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ACTUALIZACION TOMA DE MUESTRAS VIROLOGICAS

Abril 2014

MV. Judith Mora R.

Jefe Subdepto.Enfermedades ViralesISP

METODOS DE DIAGNOSTICO VIRALA. DETECCION DE VIRUS

•Aislamiento viral en cultivos celulares. •Inoculación en animales de laboratorio•Inoculación en huevos embrionados

B. DETECCIÓN INDIRECTA O PRODUCTOS VIRALES.•Inmunofluorescencia (IFD).•Inmunoensayo enzimático (ELISA)

C. DETERMINACION DE ANTICUERPOS Métodos serológicos (sueros pareados o muestra única)

•ELISA (IgM –IgG) •Inmunofluorescencia (IFI).

D. DETECCION DE MATERIAL GENETICO VIRAL• Reacción de polimerasa en cadena (PCR)

CONSIDERACIONES PARA TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO VIROLOGICO

• PERIODO OPTIMO DE RECOLECCION– Ej: Aislamiento viral en fase aguda

• TIPO DE MUESTRA– Ej: Sangre c/EDTA

• SITIO DE OBTENCION

– Ej: Deposición • TECNICA DE OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

– ANF vs Tórula faríngea• RECOLECCION DE LAS MUESTRAS

– Envase estéril, cierre hermético, etc• TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

– Temperatura, medio transporte, etc

Incluir formularios de datos relativos a la muestra

identificar al remitente y al destinatario.

1º

2º: protege el embalaje/envase secundario de los daños físicos durante el transporte.

3º

Tº

Organigrama Subdepartamento Enfermedades Virales

R.R.H.H:

Profesionales 26

Técnicos, Auxiliares, Administrativos 24

Total 50

32.000 muestras Exámenes por Algoritmos Diagnósticos

Laboratorio Nacional de Referencia y cumple acciones de vigilancia establecidas en el Reglamento sobre Notificación de Enf. Transmisibles de Declaración Obligatoria .

Virus Entéricos• Vigilancia PFA

Apoyo a erradicación del virus PolioÚltimo caso en América 1991 (Perú)

• Meningitis Viral

Estudio brotes

Diarreas agudas con diferentes etiologías:

• Vigilancia Rotavirus

Hospitales centinelas (V, VIII, RM) MINSAL-OPS

• Vigilancia Gastroenteritis virales (Norovirus, ADV, Astrovirus, Rotavirus):

– Centinelas ambulatorios– Estudio Brotes

Nombre exámen / Prestación

Método Tipo de muestra Requisitos previosVolumen de muestra

Transporte y conservación

Plazo de respuesta en días hábiles

Aislamiento de Enterovirus

Aislamiento en cultivos celulares

Deposición: envase estéril, tapa rosca. sin medio de transporteLCR: envase estéril, tapa rosca.Liq.pericárdico:envase estéril tapa rosca

0-5 días de evolución

Deposición: 1 cuch. de téLCR o LíqPericard: 1 ml ped2 ml adulto

Congelar (-18º a -20ºC) o refrigerar (2º a 8ºC) con envioinmediato

15

Vigilancia Poliovirus(sospechosos PFA)


Deposición sin medio de transporte en envase estéril tapa rosca

0-14 días de evolución

10 grs. (1 cuch. de té)

Congelar (-18º a -20ºC) y enviar en frío 2º a 8ºC. .

