Rev. Méd. Hosp. Nal. Niños Costa Rica 18 (1): 1 - 19,1983.

AISLAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER FETU~ SSP JEJUNI

Dr. Francisco Hernández*, Dra. Patricia Rivera**Dr. Marco L. Herrera** y Dra. Rosa Rodríguez**

INTRODUCCION

El género CIDllP'y1obacter se ubica taxonómicamente en la familia §p-irillaceae y estásubdividido en tres especies: ~ fecalis, ~ fetus y C.Jp-utorum, con cinco subespe·cies (Cuadro 1). Unicamente las subespecies C. fetus intestinalis y ~ fetus j~~ sehan incriminado con infecciones en humanos. La primera se asocia con septicemiasy la segunda con diarreas y esporádicamente también con septicemias (16).

Posiblemente la primera infección en humanos causada por c..ww>ylQbacter fue des­crita en 1913 (6). Sübsecuentemente se informó de otros casos de septicemias cau·sadas por ese agente, que era conocido entonces como Vibrio fetus y el cuadro clí­nico que provocaba se denominó "vibriosis". Entre 1944 y 1967 se habían descrito20 casos de vibriosis, en los cuales el agente se había aislado en hemocultivos (8,2032 Y 33). No obstante, esta bacteria era más importante en medicina veterinaria queen humana, ya que causante de abortos y septicemias en bovinos (17). Sin em·bargo, el interés médico por este agente aumentó progresivamente a partir de 1972,cuando se informó por primera vez del aislamiento de esta bacteria a partir de he­ces provenientes de pacientes con diarrea (9). Actualmente el C,fetus ssp_~j~juni esuno de los principales agentes bacterianos causantes de diarrea (10).

Los primeros aislamientos fecales se hicieron inoculando los medios de cultivo confiltrados de heces, que se hacían a través de filtros Millipore con porosidad de 0,65um de diámetro, los cuales retenían gran parte de la flora fecal y permitían el pasodel Campylobacter, de manera que se eliminaban microorganismos que posiblemen·te inhibían su crecimiento por competición (9).

Posteriormente se simplificaron los métodos para el aislamiento de este agente,cuando se desarrollaron medios de cultivo selectivos a base de antibióticos, como eldescrito por Bützler (5) y el de Skirrow (26), los que permiten el aislamiento de labacteria directamente a partir de heces.

En este informe se describen los métodos bacteriológicos, medios de cultivo e im­plementos de laboratorio necesarios para el aislamiento e identificación del CAmp.Y.:.lobacter fetus ssp j~juni. El objetivo ha sido recopilar la información mínima nec\:·saria, para establecer la metodología de trabajo, tendiente a diagnosticar rutinaria·mente este agente.

AISLAMIENTO

MEDIOS DE CULTIVO:

la Organización Mundial de la Salud recomienda el medio de Bützler, como el másapropiado para el aislamiento del Campv.lobacter (36). Este medio tiene una base

* Unidad de Microscopía Electrónica, Universidad de Costa Rica. San José, CostaRica.

** Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera" San José, Costa Rica.

1

2 REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIl'lOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA

de tioglicolato y se le adiciona agar el 1,5 % , sangre de carnero o humana en un 5 a10 % , extracto de levadura en 1 % Y las siguientes cantidades de antibióticos porlitro: bacitracina 250 mg, novobiocina 5 mg. antidiona 50 mg, colicistina 10.000UI y cefoxitina 15 mg (36).

Unicamente el aislamiento primario de Campyloba~ requiere el empleo de me­dios selectivos, ya que posteriormente puede cultivarse en medios como agar sangreo tioglicolato.

Para el aislamiento primario las heces se inoculan directamente sobre el medio deBützler, esparciéndolas con asa bacteriológica para aislar colonias.

En el Laboratorio Clínico del Hospital Nacional de Niños (HNNl, uno de los auto­res (MLH) ha logrado buena recuperación del Campylobacter a partir de tubos contetrationato·iodo (15) siguiendo la metodolOQT'a empleada en el aislamiento deenterobacterias. Los tubos con tetrationato se inoculan con una torunda impreg­nada en heces y se incuban a 37 oC durante 24 horas. Luego se homogenizan y sesaca una asada que se raya en un plato de agar Bützler, tal como se hace con un<lmuestra de heces. Hasta el momento este método ha permitido el aislamiento del95,5 % de las cepas con respecto a la inoculación directa de las heces en Bützler,incluso en algunas ocasiones la bacteria sólo se aisló del tetrationato.

