acumulación
del análogo fluorescente de PC con respecto a los parásitos control; sin embargo, no se
observaron diferencias en el acúmulo del resto de análogos de PE, PS y SM ensayados.
La sobreexpresión de LiABCG4 se correlaciona con la generación de resistencia a
análogos de alquilfosfolípidos como la miltefosina (Castanys-Muñoz et al. 2007). ii)
ABCG6 o LiABCG6 se localiza en la membrana plasmática y en el bolsillo flagelar del
parásito; su función está relacionada con el tráfico de fosfolípidos. Los parásitos que
sobreexpresan LiABCG6 presentan una menor acumulación de los análogos
fluorescentes de PC, PE y PS, y son resistentes a la miltefosina, sitamaquina y
cloroquina (Castanys-Muñoz et al. 2008). La sobreexpresión de LiABCG4 o LiABCG6
no altera la capacidad infectiva de los parásitos. En la subfamilia ABCG de mamíferos,
cabe destacar a los transportadores ABCG1 y ABCG2 implicados en la translocación de
fosfolípidos. ABCG1 transporta colesterol, PS, PC y SM (Tarling y Edwards, 2011;
Hirayama et al. 2013). ABCG2 transporta PS, PC y múltiples fármacos antitumorales.
(Kusuhara y Sugiyama, 2007; Woehlecke et al. 2003). ABCG2 al estar implicado en el
transporte de fosfolípidos endógenos puede causar importantes cambios en la asimetría
de la membrana plasmática, los cuales podrían afectar a las interacciones celulares
(Woehlecke et al. 2003).
Discusión
147
En nuestro laboratorio se han caracterizado otros transportadores ABC relacionados con
el tráfico de fosfolípidos y que pertenecen a la subfamilia ABCA. LtrABC1.1 se
localiza en el bolsillo flagelar y está implicado en el tráfico de fosfolípidos a través de la
membrana de Leishmania, ya que presentan una menor acumulación de análogos
fluorescentes de PC, PE y PS (Parodi-Talice et al. 2003). Los parásitos que
sobreexpresan LtrABC1.1 tienen disminuida la exocitosis, tal y como demuestra la
menor exposición de fosfatasa ácida (SAP) hacia la membrana y además son menos
infectivos (Parodi-Talice et al. 2003).
La función de LtrABCA.2 se relaciona con la translocación de fosfolípidos, tal y como
demuestra una menor acumulación de análogos fluorescentes de PC, PE y PS; los
parásitos que lo sobreexpresan tienen incrementada la exocitosis pero son menos
infectivos (Araújo-Santos et al. 2005). Al igual que en Leishmania, la subfamilia ABCA
de mamíferos está relacionada con el tráfico de fosfolípidos; destacando ABCA7 que
transporta PS y ABCA1 que exporta PC, PS y SM a la cara externa de la membrana
plasmática de las células (Quazi y Molday, 2013). Además, ABCA1 y ABCA7
transfieren fosfolípidos a aceptores lipídicos, lo cual es necesario para la formación del
HDL (Quazi y Molday, 2013; Reboul et al. 2013). El transportador ABCA2 está
implicado en el tráfico del colesterol derivado del LDL (Coleman et al. 2013) y
ABCA12 es fundamental para el transporte de fosfolípidos hacia el estrato córneo de la
piel (Coleman et al. 2013).
La deleción de un determinado transportador ABC puede afectar también a la
virulencia del parásito. Se ha demostrado que mutantes nulos del transportador ABCC9
de L. donovani son hipervirulentos para animales de experimentación (Zhang y
Matlashewski, 2012). Amastigotes axénicos mutantes nulos para ABCC9 tienen una
mayor proliferación que los parásitos salvajes; igualmente, ratones infectados con
parásitos deficientes en ABCC9 presentan una carga parasitaria superior a la detectada
con la cepa salvaje (Zhang y Matlashewski, 2012). Estos datos sugieren que la deleción
de este gen incrementa la proliferación de los amastigotes, lo cual facilita una rápida
invasión de los órganos y una mayor progresión de la leishmaniasis visceral en el ratón
(Zhang y Matlashewski, 2012).
Discusión
148
3. Implicación de la fosfatidilserina (PS) en el proceso de infección del parásito
Leishmania.
Al igual que en el resto de organismos eucariotas, en el parásito Leishmania estarían
presentes los complejos proteicos que generan la asimetría de la membrana plasmática;
siendo la ubicación natural de la PS la cara interna de la membrana plasmática (López-
Marques et al. 2014).
En el proceso de apoptosis o muerte celular programada, la PS se expone hacia la cara
externa de la membrana plasmática, con ello se promueve que los cuerpos apoptóticos
sean reconocidos y eliminados por los macrófagos (Wu et al. 2006; Arango Duque y
Descoteaux, 2014). La translocación de PS e incremento en la exposición de PS en la
cara externa de la membrana plasmática se ve favorecida por dos mecanismos
principales: (1) Incremento en la actividad escramblasa y disminución de la
translocación de aminofosfolípidos por parte de las fosfolípidos translocasas (flipasas)
(Bevers y Williamson, 2010) y (2) Aumento funcional de la actividad flopasa en la
membrana plasmática, como el transportador ABCA1 (Marguet et al 1999; Kiss et al.
2006). También se ha observado la liberación de PS desde la membrana de los
lisosomas, la cual se fusiona con la membrana plasmática de la célula apoptótica
(Mirnikjoo et al. 2009).
Se ha postulado que en Leishmania, la exposición de PS en la fase estacionaria de
crecimiento se debe a una disminución en la translocación dependiente de energía de PS
hacia el interior celular. Con ello se facilita la exposición de PS en la cara externa de la
membrana por otras translocasas independientes de ATP como la escramblasa (Tripathi
y Gupta, 2003). Nuestro grupo de investigación describió una proteína perteneciente a la
familia de las P4 ATPasas o fosfolípidos translocasas denominada LdMT (L.
donovani Miltefosine Transporter). Esta proteína reside en la membrana plasmática del
parásito y está implicada en la translocación al interior celular de fosfolípidos y
alquilfosfolípidos leishmanicidas tales como la miltefosina (Pérez-Victoria et al. 2003;
Pérez-Victoria et al. 2006). LdMT requiere interaccionar con la proteína LdRos3 para
la formación de un complejo estable cuya función es la del mantenimiento de la asime-
Discusión
149
tría de los fosfolípidos de la membrana plasmática del parásito (Pérez-Victoria et al.
2006; Weingärtner et al. 2010).
Se ha demostrado en diferentes especies de Leishmania que la actividad escramblasa
depende de los niveles intracelulares de Ca2+
, ya que el tratamiento con ionomicina
(ionóforo que aumenta el Ca2+
intracelular) favorece el movimiento bidireccional de
lípidos a través de la membrana plasmática, sin ningún tipo de especificidad
(Weingärtner et al. 2011; dos Santos et al. 2013).
El transportador ABCG2, descrito en esta Tesis, podría estar implicado en el tráfico de
moléculas de PS hacia la cara externa de la membrana plasmática.
La exposición de PS en la cara externa de la membrana plasmática del parásito
Leishmania es un mecanismo utilizado por las formas metacíclicas y amastigotes del
parásito para interaccionar y/o invadir las células hospedadoras (Wanderley et al. 2005;
Wanderley et al. 2006; van Zandbergen et al. 2006; van Zandbergen et al. 2007;
Tripathi y Gupta, 2003). La PS y otros factores de virulencia como el LPG y gp63
inducen una serie de modificaciones bioquímicas que conducen al silenciamiento de la
actividad microbicida del macrófago. Se ha demostrado que gp63 tiene la capacidad de
inhibir a diversas protein quinasas como PTK y MAPK, necesarias para la fosforilación
de factores de regulación como ERK1/2 (Isnard et al. 2012; Olivier et al. 2012).
Además, gp63 activa a tirosina fosfatasas (SHIP-1 y PTPB-1) que actúan inactivando la
ruta de señalización JAK2/STAT y a los factores de transcripción NFκβ, IRF-1 y AP-1,
necesarios para la producción de óxido nítrico (ON) y superóxido (Isnard et al. 2012;
Olivier et al. 2012). La alteración de estas vías de señalización celular impide que el
macrófago desarrolle una respuesta eficiente tras recibir el estímulo del INFγ, por tanto
se produce el silenciamiento del macrófago (Isnard et al. 2012; Olivier et al. 2012). El
LPG del promastigote puede alterar la producción de segundos mensajeros (IP3, DAG,
PKC y Ca+2
) que regulan la actividad citotóxica del macrófago. La producción de INFγ
e IL-1 por los linfocitos T, genera la activación de la óxido nítrico sintasa inducible
(iNOS), con la consecuente producción de ON, que actúa sobre la vacuola parasitófora
del parásito (Wanderley et al. 2012). El estrés generado por el ON promueve que el
amastigote exponga una mayor cantidad de PS en su superficie, además las citoquinas
Discusión
150
anti-inflamatorias producidas por el linfocito T (IL-4, IL-10, IL-13 y TGF- β) activan a
la enzima Arginasa del macrófago, que utiliza L-arginina para producir L-ornitina,
sustrato de la ornitina descarboxilasa (ODC) que sintetiza como producto final
poliaminas que facilitan la supervivencia del parásito (Wanderley et al. 2012). El
silenciamiento del macrófago se caracteriza por la producción de IL-10 y factor de
crecimiento transformante β (TGF- β); ambiente citoquímico que contribuye a la
proliferación y/o diseminación del parásito (Wanderley et al. 2012).
Los amastigotes liberados tienen la capacidad de invadir nuevas células e
inmunomodular a las células T vía reconocimiento de PS (Figura 1). La exposición de
PS es un factor de virulencia necesario para el desarrollo y la progresión de la
enfermedad. Se ha demostrado que amastigotes aislados de pacientes con leishmaniasis
cutánea difusa (LCD) presentan una mayor exposición de PS en superficie, al
compararlos con amastigotes procedentes de pacientes con leishmaniasis cutánea
localizada (LCL) (Franca Costa et al. 2012). La mayor exposición de PS favorece la
replicación del parásito y su diseminación, por ello pacientes con LCD presentan una
enfermedad más agresiva, persistente y con elevadas lesiones tisulares (Franca Costa et
al. 2012). No solo Leishmania utiliza la exposición de PS como mecanismo para invadir
a sus células hospedadoras. Las formas infectivas de Toxoplasma gondii exponen PS en
superficie, mediante la cual inhibe la actividad citotóxica del macrófago (Seabra et al.
2004; Santos et al. 2011). También se ha demostrado que las formas infectivas de T.
cruzi utilizan la exposición de PS para internalizarse en sus células hospedadoras
(Damatta et al. 2007).
Discusión
151
Figura 1: Interacción del parásito Leishmania con el macrófago: Silenciamiento del macrófago. La
interacción y/o internalización del parásito en el macrófago es un evento mediado por receptor. Tras dicha
interacción, se generan una serie de señales que regulan y modifican el comportamiento del macrófago
(fagocitosis, secreción de citoquinas, actividad microbicida). La activación de SHIP-1/PTP1-B por gp63
desencadena la inhibición de JAK2/STAT, ERK1/2 y factores de transcripción (NF-κβ, IRF-1 y AP1),
con ello se impide que el macrófago responda a las funciones que induce el INFγ (producción de ON,
anión superóxido, IL-1, etc.). El LPG del parásito altera a varios segundos mensajeros: inositol trifosfato
(IP3), diacilglicerol (DAG), protein quinasa C (PKC) y Ca2+
implicados en la respuesta citotóxica del
macrófago. (1) La producción de INFγ e IL-1 por los linfocitos T, activan a la enzima iNOS que utiliza L-
arginina para producir ON. El estrés generado por el ON en la vacuola parasitófora (VP) induce que el
amastigote exponga PS en superficie, y además el ambiente citoquímico anti-inflamatorio (2) facilita la
activación de la Arginasa del macrófago que sintetiza poliaminas como producto final. La liberación de
los amastigotes (3) inmunomodula a los linfocitos T, promoviendo la secreción de citoquinas no
inflamatorias (IL-4, IL-13, IL-10 y TGF- β) que activan a la arginasa, incrementándose con ello la síntesis
de poliaminas que facilitan la supervivencia y diseminación del parásito. INFγR: Receptor del INFγ en el
macrófago. Tomado y adaptado de Olivier et al. 2005 y Wanderley et al. 2012.
Discusión
152
La importancia de la exposición de PS como marcador mimético de la apoptosis y su
implicación en el establecimiento de la infección por Leishmania, están actualmente en
discusión. Se centran en dos posibilidades:
1ª - Las células que exponen PS no necesariamente mueren en un proceso similar a la
apoptosis, si no que utilizan la exposición de PS para imitar a una célula apoptótica; con
ello, los parásitos consiguen infectar al macrófago e inhibirle su capacidad microbicida
(de Freitas Balanco et al. 2001; van Zandbergen et al. 2007; van Zandbergen et al.
2006; Barcinski et al. 2003).
2ª- Se observa que coexisten dos poblaciones parasitarias: una subpoblación apoptótica
(expone PS) que muere de forma “altruista” para que una segunda subpoblación, no
apoptótica (no expone PS), infecte de forma eficiente a las células fagocíticas. Existe un
mecanismo de cooperación entre ambas subpoblaciones que favorece que la infección
se desarrolle adecuadamente, ya que la subpoblación apoptótica produce el
silenciamiento del macrófago y con ello se promueve que la población no apoptótica
infecte a las células fagocíticas (van Zandbergen et al. 2006; Laskay et al. 2008
Wanderley et al. 2009).
En cualquier caso, la exposición de PS interviene en la infección del macrófago por
Leishmania y en la posterior inactivación de la actividad microbicida de los mismos,
permitiendo de este modo la supervivencia y/o persistencia de Leishmania en la célula
hospedadora.
Los mecanismos moleculares que promueven la exposición de PS a la cara externa de la
membrana plasmática del parásito Leishmania no se conocen con exactitud. Nuestro
trabajo experimental demuestra la implicación en dicho proceso de un nuevo
transportador ABC, ABCG2 perteneciente a la subfamilia ABCG.
Discusión
153
4. Caracterización funcional del transportador ABCG2 de Leishmania major.
4.1- Mutante dominante negativo para ABCG2.