15

Vigilancia de Virus Gastroentericos: Adenovirus entéricos, Astrovirus, Norovirus y otros

Inmunoquímica y RT-PCR

* Deposición sin medio de transporte en envase esteril tapa rosca .**5 a 10 muestras por Brotetificado)

* 0-3 días de evolución en niños menores 5 años :Centinelas ambulatorios

10 grs. (1 cuch. de té)


21

Vigilancia Rotavirus (Centros Centinelas)

Técnicas Serológicas Inmunoenzimáticasytipificación

Deposición sin medio de transporte, envase esteril tapa rosca

0-5 días de evolución en niños, hasta 5 años de edad, hospitalizados

10 grms. (1 cuch. de té)


21

• Vigilancia Virus Respiratorios : ADV, VRS, PI , Metapneumovirus) e Influenza A y B– IRAG complicación frecuente de la

Influenza– Red Lab. Hosp. Centinelas IFI– Red Lab. Regionales PCR – Centro Nacional Influenza para OMS

Aislamientos Recepción hasta 12:00 hrs por tipo procesamiento

Virus Respiratorios

Nombre exámen / Prestación Método Tipo de muestra Requisitos previosVolumen de muestra



Aislamiento de Influenza A y B


a) Gargarismo b) Aspirado ANF c) Tórula con secreción NF d) Biopsia tejidos

Máximo 3 días de evolución

Medio transporte viral Hanks´s0,5% gelatina+antibiótico en frío c/refrigerantes T° 2 – 8 C

15

Aislamiento Virus Respiratorio Sincicial , Adenovirus, Parainfluenza


a) ANF b) Tórulasecreción NF

c) Biopsia tejidosd )ADV: Tórula

secreciónconjuntival

Hasta 5 días de evolución

Medio transporte viral Hanks´s0,5% gelatina +antibiótico en frío c/refrigerantes T° 2 – 8 C

15

InmunofluorescenciaIndirecta para Virus Influenza A, B

Inmunofluorescencia

Frotis fijado Aspirado NF

Hasta 3 días de evolución Otros VR :Hasta 5 días de evolución

En frío con refrigerantes. T° 2-8°C

3

PCR para Influenza A, B PCR

Aspirado nasofaríngeo o tórula secreción nasofaríngea o biopsia pulmón

Hasta 3 días desde inicio de los síntomas

Medio transporte viral Hanks´s0,5% gelatina c/antibiótico c/refrigerantes T° 2 - 8 C

5

• Vigilancia Integrada Sarampión-Rubéola:• Pacientes con exantema macular que puede ser

acompañado de fiebre, conjuntivitis, artralgia, linfoadenopatías , etc

• SRC malformaciones congénitas (1er trimestre embarazo)

Recomendaciones:– Muestra para aislamiento ideal Aspirado– En su defecto, orina: mínimo 50 ml, enviar siempre junto a la muestra de suero.

• Otras: CMV, Herpes

Virus Exantemáticos


Método Tipo de muestraRequisitos previos

Volumen de muestra pediátrica

Volumen de muestra adulto


Plazo de

respuesta en días hábile

s

Vigilancia Sarampión Rubeola

ELISA, IF, aislamiento, RT-PCR (según algoritmo ISP)

Suero extraído en forma estéril enviar en tubo estéril tapa rosca. En casos seleccionados ANF(Orina asolicitud)

Enviar muestras conformulario de vigilancia con la totalidad de los antecedentes solicitados

1 ml suero. ANF en medio de transporte viral o 50 ml orina

2 ml suero. ANF en medio de transporte viral o 50 ml orina

Aspirado con medio de transporte viral Hanks´s con 0,5% gelatina mas antibiótico. Enviar con unidades refrigerantes Tº 2-8ºC.

4

Estudio Inmunidad Sarampión

Inmunofluorescencia(IF) (IgG)

Suero extraído en forma estéril enviar en tubo estéril tapa rosca

No tiene 1 ml 2 mlEn frío Tº 2-8ºC. Con unidades refrigerantes

5

Vigilancia Síndrome Rubeola Congénita .

ELISA IgM(algoritmo ISP)

Suero en tubo estéril tapa rosca .

Recién nacidos < 1 año

1 ml de suero

En frío Tº 2-8ºC. Enviar con unidades refrigerantes

10

Serología IgG RubéolaELISA IgGSuero, en tubo estéril tapa rosca .

