BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

LICENCIATURA EN QUMICO FARMACOBILOGO

AREA: ANLISIS CLNICOS

ASIGNATURA: LABORATORIO DE PARASITOLOGA I

MANUALMC. MARICELA TORRES Y SOTO

MINERVA: PRIMAVERA 2014REGLAMENTO Y MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE PARASITOLOGA I

El alumno deber:

1- Siempre presentarse con bata blanca, incluso si en la sesin slo se llevan a cabo seminarios y o exmenes.

2- Cumplir con las actividades y o tareas solicitadas por el profesor.

3- Asistir puntualmente a las sesiones, slo tendr 10 minutos de tolerancia, una vez que se pase lista, si llega despus, se considerar como falta.

4- Colocar fuera de las mesas de trabajo, mochilas, suteres, chamarras u otros objetos que no requiera para la realizacin de la prctica.

5- Traer el material biolgico o de otro tipo solicitado por el profesor.

6- Siempre traer guantes, cubreboca y perilla para las pipetas.

7- Siempre traer jabn y papel sanitario para el aseo de las manos y para la limpieza del material de vidrio y de las mesas de trabajo.

8- Solicitar el material que requiere para las prcticas por medio de un vale, ya sea a el profesor o a la persona encargada del rea del material y reactivos.

9- Manejar con mucho cuidado el material, las soluciones o reactivos.

10- Manejar con mucho cuidado las muestras fecales ya que son potencialmente infectantes.

11- Siempre pipetear las soluciones, con la perilla correspondiente y nunca con la boca.

12- Dejar los frascos de las soluciones en el lugar de donde los tom, despus de su uso.

13- No desechar soluciones de colorantes, papeles, muestras biolgicas slidas, ni material de vidrio roto (portaobjetos, cubreobjetos, tubos) en las tarjas.

14- No dejar pipetas contaminadas directamente sobre las mesas.

15- Colocar el material contaminado, as como las muestras fecales, en las bolsas o recipientes correspondientes, de acuerdo a la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin ambiental-Salud ambiental- Residuos peligrosos biolgicos infecciosos- Clasificacin y especificaciones de manejo. Y de acuerdo a lo indicado por el profesor.

16- Manejar y cuidar los microscopios de acuerdo a la informacin proporcionada al inicio del curso.

17- Anotarse en la libreta que est al lado del microscopio que utilice, y en su caso reportar cualquier anomala o desperfecto hallado en el microscopio antes o durante su manejo.

18- Limpiar el aceite de inmersin a los objetivos del microscopio, de acuerdo a las indicaciones dadas por el profesor.

19- Al trmino de la prctica, dejar desconectados los microscopios, cubrir el microscopio con su correspondiente funda y dejar cerrada la caja con llave.

20- Al trmino de la prctica, dejar limpias y desinfectadas las mesas, libres de papeles, material biolgico o de otro tipo.

21- Al concluir la prctica, entregar el material que emple segn las indicaciones de el profesor, as como solicitar la devolucin del vale.

22- En caso de romper algn material, deber reponerlo a la brevedad posible, para lo cual se le retendr el vale.

23- En caso de algn incidente o accidente, deber informarle a el profesor, para que se tomen las medidas pertinentes.

24- Antes de retirarse del laboratorio, checar que no se le olvide algo, ya que el profesor no se har responsable por manuales, celulares, libros, batas, etc, olvidados.

NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002Elaborada en forma conjunta por la Secretaria de Salud y de Medio Ambiente y Recursos Naturales, la norma oficial mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin Ambiental - Salud Ambiental - Residuos Peligrosos Biolgico - Infecciosos Clasificacin y Especificaciones de Manejo, fue publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 17 de Febrero del 2003 y sustituye a la NOM-087-ECOL-1995.

Los RPBI se consideran como residuos peligrosos y como tal se debe establecer un plan integral para su manejo, almacenamiento, transporte, tratamiento y disposicin final.PRINCIPALES MODIFICACIONES EFECTUADAS EN LA NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.

I. Criterios para considerar un residuo como RPBI

II. Nueva clasificacin de los RPBI

III. Cantidad de sangre o fluido corporal en los RPBI

IV. Niveles de los establecimientos generadores

V. Periodo de almacenamiento temporal de los RPBI en los establecimientos generadores.

VI. Atribucin a la Secretaria de Salud, para la vigilancia de la norma.

I. Los lugares que ofrecen atencin mdica y los centros de investigacin, son considerados establecimientos generadores de materiales contaminados por agentes biolgico-infecciosos. Estos desechos se denominan Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos (RPBIs), su manejo y disposicin inadecuados, representa un riesgo para la salud del personal que labora en estos sitios, as como para la salud de la poblacin aledaa, ocasionando adems, el deterioro del medio ambiente. Los microorganismos patgenos, virus, parsitos y priones (estructuras proteicas) son ejemplos de agentes biolgicos-infecciosos. Para que un microorganismo sea capaz de producir enfermedad, es decir, que sea un Agente Biolgico-Infeccioso, debe ocurrir lo siguiente: tener una concentracin suficiente (inculo), estar en un ambiente propicio (supervivencia), en presencia de una va de entrada en un hospedero susceptible.

II. En la Nueva clasificacin, los RPBIs son:

1. La sangre y sus componentes nicamente en estado lquido.

2. Los cultivos de agentes biolgico-infecciosos generados en:

a. Los procedimientos de diagnstico e investigacin.

b. La produccin y el control de agentes biolgico-infecciosos.

3. Los utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biolgico-infecciosos.

4. Los tejidos, rganos y partes que se extirpan o remueven durante las autopsias, las cirugas o algn otro tipo de intervencin quirrgica que no estn conservados en solucin de formol.

5. Las muestras biolgicas empleadas en los anlisis clnicos (excepto las muestras de orina y de excremento), y aquellas usadas en los anlisis patolgicos.

6. En los centros de investigacin, los cadveres y las partes de los animales que fueron inoculados con agentes entero patgenos.7. Los residuos no anatmicos:

a. Los recipientes desechables que contengan sangre lquida.b. Los materiales desechables que contengan fluidos y secreciones corporales, provenientes de los pacientes de quienes se sospechen o exista un diagnstico de una enfermedad infecto-contagiosa como la tuberculosis.

c. Los materiales de curacin empapados de sangre lquida o de cualquier otra secrecin o lquido corporal.

d. Los materiales absorbentes utilizados en las jaulas de los animales que hayan sido expuestos a agentes entero patgenos.8. Los materiales punzo cortantes desechables como las hojas de bistur, las agujas de sutura y los estriles de catter. El material de vidrio de laboratorio, que se haya roto al momento de ser manipulado, se deber desinfectar o esterilizar y ya no se considerar como RPBIs, por lo que se podr disponer posteriormente como residuo municipal.La disposicin general para el desecho de RPBIs en el laboratorio queda de la siguiente manera:

TIPO DE RESIDUOESTADO FISICOENVASADOCOLOR

SangreLquidosRecipientes hermticosRojo

Cultivos y cepas de agentes infecciososSlidosBolsas de polietilenoRojo

PatolgicosSlidosBolsas de polietilenoAmarillo

Residuos no anatmicosSlidosBolsas de polietilenoRojo

Objetos punzocortantesSlidosRecipientes rgidos polipropilenoRojo

III. Para que un material de curacin se considere como RPBIs, debe ser desechable y estar goteando, chorreando o escurriendo sangre o cualquier lquido corporal contemplado en la norma.IV. Niveles de los Establecimientos GeneradoresNIVEL INIVEL IINIVEL III

Establecimientos de atencin mdica hasta con 5 camas e insti-tuciones de investiga-cin con excepcin de los sealados en el Nivel III.Unidades hospitalarias de 6 hasta 60 camas.Unidades hospitalarias de ms de 60 camas.