Inicialmente, para el estudio funcional del transportador ABCG2, y en espera de obtener
parásitos mutantes nulos para dicho gen, se empleó la estrategia de obtención de un
mutante dominante negativo. Los transportadores pertenecientes a la subfamilia ABCG
necesitan homo o heterodimerizar para ser funcionalmente activos (Figura 2); en este
principio se fundamenta la estrategia de inhibir la actividad de transporte empleando
una versión inactiva de la proteína (ABCG2K/M
). La proteína inactiva se obtuvo
cambiando, mediante mutagénesis dirigida, una lisina por una metionina en la posición
108 del motivo Walker A del NBD. El mutante generado sería incapaz de hidrolizar
ATP, lo cual impide que el transportador vuelva a su configuración original y se pueda
llevar a cabo la actividad de transporte. Por otra parte, cabría esperar que la mutación
efectuada en el NBD no afecte a las propiedades de dimerización (Woehlecke et al.
2003), de este modo la proteína inactiva (ABCG2K/M
) al dimerizar con la proteína nativa
interrumpiría el transporte de PS. Esta estrategia se ha empleado con éxito para inactivar
otros transportadores como el formado por homodímeros de ABCG2 de mamíferos
(Henriksen et al. 2005; Kage et al. 2002) y el transportador LABCG5 de Leishmania
(Campos-Salinas et al. 2011). El transportador ABCG2 de mamíferos confiere
resistencia a múltiples compuestos antineoplásicos como la mitoxantrona. El mutante
ABCG2K86M
inactiva el transporte de mitoxantrona y por tanto se consigue la reversión
de la resistencia al transfectarlo en células que sobreexpresan ABCG2 (Henriksen et al.
2005; Kage et al. 2002).
Parásitos que expresan un mutante inactivo para el transportador LABCG5 de
Leishmania (LABCG5K625M
) muestran un crecimiento reducido; este fenotipo se rescató
en presencia de hemo libre y no unido a hemoglobina. Estos resultados sugieren que el
transportador LABCG5 de Leishmania está implicado en la obtención intracelular del
grupo hemo liberado en la degradación de la hemoglobina (Campos-Salinas et al.
2011).
Discusión
154
Figura 2: Los transportadores ABC pertenecientes a la subfamilia ABCG necesitan homo o
heterodimerizar para ser funcionalmente activos. Los transportadores ABCG son hemi-
transportadores que necesitan otra subunidad para adquirir su función; para ello homodimerizan (1) o
heterodimerizan (2). La inactivación de la proteína se consigue al sustituir (mediante mutagénesis
dirigida) una lisina por una metionina en el Walker A (posición 108) del dominio de unión a nucleótidos
(NBD) del transportador (3) y (4).
La expresión de mutantes para el dominio NBD de las proteínas ABCG4 (Castanys-
Muñoz et al. 2007) y ABCG5 (Campos-Salinas et al. 2011) de Leishmania no afectan a
la exposición de PS ni a la infectividad de los parásitos; por tanto, se deduce que los
transportadores ABCG4 y ABCG5 inactivados no interaccionarían con el transportador
ABCG2. A su vez, ABCG2 podría dimerizar con la repetición en tándem ABCG1 que
presenta una identidad en aminoácidos del 92%. Se ha descrito que transportadores
ABCG con identidad en torno al 30-40%, como ABCG5 y ABCG8 de humanos (Wang
et al. 2008; Yu et al. 2014) y White, Brown y Scarlet de Drosophila, funcionan como
heterodímeros (Tatematsu et al. 2011).
Discusión
155
Antes de realizar los estudios funcionales con los parásitos transfectados con
ABCG2K/M
(parásitos
ABCG2K/M
), comprobamos que existía una expresión de la
versión inactiva de ABCG2K/M
y que no había alteración en el crecimiento de estos
parásitos en relación con los parásitos controles. La diferencia en el crecimiento puede
dar lugar a alteraciones en el proceso de metaciclogénesis y por tanto producir
diferencias en la infección.
Nos propusimos estudiar la posible implicación de la proteína ABCG2 de Leishmania
en el transporte de fosfolípidos, ya que transportadores pertenecientes a la subfamilia
ABCG de humanos y de Leishmania están relacionados con dicho transporte (Tarling et
al. 2013; Castanys-Muñoz et al. 2007; Castanys-Muñoz et al. 2008). Por consiguiente,
realizamos un ensayo de acumulación de análogos fluorescentes de fosfolípidos de
cadena corta (NBD-PC, NBD-PE, NBD-PS y NBD-SM), y observamos que los
parásitos ABCG2K/M
presentan una mayor acumulación del análogo fluorescente de PS
(NBD-PS). La mayor acumulación de NDB-PS en los parásitos ABCG2K/M
se debería a
que presentan una menor translocación de NBD-PS hacia la cara externa de la
membrana como consecuencia de la inactivación de la flopasa ABCG2. La menor
actividad flopasa se validó tras el marcaje con NBD-PS y posterior extracción del
fluoróforo expuesto en la cara externa de la membrana plasmática, confirmando que los
parásitos ABCG2K/M
presentan una menor actividad translocasa al compararlos con los
controles.
El fenotipo es específico para PS, dado que no estaba afectado el transporte del resto de
análogos fluorescentes de PC, PE y SM ensayados. La especificidad de sustrato
contrasta con el espectro de translocación de fosfolípidos de otras flopasas
caracterizadas en Leishmania: i) LiABCG4 transporta PC y análogos de
alquilfosfolípidos (Castanys-Muñoz et al. 2007), ii) LiABCG6 transloca PC, PE y PS, y
además confiere resistencia a alquilfosfolípidos (Castanys-Muñoz et al. 2008), y iii)
LtrABC1.1 y LtrABCA.2 están implicados en el transporte de PC, PE y PS (Parodi-
Talice et al. 2003; Araújo-Santos et al. 2005). También es interesante destacar a la
flopasa ABCG2 de mamíferos, cuya actividad se ha relacionado con la translocación de
PS en células de carcinoma gástrico humano (Woehlecke et al. 2003).
Discusión
156
Se ha descrito que cambios en la asimetría de fosfolípidos de la membrana promueve la
endocitosis (Pomorski y Menon, 2006; Sharom, 2011), así como la importancia que
tiene la PS en la formación de vesículas endocíticas y en el transporte vesicular de
levaduras (Xu et al. 2013). Igualmente, se ha corroborado que levaduras mutantes nulos
para las aminofosfolípidos translocasas Dnf1p, Dnf2p, Drs2p y Dnf3p tienen alterada la
endocitosis. La falta de translocación de fosfolípidos hacia la cara interna de la
membrana plasmática, altera la formación de vesículas endocíticas, y genera que
determinados marcadores endocíticos (sonda FM4-64) queden retenidos en la
membrana plasmática de levaduras mutantes nulos para Dnf1p, Dnf2p, Drs2p; además,
tienen alterada la formación de vesículas intracelulares recubiertas de clatrina que
transportan, entre otras moléculas, a la fosfatasa ácida a la membrana plasmática. Las
translocasas Dnf1p, Dnf2p, Drs2p y Dnf3p son esenciales para el tráfico vesicular entre
el aparato de Golgi y la vía endosomal (Pomorski et al. 2003; Alder-Baerens et al.
2006). La sobreexpresión de transportadores ABC también puede alterar los procesos de
endo y exocitosis en Leishmania y levaduras. Con respecto a Leishmania destacamos a
los transportadores LtrABC1.1 o LtrABCA.2 cuya expresión puede disminuir o
incrementar la exocitosis de los parásitos, tal y como demuestra la determinación de
fosfatasa ácida; sensor que nos permite evaluar la exocitosis en Leishmania (Parodi-
Talice et al. 2003; Araújo-Santos et al. 2005). En levaduras se ha demostrado que los
transportadores ABC Pdr5 y Yor1 tienen la capacidad de regular y/o modular la
endocitosis de la permeasa de triptófano (Tat2), y probablemente actúen sobre otras
proteínas de transmembrana (Johnson et al. 2010). En levaduras mutantes nulos para el
transportador Pdr10, existe una menor endocitosis de la sintasa de quitina Chs3, con el
consecuente incremento de quitina en la pared celular (Rockwell et al. 2009). El
transportador Ybt1 de levaduras está implicado en la translocación de PC al interior del
lumen de la vacuola (Gulshan y Moye-Rowley, 2011); observándose en levaduras
mutantes nulos para Ybt1 que se acumula NBD-PC en el citosol de las células, además
no tienen afectada la endocitosis. Los resultados sugieren la importancia que tiene Ybt1
en el transporte de PC hacia el interior de la vacuola (Gulshan y Moye-Rowley, 2011).
El transportador Ycf1p de levaduras está implicado en la homeostasis vesicular, ya que
se encarga de reclutar a SNARE Vamp7p y de interaccionar con otras proteínas
necesarias para que exista una adecuada fusión vacuolar (Sasser et al. 2013). Levaduras
Discusión
157
mutantes nulos para los transportadores Ycf1p y Bpt1p presentan una reducción del 30-
40% de la fusión vacuolar al compararla con la cepa salvaje (Sasser et al. 2013).
Puesto que los parásitos ABCG2K/M
presentan una mayor acumulación de NBD-PS,
quisimos evaluar si la endocitosis estaba alterada en dichos parásitos. Los resultados
obtenidos en los ensayos de acumulación de análogos de esfingomielina (NBD-SM),
marcador del proceso de endocitosis en el parásito Leishmania (Araújo-Santos et al.
2003), demuestran que el fenotipo de mayor acumulación de NBD-PS en parásitos
ABCG2K/M
no se debe a alteraciones en el proceso de endocitosis, dado que la
internalización de NBD-SM es similar a la de los parásitos control.
Resultados similares de acumulación de NBD-PS se han obtenido al expresar
ABCG2K/M
en L. infantum y L. donovani; estos datos permiten generalizar y sugerir que
la función de ABCG2 como flopasa de PS está conservada en diferentes especies de
Leishmania.
En Leishmania no se conoce con exactitud las rutas bioquímicas implicadas en la
síntesis de PS. Algunos autores concluyen que los promastigotes no sintetizan PS
(Weingartner et al. 2012), dicha afirmación contrasta con los resultados obtenidos por
otros grupos de investigación que demuestran la presencia de PS en promastigotes de
Leishmania (Imbert et al. 2012; Zheng et al. 2010; Ramos et al. 2008) y la implicación
de la misma en la interacción y/o invasión del parásito a los macrófagos (Wanderley et
al. 2012; Wanderley et al. 2006; van Zandbergen et al. 2006; van Zandbergen et al.
2007; Tripathi y Gupta, 2003). Además, se han encontrado enzimas implicadas en el
metabolismo de la PS como son la PS sintasa 2 y la PS descarboxilasa (Zhang y
Beverley, 2010). El grupo del Dr. Thomas Pomorski (Weingartner et al. 2012) concluye
que los promastigotes no sintetizan PS, ahora bien, en su análisis emplean parásitos en
fase logarítmica de crecimiento, fase en la cual la exposición de PS es minoritaria si la
comparamos con la fase estacionaria de crecimiento. En base a los argumentos
anteriores, decidimos evaluar que ocurre con la exposición de PS endógena en nuestras
líneas de parásitos.
Para determinar los niveles de exposición de PS endógena en la cara externa de la
membrana plasmática de los parásitos ABCG2K/M
, realizamos un ensayo con Anexina
Discusión
158
V. La Anexina V presenta una alta afinidad por la PS expuesta en la superficie de las
células. La interacción se ve favorecida por microambientes enriquecidos en calcio; sin
embargo, la unión de la Anexina V con la PS no es estrictamente específica, pudiendo
interactuar con otros fosfolípidos aniónicos (Weingartner et al. 2012; Yeung et al. 2009;
Zhang y Beverley, 2010).
Los resultados mostraron que los parásitos ABCG2K/M
en fase estacionaria de
crecimiento exponen menos PS en superficie, al compararlos con los parásitos
controles. Las diferencias obtenidas en los ensayos de Anexina V entre parásitos
controles y ABCG2K/M
en fase estacionaria de crecimiento, no se observaron en fase
logarítmica de crecimiento, donde el porcentaje de unión de la Anexina V es muy
reducido; estos resultados se correlacionan con una mayor expresión del mensajero del
transportador ABCG2 en fase estacionaria de crecimiento. Igualmente, estos resultados
están apoyados por publicaciones previas, en las cuales se demuestra que promastigotes
de L. donovani y L. tropica cultivados in vitro y en fase estacionaria de crecimiento,
presentan un mayor grado de externalización de PS que promastigotes en fase
logarítmica de crecimiento (Tripathi y Gupta, 2003).
Para corroborar que las diferencias en la exposición de PS entre parásitos ABCG2K/M
y
controles no se deben a interacciones inespecíficas de la Anexina V con otros
fosfolípidos, realizamos un ensayo de citotoxicidad al péptido citolítico papuamide B,
que se une de forma específica a los residuos de PS de las membranas biológicas
(Parsons et al. 2006). Los parásitos ABCG2K/M
presentan una menor sensibilidad a la
actividad citolítica de papuamide B al compararlo con los parásitos controles; dichos
resultados se correlacionan con la menor exposición de PS que presentan los parásitos
ABCG2K/M
en su membrana.
Las diferencias de sensibilidad entre parásitos controles y ABCG2K/M
al péptido
papuamide B no pueden ser altas, ya que cambios extremos en la disposición y/o
composición lipídica de la membrana pueden causar la muerte de la célula (Pomorski y
Menon, 2006; Weingartner et al. 2010; Graham, 2004). Además, hay que considerar
que los ensayos de sensibilidad se llevaron a cabo en fase logarítmica durante 72 h de
cultivo, siendo las diferencias en la exposición de PS significativas cuando los parásitos
alcanzan la fase logarítmica tardía (tercer día de cultivo). Para corroborar que no existen
Discusión
159
otras modificaciones en la distribución de otros fosfolípidos de la membrana de los
parásitos ABCG2K/M
, evaluamos la sensibilidad al péptido Ro09-0198 que se une de
forma específica a la PE. Los resultados mostraron que no existen diferencias de
sensibilidad al péptido entre parásitos control y ABCG2K/M
. Además, mediante un
ensayo de toxicidad a la anfotericina B, que se une al ergosterol de la membrana de los
parásitos, determinamos que no existen diferencias en la sensibilidad que muestran
parásitos control y ABCG2K/M
al fármaco; estos resultados sugieren que no existen
cambios en la proporción de ergosterol entre ambas líneas de parásitos, y por tanto
ABCG2 no estaría implicado en el transporte de ergosterol a la membrana plasmática
del parásito.