1 ml de suero 3 ml suero


10


Método Tipo de muestraRequisitos previos




Plazo de

respuesta en días hábile

s

Serología IgGCITOMEGALOVIRUS ELISA

Suero en tubo estéril tapa rosca .

Estudio transplante

1 ml de suero 3 ml suero

En frío Tº 2-8ºC.Enviar con unidades refrigerantes

10

Serología IgMCitomegalovirus ELISA

suero, en tubo estéril tapa rosca.

IgM recién nacidos < 3 meses con Síndrome de TORCH

1 ml de suero


10

Aislamiento de Citomegalovirus


Orina,Recolecciòn: segundo chorro. Envase estéril, tapa hermética

24 horas de evolución 3 ml 3 ml

Refrigerar sin medio de transporte viral

21

Aislamiento Herpes Simplex


a) LCR en tubo estéril tapa rosca o de goma b) Contenido vesicular (Líquido de lesión) c) TórulaSecreción Vaginal

De 0- 2 días LCR: 1 ml LCR: 1 ml

Con medio de transporte viral Hanks´s con 0,5% gelatina mas antibiótico. Enviar con refrigerantes T°2 – 8 C

7

Aislamiento de Virus Varicela Zoster


Tórula de lesión vesicular Hasta 3 días


15

SIDA • Enfermedad causada por VIH:

Confirmación de muestras reactivas al tamizaje en el paísVerificar clave en CI

• Diagnostico SIDA pediátrico (< 2 años)Recepción lu a Ju por tipo

procesamiento

• Estudios Genotipificación, FRVIH

http://formularios.ispch.cl

NOMBRE DE LA PRESTACIÓN

ENSAYOS TIPO DE MUESTRA REQUISITOS

PREVIOSVOLUMEN MUESTRA

CRITERIO DE ACEPTACION, ALMACENAMIENTO-TRANSPORTE

PLAZO DE RESPUESTA (DIAS HABILES)

DOCUMENTO REQUERIDO

VIH ADULTO CONFIRMACION

Determinación de Ag HIVAc IgG anti HIV

Ácidos nucleicos:provirus y RNA de HIV

* Suero o plasma (Técnicas serológicas)* Sangre con anticoagulante EDTA (téc. moleculares)

Muestra doblementereactiva al tamizaje de VIH

Técnicas serológicas: 1 mlTécnicas moleculares: 4 ml

Suero o plasma: En frío Tº 2 - 8ºC. Enviar con unidades refrigerantes.

Sangre con anticoagulante: Temperatura ambiente (15-25 ºC) no más de 48 hrs desde la extracción.

12 días, 90,6% año

2013)

Formulario de envío de muestra para Confirmación de VIH

VIH PEDIATRICO CONFIRMACION

Detección de Antígeno-anticuerpo virus VIH, Ag P24, virus VIH (PCR , RNA)

Sangre con anticoagulante EDTA

En > 2 años asolicitud. En <2 años, hijos de madres VIH (+), protocolo diagnóstico de sida pediátrico (Resolución Minsal).

4 ml

Temperatura ambiente (15-25 ºC) no más de 48 horas desde la extracción.

14

Formulario de envío de muestra para Confirmación de VIH pediátrico

Virus HepáticosDetección hepatitis virales: HBsAg, VHC:Hepatitis que pueden evolucionar a cronicidad, cirrosis y carcinoma hepático.Confirmación Muestras reactivas al tamizaje

http://formularios.ispch.cl/Externo/FormularioExterno.aspx

Estudio de brotes Hepatitis A:(3 a 5 casos).Hepatitis de transmisión entérica, no desarrollan infección crónica.


Método Tipo de muestra Requisitos previos





Confirmación Antígeno de Superficie Hepatitis B

ELISA, neutralización (según algoritmo ISP)

Suero en tubo estéril tapa rosca o de goma

Muestra con tamizajedoblemente reactivo a HBsAg

1 ml 3 ml


15

Confirmación de Virus Hepatitis C

ELISA, RT-PCR, Inmunoblot(según Algoritmo)

Plasma con anticoagulante (EDTA) o Sangre con EDTA (enviar dentro de 24 hrs. ). En tubo estéril tapa rosca o de goma

Muestra Doblemente reactiva a Ac-VHC.