CONDICIONES DE CULTIVO:

El ~ fetus ssp j~juni es capaz de crecer a temperaturas entre 37 y 42 oC, sin em­bargo, la temperatura recomendada para su aislamiento es de 42 OC, ya que inhibe aotras bacterias y a la vez permite diferenciarla de ~ fetus intestinalis que sólo crecea 37°C (Cuadro 2) (16).

La atmósfera de incubación debe ser microaerofílica que contenga aproximada­mente 90-95 % de mezcla de nitrógeno - anhidrido carbónico y un 5 a 10 % de oxí­geno (7, 16, 18,27). Esta condición puede lograrse con un sobre generador tipo"Gas Pack" en una jarra de anaerobiosis sín catalizador. O bien, de una manera máseconómica empleando el sistema de evacuación y reemplazo, que consiste en ex·traer el aire de una jarra de anaerobiosis con válvula (tipo BBL 60465), medianteuna bomba de vacio, hasta alcanzar una presión de 8 torro Luego la atmósfera de lajarra se reemplaza por una mezcla de N 2- CO2 , hasta recuperar la presión normal.Esta mezcla de gases también se utiliza cuando la bacteria se inocula en tubos, talcomo se ilustra en la Figura 1 (16).

Cuando se requieren almacenar cepas de Campylobacter, éstas se inoculan en tuboscon tioglicolato-agar al 0,16 % en microaerobiosis, se incuban a 37 oC durante 24horas y luego se guardan a ·70 OC. Cuando se van a reutilizar se descongelan lenta·mente a temperatura ambiente y se rayan en platos de agar sangre para evaluar lapureza del cultivo.

MORFOLOGIA DE LA COLONIA:

Es posible distinguir dos tipos morfológicos de colonias de acuerdo con el grado dehumedad de los medios de cultivo (4). Así, en medios frescos (húmedos) las colo­nías son no hemolíticas, planas, con bordes irregulares, de color blanco grisáceo ysuperficie brillante, que se esparcen siguiendo las estrías del asa, llegando a hacerseconfluentes. Las colonias separadas semejan gotas de agua derramadas sobre lasuperficie del agar (Figura 2a).

Hernández, F. et al: AISLAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER 3

En medios secos, por ejemplo cuando se incuban a 37 OC durante 48 horas antes deinocularlos, las colonias son: no hemolíticas, convexas, con borde liso de colorblanco grisáceo y superficie brillante (Figura 2b).

Además, es posible encontrar tipos de colonias intermedios entre los descritos ante­riormente.

IDENTlFICACION:

El primer paso en la identificación de las posibles cepas de Campylobacter es latinción de Gram; sin embargo, esta bacteria no se tiñe bien con la safranina, por laque ésta se sustituye por fucsina fenicada. Con esta tinción se observan bacilospequeños, curvados en forma de C o de S, monotricos bipolares (Figura 3).

En segundo término se estudia la movilidad de la bacteria en gota pendiente, usandocaldo de tripticasa; este agente presenta un movimiento característico, muy rápidoen forma de dardo. También, en algunas ocasiones las bacterias pueden quedarancladas por uno de sus flagelos, presentando entonces un movimiento de rotaciónmuy rápido. Estas observaciones pueden hacerse al microscopio de campo claro,pero se facilitan cuando se emplea un microscopio de·contraste de fase o de campooscuro.

En tercer lugar, deben realizarse las pruebas de oxidasa y cata lasa, ya que las tresespecies son oxidasa positivas y con excepción de ~. 1P.utorum las otras son catalasapositivas.

La identificación de C. fetus. ssp jgjuni puede confirmarse por otras pruebas, por

ejemplo: no reduce nitratos, es capaz de crecer en soluciones tanto de glicina comode bilis al 1 %, pero no en NaCI al 3 % Y es H 2S negativo. Además, crece a tempe·raturas entre 35 y 42 oC, es sensible al ácido nalidíxico (30 ug/disco) y es resistentea la cefalotina (30 ug/disco). Estas pruebas sencillas permiten diferenciar el géneroCampylobacter hasta subespecie, como se resume en el Cuadro 2.

También es posible hacer un diagnóstico presuntivo, mediante un frotis de hecesteñido con Giensa o Gram, en el que se buscan bacterias morfológicamente similaresal Campylobacter, o bien, examinando las heces en un microscopio de campooscuro en busca de bacterias con movimiento característico en dardo. Se ha infor­mado que este diagnóstico presuntivo suele confirmarse con el cultivo en el 57% delos casos (22).

SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS y TRATAMIENTO

Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos pueden realizarse por el mé­todo de dilución en agar, como se describe a continuación: para la preparación delinóculo se cultiva la bacteria en tioglicolato con agar al 0,16 % Yse incuba a 37 Ocen microaerobiosis, durante 12 a 24 horas hasta lograr una turbidez semejante a ladel tubo No. 2 del nefelómetro de McFarland. De estos cultivos se hace una dilu­ción 1:100 en amortiguador de fosfatos el pH 7,4 Yse inoculan alícuotas de 50 ul enlos platos con las diluciones del antibiótico e incuban a 37 OC, durante 48 horas. Elmedio base para las diluciones del antibiótico es tioglicolato complementado conagar al 1,5 %, sangre humana al 10 %, extracto de levadura al 1 % (Figura 4).

Empleando esta metodología se encontró en el HNN que las condiciones mínimasinhibitorias para eritromicina y gentamicina eran de 1,6 ug/ml y para ampicilina1,2 ug/ml. A pesar de que un 10% de las cepas fueron resistentes a la eritromicina

4 REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAEN2 HERRERA

y ninguna a la gentamicina, el primer antibiótico se sigue recomendando como tra­tamiento de elección, en tanto la gentamicina, debido a su alta toxicidad se dejapara casos más graves, como por ejemplo las septicemias causadas por CampyJo­bacter.

El tratamiento que se recomienda en las diarreas por este agente es la rehidrata­ción vía oral y en los casos crónicos (evolución entre 2 y 3 semanasl se debe implan­tar una terapia antimicrobiana para erradicar la bacteria, ya que es posible la excre­ción prolongada de este agente, aún durante períodos mayores de un año (24). Sinembargo debe tenerse cuidado con el uso indiscriminado de antibióticos, pues ya seha demostrado la presencia de un plásmido en ~ylobacterque le brinda resis­tencia a la tetraciclina; aunque tal plásmido no pudo ser transmitido a cepas deEscherichia coli (29). debe tenerse presente la posibilidad de conjugación y trans­misión de plásmidos de resistencia múltiple (21).

MORFOlOGIA y UlTRAESTRUCTURA DEL CAMPYlOBACTER

Para proporcionar mayor información respecto a la morfología del ~pylobacterfetus ssp iID\!.!!1 se hizo un estudio al microscopio electrónico (14), que permitióobservar cuatro tipos morfológicos:

1) Formas esferoides o cocoides, que presentan un cráter o agujero central y unsolo flagelo.

11) Formas curvadas en e con un flagelo polar en cada extremo.,,1) Formas bi o tricurvadas monotricas bipolares.1V) Formas filamentosas multicurvadas, monotricas monopolares o bipolares de

hasta 8 um de largo (Figura 5),

Posiblemente las formas normales son los tipos 11 y 111. El tipo" (monocurvadas)posiblemente corresponde a células jóvenes de reciente división (Figura 6), en tantolas formas bi y tricurvadas serían células maduras. Por otra parte, las formas cocoi­des pueden corresponder a células en degeneración, ya que se observan con másfrecuencia en los cultivos viejos y las formas filamentosas pueden deberse a altera­ciones metabólicas, tal como se ha propuesto que podría ocurrir en Legionellap'neumop'hila (12), o bien, se deben a alteraciones inducidas por antibióticos betalactámicos. Así, cuando se cultiva el Campylobacter en presencia de ampicilinafrecw:mtemente se observan formas filamentosas, tal como se encontró en un estu­dio que se está realizando para evaluar las alteraciones morfológicas inducidas porantibióticos. En la Figura 7 se observa un Campylobacter cultivado en tioglicolatocon 30 ug/ml de ampicilina.

las formas bi y tricurvadas miden como promedio 1,9 .t 0,1 um de largo y su diá­metro promedio es de 0,49 ±. 0,1 um. los flagelos pueden medir hasta 15 um delargo y salen de sendos poros caliciformes localizados en los extremos de la bacteria.

la pared muestra una serie de surcos que le brindan un aspecto cerebriforme (Fi­gura 8a). Además, la bacteria presenta una microcápsula (Figura 8b) (14).

CUADRO ClINICO

En patología humana el Campylobacter se ha asociado fundamentalmente con laetiología de las diarreas, pero también se le ha incriminado con la causalidad desepticemias e infecciones perinatales.

DIARREA: Afecta principalmente a niños menores de dos años de edad, y su pre­valencia oscila entre un 5 y 14 '~;, (36).