Puesto que todas las pruebas experimentales nos indican que ABCG2 está implicado en
la translocación de PS a la cara externa de la membrana del parásito, quisimos
determinar su localización subcelular, y relacionar dicha localización con la actividad
flopasa de PS que presenta la proteína. Para el análisis, obtuvimos quimeras de ABCG2
fusionada a la proteína verde fluorescente (GFP). Los estudios de microscopía revelan
que tanto GFP-ABCG2 como GFP-ABCG2K/M
se localizan en vesículas intracelulares,
bolsillo flagelar y a nivel del polo opuesto del parásito. Los parásitos GFP-ABCG2K/M
son menos sensibles al péptido papuamide B, lo cual indica que la fusión de la proteína
con GFP no altera su funcionalidad. GFP-ABCG2 y GFP-ABCG2K/M
se distribuyen de
forma similar a como lo hacen unas proteínas implicadas en la interacción
parásito/célula denominadas prohibitinas; dichas proteínas pueden concentrarse en el
polo aflagelar del parásito, región de especial importancia en la interacción del parásito
con el macrófago (Jain et al. 2010). El transportador ABCG2 facilitaría la translocación
de PS en las regiones de mayor interacción entre el parásito y la célula hospedadora.
Además, esta localización subcelular sugiere que la exposición de PS en la cara externa
de la membrana plasmática de Leishmania se realiza por un mecanismo similar al
descrito para el transporte de colesterol y, probablemente, de fosfolípidos llevado a cabo
por el transportador ABCG1 humano (Tarling y Edwards, 2011; Tarling et al. 2013).
El transportador ABCG1 humano se localiza en vesículas intracelulares y se encarga de
transportar colesterol/PC hacia diferentes vesículas, con ello se facilita su distribución
entre los distintos orgánulos subcelulares. Una vez translocados los lípidos hacia la cara
Discusión
160
orientada al lumen de las vesículas, estos se expondrían en la cara externa de la
membrana plasmática tras la fusión de estas vesículas con la membrana plasmática. El
transportador LtrABCA2 de Leishmania presenta similitudes con el transportador
ABCG2 de L. major, ya que se localiza en el bolsillo flagelar y en vesículas endocíticas,
y su función se relaciona con el tráfico de fosfolípidos. Los parásitos que sobreexpresan
LtrABCA2 presentan una menor acumulación de análogos de PC, PE y PS (Araújo-
Santos et al. 2005).
En otros organismos como las levaduras, también encontramos transportadores ABC
asociados a vesículas e implicados en el transporte de fosfolípidos, como es el caso del
transportador Ybt1 (subfamilia ABCC), cuya función es el transporte de PC al interior
del lumen de las vacuolas y es requerido para el metabolismo de la PC (Gulshan y
Moye-Rowley, 2011). Se ha demostrado que Ybt1 es necesario para mantener y regular
los niveles normales de fosfolípidos en la célula (Gulshan y Moye-Rowley, 2011).
La proteína ABCG2 de Leishmania translocaría PS, sin descartar otros factores de
virulencia, hacía la cara interna de las vesículas intracelulares antes de que se fusionen
con la membrana plasmática en el bolsillo flagelar (Figura 3). Desconocemos si se
produce una fusión entre las vesículas endocíticas y las vesículas que albergan al
transportador previo a su llegada al bolsillo flagelar.
En el caso de los parásitos ABCG2K/M
, el contenido de PS en la cara interna del lumen
de las vesículas y de otros posibles factores de virulencia se vería reducido; por tanto, se
produce una menor exposición de los mismos en la cara externa de la membrana
plasmática pudiendo afectar a la infectividad y virulencia de los parásitos.
Discusión
161
Figura 3: Representación esquemática de la exposición de PS en la membrana plasmática mediada
por ABCG2. El transportador ABCG2 podría transferir PS a la cara interna de vesículas intracelulares
antes de que se fusionen con la membrana plasmática del bolsillo flagelar; dicha suposición se indica
mediante un interrogante en la figura. Tras la fusión de las vesículas con la membrana del bolsillo
flagelar, PS y otros factores de virulencia se redistribuirán por toda la membrana plasmática del parásito.
Discusión
162
Basándonos en trabajos previos, en los cuales se demuestra que la exposición de PS en
ambas formas biológicas del parásito es un factor importante para la internalización del
parásito en el macrófago (Tripathi y Gupta, 2003; Wanderley et al. 2012; Wanderley et
al. 2013), nos propusimos evaluar cómo afecta la menor exposición de PS en parásitos
ABCG2K/M
a la infección in vitro de macrófagos peritoneales de ratón.
Nuestros resultados demuestran que el defecto en la externalización de PS en parásitos
ABCG2K/M
se correlaciona con un menor porcentaje de infección en macrófagos
peritoneales de ratón. Las diferencias en el porcentaje de infección entre parásitos
controles y ABCG2K/M
se deben fundamentalmente a una disminución en la fagocitosis
de los parásitos ABCG2K/M
, ya que en experimentos de interacción parásito/célula,
observamos que no existen diferencias en el porcentaje de interacción de ambas líneas
celulares con los macrófagos peritoneales.
De estos resultados se deduce que la PS es un factor importante en las primeras etapas
de internalización del parásito en el macrófago, no siendo tan relevante en la etapa
inicial de interacción con el macrófago, donde intervienen otros factores de virulencia
como LPG que se une a los receptores de manosa/fucosa del macrófago (Blackwell et
al. 1985; Coelho-Finamore et al. 2011; de Assis et al. 2012), y gp63 que interacciona
con los receptores del complemento cr1 y cr3 del macrófago (Franco et al. 2012). Tanto
LPG como gp63 facilitan la fagocitosis del parásito por el macrófago.
Al obtener un reducido porcentaje de infección en parásitos ABCG2K/M
, nos planteamos
evaluar si existía alguna alteración en la metaciclogénesis. Por consiguiente, aislamos
formas metacíclicas empleando la lectina PNA que aglutina a parásitos procíclicos, y
además determinamos la expresión de HASPB, proteína que sólo se expresa en las
formas metacíclicas y amastigotas del parásito, y cuya función está relacionada con la
invasión y la supervivencia del parásito en el macrófago (Sadlova et al. 2010). Los
resultados revelan que tanto la expresión de la proteína HASPB como el porcentaje de
metacíclicos (parásitos PNA-) son similares en ambas líneas de parásitos. Los datos
obtenidos con estas condiciones experimentales sugieren que la expresión de la proteína
mutada ABCG2K/M
no afecta y/o modifica el proceso de metaciclogénesis.
Discusión
163
Nuestro grupo de investigación no descarta la posibilidad de que ABCG2 transporte
otros factores de virulencia, y por consiguiente la expresión de los mismos podría estar
afectada en los parásitos ABCG2K/M
. Los principales factores de virulencia que son
sintetizados y transportados a la superficie del parásito vía tráfico vesicular son el LPG
y gp63; sin embargo, los análisis mediante citometría de flujo revelaron que los niveles
de expresión de ambas moléculas en los parásitos ABCG2K/M
eran similares a los
mostrados por los parásitos control, por lo que en principio la inhibición de ABCG2 no
influiría sobre la exposición de estos factores de virulencia.
Mediante un análisis proteómico se ha detectado la presencia del transportador
ABCG1/ABCG2 de Leishmania en unas estructuras vesiculares de 30-70 nm de
diámetro conocidas como exosomas (Silverman et al. 2010). El parásito usa los
exosomas para establecer comunicación con la célula hospedadora y modular la
actividad funcional de la misma. En dichas vesículas se han detectado proteínas y/o
factores de virulencia importantes para la infección de los macrófagos, destacando gp63
(Silverman et al. 2010). Desde nuestro punto de vista, la identificación de
ABCG1/ABCG2 en estas vesículas se podría asociar a su posible implicación en el
proceso de infección.
Debido a la reducida capacidad infectiva que presentan los parásitos ABCG2K/M
sobre
cultivos in vitro de macrófagos peritoneales de ratón, decidimos evaluar su infectividad
en un modelo murino de leishmaniasis cutánea. Los resultados revelaron que los ratones
infectados con formas metacíclicas ABCG2K/M
, purificadas mediante selección negativa
con PNA, no desarrollaron lesiones tisulares a nivel de las extremidades inferiores.
Además, se analizaron otros tejidos como el bazo y los ganglios, ya que aunque L.
major causa leishmaniasis cutánea, tiene tendencia a la visceralización en cepas de ratón
altamente sensibles como la empleada en nuestros estudios. Nuestros resultados revelan
que los ratones infectados con parásitos ABCG2K/M
tienen una carga parasitaria en los
tejidos de la pata muy inferior a la que presentan los ratones infectados con los parásitos
control. Además, los parásitos ABCG2K/M
no experimentan migración hacia bazo o
ganglios linfáticos; sin embargo, los parásitos controles se detectaron en dichos órganos,
confirmándonos la capacidad invasiva de L. major. Estos resultados sugieren que
ABCG2 es necesario para el desarrollo y la progresión de la enfermedad.
Discusión
164
Cambios en la expresión de dos transportadores ABC de Leishmania pertenecientes a la
subfamilia ABCA, denominados LtrABC1.1 y LtrABCA.2, afectan la infectividad
(Parodi-Talice et al. 2003; Araújo-Santos et al. 2005). El primero de ellos se localiza
principalmente en bolsillo flagelar (Parodi-Talice et al. 2003) y el segundo en bolsillo
flagelar y vesículas intracelulares (Araújo-Santos et al. 2005). Los parásitos que sobre-
expresan alguno de estos transportadores presentan una menor acumulación de los
análogos fluorescentes de fosfolípidos PC, PE y PS, y su infectividad está reducida
respecto al control. Sin embargo, la sobreexpresión de LtrABC1.1 o LtrABCA.2 reduce
o incrementa, respectivamente, la secreción de fosfatasa ácida, marcador empleado para
determinar actividad exocítica (Parodi-Talice et al. 2003; Araújo-Santos et al. 2005).
Estos datos sugieren que los cambios en la asimetría de los fosfolípidos de membrana
producidos por los transportadores ABC, puede alterar la virulencia del parásito de
forma independiente a la actividad exocítica; sin descartar la posibilidad de que se
encuentren implicados otros factores transportados o modulados por los ABCs.
4.2- Parásitos mutantes nulos para ABCG2.
En paralelo con los estudios realizados con parásitos ABCG2K/M
, nuestro laboratorio se
propuso obtener parásitos mutantes nulos para los genes ABCG1 y ABCG2 (parásitos
ABCG1+G2) para determinar su funcionalidad. El gen ABCG2 se localiza en el
cromosoma 6 de L. major y está triplicado en tándem; denominándose ABCG1, ABCG2
y ABCG3. Los genes ABCG1 y ABCG2 presentan un similitud a nivel de secuencia
nucleotídica del 93,7%. El gen ABCG3 decidimos no suprimirlo dado que está truncado
(carece del dominio Walker A en el dominio de unión a nucleótidos y varios segmentos
de transmembrana) y suponemos que su proteína no tiene actividad transportadora.
Una vez obtenidos los parásitos ABCG1+G2, estos se transfectaron con los genes
ABCG1, ABCG2 y ABCG1/ABCG2 para evaluar la aportación funcional individual y
conjunta de dichos genes. Se observó que no existe ninguna modificación relevante en
el crecimiento de las distintas líneas de parásitos.
Discusión
165
Al igual que en los parásitos ABCG2K/M
, los parásitos ABCG1+G2 presentan una
mayor acumulación de NBD-PS que los parásitos controles. Los parásitos
ABCG1+G2 complementados con el gen ABCG1 o ABCG2 tienen una acumulación
del análogo NBD-PS similar al de los parásitos control; estos resultados nos confirman
que ambos transportadores están implicados en el transporte de PS a la cara externa de
la membrana plasmática del parásito Leishmania. Tampoco existen diferencias
significativas en el acúmulo del resto de análogos de fosfolípidos entre parásitos
ABCG1+G2 y complementados con ABCG1 y/o ABCG2.
Los parásitos ABCG1+G2 muestran una menor infectividad en macrófagos
peritoneales de ratón, revirtiendo el fenotipo al complementarlos con ABCG1 o ABCG2;
sin embargo, el porcentaje de infección obtenido en los parásitos ABCG1+G2 es
superior al de los ABCG2K/M
(50% vs 20%). Estas diferencias podrían explicarse en
base a que altos niveles de expresión de la versión inactiva de la proteína puede dar
lugar a que se produzca una interacción con otras proteínas ABC o factores de
virulencia, reprimiéndolos y provocando que los parásitos ABCG2K/M
sean menos
infectivos que los mutantes nulos.
La media de amastigotes por célula de los parásitos ABCG1+G2 a las 24 horas post-
infección es inferior a la de los parásitos control y parásitos ABCG1+G2 transfectados
con ABCG1 y/o ABCG2, lo cual estaría relacionado con una menor fagocitosis y/o una
menor capacidad de resistir a la actividad microbicida del macrófago. Estos resultados
contrastan con las medias de amastigotes obtenidas en los parásitos ABCG2K/M
que son
similares a los de la línea control.
Para estudiar si las diferencias de infectividad observadas podrían deberse a alteraciones
en el proceso de diferenciación a metacíclicos en los parásitos ABCG1+G2,
determinamos el porcentaje de parásitos PNA-. A diferencia de lo descrito para los
parásitos ABCG2K/M
donde no se cambia la proporción de parásitos PNA- respecto al
control, los parásitos ABCG1+G2 presentan un porcentaje de recuperación de
metacíclicos PNA- significativamente inferior al de sus controles: parásitos
ABCG1+G2 complementados con ABCG1 y ABCG2; sin embargo, la expresión de la
proteína específica de metacíclicos HASPB no se ve afectada. Estos datos sugieren que
Discusión
166
la eliminación del transportador, o lo que es lo mismo su completa inactivación,
conduce a un bloqueo en la modificación/maduración del LPG que debe producirse en
la metaciclogénesis y por lo tanto los parásitos son aglutinados por la lectina PNA. Los
parásitos transfectados con ABCG2K/M
posiblemente no tienen bloqueada en su
totalidad la actividad de la proteína nativa ABCG1/ABCG2 y esa actividad residual es
suficiente para que no se vea afectada la maduración del LPG.
Durante la metaciclogénesis se produce una elongación y ramificación del LPG (Späth y
Beverley, 2001; Franco et al. 2012), lo cual favorece la resistencia del parásito a la
actividad citolítica del complemento en el hospedador vertebrado (Franco et al. 2012;
Isnard et al. 2012).
