La Biotecnología y su Aplicación en la Agricultura

MÓDULO III: EL SUELO Y SUS MICROORGANISMOS

COORDINADOR: DR. VÍCTOR OLALDE 3.3. LOS MICROORGANISMOS EN LA FERTILIDAD DEL SUELO María del Rosario Ramírez Flores 3.3.1. Hongos micorrízicos

Los hongos micorrízicos se asocian a las raíces de la mayoría de las plantas, produciendo lo que denominamos micorriza. El Término micorriza se deriva de los vocablos griegos mykes que significa “hongo” y rhiza “raíz”. Existen diferentes tipos de micorrizas, sin embargo dos son las de mayor distribución en el mundo; ectomicorrizas y endomicorrizas. Micorrizas Arbusculares Las plantas terrestres son capaces de formar diferentes tipos de simbiosis con los microorganismos de suelo. Estas simbiosis pueden contribuir significativamente en la sustentabilidad natural y agrícola de los ecosistemas. Entre éstas, las Micorrizas Arbusculares (MA) son una de las simbiosis más antiguas, se tiene evidencia que las MA existen hace 400 millones de años, además se sugiere que las MA asistieron a las plantas para colonizar la parte terrestre del planeta (Schübleret al., 2001). Aproximadamente el 70-90% de las plantas terrestres incluyendo también cultivares importantes a nivel mundial tales como: Zea mays (maíz), Oryza sativa (arroz), Triticumspp (trigo) y Sorghum bicolor (sorgo), son capaces de formar esta asociación simbiótica con hongos pertenecientes al filo Glomeromycota, en el cual se presenta alta diversidad genética y funcional entre aproximadamente las 150 especies de hongos de este filo (Smith y Read, 1997; Parniske, 2008). Los hongos son simbiontes biótrofos u obligados, es decir, son capaces de germinar sin la presencia del simbionte, sin embargo necesitan del hospedero

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para completar su ciclo de vida (figura 3). En esta asociación el hongo mejora el desarrollo de la planta con la adquisición de nutrientes, principalmente fósforo y nitrógeno, además ayuda a la planta bajo condiciones de diferentes estreses abióticos (sequía, salinidad y concentraciones altas de metales pesados) y bióticos (protección contra patógenos). Por su parte, la planta brinda carbohidratos y protección al hongo. Cabe mencionar que el mayor beneficio de la simbiosis de da cuando existe una baja disponibilidad de nutrientes (Smith y Read, 1997).El transporte de nutrientes se lleva a cabo a través de estructuras simbióticas localizadas dentro de la raíz de la planta llamadas arbúsculos.

Figura 3. Ciclo de vida de hongos micorrízicos

Inicia con la germinación de las esporas donde se ven involucradas moléculas de señalización, después el hongo forma los apresorios. Ya establecida la colonización se desarrollan las estructuras llamadas arbúsculos. Además también se extienden las hifas extraradiculares, donde se producen nuevamente las esporas que son liberadas al suelo (modificado de Bücking, 2012).

Las esporas de los hongos se encuentran en el suelo, pueden germinar espontáneamente y vivir pocos días de sus reservas de lípidos antes de encontrar

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a su hospedero. Ante la ausencia de una raíz hospedera y ante la falta de señales por parte de la planta, las hifas se retraen (Schmitz y Harrison, 2014). Los exudados de la raíz de las plantas están involucrados en la vía de señalización en la fase presimbiótica del desarrollo de MA, éstos incluyen a las estringolactonas. Sin embargo estas hormonas endógenas se identificaron por primera vez como responsables de la inducción de la germinación de plantas parásitas Estriga (Akiyamaet al., 2005). Con los descubrimientos más recientes se sugirió la participación de estas moléculas en la señalización de la simbiosis. Por su parte, el hongo también produce moléculas que intervienen en la señalización. A dichas moléculas se les caracterizaron y se les llamaron factores de hongos son los lipoquitooligosacáridos y son muy similares a las que liberan bacterias fijadoras de nitrógeno del género Rhizobium en el proceso de nodulación denominados factores Nod (Schmitz y Harrison, 2014). Después de que se desarrollan las hifas, el hongo forma una estructura llamada apresorio, se adhiere en la epidermis de la raíz y es el primer contacto célula a célula entre simbiontes. En las células de las plantas, se forma el aparato de prepenetración (APP). El APP es citoplasma que contiene microtúbulos y microfilamentos, que se alinean con el retículo endoplásmatico, formando un tubo hueco que guía la hifa a través de las células hasta llegar al córtex. Es ahí donde se forman estructuras llamadas arbúsculos, por los cuales se da el intercambio de nutrientes entre el hongo y la planta y hasta este punto se puede decir que la simbiosis está bien establecida (Figura 4) (Harrison, 2005; Paszkowski, 2006).