3 ml de sangre (EDTA) y 1 ml de plasma

5 ml sangre (EDTA) y 3 ml plasma

En frío Tº 2-8ºC. Enviar con unidades refrigerantes. Sangre no más de 24 hrs. desde la extracción hasta la recepción en el laboratorio

15

Vigilanciabrotes de Hepatitis A

ELISA (IgM) Suero en tubo estéril tapa rosca .

0-10 días desde inicio los síntomas

1 ml de suero

3 ml suero


7

Virus Enf. Emergentes :� Hantavirus

Enf. Febril que puede producir SCPH compromiso respiratorio y evolucionar a shock y muerte. Transmitido por O. longicaudatus(*) Recepción 24 horas

• Virus Dengue : Enf febril aguda con cefalea, mialgias, erupción , etc transmitida por Aedes aegyptiVigilancia y casos importados

• Virus Nilo Occidental Enf febril con manifestaciones neurológicas como cefalea a encefalitis. El vector mosquitos (Culex pipiens), se mantiene en la naturaleza mediante un ciclo de transmisión mosquito-ave-mosquito


Método Tipo de muestra Requisitos previos




Plazo respuesta dshábiles

Vigilancia Infección por Hantavirus

ELISA, RT-PCR (según algoritmo del ISP)

a)Sangre con EDTA (tubo tapa lila) y Sangre sin anticoagulante (tubo tapa roja)

b)Tejido de pulmón en tubo estéril tapa rosca, sin presevantes.(punción cardiaca)

Caso sospechoso

3 ml de sangre

5 ml sangre

En frío Tº 2 -8ºC. Enviar con unidades refrigerantes

3

Vigilancia Dengue / Fiebre Amarilla

* ELISA *Aislamiento/ PCR(según algoritmo del ISP)

Suero extraído en forma estéril. En tubo estéril tapa rosca .

Con 6 o más días de evolución.

IdentificaciònBrote muestra dentro de los 3 primeros días de evolución

2 ml 3 mlEn frío con refrigerantes. T° 2 -8°C

10

Vigilancia Virus del Nilo Occidental

Técnicas Serológicas ELISA

LCR y Suero en tubo estéril tapa rosca .

> a 8 días de evolución.

1 ml suero y 1 ml de LCR

3 ml suero y 2 ml de LCR

En frío de 2 -8 ºC con unidades refrigerantes

10

• Vigilancia HTLV I/II (Viruslinfotrópico de células T humano) Confirmar muestras reactivas tamizaje país y casos sospecha de Leucemia Linfotrópica y ParaparesiaEspástica

http://formularios.ispch.cl/Externo/FormularioExterno.aspx• Diagnóstico y estudios Virus

Papiloma Humano :El VPH puede causar verrugas genitales y ciertos cánceres (CaCu).

• Estudio brotes Parotiditis : infección aguda con aumento volumen glándula parótida.

CELLULARRECEPTOR

gp46

95

kd

p14

HTLV-I

Tax (p40), Rex (p27,p21)

HTLV-I

Virus Oncogénicos, otros


MétodoTipo de muestra

Requisitos previos




Plazo de

respuesta en días hábiles

Confirmación HTLV I/II

ELISA , IF, PCR (según algoritmo)

Sangre con anticoagulante (EDTA o citrato)

Muestra Doblemente reactiva y casos de sospecha de Leucemia Linfotrópica y ParaparesiaEspástica

3ml 5 ml

En frío Tº 2-8ºC. Enviar con unidades refrigerantes. No más de 4 ds. desde extracción a la recepción en laboratorio

15

Estudio de Brotes de Parotiditis

Serología, PCR

Suero o plasma y Orina en tubo estéril

Sólo estudio de brote según circular MINSAL

1 ml suero y 3 ml de orina

3 ml suero y 3 ml de orina

En frío de 2 a 8 ºC con unidades refrigerantes. No más de 4 ds. desde extracción a la recepción en laboratorio

7

Virus Papiloma Humano (VPH) PCR

Tórula de lesión o raspado de zona sospechosa de infección genital / Biopsias de tejidos / condiloma ; tubo estéril tapa rosca con medio de transporte.