En base a los resultados anteriores, analizamos en los parásitos ABCG1+G2 y
transfectados con ABCG1 y/o ABCG2 la resistencia a la lisis por complemento del suero
humano. Se observó que las distintas líneas de parásitos en fase de crecimiento
logarítmico presentan una sensibilidad similar a la lisis por complemento; sin embargo,
en la fase estacionaria de crecimiento, los parásitos ABCG1+G2 presentan una mayor
sensibilidad a la lisis por complemento al compararlos con los transfectados con
ABCG1 y ABCG2. Este análisis ratificaría que ABCG1/ABCG2 está implicado en el
proceso que conllevaría a la maduración del LPG durante la metaciclogénesis.
Durante la metaciclogénesis, fundamentalmente desencadenada por estrés nutricional,
existe una mayor producción de ROS, asociado a los procesos de autofagia. Se ha
demostrado que parásitos KO para genes implicados en los procesos de autofagia como
Δatg4.2, son más susceptibles al estrés oxidativo, y presentan niveles más altos de ROS
en fase estacionaria de crecimiento al compararlos con los parásitos control (Williams et
al. 2013).
En este sentido, los análisis realizados revelan que los parásitos ABCG1+G2 presentan
unos niveles de ROS más elevados en la fase estacionaria de crecimiento en relación
con los parásitos ABCG1+G2 complementados con ABCG1 y ABCG2. Los datos
sugieren que el proceso de metaciclogénesis está alterado pero desconocemos la
asociación molecular de estos genes con la producción de ROS. El estudio de los meca-
Discusión
167
nismos por el cual estos genes ABCG regulan el estrés oxidativo durante la
metaciclogénesis sería de gran interés para su abordaje en un futuro.
Igualmente, nos planteamos realizar estudios in vivo en un modelo murino de
leishmaniasis cutánea para determinar la influencia de la deleción estos genes en la
virulencia del parásito.
Finalmente, ABCG2 se ha caracterizado como una flopasa de PS, al igual que el
transportador ABCG2 de mamíferos (Woehlecke et al. 2003). El transportador ABCG2
en humanos se ha asociado con la resistencia a determinados agentes quimioterápicos,
confiriendo un fenotipo MDR a las células tumorales (Polgar et al. 2008; Leslie et al.
2005). Otras proteínas ABCG en Leishmania, como ABCG4 y ABCG6, confieren
resistencia a determinados agentes leishmanicidas (Castanys-Muñoz et al. 2007;
Castanys-Muñoz et al. 2008). Nuestro laboratorio también se plantea iniciar el estudio
de la implicación de ABCG2 en la resistencia a fármacos en Leishmania.
En resumen, nuestros resultados aportan evidencias que sugieren que el transportador
ABCG2 de Leishmania es una flopasa de PS, cuya función es esencial para la
externalización de PS en la cara externa de la membrana plasmática de Leishmania, lo
cual es necesario para la infección de los macrófagos y el desarrollo de la enfermedad.
El abordaje de los mecanismos moleculares que promueven que la inactivación de
ABCG2 afecte a la virulencia e infectividad de los parásitos forma parte de uno de los
objetivos a desarrollar próximamente.
Todos estos resultados convierten al transportador ABCG2 en una posible diana
terapéutica frente a la leishmaniasis. La selección de posibles inhibidores de origen
natural o sintético sería de utilidad para obtener fármacos que inhiban al transportador y
poder aportar nuevos agentes leishmanicidas al reducido arsenal de fármacos
disponibles.
CONCLUSIONES
Conclusiones
168
CONCLUSIONES
1. Se ha caracterizado el gen ABCG2 de Leishmania major que codifica para un
transportador ABC perteneciente a la subfamilia de “hemi-transportadores”
ABCG. Es un gen triplicado en tándem que se localiza en el cromosoma seis de
Leishmania.
2. Hemos determinado que ABCG2 se localiza en vesículas intracelulares de la vía
endosomal, en el bolsillo flagelar y a nivel del polo aflagelar de Leishmania.
3. La sobreexpresión en Leishmania de un mutante del transportador ABCG2, que
presenta un cambio de una lisina por una metionina en la posición 108 del
motivo Walker A del dominio de unión a nucleótidos, produce un fenotipo
dominante negativo que se caracteriza por una disminución de la translocación
de análogos fluorescentes de fosfatidilserina. ABCG2 reconoce específicamente
a la fosfatidilserina, ya que estos parásitos dominantes negativos no presentan
alterado el transporte de análogos de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y
esfingomielina.
4. Los parásitos dominantes negativos para ABCG2 en fase estacionaria de
crecimiento presentan una menor exposición de fosfatidilserina endógena en la
cara externa de la membrana plasmática; este fenotipo se correlaciona con un
menor porcentaje de infección en macrófagos peritoneales de ratón.
Conclusiones
169
5. Los parásitos dominantes negativos para ABCG2 no tienen afectada la
metaciclogénesis; no existiendo diferencias significativas a nivel del porcentaje
de metacíclicos purificados con respecto a los parásitos control. Además, la
expresión de la proteína HASPB, que sólo se expresa en las formas metacíclicas,
es idéntica en ambas líneas de parásitos.
6. Los parásitos dominantes negativos no presentan alteración en la expresión de
algunos factores de virulencia como LPG y gp63; tampoco se vio afectada la
capacidad de interacción de estos parásitos con los macrófagos peritoneales.
7. La línea dominante negativo para ABCG2 es menos infectiva y virulenta en un
modelo murino de leishmaniasis cutánea; por consiguiente, el transportador
ABCG2 de Leishmania está implicado en el desarrollo y la progresión de la
enfermedad.
8. Los parásitos mutantes nulos para los genes ABCG1 y ABCG2 presentan una
mayor acumulación del análogo fluorescente de fosfatidilserina, similar a lo
obtenido en la línea dominante negativo para ABCG2. Los parásitos mutantes
nulos rescatados con los genes ABCG1 y ABCG2 tienen una acumulación de
fosfatidilserina similar a la de los parásitos control, confirmando la actividad
flopasa de fosfatidilserina de ambas proteínas.
9. Los estudios de infección en macrófagos peritoneales de ratón demuestran que
los parásitos mutantes nulos para ABCG2 tienen un menor porcentaje de
infección y un menor número de amastigotes por célula que los parásitos
controles.
Conclusiones
170
10. Los parásitos mutantes nulos para ABCG2 en fase estacionaria de crecimiento
presentan una mayor sensibilidad a la lisis mediada por complemento de suero
humano, y además tienen mayor estrés oxidativo que los parásitos control.
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ANEXO
LABCG2, a New ABC Transporter Implicated inPhosphatidylserine Exposure, Is Involved in theInfectivity and Pathogenicity of LeishmaniaJenny Campos-Salinas., David Leon-Guerrero., Elena Gonzalez-Rey, Mario Delgado, Santiago Castanys,
Jose M. Perez-Victoria, Francisco Gamarro*
Instituto de Parasitologıa y Biomedicina ‘‘Lopez-Neyra’’, CSIC, (IPBLN-CSIC), Parque Tecnologico de Ciencias de la Salud, Armilla, Granada, Spain
Abstract
Leishmaniasis is a neglected disease produced by the intracellular protozoan parasite Leishmania. In the present study, weshow that LABCG2, a new ATP-binding cassette half-transporter (ABCG subfamily) from Leishmania, is involved in parasitevirulence. Down-regulation of LABCG2 function upon expression of an inactive mutant version of this half-transporter(LABCG2K/M) is shown to reduce the translocation of short-chain analogues of phosphatidylserine (PS). This dominant-negative phenotype is specific for the headgroup of the phospholipid, as the movement of phospholipid analogues ofphosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine or sphingomyelin is not affected. In addition, promastigotes expressingLABCG2K/M expose less endogenous PS in the stationary phase than control parasites. Transient exposure of PS at the outerleaflet of the plasma membrane is known to be one of the mechanisms used by Leishmania to infect macrophages and tosilence their immune response. Stationary phase/metacyclic promastigotes expressing LABCG2K/M are less infective formacrophages and show decreased pathogenesis in a mouse model of cutaneous leishmaniasis. Thus, mice infected withparasites expressing LABCG2K/M did not develop any lesion and showed significantly lower inflammation and parasiteburden than mice infected with control parasites. Our results indicate that LABCG2 function is required for theexternalization of PS in Leishmania promastigotes, a process that is involved in the virulence of the parasite.
Citation: Campos-Salinas J, Leon-Guerrero D, Gonzalez-Rey E, Delgado M, Castanys S, et al. (2013) LABCG2, a New ABC Transporter Implicated inPhosphatidylserine Exposure, Is Involved in the Infectivity and Pathogenicity of Leishmania. PLoS Negl Trop Dis 7(4): e2179. doi:10.1371/journal.pntd.0002179
Editor: Genevieve Milon, Institut Pasteur, France
Received September 25, 2012; Accepted March 15, 2013; Published April 25, 2013
Copyright: � 2013 Campos-Salinas et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work was supported by the Spanish Grants SAF2009-07440 and SAF2012-34267 (to F.G.), SAF2011-28215 (to J.M.P.V.) and SAF2011-28102 (to S.C.),the EU Marie Curie Research Training Network Grant MRTN-CT-2004-005330 (to F.G.), the Plan Andaluz de Investigacion (Cod. BIO130) and by FEDER funds fromthe EU to F.G., S.C. and J.M.P.V. and funds from Junta de Andalucia (Spain) P09-CTS-4705 (E. G-R). The funders had no role in study design, data collection andanalysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
. These authors contributed equally to this work.
Introduction
Leishmaniasis is a neglected disease that is caused by different
species of the protozoan parasite Leishmania [1]. This parasite has a
digenetic life cycle in which it alternates between promastigote and
amastigote stages. Inside the insect (sandfly) vector, non-infective
promastigotes are transformed into infective parasites during
metacyclogenesis. After the host is bitten by the sandfly, an intense
neutrophilic infiltrate into the skin bite sites occurs accompanied
by a significant recruitment of macrophages. Afterwards, Leish-
mania metacyclic promastigotes attach to neutrophils as the initial
host cell, and are taken up by phagocytosis [2]. The uptake of
infected neutrophils by macrophages is a mechanism for ‘‘silent’’
entry of parasites into macrophages, where they differentiate into
the replicative amastigote forms that are responsible for mainte-
nance and propagation of the infection in the phagolysosomal
compartment of the mammal host [3,4].
Phosphatidylserine (PS), a phospholipid (PL) normally asym-
metrically confined on the inner leaflet of the plasma membrane of
eukaryotic cells [5], seems to play a critical role in the infection of
macrophages by Leishmania [6–9]. Indeed, PS exposure on the
outer leaflet of the plasma membrane of apoptotic mammalian
cells [10] constitutes the most central ‘‘eat-me’’ signal known for
macrophages, which also ‘‘silent’’ its activity to avoid an
inflammatory reaction [11]. In a process known as apoptotic
mimicry, surface exposure of PS in Leishmania promastigotes and
amastigotes is required for the infection of new mammalian cells
[6,7] and for down-regulation of the microbicidal activity of
macrophages [8,9,12] by inhibiting their nitric oxide production
and increasing IL-10 synthesis and TGFb1 secretion [8,13]. In
addition, the well-characterized higher infectivity of the stationary
phase promastigotes (metacyclic), as compared to the log phase
promastigotes, is also due to the specific exposure of PS on their
surface [14], among others factors including the lipophosphogly-
can (LPG) or the phosphatidylinositol-anchored surface molecule
gp63 [15]. Interestingly, it has been suggested that these PS-
exposing promastigotes could be genuine apoptotic cells destined
for death [12,16] instead of apoptotosis-mimicking parasites.
Indeed, their presence in the virulent inoculum, in an altruistic
behaviour, provides survival advantages for the viable parasites
and is necessary for progress of the disease [16]. Recently, it has
been demonstrated that PS exposure by intracellular amastigotes
PLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org 1 April 2013 | Volume 7 | Issue 4 | e2179
of L. amazonensis is associated with a modified host inflammatory
response, correlating with parasite infectivity and with clinical
parameters of diffuse cutaneous leishmaniasis [17]. Thus, Leish-
mania parasites able to expose higher amounts of PS, induce a
more severe and persistent human disease [17].
The plasma membrane PL asymmetry in eukaryotic cells is
maintained due to the bidirectional transport of PL (flip-flop),
which involves three protein-mediated activities [18]: i) flippases,
which promote active inward-directed PL migration, mediated by
aminophospholipid translocases (APT); ii) floppases, which are
responsible for the active outward transport of PL from the
cytoplasmic to the exoplasmic leaflet of the membrane, mediated
by various ATP-binding cassette (ABC) transporters; and iii)
scramblases, which are translocases that not require ATP to
equilibrate the PL between the two membrane bilayers. PS
externalization in apoptotic cells has been suggested to be due to i)
a scramblases activity, enhanced by loss of the APT function [19];
and ii) to a higher activity of ABC efflux pumps such as ABCA1
[20]. Additionally, it has been suggested that PS is also delivered to
the surface of lysosomes that fuse with the plasma membrane
during apoptosis [21]. In the case of Leishmania, a decrease in the
active out-to-in PS translocation, thus allowing ATP-independent
PS movement, has also been suggested to be responsible for the
loss of PL asymmetry [14]. However, disruption of the plasma
membrane APT of Leishmania (LdMT) does not lead to an
increased infectivity [22,23]. In addition, although a scramblase
activity has been described in Leishmania, its role in parasite
infectivity remains to be elucidated [24]. The molecular basis of
PS exposure in Leishmania therefore remains unsolved.
Functional ABC transporters consists of two homologous halves,
each of which is composed of a transmembrane domain (TMD),
which is involved in substrate binding and a cytosolic nucleotide
binding domain (NBD), which hydrolyses ATP to provide the
energy required for the transport [25]. The ATP sites are
reconstituted upon dimerization of both NBDs, which pack
together in a head-to-tail configuration to generate two ATP
binding and hydrolysis sites between the conserved Walker A and
B motifs of one NBD and the signature motif of the other [26].