Laboratorios clnicos y bancos de sangre que realicen anlisis de 1 a 50 muestras al da.Laboratorios clnicos y bancos de sangre que realicen anlisis de 51 a 200 muestras al da.Centros de produccin e investigacin experi-mental en enfermeda-des infecciosas.

Unidades hospitalarias psiquitricas.Bioterios que se dedi-quen a la investigacin con agentes biolgico-infecciosos.Laboratorios clnicos y bancos de sangre que realicen anlisis a ms de 200 muestras al da.

Centros de toma de muestras para anlisis clnicos.Establecimientos que generen de 25 a 100 kilogramos al mes de RPBIs.Establecimientos que generen ms de 100 kilogramos al mes de RPBIs

V. Perodo de almacenamiento temporal de los RPBIs en los establecimientos generadores.NIVEL INIVEL IINIVEL III

30 das mximos de almacenamiento tem-poral.15 das mximos de almacenamiento tem-poral.7 das mximos de almacenamiento tem-poral.

No requiere de rea especfica para el almacenamiento tem-poral.Si requiere de rea especfica para el almacenamiento tem-poral.Si requiere de rea especfica para el almacenamiento tem-poral.

Se podrn ubicar los contenedores espec-ficos para los RPBIs* en el lugar ms apropiado dentro de sus instalaciones, de manera tal que no obstruyan las vas de acceso.Deber cumplir con las especificaciones esta-blecidas en la NOM-087-SEMARNAT- SSA1-2002, para el rea de almacena-miento temporal.Deber cumplir con las especificaciones esta-blecidas en la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, para el rea de almacena-miento temporal.

*Los contenedores pueden ser plsticos o metlicos, con sealamiento del smbolo universal de RPBIs y no mezclarlos con la basura municipal.VI. Atribucin a la Secretaria de Salud. Corresponde a la secretaria de salud regular y vigilar el equipamiento, instalacin y funcionamiento de los servicios mdicos que son los principales generadores de los RPBIs, por ello participa complementariamente con la SEMARNAT en la regulacin y vigilancia de la norma, para lo cual se estableci en el cuerpo de la misma, la disposicin de crear las bases de colaboracin que firmarn ambas dependencias y que sern publicadas en el Diario Oficial de la Federacin, en las que se especificarn los puntos de la norma que vigilarn cada una de ellas. PRCTICAS DE LABORATORIO.Prctica No 1: Examen fsico y qumico de las heces.

Prctica No 2: Mtodo coproparasitoscpico (CPS) directo o en fresco.

Prctica No 3: Mtodo CPS de Faust y uso del conservador PAF.

Prctica No 4: Mtodo CPS de Sheater

Prctica No 5: Mtodo CPS de MIFC

Prctica No 6: Amiba en fresco

Prctica No 7: Observacin de protozoarios de tubo digestivo y vas genitourinariasPrctica No 8: Observacin de protozoarios tisulares.Prctica No 9: Realizacin de tcnicas de tincin, cultivos y mtodos inmunolgicos.

SEMINARIO I

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

Conjunto de acciones planificadas y sistematizadas necesarias para asegurar la reproducibilidad, especificidad, sensibilidad y precisin de una prueba, dentro del laboratorio.

EVALUACION INTERNA DE LA CALIDAD

1. FASE PREANALITICA

a) Solicitud de estudios

b) Programa de bioseguridad

c) Informacin y preparacin del paciente (indicaciones de ventanilla)

d) Obtencin directa del producto biolgico

e) Recoleccin, transporte y conservacin del producto biolgico.

f) Recepcin del producto biolgico (criterios de aceptacin o rechazo)

g) Revisin de reactivos (colorantes, sulfato de zinc, etc.)

h) Limpieza de equipos e instrumentos

i) Graficas de control de calidad Levey-Jennings (inmunoparasitologa)

j) Registro de temperaturas de equipos (refrigeradores y estufas)

k) Limpieza de material

2.- FASE ANALITICA

a) Preparacin, almacenamiento y registro de reactivos (bitcoras)

b) Verificacin de instalaciones, equipo y material

c) Realizacin de la prueba (manual de procedimientos)

d) Lectura de la prueba

e) Evaluacin interna de la calidad

f) Almacenamiento de productos biolgicos (bitcoras)

3.- FASE POST-ANALITICA

a) Reporte de resultados( nombre y fase del parasito) en bitcoras de control interno y en el sistema

b) Confirmacin de los resultados

c) Confidencialidad

d) Informes estadsticos peridicos

e) Archivo de informe

f) Manejo de residuos qumicos (RQ) (manual de procedimientos)EVALUACION EXTERNA DE LA CALIDAD

a) Programa de evaluacin externa de la calidad

b) Formacin de grupos pares

MATERIAL DE REFERENCIAComo parte de la evaluacin interna de la calidad en un laboratorio de parasitologa diagnstica debe de contarse con material de referencia, este corresponde a la existencia en el lab, de las diferentes fases de los protozoarios, trofozotos, quistes y ooquistes y de los helmintos, huevos, larvas y adultos, parsitos del hombre, que puedan ser consultados y comparados (referidos) para emitir un resultado. Tambin utilizados para la docencia. Este material consiste en:

1) Concentrados de parsitos en forma mltiple (parasiteca)

2) Concentrados de parsitos en forma individual (parasiteca)

3) Laminillas coloreadas semi-permanentes

4) Laminillas coloreadas permanentes

5) Ejemplares microscpicos

6) Diapositivas, fotografas y atlas de parasitologa

PRCTICA N 1EXAMEN FSICO Y QUMICO DE LAS HECES.OBJETIVOS.- Conocer la importancia de realizar el examen fsico-qumico de las heces, as como el aprender a hacer cada una de las determinaciones.Comprender la importancia de la informacin que nos proporciona este examen tanto a nivel mdico general como a nivel parasitolgico.

INTRODUCCIN.- El examen de las heces o coprologa comprende la observacin macroscpica, la observacin microscpica y el anlisis qumico.

La observacin macroscpica determina las caractersticas fsicas y la presencia de parsitos visibles a simple vista.La observacin microscpica comprende el estudio microbiolgico (bacteriolgico, parasitolgico, virolgico y micolgico).El anlisis qumico consiste en la bsqueda de compuestos qumicos tales como; lpidos, carbohidratos y sangre oculta entre otros.

