bases microbiologicas de la terapÉutica y la resistencia antimicrobiana máster en investigación...

BASES MICROBIOLOGICAS DE LA TERAPÉUTICA Y LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Máster en investigación médica, clínica y experimental

FARMACOLOGIA INTRACELULAR DE ANTIMICROBIANOSDra. Sofía Ballesta Mudarra

El objetivo del tratamiento antimicrobiano es concentrar en el lugar de la infección suficiente cantidad de antimicrobiano para inhibir o destruir al microorganismo

En este sentido los parámetros

PK/PD son predictivos del perfil

farmacocinético; son parámetros

que correlacionan la eficacia

frente a infecciones extracelulares

Para patógenos intracelulares, el lugar donde debe concentrarse el antimicrobiano es menos accesible.

Farmacología intracelular


Relaciones microorganismos y huésped

Intracelulares obligados. Adaptado a vivir exclusivamente en el interior de las células y necesitan estar en el interior de la célula para sobrevivir

Intracelulares facultativos pueden residir tanto dentro como fuera.

Intracelulares oportunistas


Intracellular drug concentrations (review)

Dollery, C.T.

Clinical Pharmacology and Therapeutics. 2013. Volumen 93, 263-266


Vida intracelular • Células fagocíticas • Células no fagocíticas (epiteliales)

La actividad intracelular va a depender de muchos factores, entre ellos

de donde se localice la bacteria y

de donde se acumule el antimicrobiano

La célula con antibiótico intracelular se convierte en un transportador fisiológico al lugar de la infección


Factores de los que depende la penetración de los ATB en la cell

Tipo de transporte que utilizan los ATB para entrar en la cell

Localización intracelular de los ATB en la célula

Elución del ATB desde el interior de la célula al medio extracelular

Actividad intracelular del ATB

Selección del ATB adecuado

DISEÑO de moléculas nuevas


Ci/Ce


Parámetros F-Q que rigen la penetración de ATB

LipofíliaP = coeficiente de reparto

Betelactámicos = hidrófilos

Quinolonas = moderadamente lipofílicas

Peso Molecular <700 Da

Capacidad de unión a proteinas

Naturaleza acido-base de la molécula

Ka; pKa


Parámetros F-Q que rigen la penetración de ATB

Naturaleza acido-base de la mólecula

Betalactámicos (acidos orgánicos)

Quinolonas (anfotéricas)Macrólidos (carácter básico)


Mecanismo de penetración de ATB en la célula

Moléculas

• Neutras• Lipófilas • <700 Da

- Betalactámicos- Quinolonas

Difusión pasiva

EndocitosisMoléculas• (No neutras)

Moléculas demasiados polares• (<<700 Da)

Moléculas demasiados voluminosas

- Aminoglicosidos y- Glicopéptidos





Canales transportadores

Activo pasivoMoléculas• Análogos de sustratos

endógenos transportables al interior de la célula

• Con o sin Energía

- Quinolonas y - Betalactámicos


Salida del ATB de la célula


Penetración intracelular de los ATB

antimicrobiano

célula eucariota

Aislamiento de células

(PMN, Macrófagos, células epiteliales…)

Incubación células + ATB

Medir la concentración del ATB intracelular



IncovenientesMide antimicrobiano asociado a la célula (fracción lipídica, proteica)

antibiótico intracelular ó unido a la superficie externa de la célula.

parte del antibiótico intracelular puede salir al exterior en el proceso



Técnica cromatográfica

V HPLC muy especifica

I Requiere grandes volúmenes de

células

I Altas concentraciones de ATC

Técnica radiométrica

V Muy sensible y reproducible

I ATB marcados radiactivamente

Técnica fluorométrica

V Muy sensible y reproducible

I ATB con fluorescencia


Caracterización de la penetración de ATB

Caracterizacion del paso por difusión pasiva

Viabilidad celular

Temperaturas

Saturación del proceso

Modificación del pH extracelular

Caracterizacion del transporte activo

Inhibidores metabólicos

Inhibidores de fuentes de energía ( NaCN, FNa, 2,4 dinitrofenol)

Desacoplantes de potencial de membrana (ouabaína o CCCP)

Ionóforos como el w-clorofenil hidrazona (CCP)

Análogos del transporte

Estimuladores celulares (PMA )

Caracterizacion del effluxInhibidores de bombasDistintos tiempos de incubación


Medida de la actividad intracelular

1. Medición de halos de inhibición del antibiótico del interior de las células

2. Medición de la reducción que se produce en la supervivencia intracelular de las bacterias

bacterias

antimicrobiano

célula eucariota

Diseño de nuevas moléculas.

Formulación de nuevos fármacos

Fluorquinolonas

Activos intracelularmente frente a patógenos intracelulares como Micobacteria, Legionella spp, Streptococcus pneumoniae y Sthapylococcus aureus.