ABC half-transporters with a single NBD therefore require
homo-/heterodimerization to reconstitute the ATP sites. Members
of the ABCA, ABCB and ABCG human subfamilies have been
implicated in PL translocation [18,27]. For example, human
ABCG2 (BCRP/MXR/ABCP), a protein involved in multidrug
resistance in cancer cells [28,29], is responsible for enhanced
exposure of PS at the plasma membrane of ABCG2 overexpress-
ing cells due to increased outward PS transport [30]. Members of
the ABCG subfamily of half-transporters have been identified in
Leishmania [31], and three of these have already been functionally
characterized. Thus, LABCG4 is localized at the plasma
membrane of the parasite and is involved in the translocation of
phosphatidylcholine (PC) analogues; it also confers resistance to
alkyl phospholipids [32]. LABCG6 is also localized at the plasma
membrane and is probably involved in PL trafficking as it reduces
the accumulation of PL analogues of PC, phosphatidylethanol-
amine (PE) and PS [33], and confers resistance to camptothecin
[34], miltefosine and sitamaquine [33]. LABCG5, in contrast, is
not involved in the translocation of PL at the plasma membrane or
drug resistance but participates in salvage of the heme released
after the breakdown of internalized haemoglobin [35]. Addition-
ally, it has been reported that other Leishmania ABC transporters
such as LABCB4 [36], LABCA1 [37] and LABCA2 [38] are
involved in PL translocation.
The aim of our work was to study the functionality of the
transporter LABCG2 from Leishmania, specifically its involvement
in PS translocation and its implication in parasite virulence. The
results show that down-regulation of LABCG2 produces a defect
in the exposure of endogenous PS at the external surface of the
parasite, and that this defect correlates with a significant decrease
in the ability of these parasites to infect mouse peritoneal
macrophages and to produce pathology in a mouse model of
cutaneous leishmaniasis.
Materials and Methods
Materials3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide
(MTT), PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), DFP (diisopropyl-
fluorophosphate), monoclonal anti a-tubulin, and amphotericin B
were obtained from Sigma Chemical Company (St. Louis, USA).
Anti-histone H2A was courtesy of Dr. Stephen M. Beverley
(Washington University, School of Medicine, St. Louis, Missouri,
USA). Polyclonal anti-GFP antibody was from Rockland Compa-
ny. Mouse monoclonal anti-gp63 was from Life Span BioSciences.
Polyclonal antisera against metacyclic marker protein HASPB was
a kind gift from Dr. Deborah F. Smith (University of York, UK).
The fluorescent analogues 1-palmitoyl-2-[6-(7-nitrobenz-2-
oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]hexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
(NBD-PC), -phosphoethanolamine (NBD-PE), -phosphoserine
(NBD-PS) and 6-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino-hexa-
noyl-sphingosine-1 phosphocholine (NBD-sphingomyelin; NBD-
SM) were purchased from Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL,
USA). Annexin V-Alexa 488, FM4-64, concanavalin A-Alexa
Red, MitoTracker Deep Red 633, Cell Tracker TM Green and
DAPI were from Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Ro-peptide (Ro09-0198), a tetracyclic peptide antibiotic, was
kindly provided by Dr. Masato Umeda (The Tokyo Metropolitan
Institute of Medical Science, Japan). Papuamide B (Flintbox,
LynseyHuxham), a novel depsipeptide obtained from extracts of
marine sponges, was kindly provided by Dr. Thomas Gunther
Pomorski and Dr. Rosa Lopez (Department of Plan Biology and
Biotechnology, University of Copenhagen, Denmark). Peanut
agglutinin (PNA) and fluorescein-conjugated ricin agglutinin was
purchased from Vector (Burlingame, CA). The plasmids
Author Summary
Leishmania is a protozoan parasite that infects humanmacrophages, producing the neglected tropical diseaseknown as leishmaniasis. As is the case for apoptotic cells,transient exposure of phosphatidylserine (PS) on thesurface of the parasite is required for macrophageengulfment and infection. Although the mechanisminvolved in this lipid translocation remains unknown,inhibition of PS exposure could therefore prove to be anovel way to combat this parasitic disease. Here, we haveidentified a new ABC transporter from Leishmania, namelyLABCG2, as a protein involved in this process. Thedominant-negative inhibition of LABCG2 showed that thistransporter is required for the normal exposure of PS onthe outer leaflet of the plasma membrane. This alteredphenotype was subsequently found to be correlated witha deficient ability to infect mouse peritoneal macrophages.In addition, studies in a mouse model of cutaneousleishmaniasis showed that animals infected with parasiteswith down-regulated LABCG2 activity did not develop anylesions. Taken together, these results suggest a role for theLeishmania LABCG2 transporter in PS exposure, determin-ing the virulence of the parasite.
Leishmania Infectivity Involves an ABC Transporter
PLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org 2 April 2013 | Volume 7 | Issue 4 | e2179
pXG-GFP+29 and pXG-’GFP, which can be used to express GFP
fusion proteins in Leishmania with GFP at either the N- or the C-
terminus, respectively, were kindly provided by Dr. Stephen M.
Beverley.
Leishmania strains and cell culturesPromastigote forms of Leishmania major clone V1 (MHOM/IL/
80/Friedlin), Leishmania infantum (MHOM/ES/1993/BCN-99)
and Leishmania donovani (MHOM/ET/67/HU3) were maintained
in vitro at 28uC in modified RPMI-1640 medium (Invitrogen,
Carlsbad, CA) supplemented with 20% heat-inactivated foetal
bovine serum (hiFBS, Invitrogen), as described previously [37,38].
To determine parasite sensitivity to the toxic peptides papuamide
B and Ro-peptide, and to amphotericin B, 106/mL parasites were
incubated in RPMI-1640 containing different concentrations of
peptides and the parasite viability determined by MTT analysis
after 72 h, as described previously [39].
DNA constructs and cell transfectionLABCG2 (GeneDB-L. major, Accession Code LmjF06.0090) was
isolated from the genomic DNA of L. major by PCR using sense (59-
ATATCGCTGTCTCTGCGTCG) and antisense (59- GGCA-
AACACACAGAGCGATG) primers. The nucleotide sequences
were determined automatically as previously described [40]. To
obtain parasites expressing non-functional LABCG2, a mutation
was introduced in the Walker A motif of the ATP binding domain,
replacing lysine 108 with a methionine (K108M) using the
QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La
Jolla, CA). The resulting mutated gene LABCG2K108M
(LABCG2K/M) was cloned into the Leishmania expression vector
pUCNeoPlus [37]. The vector pXG-GFP+29 was used to create
GFP- LABCG2 and -LABCG2K/M versions with GFP fusions at
N-terminus [41]. The LABCG2 and LABCG2K/M open reading
frame for these N-terminus tagged versions was amplified by PCR
using sense (59-GCGGCCGCATGCCCCCTCCCGCAGCAA-
CACGTGC) and antisense (59-GCGGCCGCTCATGCC-
GTTCTCGCACAGCTCGCCA) primers. For the C-terminus
tagged versions, LABCG2 and LABCG2K/M were cloned in a
pXG-’GFP+ using sense (59-ACCGGTATGCCCCCTCCCG-
CAGCAACACGTGC) and antisense (59- GATATCTGCCGTT-
CTCGCACAGCTCGCCACGG) primers. Promastigotes of L.
major were transfected with the different constructs and selected for
G-418 resistance as described previously [42].
Gene expression analysisTotal RNA was prepared from control (empty vector) and
LABCG2K/M expressing promastigotes using the total RNA
isolation kit (Roche Biochemicals). cDNA was synthesized from
60 ng of total RNA using Superscript II TM RNaseH Reverse
Transcriptase (Invitrogen) and oligo (dT)12–18 primers (Invitro-
gen) following the manufacturer’s instructions. Semi-quantitative
PCR was performed with 50 mL aliquots using 50 pmol each of
sense and antisense primers corresponding to LABCG2 and
LmGAPDH using the following profile: initial denaturation at
95uC for 5 min followed by 25 cycles with denaturation at 95uCfor 1 min, annealing at 54uC for 30 s and extension at 68uC for
35 s, with a final extension of 5 min.
Fluorescence microscopy of Leishmania promastigotesFor endosome/lysosomal labelling, 107 stationary-phase pro-
mastigotes obtained after 4 day culture were incubated in 1 mL of
RPMI 1640 medium containing 50 mg/mL of concanavalin A-
Alexa Red for 2 h at 28uC or with 1 mM FM4-64 for 30 min at
28uC or 4uC. For mitochondrial labelling, 107 stationary-phase
promastigotes were stained with 50 nM MitoTracker Deep Red
633 for 30 min at 28uC and then washed in ice-cold phosphate-
buffered saline (PBS; 1.2 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4,
130 mM NaCl and 2.6 mM KCl adjusted to pH 7). Parasites were
fixed for 30 min at 4uC with 2% paraformaldehyde and then
observed under a microscope. Images (one stack) were acquired
using an Olympus IX81 microscope and deconvolved using
Huygens Professional.
Analysis of fluorescent PL uptakeThe NBD-phospholipid accumulation was determined by flow
cytometry as described previously [43]. Briefly, stationary-phase
promastigotes (107/mL) were incubated in HPMI buffer (20 mM
HEPES, 132 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 5 mM
glucose, 1 mM CaCl2, pH 7.4) supplemented with 0.3% (w/v)
BSA for 30 min at 28uC, then labelled with 10 mM NBD-PC,
10 mM NBD-PE, 10 mM NBD-SM or 30 mM NBD-PS for 30 min
at 28uC. HPMI was supplemented with either 500 mM PMSF or
5 mM DFP to block the catabolism of NBD-lipids [43]. Parasites
were washed twice with ice-cold PBS, supplemented with 0.3%
BSA and resuspended in PBS for flow cytometry analysis, using a
Beckton Dickinson FACScan (San Jose, CA) equipped with an
argon laser operating at 488 nm.
Measurement of NBD-PS outward transport in L. majorlines
To measure the NBD-PS outward transport from the cytoplas-
mic to the exoplasmic leaflet, Leishmania stationary-phase promas-
tigotes (107/ml) were labeled with 30 mM (control parasites) or
15 mM (LABCG2K/M) NBD-PS for 30 min at 28uC in HPMI
buffer (20 mM HEPES, 132 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 0.5 mM
MgCl2, 5 mM glucose, 1 mM CaCl2, pH 7.4) supplemented with
0.1% (w/v) BSA to allow that inward movement of the NBD
analogue was equally, as previously described [30]. Afterwards,
NBD-PS remaining on the cell surface was extracted twice by
incubation with 2% (w/v) BSA in HPMI (supplemented with
5 mM glucose and 500 mM PMSF) for 5 min on ice. Before
starting the outward transport assay, the medium was removed
and parasites were washed with ice-cold PBS. For t = 0 min, the
cells were resuspended in HPMI (supplemented with 2% BSA,
5 mM glucose and 500 mM PMSF). Time dependent outward
transport was monitored at 28uC at different time points (5, 15, 30,
60 min) in the supernatants and the samples were analyzed by
SLM-Aminco 8000C spectrofluorimeter.
Annexin V- binding assayLeishmania promastigotes were harvested in RPMI-1640 and
centrifuged at 25006 g for 10 min at 4uC. The cells were washed
with Annexin V-binding buffer (20 mM HEPES, 132 mM NaCl,
3.5 mM KCl, 5 mM CaCl2 and 0.5 mM MgCl2, pH 7.4 and
10 mM glucose), then resuspended in the same buffer and
incubated with Annexin V–Alexa 488 (1/20 dilution; at the
concentration indicated by the manufacturer) at 4uC for 15 min.
The parasites were subsequently labelled with propidium iodide
(0.4 mg/ml) and the mixture incubated for 5 min at 4uC. The cells
were washed for 1 min at 25006 g and 4uC, and resuspended to a
cell density of 46106 cells/mL. Controls measurements in the
absence of calcium were included using Annexin V–Alexa 488
plus 8 mM EGTA. Cellular fluorescence was quantified by
scanning the emission in a FACSCalibur and analysed using the
Cell Quest Pro software application. A total of 10,000 events were
harvested from each sample. The control cells were incubated in
Leishmania Infectivity Involves an ABC Transporter
PLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org 3 April 2013 | Volume 7 | Issue 4 | e2179
Annexin V-binding buffer alone, without Annexin V–Alexa 488,
under identical conditions.
In vitro infection of mouse peritoneal macrophagesPeritoneal macrophages from BALB/c mice (Charles River Ltd.)
were harvested by lavage with ice-cold RPMI 1640 medium, plated
at a density of 56105 macrophages/well in RPMI-1640 medium plus
10% hiFBS in 24-well plates provided with glass coverslips (22 mm2)
and allowed to adhere for 4 h at 37uC under 5% CO2, as described
previously [7,8]. The adherent macrophages were infected at 35uCwith stationary-phase promastigotes of control and LABCG2K/M-
expressing L. major parasites with or without Annexin V (0.05 mg/
ml6107promastigotes), at a parasite-to-cell ratio of 5:1 in RPMI-1640
medium supplemented with 5% hiFBS. After 4 h of infection,
unphagocytosed parasites were removed by washing with serum-free
medium. The infected macrophages were further incubated in RPMI
1640 medium supplemented with 10% hiFBS for 24 h at 37uC in a
5% CO2 atmosphere. Following incubation, the cultures were fixed
with 2% paraformaldehyde/glucose, stained with DAPI and the rate
of infected macrophage analyzed using images acquired with an
Olympus IX81 microscope as described previously [44]. Parasites
were quantified using a cell counter provide with the Image J software
(http://rsb.info.nih.gov/ij/). The images were deconvolved using
Huygens Professional from Scientific Volume Imaging (http://www.
svi.nl). The percentage of macrophage infection was calculated by
dividing the number of infected macrophages by the number of
counted macrophages. The mean number of amastigotes per infected
macrophage was determined by dividing the total number of
amastigotes counted by the number of infected macrophages. Three
independent experiments were performed with duplicates.
Leishmania binding assaysThe interactions between L. major stationary-phase promasti-
gotes and mouse peritoneal macrophages were measured as
previously described with some modifications [22]. Mouse
peritoneal macrophages (56105/well), maintained at 37uC with
5% CO2 in RPMI 1640 medium supplemented with 10% of
hiFBS, were labeled with 5 mM FM4-64 for 30 min at RT in
RPMI 1640 medium. LABCG2K/M and control L. major
promastigotes (107/ml) in stationary phase were labeled with
1 mM Cell Tracker TM Green for 40 min at 28uC in RPMI 1640
medium. Then, parasites and peritoneal macrophages were
washed four times in RPMI 1640 medium and finally resuspended
in RPMI 1640 medium supplemented with 5% of hiFBS. Binding
assays were performed using a parasite:macrophage ratio of 5:1.
Promastigote forms of L. major lines were added to the monolayer
cells. After 4 h incubation at 37uC, unbound promastigotes were
removed by thorough washing. The monolayers and bound
promastigotes were analysed by a Confocal Leyca SP5 microsco-
py. All the experiments were done in triplicate.