Figura 4. Desarrollo de las MA Inicia con la germinación de la espora y un intercambio de señales entre el hongo (factores de hongo) y la planta (estrigolactona). El apresorio se coloca en la epidermis de la raíz, donde posteriormente se forma el aparato de prepenetración que guía a la hifa. Una vez que la hifa llega a las células del córtex se forman los arbúsculos (modificado de Parniske, 2008).

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Las hifas de los hongos se extienden extraradicalmente explorando un volumen de suelo mucho mayor, que el que lo harían las plantas con sus raíces. Hay que destacar la gran importancia de las micorrizas como auxiliares eficaces de las especies forestales, agrícolas y ornamentales. Por un lado, las micorrizas mejoran las condiciones nutricionales de las plantas con el correspondiente aumento de crecimiento; y por otro la planta adquiere defensas físicas y químicas que la protegen de la acción de los agentes patógenos. En referencia a los aspectos nutricionales, los árboles micorrizados absorben mayor cantidad de N, P, K, Na, Zn, Cu y agua. Estos incrementos son consecuencia de:

a) Aumento del área del suelo en contacto físico con la micorriza (raíz e hifas).

b) Aumento de la movilidad, a través de las hifas del hongo, de los minerales del suelo en las regiones próximas a la raíz.

c) Incremento de la actividad biológica de la rizósfera, acelerando los procesos de mineralización y reciclaje de nutrientes.

En cuanto a los agentes patógenos:

a) Barrera física en las raíces del árbol: el manto de hifas cubre el meristemo radicular y cortex dificultando mucho la penetración de agentes patógenos.

b) Producción de antibióticos por la micorriza.

c) Producción de inhibidores por parte de la planta: se estimula la resistencia química, impidiendo la germinación de zoosporas de Phytophtora cinnamoni y de otros patógenos.

d) Reducen la incidencia de nematodos.

e) Mayor resistencia a la acidez y a la sequía.

f) Aminora la toxicidad de ciertos metales como Al, Cu o Zn. En recientes investigaciones hemos demostrado que la calidad de los frutos y la sobrevivencia de las plantas se incrementa significativamente. En caso de papa se puede reducir la aplicación de fósforo, se incrementa el grosor de la pared de los tubérculos, incrementa los tubérculos de primera, y ayuda a controlar el ataque de patógenos de raíz.

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Literatura citada

Akiyama, K., Matsuzaki, K., & Hayashi, H. (2005). Plant sesquiterpenes induce hyphal branching in arbuscularmycorrhizal fungi. Nature, 435(7043), 824-827.

Bücking, H., Liepold, E., &Ambilwade, P. (2012). The role of the Mycorrhizal Symbiosis in nutrient uptake of plants and the regulatory mechanisms underlying these transport processes. In Plant Science: InTech.

Harrison, M. J. (2005). Signaling in the ArbuscularMycorrhizal Symbiosis. Annu. Rev. Microbiol., 59, 19-42.

Parniske, M. (2008). Arbuscularmycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nat Rev Microbiol, 6(10), 763-775.

Paszkowski, U. (2006). A journey through signaling in arbuscularmycorrhizal symbioses.New Phytol, 172(1), 35-46.

Schmitz, A. M., & Harrison, M. J. (2014). Signaling events during initiation of arbuscularmycorrhizal symbiosis. J Integr Plant Biol, 56(3), 250-261.