Mecanismos de resistencia específicos asociados con mutaciones, principalmente en los genes gyr A y parC.

UB-8902 . Esta molécula se diseña con objeto de mejorar la actividad de ciprofloxacino y

norfloxacino frente a cepas resistentes.

X R1 R2 R3 R4 R5 R6

Ciprofloxacino NH C3H5 H H H H -

UB-8902 N C3H5 H H H H Met

Objetivo

• Evaluar la penetración de UB-8902 en leucocitos polimorfonucleares hunanos (PMNs)

• Estudiar la actividad intracelular de UB-8902 frente a S. aureus con resistecia asociada con mutaciones en los genes gyr A o parC

Strain

Mutations

gyrA Ser84 gyrA Glu88 grlA Ser805-61 wild-type wild-type wild-type

5-61 G8 wild-type wild-type mutant5-61 M14 wild-type mutant mutant

Cinética de penetración y eflujo de UB-8902

Tras 20 minutos de incubación con concentración extracelular de 2 mg/mL se alcanzan concentraciones intracelulares de 13,5 mg/mL (C/E=6.5).

Tras cinco minutos de incubación en medio libre de antimicrobiano se libera el 70% del mismo desde el interior de los PMN.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 20 40 60 80 100 120

time (min)

Intr

acel

lula

r co

nce

ntr

atio

n (

µg/m

l)

PENETRACIÓN DE UB-8902 EN PMN

Fluorquinolonas

C/E

UB-8902 6.5

Norfloxacino 4.5

Lomefloxacino 6.9

Ofloxacino 6.6

Moxifloxacino 10

Trovafloxacino 10

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

2 5 10 25 50

Extracellular concentration (µg/ml)

Intr

acellu

lar

co

ncen

trati

on

(µg

/ml)

La cantidad de UB-8902 asociado a PMNS se saturó a concentraciones > 50 mg/ML

Influencia de los factores ambientales

Conditions C/E

Viable cells, 37ºC, pH 7’2 (control) 6.5 ± 0.8

Viable cells, 4ºC 6.3 ± 1.5

Dead cells, 37ºC 7.6 ± 1.3

pH 5 8.6 ± 1.0 a

pH 6 8.6 ± 1.6 a

pH 8 4.9 ± 1.1 a

a p <0.05 compared with the control.

Efecto de los estímulos de membrana

Conditions C/E

Control 6.5 ± 0.8

2,4-Dinitrophenol 0.1 mM 7.4 ± 1.1

Sodium cyanide 1.5 mM 3.3 ± 1.4 a

Sodium fluoride 1.5 mM 5.6 ± 1.8

m-Chlorophenylhydrazone 0.015 mM

6.0 ± 1.2

PMA 7.1 ± 0.8

S. aureus 5-61 7.1 ± 1.0

S. aureus 5-61 M14 6.9 ± 1.6

a p <0.05 compared with the control.

Conditions/ Value UB 8902 Moxifloxacino DX 619 TROVAFLOX OFXLVX

Viable cells, 37ºC, pH 7’2 (control) 6.5 ± 0.8 10 10 10 6.6 4.6

Viable cells, 4ºC = ↓* ↓* ↑* ↓* ↓*

Dead cells, 37ºC = = = = ↓* ↓*

Eflujo Rápido Rápido Rápido Rápido Rápido Rápido

Saturabilidad[0-40 mg/L]

No No No No No No

pH 6 ↑* = = ↑* ↑ ↑

pH 8 ↓* ↓* = = ↓* ↓*

2,4-Dinitrophenol 0.1 mM = = = = = =

Sodium fluoride 1.5 mM = ↓* = = = =

m-Chlorophenylhydrazone 0.015 mM

= ↓* ↓* = ↓* ↓*

Hidrofobicidad =Poco

hidrofóbica= Muy Hidrofóbica =

=

Pasivo Activo Activo/pasivo PasivoActivo/pasivo

Activo/pasivo

Actividad Intracelular de UB-8902

Cepa

Mutaciones CMI

gyrA Ser84

gyrA Glu88 grlA Ser80 UB 8902 Ciprofloxacino

5-61 wild-type wild-type wild-type 0,06 0,06

5-61 G8 wild-type wild-type mutant 0,5 8

5-61 M14 wild-type mutant mutant 4 64

La actividad de UB892 comparada con ciprofloxacino

se ve aumentada 16 veces

UB-8902

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

0,125 1 5

Extracellular concentration (mg/L)

Surv

ivin

g s

taphylo

cocci (

%)

S. aureus 5 61 CEPA 5 61 G8 CEPA 5 61 M14

En la cepa salvaje, UB 8902 provocó una reducción significativa de la supervivencia intracelular con las tres concentraciones extracelulares ensayadas.

En las cepas mutadas, solo produjo una reducción significativa de la supervivencia intracelular a con > 1 mg/mL, no apreciándose diferencias significativas entre ambos tipos de cepas

* **

*** *

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