LPG and gp63 surface expression analysisExpression analysis of the surface molecule LPG was performed
as described previously [45]. Thus, stationary-phase promastigotes
(107/mL) were washed twice with PBS and incubated with 5 mg/
mL fluorescein-conjugated ricin agglutinin in PBS for 10 min at
28uC, then washed with PBS and analyzed by flow cytometry
using a FACSCalibur (Beckton Dickinson). For quantification of
cell surface gp63, parasites were incubated with a 1:500 dilution of
a mouse monoclonal anti-gp63 on ice. The cells were subsequently
washed with PBS supplemented with 0.1% BSA and fixed at 4uCin 2% paraformaldehyde for 20 min, then washed again and
incubated at room temperature with a 1:500 dilution of FITC
fluorescein isothiocyanate-labeled goat anti-mouse immunoglobu-
lin G (Sigma). These cells were washed three times with PBS-0.1%
BSA and the parasite-associated fluorescence was analyzed by flow
cytometry using a FACSCalibur.
Metacyclic purification assayMetacyclic promastigotes were isolated from stationary cultures of L.
major promastigotes by negative selection using a previously described
peanut agglutinin (PNA) methodology [46]. Briefly, stationary-phase
promastigotes were collected after culture for 4 days, washed with PBS
and then incubated with 100 mg/mL of PNA. After incubation for
10 min at room temperature, cells were separated by centrifugation at
5006 g for 10 min. The non-agglutinated promastigotes (metacyclic)
collected in the supernatant were washed twice with PBS and
resuspended in PBS for further experiments.
Western blot analysisProteins from whole stationary-phase promastigotes (107/well)
were resolved in 10% SDS-PAGE and electroblotted onto PVDF
membranes. Western blot analysis was performed as described
previously [47], using a polyclonal antibody against metacyclic
promastigote protein HASPB (1:2000) or GFP (1:5000; Invitro-
gen), followed by detection with a horseradish peroxidase-
conjugated secondary goat anti-rabbit IgG (1:5000; Dako Den-
mark) antibody. Monoclonal antibodies against H2A histone or a-
tubulin (1:5000 or 1:10000; Sigma-Aldrich) were used to confirm
equivalent protein loading. Detection was carried out by enhanced
chemiluminescence reaction using the ECL kit (Amersham).
Analysis of in vivo infectionSix-week-old female BALB/c mice were purchased from Charles
River Breeding Laboratories and maintained in the Animal Facility
Service of our Institute under pathogen-free conditions. Animals (10
mice/group) were injected subcutaneously in their left hind footpads
with 104 L. major purified metacyclic promastigotes resuspended in
PBS, as described above. Disease progression was monitored by
measuring the inflammation edema and the area of the cutaneous
lesion of the infected footpad using a digital caliper (Mitutoyo,
Japan), in comparison with the values obtained in the uninfected
contralateral footpad. Parasite burdens in target tissues were
determined from the presence of amastigotes isolated from footpad,
spleen and lymph nodes at week five post-infection, after tissue
homogeneization and culture in promastigote culture medium,
using a limiting dilution assay, as described previously [48].
Ethics statementAll experiments were performed according to the National/EU
Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals in
Research and the approval of the Ethics Committee of the Spanish
National Research Council (CSIC, file CEA-213-1-11).
Statistical analysisStatistical comparisons between groups were performed using
Student’s t test. Differences were considered significant at a level
p,0.05.
Results
Sequence features of LABCG2 and generation of aLeishmania line expressing an inactive version of theprotein
LABCG2 (GeneDB-L. major, accession code LmjF06.0090) has
two additional tandem imperfect repeats in chromosome 6 of
Leishmania (LABCG1, accession code LmjF06.0080, and
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Figure 1. LABCG2 localizes to the intracellular vesicles of Leishmania parasites. L. major stationary promastigotes transfected with GFP-LABCG2 (A and C) and GFP-LABCG2K/M (B and D) were incubated at 28uC with 1 mM FM4-64 (A and B) and 50 mg/mL concanavalin A-Alexa Red (C andD) for 30 min and 120 min, respectively. (E) LABCG2K/M localizes into the flagellar pocket of Leishmania parasites. L. major stationary promastigotes
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LABCG3, accession code LmjF06.0100) [31]. LABCG1,
LABCG2 and LABCG3 are ‘‘half-transporters’’ with a single
NBD and a single TMD localized at their C-terminus (Appendix
in Supporting information, Fig. S1A). LABCG1 and LABCG2 codes
for a 657 and 663 amino acid protein, with a predicted molecular
weight of approximately 73.4 and 74.0 kDa, respectively.
LABCG1 and LABCG2 are almost identical (95.7% of identity).
LABCG3 protein is truncated, with Walker A and several
transmembrane segments being absent (Appendix in Supporting
information, Fig. S1B). LABCG2 shares 19.5% amino acid
identity with human ABCG1, 24.6% with human ABCG2 and
27.3% with the White protein from Drosophila [35].
The dimerization requirement for ABC half-transporters (such
as LABCG2) to become functional led us to test a dominant-
negative approach to down-regulate LABCG2 function, as
recently described for Leishmania LABCG5 [35]. To this end, we
first mutated in LABCG2 the lysine residue inside the Walker A
motif (108 position), which is known to be critical for ATP
hydrolysis in ABC transporters [35,49], to a methionine (K108M).
The expression of other ABCG half-transporters with a similar K/
M substitution produces a dominant-negative inhibition in the
wild-type transporters [35,50]. The resulting construct was
transfected into L. major and the expression of LABCG2K108M
(LABCG2K/M) was verified by RT-PCR (Appendix in Supporting
information, Fig. S2A). In contrast to the phenotype observed after
LABCG5K/M expression [35], parasites transfected with
LABCG2K/M grew at normal rates (Appendix in Supporting
information, Fig. S2B).
Subcellular localization of LABCG2To study the localization of LABCG2, we fused LABCG2 and
LABCG2K/M with an N-terminal GFP-tag. These constructs were
transfected into L. major promastigotes and expression of these
proteins determined by Western-blot analysis of whole parasite
lysates. As expected, a band corresponding to GFP-LABCG2 was
observed at around 100 kDa (Appendix in Supporting informa-
tion, Fig. S3A). Additional higher molecular weight signals could
correspond to dimeric forms of the protein, as described for
LABCG5 [35], whereas the lower bands probably correspond to
degraded proteins.
Fluorescence microscopy studies showed that GFP-LABCG2
partially overlap with the endosomal markers FM4-64 [51] and
concanavalin A [52] in the stationary growth phase promastigotes,
which is depicted in representative micrographs in Fig. 1A and 1C.
In contrast, the stained vesicular structures do not co-localize with
the mitochondrial marker MitoTracker (data not shown). The
localization pattern of the protein does not change when GFP-
LABCG2K/M was expressed in Leishmania parasites (Fig. 1B and
1D). To evaluate whether GFP-LABCG2 was also localized in the
flagellar pocket, the sole site for endo-/exocytosis in Leishmania, we
subsequently performed the co-localization experiments with
FM4-64 at 4uC to block its vesicular trafficking. The results
showed that GFP-LABCG2K/M co-localizes in the flagellar pocket
of the stationary-phase promastigotes (Fig. 1E, yellow arrows).
Another part of the GFP-LABCG2K/M pool was detected in
intracellular vesicles localized in the apical part of the cell, at the
tip of the aflagellar pole of the parasite (Fig. 1E), a site that is
known to be involved in the interaction with host cells [53]. GFP-
tagged LABCG2 protein at the COOH-terminal showed a similar
pattern of localization (Appendix in Supporting information,
Fig. S3B), but its expression was unstable after few culture
passages, thus suggesting that the C-terminal TMD region is
critical for maintaining LABCG2 stability. Overall, these studies
suggest that LABCG2 localizes to intracellular vesicles of the
endosomal pathway, at the flagellar pocket and at the aflagellar
pole of Leishmania.
LABCG2 is involved in the exposure of PS on the outersurface of Leishmania
To study the possible role of LABCG2 in PL transport, we first
investigated the accumulation level of fluorescent short-chain PL
analogues by flow cytometry. Thus, stationary-phase L. major
promastigotes transfected with the empty vector (control) or the
vector containing LABCG2K/M (LABCG2K/M parasites) were
incubated with NBD-PE, -PC, -PS and -SM, and the cell-
associated fluorescence analyzed by flow cytometry after back-
exchange with BSA to extract the NBD-PL located in the outer
plasma membrane leaflet. Under these conditions, accumulation
of NBD-PS by the LABCG2K/M parasites was significantly higher
than that observed for control cells (4.2 fold, n = 12, p,0.05;
Fig. 2A). In contrast, no significant differences were observed for
NBD-PC, NBD-PE and NBD-SM accumulation between control
and LABCG2K/M parasites (Fig. 2B–D). The change in NBD-PS
accumulation was not due to differences in endocytosis, as the
internalization of NBD-SM, which is taken up by this process, was
not affected by the functionality of LABCG2 (Fig. 2D). The above
results were validated in a second transfection event with
LABCG2K/M (Fig. 2E). To verify that the higher NBD-PS
accumulation observed was due to the dominant-negative
inhibition of LABCG2 activity, LABCG2K/M parasites were
cured for the plasmid pUCNeoplusLABCG2K/M (reverted line)
by culturing the parasites in the absence of plasmid drug selection
pressure for three months. This reverted line showed a similar
NBD-PS accumulation to the control line (Fig. 2F). We
subsequently tested whether LABCG2 was involved in NBD-PS
internalization in two other Leishmania species (L. infantum and L.
donovani). Down-regulation of LABCG2 function was also assayed
by expressing LABCG2K/M and a similar phenotype was observed
in these Leishmania species (Appendix in Supporting information,
Fig. S4A and B). To confirm that the higher accumulation of
NBD-PS in the LABCG2K/M parasites was due to a reduced
floppase activity, we measured the outward translocation of NBD-
PS from the cytoplasmic to the exoplasmic leaflet of the plasma
membrane in both Leishmania lines. Thus, control and
LABCG2K/M L. major promastigotes were loaded under conditions
that yielded similar amounts of intracellular NBD-PS after the
back-exchange step. Then, parasites were maintained in probe-
free culture medium containing BSA and the amount of NBD-PS
extracted from the external side of the plasma membrane was
measured at different time points. The results showed that the
outward translocation of NBD-PS was higher in control versus
LABCG2K/M promastigotes (Fig. 2G) suggesting a PS floppase
activity of LABCG2.
Next, we studied the translocation of endogenous, long-chain
PS labelling control and LABCG2K/M stationary growth phase
promastigotes with Annexin V-Alexa Fluor 488. This probe binds
transfected with GFP-LABCG2K/M were incubated with 1 mM FM4-64 for 30 min at 4uC. The parasites were fixed for 10 min in 2% withparaformaldehyde at 4uC. (a) Nomarski images of b, c, d and e. Representative co-localization sites (f) are indicated by yellow arrows in the mergedimages. Scale bar: 5 mm. N (nucleus) and K (kinetoplast) are stained with DAPI. FP: flagellar pocket; AP: aflagellar pole. The figure illustrates arepresentative parasite of a total population of parasites with a similar fluorescence pattern.doi:10.1371/journal.pntd.0002179.g001
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PS exposed in mammalian apoptotic cells [8] and Leishmania
promastigotes in a calcium dependent manner [16] (Appendix in
Supporting information, Fig. S5). Quantitative analysis by flow
cytometer (Fig. 3A) showed that LABCG2K/M parasites presented
a significantly reduced exposure of PS in the outer leaflet of the
plasma membrane compared with control cells (20.1% vs. 52.7%
of Annexin V positive/propidium iodide negative, respectively,
p,0.05). Additionally, we determined that the density of PS
molecules on the cell surface is significantly higher in the control
(53.3566.12) than in the LABCG2K/M parasites (38.1063.49), as
measured by the mean fluorescence intensity (Fig. 3B); however,
control and LABCG2K/M log phase parasites showed a low and
similar Annexin V-binding (10.97% vs. 11.06% of Annexin Vpositive/propidium iodide negative, respectively, p,0.05; data not
shown). These results were supported by RT-PCR analysis of
expression of LABCG2 through the life cycle of L major that shows
higher expression of LABCG2 in stationary growth phase/
metacyclic promastigotes versus log phase parasites (Fig. 3C and
3D). To validate that the differences in Annexin V-Alexa Fluor
488 labelling were due to a defect in PS exposure, we tested the
sensitivity of control and LABCG2K/M parasites to papuamide B,
a pore-forming cytolytic peptide that specifically binds to PS at the
external surface of the plasma membrane [54]. The results showed
that LABCG2K/M parasites were less sensitive to papuamide B
than controls (EC50 = 3.2660.67 mM vs. EC50 = 2.1260.33 mM,
p,0.05, respectively) (Fig. 4A). As a control experiment, we tested
the sensitivity of both lines to Ro-peptide, which strictly recognizes
PE residues at the external surface of biological membranes [55].
The results of this study indicated that there were no differences in
sensitivity between LABCG2K/M and control parasites
(EC50 = 1.5860.09 mM vs. EC50 = 1.6460.12 mM, respectively)
(Fig. 4B). These results are in agreement with the absence of
Figure 2. Fluorescent PL accumulation in Leishmania parasites. Stationary promastigotes of Leishmania were incubated with the fluorescentPL analogues NBD-PS (A), NBD-PC (B), NBD-PE (C) or NBD-SM (D) for 30 min at 28uC. After washing and back-exchange with BSA, cell-associatedfluorescence was measured by flow cytometry analysis. The grey histogram represents control cells transfected with the empty vector, theuncoloured histogram represents parasites expressing LABCG2K/M and the dotted histogram represents non-labelled cells. (E) NBD-PS accumulationin Leishmania lines after a second transfection event. The reverted line (F), which was maintained for 3 months without drug pressure, was alsoincluded. The histograms correspond to a representative experiment from three independent experiments. (G) Outward transport of NBD-PS inLeishmania parasites. Stationary promastigotes of control (black circles) and LABCG2K/M (black squares) Leishmania lines were incubated with thefluorescent analogue NBD-PS for 30 min at 28uC. After washing and back-exchange with BSA, cells were incubated for different time points in a freeNBD-PS medium containing BSA and the fluorescence of the supernatant was measured by spectrofluorimetry. Results represent the means 6 SD offour independent duplicated experiments. * P,0.05 vs. control parasites.doi:10.1371/journal.pntd.0002179.g002
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alterations in NBD-PE translocation in LABCG2K/M parasites.