~1ernández, F. et al: AISLAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER 5

El período de incubación es de 48 horas y entre los signos y síntomas destacan lafiebre mayor de 38 oC, diarreas, dolor periumbilical severo, vómitos, leucocitos conpresencia de bandas y puede presentarse deshidratación en más del 50 % de loscasos. Las heces son acuosas con moco y en ocasiones pueden ser sanguinolentascon leucocitos (2, 17, 23) y el número de deposiciones diario puede ser hasta de20 (34).

SEPTICEMIA: Afecta principalmente a adultos y la subespecie involucrada másfrecuentemente es C. fetus intestinalis. El cuadro es poco frecuente y está asociadocon enfermedades crónicas como diabetes, cirrosis, cuadros cardiopulmonares yneoplasia, o bien con tratamientos inmunosupresores.

Clínicamente el cuadro es pleomórfico presentando: fiebre, escalofríos, sudoraciónespecialmente nocturna, vómitos, dolor abdominal y también puede presentarsehepatosplenomegalia, ictericia y diarrea (17).

Cuando la septicemia afecta a madres en el período de embarazo puede ocurrir unainfección perinatal, cuya letalidad es de cerca del 80 'X,. Clínicamente hay fiebre,tos, vómitos, dificultad respiratoria, cianosis e ictericia (17,30).

EPIDEMIOLOGIA

El Campylobacter fetus ssp j~uni es un agente distribuido ampliamente, descritocomo una importante causa de diarrea tanto en países desarrollados como en desa­rrollo, el cual se aisla también de otros mamíferos aparte del hombre (28) y de avesque conviven con éste (11, 31) por lo tanto la infección se da como una zoonosis.Sin embargo, es posible que uno de los principales mecanismos de transmisión seala contaminación fecal entre humanos (2, 3).

Se ha informado que la prevalencia de este agente en casos de diarrea oscila entre un5 y 14 %; no obstante, en un estudio realizado en el HNN (25) se encontró que enalgunos meses este agente se aislaba del 25 % de los casos, presentando una curva deprevalencia ascendente, cuyo máximo valor se presenta a finales del año_ En estu­dios realizados anteriormente, se había observado este incremento de diarreas haciafinal del año y se había encontrado que los agentes etiológicos más importantes enesas diarreas eran los rotavirus (13, 19); estos datos nos indican que en esos casos definal de año hay involucrados por lo menos dos agentes importantes: rotavirus yCampylQbactel'c

Por otra parte, al comparar la etiología bacteriana de las diarreas entre enero y juliode 1983, se observó que el principal agente era ~. fetus ssp j~1l!!.L aislándose gene·ralmente en mayor proporción que Shigella y Salmonella (25).

Estos datos, junto con los de etiología de diarrea en niños no hospitalizados del árearural (35), colocan al c.. fetus ssp ~juni como uno de los principales agentes bacte­rianos causantes de diarrea.

CONCLUSION

Este informe resume los principales métodos de aislamiento y diagnóstico del Cam­I!}'lobacter fetus ssp ~juni. A pesar de que a primera vista la metodología parece untanto compleja, es relativamente simple.

Los equipos e implementos necesarios para su aislamiento en resumen son:

a) Incubadora a 42°C.

6 REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NII'lOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA

b) Jarra de anaerobíosis tipo Gas Pack con válvula (incluso a las jarras corrientespuede adaptársele una válvula tal como se hizo en el HNNl.

e) Una bomba de vacío, que puede sustituirse por una trampa de agua.

d) Cilindro de N z y COz

e) Medios de cultivo: cuya base es tioglicolato, adicionado de agar, sangre huma·na, extracto de levadura y antibióticos.

Por lo tanto, es factible montar esta metodología en cualquier laboratorio el ínicodonde se trabaje en bacteriología.

El aislamiento e identificación del Campylobacter a partir de casos de diarrea es im­portante, tanto desde el punto de vista epidemiológico, como clínico. La importan·cia radica en el esquema de tratamiento, que incluye además de la rehidratación,antibióticoterapia, al menos en los casos que evolucionan crónicamente. Epidemio­lógicamente, el diagnóstico es importante, ya que se ha propuesto que algunos pa·cientes pueden continuar excretando la bacteria intermitentemente durante pe·ríodos mayores de un año, con lo cual se convierten en reservarías.