Estos tres estudios de las heces fecales en su conjunto determinan el estado funcional e integral del aparato digestivo de un individuo.En el laboratorio clnico es comn el que se realicen mtodos coproparasitoscpicos, olvidndose de que previamente debe realizarse un estudio fsico, el cual proporciona informacin valiosa para orientar hacia qu mtodo coproparasitoscpico es el ideal a emplear en funcin de lo que se espera hallar de un parsito y de las caractersticas fsicas de las heces.

Actualmente ste estudio sumado al examen qumico, se ha retomado del pasado y se le ha considerado relevante para el diagnstico diferencial de muchas enfermedades tanto infecciosas como no infecciosas.PRIMERA PARTE

EXAMEN FSICO, MACROSCPICO U ORGANOLPTICO DE LA MATERIA FECAL

A la observacin macroscpica de la materia fecal, que es rpida y fcil de hacer, podemos saber desde el punto de vista de la parasitologa, lo siguiente:

1. El tiempo crtico del anlisis

2. El posible agente etiolgico

3. La posible localizacin del dao

4. El estadio del parsito a hallar a nivel microscpico

5. El mtodo coproparasitoscpico a emplear de acuerdo al estadio del parsito6. El agente etiolgico cuando ste es macroscpico.

CARACTERSTICAS FSICAS NORMALES DE LAS HECES.La consistencia debe ser blanda con forma cilndrica y replegada sobre s misma varias veces, de tal manera que al ser emitidas las heces, stas conserven su forma. La superficie debe ser rugosa y opaca. El color vara del castao, caf o marrn claro al obscuro. El olor aunque es desagradable, debe ser soportable (caracterstico). No debe presentar moco, sangre, pus, parsitos macroscpicos ni restos burdos de alimentos.

La cantidad de materia fecal que un adulto sano elimina por da es variable en funcin de la dieta, pero el rango que se considera normal es de 80 a 250 gr repartidas en una a dos defecaciones por da.

La consistencia de las heces est en funcin de la cantidad de agua, lo que a su vez determina el estadio de los parsitos a hallar, por lo que:a) en heces lquidas encontraremos de preferencia trofozotos de protozoarios y larvas de helmintos.

b) en heces pastosas (semiblandas) encontraremos aunque en menor proporcin, trofozotos y algunos quistes de protozoarios y tambin larvas de helmintos.

c) en heces blandas y duras se pueden encontrar quistes de protozoarios y huevecillos de helmintos, que son formas de resistencia de los parsitos.

Como puede observarse a medida que las heces pierden agua, la posibilidad de hallar sobretodo trofozoitos, disminuye, por lo que la consistencia de las heces determina el tiempo crtico del anlisis, que es el tiempo que transcurre desde que la materia fecal es emitida hasta el momento de su anlisis, que si se respeta, esto asegura el hallazgo sobretodo de trofozotos, tenindose que:

Para heces lquidas y pastosas el tiempo crtico del anlisis es de 30 min.

Para heces blandas el tiempo crtico del anlisis es de 24 hr.

Para heces duras el tiempo crtico del anlisis es de 48 hr.

Despus de ese tiempo las formas parsitas se destruyen (trofozoitos) o se deforman (quistes, huevos y larvas).REQUERIMIENTOSUna muestra fecal recin emitida, libre de contaminantes y recolectada en un frasco limpio, seco y con tapa hermtica.

Una lupa y un abatelengua. Cubreboca, guantes desechables y cajas de Petri.

PROCEDIMIENTO:

a) con los brazos extendidos y colocando el frasco en la mesa, destpelo poco a poco, sobretodo si est lleno, para evitar que el contenido salga disparado

b) observe a simple vista la muestra fecal y anote el color y la forma que tenga, tambin anote cmo es la superficie de la muestra.

c) observe tambin si en la superficie hay sangre, moco, pus, restos burdos de alimentos y/o parsitos macroscpicos.

d) con un abatelengua detecte la consistencia y removiendo la materia fecal busque sangre, moco, restos burdos de alimentos y/o parsitos macroscpicos, anote los hallazgos. De preferencia coloque la muestra en cajas de Petri, para la bsqueda de los parsitos macroscpicos, ayudndose para ello con una lupa.

FORMA DE REPORTAR: Nombre del mdico que solicit el estudio.

Nombre del paciente.

Sexo y edad del paciente.

Nombre del mtodo realizado.

Nmero de muestra analizada y fecha de emisin y de anlisis.

Cantidad (solo si es toda la emitida en 24 hr).

Forma: la hallada, siempre y cuando la condicin de la muestra lo permita.

Superficie: la observada.

Color: el hallado, si es el normal se puede reportar como caracterstico.

Consistencia: la observada.

Moco: si no hay se reporta negativo, si lo hay se reporta como positivo, y adems debe indicarse si se hall mezclado o en la superficie de las heces, y en este ltimo si fue opaco o brillante, en forma de hilos o corpsculos. La cantidad se indica con cruces.

Sangre: si no hay se reporta negativo, si hay se reporta positivo, pero debe indicarse si fue sangre fresca o digerida, la cantidad se indica con cruces.

Pus: si no hay se reporta negativo, si hay se reporta como positivo. La cantidad se reporta con cruces.

Parsitos macroscpicos: si no hay se reporta negativo, si hay se reporta como positivo y debe indicarse el estadio y el nombre genrico y si es posible el nombre de la especie del parsito, as como la cantidad.

Restos burdos de alimentos: si no hay se reporta negativo, si hay se reporta positivo y hay que indicar el tipo de alimento encontrado.

Otros hallazgos: en los nios es comn pero anormal, encontrar objetos tales como monedas y canicas entre otros, se puede hallar restos de insectos. Cuando la muestra no es recolectada adecuadamente y est contaminada, las caractersticas fsicas se alteran, y esto debe considerarse para el reporte. Todo hallazgo anormal debe reportarse.

SEGUNDA PARTE DE LA PRCTICA

EXAMEN QUMICO DE LAS HECESComprende la determinacin de diversos componentes:

1- pH

5- Moco fecal o recuento de2- Sangre oculta

leucocitos fecales 3- Azcares reductores

4- Grasa fecal

}REQUERIMIENTOS Una muestra fecal libre de contaminantes y recolectada en un frasco limpio, seco y con tapa hermtica.

Papel indicador Merck, para medir el pH

Tabletas de Clinitest, para la determinacin de azcares reductores

Guayacol, bencidina, Hematest, o el reactivo del mtodo con el que se cuente para la determinacin de sangre oculta.

Solucin salina fisiolgica, pelcula radiogrfica o de gelatina. Para determinar actividad trptica. O los reactivos del mtodo con el que se cuente.

Colorante Sudn III o Rojo Sudn, o reactivo de Saathoff para determinacin de grasas.