En frío de 2 a 8 ºC con unidades refrigerantes. No más de 4 ds. desde extracción a la recepción en laboratorio

10

RABIA• Sd neurológico agudo

(encefalitis ) que progresa a coma , insuficiencia respiratoria y muerte. Pacientes con antecedentes contacto con animal sospechoso.

•Estudio de inmunidad en mascotas .

•Vigilancia virus Rábico:

Animales sospechosos: murciélagos, perros, gatos

(*) Recepción 24 horas

•Caracterización antigénica para determinar variantes virales circulantes

Recomendaciones:Cumplir normas de transporte, bioseguridad

• Diagnóstico de Rabia en humanos

NOMBRE DE LA PRESTACIÓN

TIPO DE MUESTRA REQUISITOS PREVIOS

VOLUMEN MUESTRA ADULTO PEDIATRICO

ALMACENAMIENTOTRANSPORTE

PLAZO DE RESPUESTA (DIAS HABILES)

DESCRIPCION DE PRESTACION

INMUNIDAD PARA RABIA ESTUDIO

Sangre s/anticoagulante, o suero en un tubo plástico estéril con tapa rosca o tapón de goma.En caso de sospecha de rabia humana (*)

30 días después de la vacunación antirrábica.

2 ml de sangre o 1 ml suero

<8ºC. Enviar con unidades refrigerantes.

12

Detección de Acantirrábicos neutralizantes por la tecnica de inhibición de focos fluorescentes (RIFFT)

VIRUS RABICO VIGILANCIA

Animal

En caso de sospecha de rabia humana (*)

Sospecha de rabia.

No Aplica

<8ºC. Enviar con unidades refrigerantes.

5

Detección de Ag rábico por la técnica de inmunofluorescencia directa

* Ver siguiente tabla

Muestras para diagnóstico en caso sospecha de encefalitis rábica en humanos

Muestras antemortem (anticuerpos, antígeno y ácidos nucleícos)

Muestras postmorten (antígeno y ácidos nucleícos)

Biopsia: cerebro: Corteza cerebral, Cuerpo calloso, Cerebelo, Médula espinal

Muestra Condiciones de envío Técnica Detección Frecuenc ia

Suero (3 ml) 4ºC /-20ºC RIFFT Anticuerpos

2 veces por semana

LCR 4ºC /-20ºC RIFFT Anticuerpos2 veces por semana

(1 a 2 ml) RT-PCR Nested Ácidos nucleicos

Saliva (1-2ml) Congelada-20ºC RT-PCR Nested Ácidos nucleicos D iariamente

Biopsia nuca, Folículo piloso Congelada-20ºC

IFD

RT-PCR Nested

Antígeno

Ácidos nucleicos2 veces por semana

Factores a revisar:• Demora en envío de las muestras desde laboratorio• Cumplir indicaciones de envío (BS, envase, Tº).

Muestras sin refrigerantes recibidas fuera de rango Tº indicado causal de rechazo

• Identificación correcta del paciente • Formulario indicado y vigente• Completar antecedentes del formulario:

– Fecha obtención muestra – Inicio síntomas (ds evolución)– Resultados exámenes solicitados (Ej. Absorbancias)– Vacunas (Ej: Polio) – Correo @ de responsable envío– Etc.

• Diferencias entre el código del tubo y del antecedente. • Volumen de muestra solicitado • Estafeta Acreditado: El retiro de resultado no siempre

es periódico

Gracias

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