CUADRO 1

CLASIFICACION DEL GENERO CAMPYLOBACTER (*)

Familia

Género

Especies y subespecies

Spirillaceae

Carnpy!obacter

C. fetus ssp fetus

C. fetus ssp intestinalis (**)

C. fetus ssp jejUnJ t* 1<)

C. sputorurn ssp sputorum_

C. sputorum ssp bubulus

C. sputorum sSIl mucosal!s

C. recalis

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(*) Modificación de Kaplan, R. L. 1980. (16)

(**) Involucrado con patología en humanos.

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8 REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA

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FIGURA 1. Sistema de eV(jcuación y reemplazo necesario para lograr ulla atmósfer" microaerofílica en Jarras para al1i:lerobiosis y aplicación de este sistema paracambiar la atmósfera a las dp, tubos de cultivo, paso que es fundamental piJra lograr'un buen crecimiento de Campylobacter, aún en caldo de tlogliealido, El esquernadel dispositivo para conectar los cilindros de gas, la bomba de vacío y la J"t'Ui, fUI:'

construido según indican Afien V Siders (1),

Hernández, F. et al: AISLAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER 9

FIGURA 2: Morfología dé las colonias de Campylobacter en agar de BützlerA. en medio fresco (húmedo) B. en medio seco (incubado a 37 oC durante 48horas antes de inocular la bacteria).

10 REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA

FIGURA 3: Tinción de Gram de un frotis de Campylobacter obtenido de un cul­tivo en agar de Bützler. La safranina fue sustituida por fucsina. Obsérvese la formacurvada característica de esta bacteria.

Hernandez, F. el al: AISLAMIENTO y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER 11

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FIGURA 4: Diagrama de la metodología empleada para estudiar la sensibilidad alos antibióticos por el método de dilución en agar, aplicada al estudio de Campylo­bacter.

12 REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE N I 1'1 OS DR. CARLOS SAENZ HERRERA.

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14 REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA

FIGURA 6: A. Réplica de platino de un Campylobacter en división, obsérvese elestrechamiento de la célula en el sitio de división que originaría dos células hijascurvadas en C (tipo morfológico 11). En la figura B, se observa otro Campylobacteren división, pero en una preparación teñida con ácido fosfotúngstico (tinción nega­tiva). Barra = 1 um.

Hernández, F. el al: AISLAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE CAMPYLOBACTER 15

FIGURA 7: Microfotografía electrónica de una preparación de Campylobacterteñida con ácido fosfotúngstico (tinción negativa). Se observa una forma alargada,semejante al tipo morfológico IV; éstas son las formas que predominan cuando labacteria se inocula en tioQlicolato con 30 u!l/ml de amoicilina. E' arra = 1 um.

16 REVISTA MEDICA HOSPITAL NACIONAL DE NIÑOS DR. CARLOS SAENZ HERRERA

bFIGURA 8: A. Microfotografía electrónica de transmisión del extremo de unCampyJ.Qbacter en el que se aprecia el poro polar del cual sale el flagelo. Además,se observa el aspecto ccrebri forme de la pared bacteriana. Barra = 0.25 um.B. Mi::rofotografía electrónica de transmisión de '.In Campylobacter teñido conácido fosfotúngstico (tinc;ón negativa). Se observa la microcápslJfa que envuelvp. elcuerpo de la bacteria (flecha\. Barra = 1 um.

Hernández, F. et al: AISLAMIENTO V DIAGNOSTICO OE CAMPVLOBACTER

RESUMEN

17

Se describen los métodos bacteriológicos, medios de cultivo e implementos de labo­ratorio necesarios para el aislamiento, identificación y estudio de sensibilidad a losantibióticos del Campylobacter fetus ssp jgj\!!!i. Además, se hace una sinopsis histó­rica respecto al conocimiento de la patología en humanos causada por esta bacteria,que recientemente se está considerando como uno de los principales agentes causan­tes de diarrea. Etiológicamente esta bacteria resultó tan importante o más, queShig~ y Salmonella en casos de diarrea en niños menores de dos años de edad,atendidos en el Hospital Nacional de Niños entre enero y julio en 1983.

SUMMARY

We described the bacteriological methods, culture medium and laboratory imple­ments for isolation, identification and antibiotic sensibility tests ofCamp'y'lobacterfetus ssp j~uni. We also reviewed the historic sinopsis about the knowledge ofCampylobacter in human pathology. Recently this bacteria has been considered asan important etiologic agent of children's diarrhea, as much as Shigella and Salmo­nella in hospitalized cases studied at the National Children.s Hospital, Costa Rica,from Janllary and JlIly, 1983.

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