Several ABCG transporters have been implicated in sterol
transport [56]. Thus, differences in papuamide B sensitivity might
be indirectly caused by a general change in membrane lipid
organization in LABCG2K/M parasites. We study this possibility
by analyzing both sensitivity of control and LABCG2K/M parasites
to amphotericin B; the results shown that there were no significant
differences in sensitivity of both lines to amphotericin B (Fig. 4C),
suggesting that LABCG2 does not contribute greatly in the
distribution of sterols into the plasma membrane. Finally, we
confirmed that the parasites expressing GFP-LABCG2K/M used
for the subcellular localization analysis also maintained their
papuamide B resistance phenotype (data not shown).
Down-regulation of LABCG2 function decreases in vitroparasite infectivity
As PS externalization by the parasite is a key mediator for infection
of the macrophages [12] and polymorphonuclear cells [16], we
evaluated whether down-regulation of LABCG2 function correlated
with a decreased infectivity of the parasites. Thus, we measured the
ability of control and LABCG2K/M stationary-phase promastigotes to
infect mouse peritoneal macrophages. The results showed that
whereas 80% of macrophages were infected by control parasites after
24 h post-infection, only 20% of cells were infected by LABCG2K/M
parasites (Fig. 5A). In contrast, the number of parasites per infected
macrophage was similar in both cases (Fig. 5B). We have shown that
the different infectivity values observed in LABCG2K/M parasites are
not due to differences in the interaction parasite-macrophages as
determined after 4 hours post-infection binding assays (Appendix in
Supporting information, Fig. S6A and B. The results showed there
were not differences in the percentage of interaction in control cells
(80.5065.77) compared with LABCG2K/M parasites (84.3367.35).
Additionally, we have determined that the overexpression of
LABCG2 in Leishmania parasites did not show differences in the PS
exposition nor in the % infectivity of mouse peritoneal macrophages
(data not shown).
Figure 3. The externalization of endogenous PS by stationary Leishmania promastigotes depends on LABCG2 function. (A) PSexposure at the outer leaflet of the parasite plasma membrane was analyzed by flow cytometry using Annexin V–Alexa 488 as described in Materialsand Methods. The lower right quadrant in the density plots represents the percentage of Annexin V positive/Propidium iodide negative in control orLABCG2K/M parasites. Markers were placed using non-stained parasites. (B) Density of PS molecules (GeoMean) on the cell surface. The grey histogramrepresents control cells transfected with the empty vector, the uncoloured histogram represents parasites expressing LABCG2K/M and the dottedhistogram represents non-labelled cells. The results shown are representative of three independent duplicated experiments. (C and D) Geneexpression analysis of LABCG2 from L. major control determined by RT-PCR analysis through the different growth phases of Leishmania parasites:early log (day 2), late log (day 3), stationary (day 4) and late stationary phase (day 5). RT-PCR was carried out for 35 cycles using RNA isolated from theabove parasites and the products were run in 2% agarose gel as described in Materials and Methods. Lower imagine in C shows the expression ofGADPH used as internal loading control. The arrows indicate amplified 280 bp LABCG2 fragment and 227 bp GADPH fragment. Lower imagine in Dshows the mRNA level of LABCG2 normalized with GADPH in different points of the growth curve. The results shown are the means of threeindependent experiments 6 SD.doi:10.1371/journal.pntd.0002179.g003
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We have repeated the infection experiments masking most of
the PS in the metacyclic forms by incubating stationary-phase
control and LABCG2K/M parasites with Annexin V. As expected,
PS masking reduced the macrophage infection percentage of
control parasites by approximately 82%. Annexin V-mediated
masking of PS in LABCG2K/M parasites did not significantly
altered their lower ability to infect peritoneal macrophages,
reaching similar values to those obtained with Annexin V treated
control parasites (Fig. 5C). Furthermore, we assessed whether
other molecules, such as lipophosphoglycan (LPG) or the
phosphatidylinositol-anchored surface molecule gp63 [15], both
of which are implicated in Leishmania infectivity, could be altered in
LABCG2K/M parasites. Flow cytometry analysis of stationary-
phase promastigotes marked with fluorescein-conjugated ricin
agglutinin, which specifically label LPG [45], showed no
differences between control and LABCG2K/M parasites (Appendix
in Supporting information, Fig. S6C). Additionally, flow cytometry
analysis using a specific monoclonal antibody for Leishmania gp63
showed no significant differences between expression of this
surface molecule in the control and LABCG2K/M stationary-phase
promastigotes (Appendix in Supporting information, Fig. S6D).
Finally, we evaluated whether the infectivity differences observed
may be due to an alteration in the metacyclogenesis of the
parasites produced by down-regulation of LABCG2 function.
Thus, we purified infective metacyclic forms from stationary-phase
promastigotes of control and LABCG2K/M parasites by binding to
the lectin peanut agglutinin (PNA) [57], and found that the
percentage of metacyclic parasites (PNA2) obtained was similar in
both cell lines (Appendix in Supporting information, Fig. S7A).
Furthermore, both parasite lines were morphologically elongated,
highly mobile, there were no rounded shapes and differences in
size (FSC-H) between control (427.26613.82) and LABCG2K/M
(413.61614.53) lines, respectively (Appendix in Supporting
information, Fig. S7B). We also analysed expression of the
metacyclic marker protein HASPB (hydrophilic acylated surface
protein B) [58], which is implicated in host-cell infection. Western
blot analysis indicated that there were no differences in expression
of this 32 kDa protein between control and LABCG2K/M
parasites (Appendix in Supporting information, Fig. S7C).
LABCG2 is required for disease development in a mousemodel of cutaneous leishmaniasis
As down-regulation of LABCG2 function decreased the in vitro
macrophage infectivity of metacyclic parasites, we analysed
whether this defect was correlated with a lower in vivo virulence
of the parasites using a mouse model of cutaneous leishmaniasis.
Thus, susceptible female BALB/c mice were infected with 104
metacyclics purified from control and LABCG2K/M parasites by
footpad inoculation. As we had previously observed during the
assays to cure LABCG2K/M parasites for the plasmid pUCNeo-
plusLABCG2K/M (reverted line) that the defect on the external-
ization of NBD-PS remained unaltered for at least five weeks in
the absence of antibiotic pressure, we were able to use transfected
parasites for this model. After infection, the measure of inflam-
mation and the development of skin lesions in the footpad with
time were monitored weekly up to a maximum of five weeks. At
this time, control animals had to be sacrificed due to the severity of
the lesions. Mice infected with control parasites showed progres-
sive inflammation and lesion pathology after the first two weeks
(Fig. 6A–C), whereas mice infected with LABCG2K/M parasites
showed no detectable lesions pathology at any time, and presented
significantly lower footpad inflammation (Fig. 6A–C). As observed
in Fig. 6B, the curve for footpad lesion size is the same for non-
infected control animals and for the animals infected with
LABCG2K/M L. major metacyclic parasites, which shows no
lesions during the time of the infection assay.
Additionally, we decided to determine whether these infected
mice presented parasites in different target tissues and whether these
parasites maintained the expression of LABCG2K/M and increased
NBD-PS accumulation. Thus, at the indicated time, mice were
euthanized and their footpad, spleen and lymph nodes collected for
parasite isolation following the limiting dilution assay. As can be
seen from Fig. 6D–E, a lower parasite burden was recovered from
the footpad of mice infected with the LABCG2K/M parasites
compared to the control mice (Fig. 6D), and no parasites were
isolated from the spleen or lymph nodes of mice infected with the
LABCG2K/M parasites (Fig. 6E) after one week of in vitro culture.
Moreover, we confirmed by RT-PCR that the mutant
LABCG2K/M gene was still expressed in parasites isolated from
Figure 4. Leishmania LABCG2K/M parasites present resistance to papuamide B. Sensitivity of control and LABCG2K/M parasites to the PS-binding peptide papuamide B (A), PE-binding peptide Ro09-0198 (B) and amphotericin B (C). Logarithmic-phase promastigotes were diluted to 106/mL in RPMI 10% hiFBS containing different concentrations of these peptides; after 72 h, cell viability was analysed by a MTT analysis as described inMaterials and Methods. Results represent the means 6 SD of four independent duplicated experiments. * P,0.05 vs. control parasites.doi:10.1371/journal.pntd.0002179.g004
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the footpad of mice infected with the LABCG2K/M parasites
(Fig. 7A), and that its phenotype of increased NBD-PS accumula-
tion remained unaltered (Fig. 7B). To confirm that the loss of
virulence exhibited by the mutant line was due to the expression of
LABCG2K/M, these experiments were repeated with a second line
of LABCG2K/M parasites generated from an independent trans-
fection event. The results of this study were similar to those
described above (Appendix in Supporting information, Fig. S8 ),
thus indicating that the dramatic differences in the virulence of
LABCG2K/M parasites were due to down-regulation of LABCG2
function and suggesting that the Leishmania LABCG2 gene is crucial
for disease development.
Discussion
The exposure of PS on their cell surface is one of the
mechanisms known to be used by Leishmania amastigotes and
metacyclic promastigotes to infect host macrophages and to
Figure 5. LABCG2K/M parasites are less infective to mouse peritoneal macrophages. Infection of mouse peritoneal macrophages withstationary Leishmania promastigotes from control and LABCG2K/M parasites was performed as described in Materials and Methods. The percentage ofinfected macrophages (A) and the mean number of parasites per macrophage (B) were determined 24 h post-infection. The results represent themeans 6 SD of three independent experiments. *P,0.05 vs. infection level of control parasites. Additionally, the effect of Annexin V-binding onmacrophage infectivity was determined (C) using control and LABCG2K/M stationary parasites incubated in the presence (+) or absence (2) of AnnexinV (0.05 mg/ml6107 stationary promastigotes) for 4 h. The results shown are the means of three independent experiments 6 SD. *P,0.05 untreatedcontrol vs.: Annexin V-treated control, untreated LABCG2K/M parasites and Annexin V-treated LABCG2K/M parasites.doi:10.1371/journal.pntd.0002179.g005
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inhibit their microbicidal activity [7–9,11,14,16]. PS is usually
asymmetrically distributed in the cell membrane of eukaryotic
cells and is present only in the cytoplasmic leaflet of the plasma
membrane [18]. Although the PS synthesis in Leishmania have
been a matter of intense debate [59,60], in which the growth
state of Leishmania parasites could be the possible discrepancy
factor, it could be concluded that parasites in late logarithmic
phase contain PS.
Figure 6. LABCG2K/M parasites are less infective in a cutaneous leishmaniasis mouse model. Susceptible BALB/c mice were infected with104 control and LABCG2K/M L. major metacyclic parasites as described in Materials and Methods. Disease development was monitored weekly bymeasuring the inflammation (A) and lesion size (B). The pictures in C show the lesion at week 5 post-infection. Parasite burden was determined infootpad (D) and tissues (E): lymph nodes (LN) and spleen (SP). The results represent the means 6 SD of three independent experiments, with 10 miceper group. Mice were euthanized when the lesion size in controls reached a value of 50–70 mm2. * P,0.05 vs. control parasites; n.d. stands for notdetected.doi:10.1371/journal.pntd.0002179.g006
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Although the molecular basis for this outward PS translocation
in Leishmania remains unknown, herein we provide experimental
evidence supporting the involvement of a new ABCG half-
transporter (LABCG2) from Leishmania in this process.
Thus, down-regulation of LABCG2 function in L. major upon
expression of an inactive version of the transporter (LABCG2K/M)
diminishes the outward translocation of fluorescent short-chain
analogues of PS (NBD-PS). This dominant-negative phenotype
seems to be specific for the head of PL, as the movement of
fluorescent analogues of PC, PE or SM was not affected. This
substrate specificity contrasts with the broader spectrum of PL
translocated by other lipid floppases [33,36] and flippases [42]
characterized in Leishmania. Similar results were obtained after
expression of LABCG2K/M in L. donovani and L. infantum, thereby
suggesting that the functionality of LABCG2 could be conserved
in Leishmania spp. It should be noted, however, that this phenotype
was not due to an LABCG2-mediated alteration of PL endocytosis
as the internalization of NBD-SM (which is taken up by lipid-
phase endocytosis) was not altered. In addition, Annexin V-Alexa
488 binding assays showed that LABCG2K/M promastigotes in the
stationary phase exposed less endogenous PS than control
parasites. As Annexin V is not entirely specific for PS, despite its
widespread use in labelling it, and could bind to other anionic PL
[60–62], we performed an additional control using papuamide B,
a cytolytic peptide that specifically recognizes PS residues in
biological membranes [54]. The reduced exposure of PS on the
outer face of the plasma membrane in LABCG2K/M parasites was
correlated with an increased resistance to papuamide B. Although
these differences in resistance to papuamide B were not so higher,
such differences were statistically significant and reproducible even
in GFP-LABCG2K/M parasites, considering that extreme changes
in the phospholipid asymmetry of the eukaryotic membranes lead
to cell death [5,22,63]. The differences in Annexin V labelling
between control and LABCG2K/M parasites were not observed
during the log growth-phase of parasites, where the labelling was
very low. This finding is in agreement with previous reports for L.
donovani and L. tropica [14] and suggests that LABCG2-mediated
PS exposure could be induced during metacyclogenesis of the
parasite and is probably maintained in the intracellular amastigote
stage. The constitutive expression of LABCG2 in both life-cycle
stages of L. donovani has been described recently [34]. Although not
discussed in detail in that study, LABCG2 expression seems to be
higher in the amastigote forms than in the log-phase promastigote
forms [34], as would be expected for a protein involved in PS
externalization. In our case, the results have shown that the
expression of LABCG2 increases in the early and late stationary
phase compare with the log phase and this increase would be
involved in the redistribution of PS to the outer leaflet of the
plasma membrane in the metacyclic forms of the parasite. On the
other hand, the localization of LABCG2 at both the flagellar
pocket and the aflagellar pole as well as in intracellular vesicles,
suggests a possible mechanism for PS exposure in Leishmania,
similar to that described for human ABCG2, namely as an
intracellular sterol transporter [64]. It remains possible that
LABCG2 could transfer PS and other factors (as virulent factors)
to the inner leaflet of these vesicles before their fusion with the
plasma membrane at the flagellar pocket, followed by a
redistribution of PS/other factors to the outer leaflet of the plasma
membrane of the parasite (Fig. 8). In the case of LABCG2 K/M,
the content of PS and other factors could be reduced in the
intracellular vesicles and in the outer leaflet of plasma membrane,
consequently influencing in the infectivity and virulence. A similar
situation has been described for the LtrABCA2 transporter of
Leishmania, involved in phospholipid trafficking and localized at the
flagellar pocket and internal vesicles [43]. Additionally, LABCG2
could function as a floppase of PS/other factors due to their
localization in the flagellar pocket of the parasite (Fig. 8).