Schübler, A., Schwarzott, D., & Walker, C. (2001). A new fungal phylum, the Glomeromycota: phylogeny and evolution. Mycol. Res., 105(12), 1413-1421.

Smith, S., & Read, D. (2008). Mycorrhizal Symbiosis (Third ed.). London: Academic Press.

3.3.2. Bacterias promotoras de crecimiento de plantas (PGPRs) Víctor Olalde Portugal Naieli Herrera De manera general, las características de las PGPR son las siguientes:

a) No requieren de la invasión interna de tejidos de plantas ni de la formación de estructuras especializadas.

b) Un segundo criterio para considerar a una rizobacteria como PGPR, es que ésta tenga la capacidad de persistir en el suelo después de su inoculación, ya que una población que disminuye rápidamente en la rizósfera tiene una baja capacidad competitiva con la microflora nativa del suelo.

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c) Quizá, la característica más importante considerada en la literatura, es que este tipo de bacterias presenten una capacidad de colonización efectiva en la superficie de la raíz para tener un efecto significativo sobre el crecimiento de la planta (Smith y Goodman, 1999; Yoram, 1999).

Mecanismos de acción de las PGPR. Conceptualmente y de acuerdo a Kloepper y col. (1989), las bacterias promotoras del crecimiento pueden tener un impacto favorable sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas por dos vías diferentes: indirectas y directas (Bloemberg y Lugternberg, 2001). Promoción directa del crecimiento de plantas. La promoción directa del crecimiento de plantas, ocurre cuando las PGPR proveen a la planta de compuestos que son sintetizados por las bacterias o bien facilitan la disponibilidad de nutrimentos presentes en el suelo a través de diferentes mecanismos:

a) Fijación de nitrógeno (Strenhoudt y Vanderleyden, 2000).

b) Incremento en la disponibilidad de minerales, principalmente fósforo (Idriss y col., 2002).

c) Síntesis de compuestos reguladores del crecimiento; ácido indolacético (AIA), giberelinas y citocininas (Bari y Okin, 1993; Cassan y col., 2001; García y col., 2001).

d) Síntesis de compuestos de bajo peso molecular menos caracterizados que modulan el crecimiento y desarrollo de las plantas, por ejemplo, compuestos volátiles (Ryu y col., 2003).

e) Ha sido sugerido que la secreción de ácido succínico y láctico por cepas del género Pseudomonas pueden actuar directamente estimulando el crecimiento de plántulas de espárrago (Burd, 2000).

f) Regulación de los niveles de etileno por acción de la enzima 1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminasa (Shah y col., 1998; Belimov y col., 2002).

Una bacteria en particular puede promover el crecimiento y desarrollo de la planta, usando uno o más de estos mecanismos. Además, puede utilizar diferentes mecanismos en diferentes tiempos durante el ciclo de vida de la planta. La mayoría de las investigaciones realizadas en el ámbito de estimulación del crecimiento de plantas se han enfocado a la elucidación de mecanismos involucrados en el control biológico y relativamente las bacterias que actúan por estimulación directa han recibido menos atención, sin descartar la idea de que éstas representan un enorme potencial para la agricultura.