Solucin de colorante azul de metileno o bien de Wright, para el recuento de leucocitos

Agua destilada

Etanol al 95%

Etanol al 96%

cido actico glacial

Sulfato de azul de Nilo al 1% cido actico glacial al 36%

Tubos de ensaye

Pipetas volumtricas

Portaobjetos

Cubreobjetos

Abatelenguas

Aceite de inmersin

Gradilla Microscopio ptico compuestoPROCEDIMIENTO:Siga las instrucciones para cada mtodo de acuerdo a la determinacin que va a efectuar.pHSe examina con el papel indicador Merck que seala el pH aproximado. Las heces normales son neutras o ligeramente alcalinas entre 6.8 y 7.2, pero la reaccin depende de mltiples factores, dietticos y endgenos, por lo que se pueden presentar variaciones, tanto en la salud como en la enfermedad. La medicin se hace impregnando el papel indicador con las heces con ayuda de una varilla de vidrio.SANGRE OCULTAPara este anlisis es importantsimo que el paciente durante los 2 3 das anteriores a la toma de muestra se someta a un rgimen riguroso (blanco), sin carne, pescados, embutidos, lentejas, espinacas, pltanos, etc., es decir alimentos ricos en peroxidasas. Tampoco deber tomar medicamentos que contengan hierro o hemoglobina, o que puedan provocar prdidas sanguneas como salicilatos o esteroides. La alimentacin permitida consiste en: huevos, papas, cebolla, arroz, garbanzos, pan y leche.

La mayora de las pruebas para detectar hemorragias ocultas en heces se basan en la determinacin de peroxidasas como indicativo del contenido de hemoglobina. Para ste estudio se pueden encontrar los kits clsicos de guayacol y bencidina. Y hace un par de aos, que ya se emplean nuevos kits por mtodos inmunocromatogrficos para la deteccin de hemoglobina especfica humana, lo que evita en muchos casos los

falsos positivos que se dan en los mtodos tradicionales.Reaccin de la bencidina:Sobre un papel de filtro se untan las heces, luego se ponen unas gotas de bencidina y agua oxigenada de 10 volmenes. Si el resultado es (+), como resultado de la presencia de peroxidasa, se formar un halo de color verde azulado en torno a la muestra fecal.DETERMINACIN DE GRASA EN HECES:Una persona normal digiere y reabsorbe casi toda la grasa de su dieta. Cuando la dieta es normal, la grasa en heces constituye hasta un 20% de los slidos totales. Tcnica de coloracin de sudn III (cualitativa):

Los lpidos se miden en forma de cidos grasos: (0 6.0 g/24h). Se requiere materia colectada de 48 o 72 hr, con dieta previa de 100 g de grasa normal por da, durante 5 6 dasUna pequea cantidad de muestra fecal es mezclada con 2 gotas de agua, 2 gotas de etanol al 95% y 3 4 gotas de colorante de Sudan III, esto aumenta el color amarillo naranja retrctil de los glbulos de grasa para as identificar las grasas neutras.

Las grasas cidas y de jabn son detectadas por hidrlisis, mezclando la muestra fecal con 2 3 gotas de Sudan III y de 2 3 partes de cido actico glacial al 36 %, seguido por un calentamiento a hervir por dos veces, antes de observarlo al microscopio.

Luego se coloca una pequea cantidad de la anterior mezcla en un portaobjetos, se coloca el cubreobjetos cuidando que no se formen burbujas y se observa al microscopio, la lectura se hace aplicando el siguiente criterio:

Grasas neutras: < de 50 glbulos de grasa por campo en 40X, se reporta como normal. Grasas cidas: < 100 glbulos de grasa en 40X, se considera normal.

Grasas neutras: se observan como gotas de color naranja o rojo. Grasas cidas: se observan como escamas que se tien ligeramente, o cristales en forma de agujas largas y finas, que no se tien. Jabones: se observan como escamas o cristales que no se tien. AZCARES REDUCTORES Las heces deben de ser recientes, no debe dejarse pasar ms de una hora desde que son emitidas hasta que se realiza el examen.

Hay que diluir una parte de heces en dos partes de agua destilada, mezclar bien y centrifugar a un nmero bajo de revoluciones (1 500 rpm). Se toman 15 gotas del sobrenadante, se colocan en un tubo de vidrio y se le aaden dos gotas de HCl 1 N. Luego se calienta para desdoblar la sacarosa.

Una vez que ha enfriado el lquido anterior, se aade una tableta de CLINITEST(Ames) para azcares reductores y se deja disolver. A continuacin se compara con la escala de colores que lleva el reactivo.

El resultado se da en gramos por litro. El resultado ser negativo si es inferior a 2.5 g/L. Entre 2.5 y 5 es dudoso y ser positivo si es mayor de 5 g/LCITOLOGIA DE MOCO FECAL O RECUENTO DE LEUCOCITOS FECALESTcnica azul de metileno amortiguado (AMA)

Se toma una pequea porcin de la muestra (de preferencia del moco) y se realiza una extensin en un portaobjetos.

Se le adiciona una gota del colorante AMA y se coloca el cubreobjetos, se deja reposar 5 min y se observa con objetivo 40X.

En caso de duda se repite la operacin, tomando moco de otra parte de la muestra.

Se realiza un conteo de 100 clulas y se informa el porcentaje de clulas observadas.

Resultado:

En caso de no encontrarse leucocitos se reporta como no se observ celularidad.

En caso de encontrarse un nmero escaso de leucocitos polimorfonucleares, se informa como escasos polimorfonucleares.

En caso de encontrarse las clulas necesarias para hacer el conteo, se reporta de la siguiente manera:

Polimorfonucleares:

..%

Mononucleares:

..%

Si existe duda sobre la presencia de eosinfilos en la muestra, se realiza un extendido del moco fecal, se deja secar y se realiza la tincin especial de Hansel, y se realiza el conteo de 100 clulas, reportando el porcentaje de eosinfilos hallado.

Valor de referencia: si hay mayor cantidad de leucocitos, de 10 20 por campo, principalmente polimorfonucleares, es indicativo de pus y la infeccin es causada por bacterias, si hay mayor cantidad de mononucleares la infeccin es de tipo viral. Menos de 10 leucocitos por campo es sugestivo de amibiasis.PRCTICA N 2MTODO COPROPARASITOSCPICO DIRECTO.OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar un mtodo coproparasitoscpico (CPS) cualitativo, que conozca las ventajas y desventajas del mismo y que empiece a familiarizarse microscpicamente con las diferentes estructuras que contienen las heces, tanto parasitarias como de todo tipo.

INTRODUCCIN.

Esta tcnica parasitoscpica llamada tambin CPS en fresco, es la ms antigua que se conoce, existen datos acerca de que Anton Van Leewenhoek a mediados del siglo XVII, fue el primero en realizarla al observar sus propias heces y hallar trofozotos del protozoario Giardia lamblia .

Es uno de los mtodos CPS ms utilizados en cualquier laboratorio de anlisis clnicos, debido a que es sencillo y rpido de realizar, adems de que es muy econmico por requerir de poco material y de soluciones en pequea cantidad, usuales en el laboratorio.

FUNDAMENTO.

Este mtodo se basa en la utilizacin de una solucin salina isotnica para mantener vivos a los trofozotos de protozoarios. As como en la utilizacin de una solucin de yodo (lugol) para colorear a los quistes y ooquistes de protozoarios; huevos y larvas de helmintos, (el lugol destruye a los trofozotos).