In addition, the defect in PS externalization produced by down-
regulation of LABCG2 function was found to be correlated with a
significant reduction of the infection of mouse peritoneal
Figure 7. LABCG2K/M parasites isolated from footpad lesions of infected mice retained the increased NBD-PS accumulationphenotype. (A) RT-PCR gene-expression analysis of wild-type and mutated LABCG2 in control and LABCG2K/M Leishmania parasites. The lower imageshows the expression of GADPH used as internal loading control. RT-PCR was carried out for 35 cycles using RNA isolated from the above parasitesand the products were run in 2% agarose gel. The positions of molecular markers (bp) are indicated on the left. (B) Accumulation of NBD-PS in control(grey histogram) and LABCG2K/M (uncoloured histogram) parasites. Parasites recovered from the footpad lesions of infected mice were maintained inculture medium and the stationary promastigotes incubated with the fluorescent phospholipid analogue NBD-PS for 30 min at 28uC. After washingand back-exchange with BSA, cell-associated fluorescence was measured by flow cytometry analysis as described in Materials and Methods. Thedotted line represents non-labelled parasites.doi:10.1371/journal.pntd.0002179.g007
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macrophages by LABCG2K/M parasites. This finding agrees with
previous reports [7,14], which showed that PS exposure was
important for macrophage engulfment of the promastigote and
amastigote forms of Leishmania. As suggested [12], we believe that
the only process probably affected would be the phagocytosis and
consequently the variation of PS exposure could not be important
for the interaction; this consideration would explain the observed
differences in % of infected macrophages. Additionally, the
reduced infectivity was not due to changes in the metacyclogenesis
process considering that LABCG2 function does not affect either
expression of the metacyclic marker protein HASPB or the
number of metacyclic promastigotes produced.
Furthermore, the virulent factors LPG and gp63 are probably
not affected by the function of LABCG2, as deduced by the
absence of variations in the expression levels of these surface
molecules, both of which have been suggested that play important
roles in establishment of the infection. However, we cannot
discard the possibility that other unknown factors involved in the
virulence of Leishmania could be transported by LABCG2, and
their expression could be affected in the LABCG2K/M parasites.
The decrease of the in vitro ability to infect macrophages
observed in mutant parasites with a defect in PS exposure was
found to be correlated with lower infectivity in an in vivo mouse
model of cutaneous leishmaniasis, thereby supporting the proposal
that LABCG2 function is required in order to develop the lesion.
The role of the apoptosis-like PS exposure in the establishment of a
Leishmania infection has been widely discussed. One possibility in
this respect is that PS-positive cells do not necessarily die but use
PS exposure, in an apoptosis-mimicking fashion, to infect
macrophages and inhibit their microbicidal activity [8,11,16,65].
The second possibility suggests that PS-positive forms are indeed
‘‘altruistic’’ apoptotic parasites that have been sentenced to death
but are nevertheless required in order that the PS-negative
infective parasites invade the host cell, in a truly cooperative
system [16,66]. Should be noted considered that these experiments
were made using late stationary phase Leishmania parasites, where
they begin to appreciate the apoptotic round shapes described
above. In our case, the experiments were performed using early
stationary phase Leishmania parasites, where rounded apoptotic
forms were not detected. In any case, PS exposure is the relevant
phenotype for macrophages infection and subsequent inactivation
of microbicidal activity in both these scenarios, thereby allowing
parasite persistence in the host [65].
The need for ABC half-transporters such as ABCG proteins to
dimerize in order to reconstitute the ATP-binding sites and
become functional has allowed us to test a dominant-negative
approach to down-regulate LABCG2 function. Dominant-nega-
tive inhibition of mammalian ABCG2 [50,67] and Leishmania
LABCG5 [35] has also been described upon expression of
different mutants of these transporters. Although the inhibition
of homodimeric LABCG2 function is the most likely explanation
for expression of the inactive version of LABCG2, we cannot rule
out the inhibition of other putative partners. Indeed, some ABCG
proteins, such as human ABCG5/8 [68] and Drosophila White,
Brown and Scarlet, work as heterodimers [69]; the latter can even
change the substrate transported as a function of the partner of the
White protein. However, as expression of inactive versions of
LABCG4 [32] and LABCG5 does not affect the translocation of
PS [35] or the infectivity of the parasites, it is more likely that
LABCG2 does not heterodimerize with these other Leishmania
ABCG proteins; it could however dimerize with LABCG1, which
is almost identical in its TMD.
A further attractive alternative could be that truncated
LABCG3, which only includes the conserved Walker B, the
signature motifs and two transmembrane segments and is
expressed at least at mRNA levels [31,34], could dimerize with
Figure 8. Schematic diagram of the localization of LABCG2 in intracellular vesicles and flagellar pocket of Leishmania parasites. Itremains possible that LABCG2 could transfer PS and other factors (as virulent factors) to the inner leaflet of intracellular vesicles before their fusionwith the plasma membrane at the flagellar pocket, followed by a redistribution of PS/other factors to the outer leaflet of the plasma membrane of theparasite.doi:10.1371/journal.pntd.0002179.g008
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LABCG2 to produce an inhibitory effect on LABCG2 function.
This could be a novel way to regulate protein function in this
parasite, although further experiments will be required to confirm
this hypothesis.
Finally, LABCG2 belongs to the same subfamily as mammalian
ABCG2, a well-characterized PS transporter [30] that also pumps
drugs conferring a MDR phenotype in cancer cells [70,71]. Others
LABCG proteins, such as LABCG4 and LABCG6, also confer
resistance to leishmanicidal agents [32,33]. Future work in our
group will examine the implication of LABCG2 in drug resistance.
In conclusion, we have provided evidence that strongly suggests
the involvement of Leishmania LABCG2 function in the PS
externalization required for the infection of host macrophages
and development of the disease. Nonetheless, new approaches will
be needed to fully understand the molecular mechanism by which
LABCG2 affects the infectivity and virulence of Leishmania.
Additionally, these findings indicate that LABCG2 could be
considered as a promising drug target for leishmaniasis. Further-
more, as mutant parasites could be isolated from infected mice
despite the absence of lesions, null mutants for LABCG2 could
potentiality be used for live vaccination studies and to understand
the role of LABCG2 in Leishmania pathogenesis.
Supporting Information
Figure S1 (A) Membrane topology model of the Leish-mania half-transporters LABCG1, LABCG2 andLABCG3. The nucleotide binding domain (NBD) is located N-
terminal with respect to the transmembrane domain (TMD). The
putative membrane-spanning helices of the TMD are shown as
cylinders passing through the lipid bilayer. The ATPase catalytic
Walker A, Walker B, and the signature motif C localized in the
nucleotide binding domain (NBD) are shown (boxes A, B and C,
respectively). The arrow indicates the catalytic site mutation
(K108M) engineered into the Walker A motif. The topology model
was predicted using TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/
TMHMM-2.0/) and TMRPres2D ((http://biophysics.biol.uoa.
gr/TMRPres2D/) softwares. (B) Amino acid sequences andalignment (Clustal W) of L. major LABCG1, LABCG2 andLABCG3. Putative transmembrane segments predicted by
TMHMM and TMRPres2D are underlined. The Walker A/
Walker B motifs, and the ABC family signature motif C are boxed.
Identical amino acids present in the three sequences are indicated
by *, the amino acid similarity is indicated by : and weak similar
amino acid are indicated by . . Gaps introduced for the sequence
alignment are indicated by -.
(TIF)
Figure S2 Gene-expression analysis of LABCG2 inLeishmania lines. (A) Upper panel: gene expression of
LABCG2 by RT-PCR as indicated by the amplified 280 bp
LABCG2 fragment. Lower panel: gene expression of GADPH as
internal loading control. The arrow indicates amplified 227 bp
GADPH fragment. Lane 1: DNA marker phi 174 HaeIII; lane 2:
control parasites; lane 3: LABCG2K/M parasites. RT-PCR was
carried out for 35 cycles using RNA isolated from the above-
mentioned parasites and the products run in 2% agarose gel. (B)
Growth curve of control (black circles) and LABCG2K/M (black
squares) parasites at different time points (24, 48, 72, 96 and
120 h). The results represent the means 6 SD of three
independent experiments.
(TIF)
Figure S3 Protein expression in GFP-LABCG2 and GFP-LABCG2K/M Leishmania parasites. Immunodetection of
GFP (A) or H2A histone (lower inset) in L. major lines expressing
control GFP (lane 1), GFP-LABCG2 (lane 2) and GFP-
LABCG2K/M (lane 3). Western blot analysis of total proteins
from parasites incubated with antibodies against GFP or H2A
histone, as loading control, at a 1:5000 dilution. The molecular
mass standards (kDa) from Bio-Rad are indicated on the left. (B) L.
major stationary promastigotes transfected with pXG-GFP+ and
LABCG2K/M-GFP were fixed for 10 min in 2% paraformalde-
hyde at 4uC. a and c, Nomarski images of b and d, respectively. b
shows the cytoplasmic localization of the protein GFP and d
corresponds to localization sites of LABCG2K/M-GFP, indicated
by white arrows in the merged images. Scale bar: 5 mm. FP:
flagellar pocket; AP: aflagellar pole. The figure illustrates a
representative parasite of a total population of parasites with a
similar fluorescence pattern.
(TIF);
Figure S4 Fluorescent PS accumulation in Leishmaniaparasites. Stationary promastigotes of L. infantum (A) or L.
donovani (B) were incubated with the fluorescent PL analogue
NBD-PS for 30 min at 28uC. After washing and back-exchange
with BSA, cell-associated fluorescence was measured by flow
cytometry analysis. The grey histogram represents control
parasites transfected with the empty vector, the uncoloured
histogram represents parasites expressing LABCG2K/M and the
dotted histogram represents non-labelled cells. The histograms
correspond to a representative experiment from three independent
experiments.
(TIF);
Figure S5 The externalization of endogenous PS inLeishmania parasites. PS exposure at the outer leaflet of the
parasite plasma membrane was analyzed by flow cytometry using
Annexin V–Alexa 488 in control parasites as described in
Materials and Methods. Controls measurements in the absence
of calcium were included using Annexin V–Alexa 488 plus 8 mM
EGTA. The results shown are representative of three independent
duplicated experiments 6 SD. * P,0.05 vs. control parasites.
(TIF)
Figure S6 LABCG2K/M parasites has not affected itscapacity of binding to macrophages. (A) Binding of control
and LABCG2K/M metacyclic promastigotes to mouse peritoneal
macrophages. Percentage of positive interaction of promastigotes
to macrophages after 4 h interaction was determined by a
fluorescence microscopy analysis counting 100 macrophages/well.
The results represent the means 6 SD of three independent
experiments. (B) Micrograph of double-fluorescence labeling of the
binding of Leishmania control and LABCG2K/M metacyclic
parasites to mouse peritoneal macrophages. Cell Tracker TM
Green-labeled parasites were added (5:1) to mouse peritoneal
macrophages relabeled with FM4-64 (red). a and c, Nomarski
images of b and d, respectively. b and d shows the binding and
intracellular localization of control and LABCG2K/M parasites.
Scale bar: 10 mm. The expression levels of two surface molecules,
LPG (C) and gp63 (D), were determined in control and
LABCG2K/M parasites marked with fluorescein-conjugated ricin
agglutinin that specifically labels LPG (C) and a specific
monoclonal antibody for Leishmania gp63 (D). The fluorescence
intensity was determined by flow cytometry analysis, as described
in Materials and Methods. The data are means of the geometrical
mean channel fluorescence values (g.m.) 6 SD of three
independent experiments versus controls.
(TIF)
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PLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org 14 April 2013 | Volume 7 | Issue 4 | e2179
Figure S7 LABCG2K/M Leishmania parasites do notshow defective metacyclogenesis. (A) Control and
LABCG2K/M metacyclic parasites were purified from stationary
promastigotes using negative selection with the lectin PNA, as
described in Materials and Methods. The results represent the
means 6 SD of four independent experiments. (B) Analysis by flow
cytometry of the FSC-H of control and LABCG2K/M metacyclic
parasites; right panel shows a Nomarsky micrography of the same
samples. Scale bar: 5 mm. (C) Total cell lysates from stationary
promastigotes were analyzed by Western blotting with an antibody
to the metacyclic protein HASPB. Anti-alpha tubulin antibody
was used as loading control. The positions of molecular marker
(kDa) are indicated on the left.
(TIF)
Figure S8 LABCG2K/M parasites are less infective in amouse model of cutaneous leishmaniasis. A second
independent transfection event using control and LABCG2K/M
parasites was inoculated in mice, as described in Materials and
Methods. The inflammation (A), lesion size (B) and parasite
burden in footpad (D) and tissues (E) such as lymph nodes (LN)
and spleen (SP) were determined weekly. The pictures in C show
the lesion at week 5 post-infection. The results represent the means
6 SD of three independent experiments, with 10 mice per group.
Mice were euthanized when the lesion size in controls reached a
value of 50–70 mm2. *P,0.05 vs. control parasites; n.d. stands for
not detected.
(TIF)
Acknowledgments
We thank Stephen M. Beverley (Washington University, School of
Medicine, USA) for providing the vectors pXG-GFP+29 and pXG-
’GFP+, Barbara A. Smith (University of York, UK) for providing the
polyclonal antisera against metacyclic marker protein HASPB, and
Thomas Gunther Pomorski and Rosa Lopez (Department of Plan Biology
and Biotechnology, University of Copenhagen, Denmark), for providing
the papuamide B peptide.
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: FG JMPV SC. Performed the
experiments: JCS DLG EGR MD. Analyzed the data: FG JMPV SC JCS
EGR MD. Contributed reagents/materials/analysis tools: FG. Wrote the
paper: FG JMPV SC JCS. Obtained permission for use of the vectors
pXG-GFP+29 and pXG-’GFP+, for use of the polyclonal antisera against
metacyclic marker protein HASPB, and for use of the papuamide B
peptide: FG.
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Leishmania Infectivity Involves an ABC Transporter
PLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org 16 April 2013 | Volume 7 | Issue 4 | e2179