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Colonización de las PGPR. Enfocando la atención en los mecanismos directos de estimulación del crecimiento de plantas, se asume que como prerrequisito es necesaria la adhesión de la bacteria a la semilla o a la raíz de la planta, mostrando la capacidad de las diferentes cepas de PGPR para colonizar la superficie de la raíz y rizósfera. Por ejemplo, estudios de microscopia electrónica de raíces de plántulas de canola, creciendo bajo condiciones axénicas en presencia de la cepa Pseudomonas putida GR12-2, indican que la adherencia de la bacteria a la superficie de la semilla fue suficiente para aumentar la elongación de la raíz durante los primeros días de desarrollo de las plántulas (Hong y col., 1991). De igual modo, el estudio realizado por Persello-Cartieanux y col. (2001), indica que la colonización de la rizosfera de Arabidopsis thaliana por cepas de Pseudomonas tienen la capacidad de inducir cambios morfológicos en la raíz promoviendo de esta manera su desarrollo. Sin embargo, el proceso de colonización puede variar notablemente debido a factores que modifican la interacción planta-PGPR. De modo que, la estructura del suelo, el contenido de humedad, aeración, pH, genotipo de la planta, actividades y composición de la microflora nativa del suelo pueden influir y afectar en magnitud y dirección la respuesta del crecimiento de la planta posterior a la inoculación con cepas PGPR (Buyer y col., 1999; Pillay y Nowak, 1997). Debido a que la colonización de la raíz es un proceso activo controlado por estímulos ambientales, los sistemas planta-PGPR se tornan complejos y con ello, la oscilación en el efecto promotor del crecimiento de plantas por variación en el proceso de colonización, el uso de microorganismos benéficos con aplicaciones prácticas se dificulta. No es raro, que la aplicación de estas cepas en la rizosfera muestren inconsistencia en su efecto positivo sobre el desarrollo de las plantas y en muchos casos se carezca de reproducibilidad. Es por ello, que un mejor conocimiento en la relación planta-PGPR es requerido para seleccionar y optimizar el uso de cepas con actividades fitoestimulantes que sean estables bajo una gran variedad de condiciones de campo. Bajo este concepto, se hace necesario el planteamiento de investigaciones que involucren la identificación de mensajeros o molécula señal producida por bacterias PGPR que puedan regular el crecimiento y desarrollo de las plantas. Reguladores de crecimiento producidos por PGPR. La evaluación del efecto promotor por acción de cepas PGPR, es medido en la mayoría de los casos por un incremento en la magnitud de diferentes parámetros biométricos, por ejemplo; peso seco del follaje, raíz y fruto, área foliar, número de hojas, altura de la planta entre otros, observando una rápida germinación de la semilla, mejor emergencia de la plántula, aceleramiento en su desarrollo e incremento en el rendimiento del cultivo (Cattelan y col., 1998; Lazarovits y Nowak, 1997).

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El mecanismo que ha sido con mayor frecuencia involucrado para explicar los efectos de las PGPR antes mencionados, es la producción de fitohormonas, enfocando la atención en la capacidad de diferentes cepas de PGPR para modular los niveles de etileno en plantas y de producir auxinas, funcionando como reguladores de crecimiento y desarrollo en plantas. Producción de auxinas por PGPR y su efecto en el desarrollo del sistema radicular. Las auxinas promueven la diferenciación de tejido vascular, división y elongación celular, elongación de tallos y raíz e iniciación de raíces adventicias y laterales. En plantas, la auxina más abundante es el ácido indolacético (AIA), este compuesto principalmente se sintetiza a partir del triptofano en el meristemo apical y en hojas jóvenes de donde se transporta a través del floema al resto de los tejidos vegetales (Glick y col., 1999b). La concentración de auxinas es crítica para la repuesta fisiológica, además de los factores que influyen en los niveles endógenos de auxinas, como es la síntesis de novo, degradación, hidrólisis y formación de conjugados, las auxinas secretadas por cepas PGPR pueden funcionar como fuente exógena para la planta. Es reconocido que cepas de PGPR de los géneros Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter y Azospirillum sintetizan AIA y su efecto en plantas mimetiza los efectos de AIA exógeno. Por otra parte, como se mencionó con anterioridad, la promoción del crecimiento de la raíz es uno de los principales marcadores por el cual el efecto benéfico de las PGPR es medido. Dos diferentes pruebas han sido realizadas para ensayar el efecto del AIA producido por PGPR sobre el crecimiento de plantas; un método compara los efectos de la inoculación de raíces con mutantes de bacterias que producen niveles alterados de auxinas. Una segunda prueba varía la cantidad del inóculo de una sola cepa, asumiendo que una alta densidad de inóculo significa mayor disponibilidad de AIA para la planta. Un ejemplo claro, es la aplicación de la cepa tipo silvestre de Pseudomonas putida GR12-2 en semillas de canola, que estimula de dos a tres veces la elongación de la raíz primaria comparada con el control no inoculado, una mutante sobre-productora de AIA de esta bacteria estimula extensivamente el desarrollo de raíces laterales en plántulas de canola (Xie, y col., 1996) y de raíces adventicias en fríjol (Mayak y col., 1997). Otro ejemplo, de la influencia positiva en el desarrollo del sistema radicular es la aplicación de la cepa de Azospirillum brasilense que incrementa el número y longitud de raíces laterales en trigo (Barbieri y Galli, 1993). Estos reportes nos indican que la producción de AIA por bacterias PGPR en la rizósfera es importante para determinar el efecto de éstas sobre la morfología de la raíz, asociado a la especie de la planta y al estado de desarrollo del sistema radicular.