REQUERIMIENTOS. Aplicadores de madera o palillos.

Portaobjetos de 25X76 mm.

Cubreobjetos de 22X22 mm.

Microscopio compuesto ptico.

Solucin salina isotnica.

Solucin de yodo o lugol parasitolgico.

Una muestra fecal recin emitida.

PROCEDIMIENTO.

1- En un portaobjetos colocar una gota de solucin salina isotnica.

2- Con el aplicador de madera tomar una muestra fecal de 1 4 mg, de preferencia de donde haya moco y sangre.

3- Mezclar con cuidado haciendo una suspensin y no un frote, con ayuda de un palillo o la punta del cubreobjetos

4- Quitar de la suspensin fibras y otros fragmentos grandes.

5- Poner con cuidado el cubreobjetos, evitando la formacin de burbujas.

6- Observar al microscopio primero con el objetivo seco dbil y luego con ms cuidado con el objetivo seco fuerte cuando localice formas parasitarias.

7- La observacin debe hacerse de manera sistemtica abarcando toda la superficie del cubreobjetos, incluso los bordes del mismo.

8- En otro portaobjetos colocar una gota de lugol

9- Luego colocar una muestra de heces de 1 4 mg, con el aplicador de madera.

10- Repetir los pasos del 3 al 8.

11- Reportar lo observado

MTODO CPS DIRECTO

MEDIDAS DE SEGURIDAD.

El material biolgico con el que se trabaja, es potencialmente infectante, por lo que se recomienda utilizar guantes, cubreboca y abundante detergente para el lavado de manos, material y rea de trabajo.

INDICACIONES Y LIMITACIONES.

Este mtodo est indicado para la deteccin de trofozotos de protozoarios en heces que cubran los requisitos para ello.

La muestra fecal empleada es tan pequea que resulta poco representativa.

A la observacin microscpica se observan demasiados detritos, lo cual puede enmascarar a las formas parasitarias.

PRCTICA N 3MTODO COPROPARASITOSCPICO DE FAUST

OBJETIVOS: Aprender a realizar un mtodo coproparasitoscpico cualitativo de concentracin por flotacin.

Conocer las ventajas y utilidad por las que este mtodo se emplea de rutina en la mayora de los laboratorios clnicos tanto privados como pblicos.

Realizar la bsqueda e identificacin de formas parsitas en las heces.

Conocer el manejo y la utilidad del conservador qumico PAF en el trabajo rutinario.

INTRODUCCIN.

Este mtodo coproparasitoscpico (CPS) fue descrito en 1938 basndose en los siguientes antecedentes:

En 1906 Bass la describi originalmente como una tcnica de flotacin con salmuera, para la recuperacin de huevos de helmintos.

En 1910 el mismo Bass introdujo la centrifugacin.

En 1924 Lane ide un refinamiento de la tcnica, que consisti en realizar un lavado del sedimento antes de centrifugar con la salmuera.

En 1930 Faust y cols. realizaron pruebas con diferentes soluciones, y la solucin de sulfato de zinc con densidad de 1.18 Baum, fue la que result ser un medio adecuado para la flotacin de quistes de protozoarios y huevos de helmintos.

Es uno de los mtodos CPS ms utilizados y preferidos en cualquier laboratorio de anlisis clnicos, debido a las ventajas que presenta.

Cabe aclarar que debido a que cada laboratorio y cada analista introducen variaciones a la tcnica, en la actualidad se ha buscado estandarizarla, para cumplir con las exigencias de calidad y evaluaciones externas.

FUNDAMENTO.Este mtodo se basa en una diferencia de densidades entre la solucin que se emplea y la de las formas parasitarias, es decir, se basa en la utilizacin de una solucin de sulfato de zinc con densidad de 1.18 Baum que por ser mayor a la densidad de las estructuras parasitarias (1.05 1.15), ocasiona que stas floten.

Adems, la solucin de sulfato de zinc no produce deformacin de las formas parasitarias y el proceso de flotacin se agiliza con la centrifugacin.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO Muestra fecal recolectada adecuadamente

Aplicadores de madera

Portaobjetos de 25X76 mm.

Cubreobjetos de 22X22 mm.

Frasco de vidrio de 100 ml

Abatelenguas o varillas de vidrio

Tubos de ensaye de vidrio de 13 X 100 mm

Embudo de 7.5 cm de dimetro

Coladerita de 3.5 a 5 cm de dimetro

Asa de alambre o microbiolgica, terminada en crculo de 3 5 mm de dimetro, formando ngulo recto con la varilla.

Mechero Bunsen

Gradilla

Solucin de sulfato de zinc con densidad de 1.18 Baum (al 33% en agua)

Solucin de yodo o lugol parasitolgico.

Agua destilada

Microscopio compuesto ptico.

Centrfuga.

TCNICA (PROCEDIMIENTO).1- En un frasco de vidrio colocar aproximadamente un gramo de materia fecal y agregarle 10 ml de agua destilada. Mezclar con el abatelenguas o varilla de vidrio a hacer una suspensin homognea.

2- Filtrar la suspensin a travs de la coladerita colocada en el embudo y stas a su vez colocadas en el tubo de ensayo, teniendo cuidado de no llenar completamente el tubo, debe dejarse siempre aproximadamente un cm del tubo sin llenar.

3- Centrifugar el tubo a 2,000 2,500 rpm durante 1 minuto.

4- Decantar el sobrenadante en un frasco recolector ex profeso.

5- Resuspender el sedimento con 2 3 ml de agua destilada, ayudndose con un aplicador de madera y se completa el volumen con ms agua, dejando un cm del tubo sin llenar, se mezcla nuevamente con el aplicador de madera.

6- Centrifugar nuevamente el tubo a 2,000 2,500 rpm durante 1 minuto.

7- Repetir los pasos 4 6, hasta que el sobrenadante se observe limpio, no ms de dos veces.

8- Decantar el sobrenadante en un frasco recolector ex profeso.

9- Resuspender el sedimento con 2 3 ml de solucin de sulfato de zinc, ayudndose con un aplicador de madera y se completa el volumen con ms solucin de sulfato de zinc, dejando un cm del tubo sin llenar, se mezcla nuevamente con el aplicador de madera.

10- Centrifugar nuevamente el tubo a 2,000 2,500 rpm durante 2 minutos.

11- Sacar el tubo de la centrfuga con cuidado sin agitarlo y colocarlo en la gradilla.

12- Quemar el asa con el mechero y dejar enfriar.

13- Colocar el anillo del asa sobre la pelcula del sobrenadante y recolectar una muestra.

14- Depositar la muestra en una gota de lugol previamente colocada en el portaobjetos, lavando el anillo del asa en el lugol.

15- Tomar otras dos asadas de la pelcula del sobrenadante y repetir el paso 14.

16- Mezclar con la punta del cubreobjetos y cubrir la preparacin con el mismo, cuidando que no se formen burbujas.