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Modulación de los niveles de etileno en plantas por PGPR y su efecto en el desarrollo del sistema radicular. El etileno (CH2= CH2) es un gas importante que actúa como regulador del crecimiento vegetal, así como para responder a condiciones de estrés (Deikman, 1997). Se le ha asociado a procesos tan diversos como la maduración del fruto, senescencia, abscisión, germinación, elongación y desarrollo celular, nodulación, y respuesta al ataque de patógenos (Kende y Zeevaart, 1997). En plantas superiores el etileno se produce a partir de la L-metionina e involucra la formación de dos intermediarios, la S-adenosil-L-metionina (SAM) y el ácido 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC). Las enzimas involucradas en está secuencia metabólica son la SAM sintetasa, la cual cataliza la conversión de metionina a SAM y la ACC sintasa, la cual es responsable de la hidrólisis de SAM a ACC y 5’-metiltioadenosina (MTA), finalmente la ACC oxidasa, metaboliza el ACC a etileno, CO2 y HCN (Yang y Hoffman, 1984). El patrón de crecimiento observado en plántulas expuestas a etileno es llamado “triple respuesta” debido a que se describe un trío de cambios en el crecimiento único, que incluye la inhibición de la elongación del hipocotilo y raíz, la ausencia de la respuesta geotrópica normal y una curvatura exagerada del ápice del tallo, también conocida como gancho apical del hipocotilo. Estas respuestas se han usado como marcadores fenotípicos para el aislamiento de mutantes en la vía de biosíntesis del etileno en Arabidopsis thaliana (Guzmán y Ecker, 1990). Por otra parte, la investigación de algunas PGPR que además de su capacidad de estimular el desarrollo de las plantas son también capaces de disminuir los niveles de etileno en las mismas. Muchos microorganismos son capaces de utilizar ACC como un substrato a través de una única reacción. En 1978, una enzima capaz de degradar el ACC fue aislada de la cepa Pseudomonas sp. ACP, así la ACC deaminasa ha sido detectada en un gran número de rizobacterias, mostrando en la Tabla 1, algunos ejemplos de estas cepas, las cuales han sido aisladas de suelo en diferentes zonas geográficas (Belimov y col., 2002). Muchos de estos microorganismos fueron identificados por su capacidad de crecer en medio mínimo mineral conteniendo ACC como única fuente de nitrógeno (Penrose y Glick, 2003).

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Tabla 1. Ejemplos de rizobacterias que han mostrado actividad de ACC deaminasa.