17- Observar la preparacin primero con el objetivo 10X y luego con ms cuidado con el objetivo 40 45X.

18- La observacin debe hacerse de manera sistemtica abarcando toda la superficie del cubreobjetos, incluso los bordes del mismo.

19- Reportar lo observado

FAUST

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Ventajas

a- Es sencillo y fcil de realizar.

b- No se invierte mucho tiempo para su realizacin.

c- Es relativamente econmico por requerir de reactivos no costosos, material y equipo con el que generalmente cuenta el laboratorio.

d- Hace una buena concentracin de las estructuras parasitarias en la superficie del sobrenadante debido al proceso flotacin centrifugacin.

e- Y algo muy importante es que se recuperan la mayora de las estructuras parasitarias tales como; quistes y ooquistes de protozoarios, larvas y huevecillos de helmintos.

Desventajas

a. Los huevos de helmintos como Taenia sp, Ascaris lumbricoides no fertilizados y de trematodos como Fasciola hepatica y Paragonimus mexicanus, as como los quistes de Balantidium coli, por ser pesados tienden a sedimentar, por lo que ste mtodo no los recupera.

b. No es posible recuperar trofozotos de protozoarios, ya que se destruyen por la concentracin del sulfato y por el proceso de centrifugacin.

PRECAUCIONES

La solucin de sulfato de zinc debe prepararse cada tercer da o bien checar peridicamente la densidad, segn el volumen de trabajo diario.

La toma de muestra de la superficie del sobrenadante debe hacerse en seguida de la centrifugacin, ya que despus de una hora se pueden sedimentar y/o deformar las estructuras parasitarias.

El material biolgico con el que se trabaja, es potencialmente infectante, por lo que se recomienda utilizar guantes, cubreboca y abundante detergente para el lavado de manos, material y rea de trabajo (en ste caso usar desinfectantes como el benzal).

PRACTICA NO. 4MTODO COPROPARASITOSCPICO DE FAUST Y USO DEL CONSERVADOR PAFINTRODUCCIN.Cuando se tiene un volumen de trabajo diario grande, o bien se realizan muestreos a gran escala, ocasiona que no se tenga tiempo suficiente para procesar todas las muestras y se corre el riesgo de que se deformen o destruyan algunas estructuras parasitarias.

Lo mismo sucede cuando el laboratorio por la distancia no es accesible para las personas.

Por ello es que surgi la necesidad del uso de los conservadores o preservadores qumicos ya sea una sustancia qumica o una mezcla de stas, que contribuyen a prolongar el tiempo crtico del anlisis de das a meses, dependiendo de la sustancia qumica y los estadios de los parsitos a conservar.

Uno de los conservadores qumicos que ms se emplea en el trabajo rutinario de Parasitologa es el PAF porque presenta las siguientes caractersticas:

Nombre comnComponentesEstadios de los parsitos que conservaTipo de muestra de heces para la que se recomienda

PAF (fenol-alcohol-formol)Fenol, solucin salina isotnica, formol, alcohol etlico al 95% y agua destiladaTrofozoitos, quistes, ooquistes, huevecillos y larvasPara todo tipo de consistencia de heces

V.- FORMA DE RECOLECTAR LA MUESTRA

Debe usarse un frasco con las siguientes caractersticas; que sea de vidrio de preferencia (o de plstico que previamente se haya demostrado que no reacciona con el PAF), que sea de boca ancha, con tapa hermtica, y con capacidad de 100 - 150 ml. Se recomiendan los frascos Gerber 2da etapa.

Se colocan 50 ml del conservador PAF en el frasco, se agrega la primera muestra de heces del tamao de una haba y se mezcla perfectamente con ayuda de un abatelenguas se tapa el frasco y se guarda en un lugar seco y lejos del sol.

La segunda muestra se recolecta de la misma manera y la tercera de la misma manera. Todas las muestras se recolectan en el mismo frasco.

Las muestras pueden recolectarse en 3 das sucesivos o en das alternados de preferencia.

El frasco guardado en las condiciones indicadas arriba, permite que el PAF conserve a la muestra hasta por un mes o ms tiempo, dependiendo de las estructuras parasitarias que contenga.

VI.- TCNICA (PROCEDIMIENTO).

1. Mezclar con el abatelenguas o varilla de vidrio a hacer una suspensin homognea, el contenido del frasco (PAF-materia fecal).

2. Filtrar la suspensin a travs de la coladerita colocada en el embudo y stas a su vez colocadas en el tubo de ensayo, teniendo cuidado de no llenar completamente el tubo, debe dejarse siempre aproximadamente un cm del tubo sin llenar.

3. Centrifugar el tubo a 2,000-2,500 rpm durante 1 minuto.

4. Decantar el sobrenadante en un frasco recolector ex profeso.

5. Re suspender el sedimento con 2-3 ml de PAF, ayudndose con un aplicador de madera y se completa el volumen con ms PAF, dejando un cm del tubo sin llenar, se mezcla nuevamente con el aplicador de madera.

6. Centrifugar nuevamente el tubo a 2,000-2,500 rpm durante 1 minuto.

7. Repetir los pasos 4-6, hasta que el sobrenadante se observe limpio, no ms de dos veces.

8. Decantar el sobrenadante en un frasco recolector ex profeso.

9. Re suspender el sedimento con 2-3 ml de Soln de sulfato de zinc, ayudndose con un aplicador de madera y se completa el volumen con ms soln de sulfato de zinc, dejando un cm del tubo sin llenar, se mezcla nuevamente con el aplicador de madera.

10. Centrifugar nuevamente el tubo a 2,000-2,500 rpm durante 2 minutos.

11. Sacar el tubo de la centrfuga con cuidado sin agitarlo y colocarlo en la gradilla.

12. Quemar el asa con el mechero y dejar enfriar.

13. Colocar el anillo del asa sobre la pelcula del sobrenadante y recolectar una muestra.

14. Depositar la muestra en una gota de lugol previamente colocada en el portaobjetos, lavando el anillo del asa en el lugol.

15. Tomar otras dos asadas de la pelcula del sobrenadante y repetir el paso 14.

16. Mezclar con la punta del cubreobjetos y cubrir la preparacin con el mismo, cuidando que no se formen burbujas.

17. Observar la preparacin primero con el objetivo 10X y luego con ms cuidado con el objetivo 40-45X.

18. La observacin debe hacerse de manera sistemtica abarcando toda la superficie del cubreobjetos, incluso los bordes del mismo.

19. Reportar lo observado.VII.- VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Ventajas

Adems de las propias del mtodo, al usar el PAF se obtienen las siguientes:

a. Se pueden recolectar 3 o ms muestras en el conservador, lo que permite realizar un CPS seriado.

b. Al ser mayor la cantidad de heces, la muestra es ms representativa, es decir hay mayor probabilidad de encontrar formas parasitarias, an cuando la parasitosis sea leve o moderada.

c. Se hace un solo procesamiento de la muestra en lugar de 3, que redunda en un ahorro de tiempo y econmico para el laboratorio.

d. Se facilita el manejo de la muestra ya que con el conservador se desinfecta y desodoriza la misma.

e. Se puede procesar la muestra en otro da, cuando en el presente se tengan demasiadas muestras.

f. La persona a analizar, no tiene que acudir al laboratorio en tres ocasiones, sobre todo si el laboratorio se encuentra lejos de su domicilio, beneficindole en ahorro de tiempo y dinero.

g. A nivel comunitario se pueden hacer muestreos a gran escala y luego procesar las muestras de acuerdo al tiempo que se tenga.

h. Se puede realizar otro preparado de la muestra para su verificacin o investigacin, en el caso de encontrarse con parsitos no comunes o no frecuentes en el medio. E incluso se puede remitir la muestra a un centro de investigacin.

Desventajas

En cuanto al uso del PAF, a pesar de que puede preservar trofozotos, durante la realizacin del mtodo CPS, stos pueden deformarse o destruirse.

En cuanto al mtodo CPS, las mismas que para el mtodo sin uso del conservador.Prctica N 5MTODO CPS DE CONCENTRACIN POR FLOTACIN DE SHEATHEROBJETIVOS: Aprender a realizar un mtodo coproparasitoscpico cualitativo de concentracin por flotacin.

Conocer las ventajas y utilidad de ste mtodo, en el diagnstico de coccidiosis.Realizar la bsqueda e identificacin de formas parsitas en las heces.

INTRODUCCINEsta tcnica se ha empleado con buenos resultados en el rea veterinaria, y recientemente se ha introducido en el laboratorio de parasitologa mdica, como un apoyo importante en el diagnstico de las coccidiosis.

Debido al tamao pequeo y a la morfologa similar entre los ooquistes de Cryptosporidium spp y Cyclospora cayetanensis, as como a la cantidad baja de los mismos que se observan en los coproparasitoscpicos (CPS) de rutina, es que se ha hecho necesario introducir mtodos CPS que hagan una mejor concentracin de los ooquistes, as como el que sea ms fcil su recuperacin. Siendo el CPS de Sheather el que ha demostrado tener dichas ventajas.Los ooquistes as recuperados y concentrados posteriormente se someten a la tcnica de tincin de Ziehl-Neelsen modificado, lo que a su vez permite identificar y diferenciar a Cryptosporidium spp y a Cyclospora cayetanensisFundamento.

Se basa en la flotacin de quistes, ooquistes y huevos de parsitos en una solucin de azcar que posee mayor densidad que ellos. Requerimientos.- Tubos de ensayo 13 x 100.

- Portaobjetos std- Cubreobjetos de 22X22 mm- Aplicador.

- Solucin saturada de azcar con densidad de 1.18 Baum- Asa de platino.

- Gradilla para tubos de ensayo.

- Suero fisiolgico - Embudo de vidrio.- Gasa o coladeritaProcedimiento.

1.- Homogeneizar 1 a 2 g de materia fecal en suero fisiolgico.

2.-- Colocar un embudo de vidrio con una gasa doblada en la abertura del tubo de ensayo y filtrar el material homogeneizado.

3.- Centrifugar el tubo con el material homogeneizado a 1500 r.p.m. durante 2 a 5 minutos.

4.- Eliminar el sobrenadante, y agregar la solucin de azcar hasta 1 cm del borde del tubo, agitar hasta disolver el sedimento..

5.- Centrifugar como en el paso anterior.

6.- Completar con la solucin de azcar hasta el borde y esperar de 2 a 5 minutos la formacin de un menisco.

7.- Con la ayuda del asa de platino, tomar una muestra de la superficie del menisco y colocarla en portaobjetos.

8.-Agregar lugol, cubrir con un cubreobjetos y observar al microscopio. 9.-En el caso de observar coccidios, de la superficie del preparado, tomar con la asa de platino o con una pinza curva, una muestra para preparar un frotis para teir por el mtodo de Ziehl Neelsen modificado.

Utilidad

Esta tcnica es til para la concentracin de quistes y ooquistes de protozoos y huevos de helmintos y se usa como mtodo preferencial en el diagnstico de los coccidios: Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora, etc.

PRCTICA N 6MTODO COPROPARASITOSCPICO DE CONCENTRACIN POR SEDIMENTACIN DE MIFC

OBJETIVOS: Aprender a realizar un mtodo coproparasitoscpico cualitativo de concentracin por sedimentacin que adems utiliza el conservador qumico MIF.

Realizar la bsqueda e identificacin de formas parsitas en las heces.

Conocer las ventajas, utilidad y desventajas de este mtodo.

INTRODUCCIN.

Esta tcnica coproparasitoscpica fue descrita en 1955 por Blagg y cols., y es semejante en gran parte a la tcnica de formol ter (de Ritchie, 1948), slo que en ste caso se utiliza el conservador MIF en lugar del formol, por lo que es uno de los mtodos CPS de concentracin por sedimentacin ms utilizados y preferidos en cualquier laboratorio de anlisis clnicos, debido a las ventajas que presenta.

La introduccin del uso de los conservadores o preservadores qumicos en el trabajo rutinario de la parasitologa clnica, no slo contribuyen a prolongar el tiempo crtico del anlisis de das a meses, sino que tambin ha permitido disear otras tcnicas coproparasitoscpicas o modificarlas, logrando con ello la mejor recuperacin e identificacin de las formas parasitarias.

El MIF es uno de los conservadores qumicos que en segundo lugar se emplea en el trabajo rutinario de parasitologa (despus del PAF) porque presenta las siguientes caractersticas:

Nombre comnComponentesEstadios de los parsitos que conservaTipo de muestra de heces para la que se recomienda

MIF (merthiolate-iodo-formol)Solucin de mer-thiolate rojo, solucin madre de yodo-yoduro al 5% 10% respectivamente, gli-cerina y agua destiladaTrofozoitos, quistes, ooquistes, huevos y larvasPara todo tipo de consistencia de heces

Fundamento del uso de los conservadores qumicosLa mayora de estas sustancias son fijadoras, es decir que actan a nivel de los grupos carboxilo y amino de las protenas de membranas de las formas parasitarias, ocasionando una precipitacin o coagulacin de esas protenas y endureciendo dichas membranas, por lo que se conserva la forma original del parsito (caracterstica clave para su identificacin).

En el caso del MIF, el formol es el fijador.

FUNDAMENTO DEL MTODO MIFC

Este mtodo se basa en una diferencia de densidades entre la solucin que se emplea y la de las formas parasitarias, es decir, se basa en la utilizacin del ter etlico anhidro con densidad menor o igual a 1, que por ser menor a la densidad de las estructuras parasitarias (1.05 1.15), ocasiona que stas precipiten o sedimenten y ste proceso se agiliza con la centrifugacin.

Adems, tambin la acetona que contiene el merthiolate rojo contribuye a reducir la densidad de toda la solucin.

El ter acta tambin como un saponificador, por lo que al eliminarse los corpsculos de grasa se facilita la identificacin microscpica de las formas parasitarias.