género y especie cepa fuente de aislamiento

Pseudomonas

ACP

Suelo

Pseudomonas putida

GR12-2

suelo de pasto Canadian Arctic

Pseudomonas putida

UW1

suelo de, frijol Waterloo Canada

Enterobacter cloacae

UW2

suelo de trébol Waterloo Canadá

Pseudomonas fluorescens

CAL1

suelo de cebolla San Benito, California,

USA

Enterobacter cloacae

CAL3

suelo de algodón, Fresco, California, USA

Kluyvera ascorbata

SUD165

suelos contaminados con metales

Diferentes estudios han revelado el papel de ACC en la interacción planta-PGPR, la cepa tipo silvestre de P. putida GR12-2 contiene la enzima ACC deaminasa, estimulando la elongación de la raíz y reduciendo significativamente los niveles de ACC de plántulas de canola, en comparación con semillas no tratadas (Penrose y col., 2001; Penrose y Glick, 2001). Adicionalmente, los niveles de ACC en raíces de plántulas de semillas tratadas con mutantes ACC deaminasa menos de esta cepa, fue similar al de los controles no tratados. Semillas de canola fueron tratadas con Escherichia coli expresando un gen de ACC deaminasa aislado de Enterobacter cloacae, la cual también estimulo la elongación de la raíz, un resultado que demuestra que la capacidad de la bacteria para promover la elongación de la raíz está directamente relacionado a la presencia de la enzima ACC deaminasa en la bacteria (Glick, 1994; Shah y col., 1998). De acuerdo a estas observaciones, Glick y col. (1998), proponen un modelo, por el cual, las rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas pueden disminuir los niveles de etileno y así estimular el crecimiento de éstas. En este modelo, se postula que ocurre la siguiente secuencia de eventos (Fig. 1); la cepa PGPR unida a la superficie de semilla o raíz de una planta en desarrollo y en respuesta al triptofano y otras moléculas pequeñas de los exudados de la semilla y/o raíz, las PGPR sintetizan y secretan AIA, determinada cantidad de AIA bacteriano puede ser tomado por la planta. Este AIA en conjunción con el AIA endógeno de la planta puede estimular la proliferación y elongación celular, o inducir a la actividad de la ACC sintasa para convertir SAM a ACC.

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Figura 5. Modelo que representa el papel de la enzima ACC deaminasa en la interacción planta-PGPR. AIA: ácido indolacético, SAM: S-adenosil-L-metionina, ACC: ácido 1-amino-ciclopropano-1-carboxílico.

Es postulado que una porción del ACC producido por esta reacción puede ser exudado de la semilla o raíz de la planta (junto con otras moléculas normalmente presentes en los exudados), y ser tomado por la bacteria y subsecuentemente ser hidrolizado por la enzima ACC deaminasa, a amonio y α-cetobutirato. La disponibilidad y rompimiento de ACC por la bacteria promotora disminuye la cantidad de ACC afuera de la planta, por lo que hay un incremento en la cantidad del ACC que es exudado por la planta para mantener el equilibrio entre los niveles de ACC interno y externo. Este modelo predice que la acción de la enzima ACC deaminasa disminuye la cantidad de ACC. Dos consecuencias directas que resultan de la disminución en los niveles de ACC en la planta son una reducción en la cantidad de etileno y la elongación de la raíz. Sugiriendo que la actividad de la enzima ACC deaminasa es uno de los principales mecanismos que las PGPR usan para tener un efecto fitoestimulatorio.

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Otras moléculas reguladoras producidas por PGPR. La existencia de otro tipo de moléculas producidas por cepas PGPR que puedan funcionar como reguladores de crecimiento en plantas, diferentes a las llamadas “hormonas clásicas” ha tomado importancia en los últimos años. De esta manera, el papel que juegan los metabolitos producidos por cepas PGPR que puedan modificar señales fisiológicas en plantas es aún desconocido, siendo escasos los estudios que indican el efecto benéfico en plantas por moléculas reguladoras. Bai y col. (2002), reportan la producción de un activador análogo a un lipoquito-oligosacárido (LCO) por la cepa Serratia proteamacuans 1-102, el cual estimula la germinación de semillas de soya incrementando el proceso en la formación de nódulos, concluyendo que el activador producido por esta cepa puede proveer una señal, incrementando la calidad en la señal durante el proceso planta-bacteria. De igual modo, Mathesius y col. (2003), establecen la participación de la molécula N-acil-homoserina lactona (AHL) producida por Pseudomonas auriginosa y Sinorhizobium maliloti, la cual induce cambios en la secreción de compuestos en Medicago truncatula favoreciendo la interacción planta-bacteria. La participación de este tipo de moléculas ha sido referido únicamente a rizobacterias Gram negativas, por lo que investigaciones que involucren otro grupo de rizobacterias consideradas como PGPR, podría ayudar a ampliar el conocimiento en este campo.