Por otro lado la eosina que contiene el merthiolate y el lugol que contiene la solucin de MIF, colorean las estructuras parasitarias, facilitando su identificacin. Aunado a la accin del formol como fijador.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO Muestra fecal recolectada adecuadamente

Aplicadores de madera

Portaobjetos de 25X76 mm.

Cubreobjetos de 22X40 mm.

Frasco de vidrio de 100 ml

Abatelenguas

Tubos de ensaye cnicos, graduados, para centrfuga, de 15 ml

Tapn de caucho para el tubo cnico

Pipeta Pasteur de punta larga

Algodn

Embudo de 7.5 cm de dimetro

Coladerita de 3.5 a 5 cm de dimetro

Gradilla

Solucin de MIF

ter etlico anhidro (es importante sta caracterstica por la densidad) Microscopio compuesto ptico.

Centrfuga

FORMA DE RECOLECTAR LA MUESTRA Para la solucin MF (merthiolathe,formol, glicerina y agua destilada) debe usarse un frasco con las siguientes caractersticas; que sea de vidrio, de boca ancha, con tapa hermtica, y con capacidad de 100 150 ml. Se recomiendan los frascos Gerber 2da etapa. Para la solucin madre de lugol debe usarse un frasco con las siguientes caractersticas; que sea de vidrio y de color mbar, de boca ancha de preferencia, con tapa hermtica, y con capacidad de 10 20 ml.

Se pueden usar tubos de ensaye para las soluciones, pero para el lugol es muy importante proteger el tubo del sol, y hay que usar tapones adecuados para evitar el derrame de las soluciones. Las cantidades de las soluciones a usar dependen de la cantidad de la muestra fecal y del nmero de muestras a recolectar, como se indica a continuacin:

Cantidad de hecesSoln MFSoln madre de lugol

Mediana + 0.50 g4.7 ml 0.30 ml

Grande + 1.00 g9.4 ml0.60 ml

Las soluciones MF y de lugol se mezclan inmediatamente antes de colocar la muestra fecal (se recomienda lavar el frasco que contena el lugol, con la mezcla de las dos soluciones, para evitar prdidas de lugol, por ser pequeo el volumen). Se mezcla perfectamente con ayuda de un abatelengua, se tapa el frasco y se guarda en un lugar seco y protegido del sol.

Si se van a recolectar ms de una muestra, stas se recolectan por separado, de la misma manera que la primera. Rotulando cada una de ellas con el nmero correspondiente. Las muestras pueden recolectarse en 3 das sucesivos o en das alternados de preferencia. El frasco(s) guardado(s) en las condiciones indicadas arriba, permite que la muestra con el MIF se conserve hasta por una semana, dependiendo de las estructuras parasitarias que contenga y de la calidad del merthiolate. Es importante dejar reposar la muestra mnimo 24, para que el MIF pueda llevar a cabo su funcin, sobre la de colorear a las formas parasitarias. Se recomienda no dejar pasar ms de dos das posterior a la colecta de la muestra, para obtener mejores resultados al analizar la muestra.TCNICA (PROCEDIMIENTO).

1- Mezclar bien la suspensin de MIF- materia fecal, con ayuda de un abatelenguas.

2- Filtrar la suspensin a travs de la coladerita colocada en el embudo y stas a su vez colocadas en el tubo de ensayo cnico, teniendo cuidado de no rebasar la marca de 10 mililtros.

3- Si la cantidad de muestra no es suficiente para llegar a la marca de 10 ml, se completa con soln de MIF (recin mezcladas las dos soluciones), y se homogeniza con un aplicador de madera.

4- Se agregan 3 ml de ter etlico anhidro y se tapa el tubo con el tapn de caucho.

5- Agitar vigorosamente pero con cuidado durante un minuto, hay que sujetar el tapn con un dedo para evitar que se bote el contenido del tubo.

6- Despus de agitar y sin quitar el tapn, se deja reposar el tubo durante 5 10 segundos, para evitar la expulsin del contenido del tubo.

7- Quitar el tapn con cuidado y centrifugar el tubo a 1500 2,000 rpm durante 2 minutos.

8- Sacar con cuidado el tubo de la centrfuga, sin agitar y colocarlo en una gradilla.

9- Observar la formacin de 4 capas en el tubo, de arriba hacia abajo: a) ter con grasa, b) tapn de restos fecales, c) solucin de MIF y d) sedimento con las formas parasitarias, si es que las hay.

10- Preparar un aplicador de madera, un hisopo grueso y un frasco para decantar el sobrenadante.

11- Introducir el aplicador de madera pegado a la pared del tubo, hasta rebasar aproximadamente 1 1.5 cm el tapn de restos fecales, y sin despegar el aplicador de la pared del tubo, se gira hasta desprender todo el tapn fecal, se retira con cuidado el aplicador de madera.

12- Decantar el sobrenadante en un frasco ex profeso, dejando slo el sedimento.

13- Inmediatamente antes de enderezar el tubo, con un hisopo grueso, se limpian las paredes del tubo de manera circular, sin tocar el precipitado.

14- Colocar el tubo en una gradilla.

15- Tomar de la parte superior del sedimento una muestra pequea con ayuda de la pipeta Pasteur.

16- Depositar la muestra en una gota de solucin MIF (recin mezcladas las dos soluciones) previamente colocada en el portaobjetos.

17- Mezclar con la punta del cubreobjetos y cubrir la preparacin con el mismo, cuidando que no se formen burbujas.

18- Observar la preparacin primero con el objetivo 10X y luego con ms cuidado con el objetivo 40 45X.

19- La observacin debe hacerse de manera sistemtica abarcando toda la superficie del cubreobjetos, incluso los bordes del mismo.

20- Reportar lo observado

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Ventajas

a) Es sencillo y fcil de realizar.

b) No se invierte mucho tiempo para su realizacin.

c) Hace una buena concentracin de las estructuras parasitarias en el fondo del tubo cnico debido al proceso de sedimentacin centrifugacin.

d) Se recuperan estructuras parasitarias tales como; quistes de protozoarios, larvas y huevecillos de helmintos.

e) Los huevos de helmintos como Taenia sp, Ascaris lumbricoides no fertilizados y de trematodos como Fasciola hepatica y Paragonimus mexicanus, as como los quistes de Balantidium coli, por ser pesados tienden a sedimentar, por lo que ste mtodo es ideal para su recuperacin.

f) Algunos analistas con mucha experiencia en el manejo de sta tcnica han reportado el hallazgo de trofozotos de protozoarios, sobre todo de Giardia lamblia, debido al uso del conservador MIF, sin embargo, algunos investigadores dicen que el ter y la centrifugacin pueden destruir los trofozotos.

g) Los componentes del MIF como el lugol y la eosina que contiene el merthiolate rojo, colorean a las formas parasitarias en tonos amarillo, naranja, rosado-rojizo, dependiendo de la madurez y tipo de la estructura parasitaria y del tiempo que tenga sta en el conservador. Las estructuras no parasitarias tales como clulas vegetales, fibras vegetales, etc., tienden a teirse de caf, por lo que se pueden diferenciar muy bien de las parasitarias.

Desventajas

a. Es relativamente caro por requerir de varios reactivos, los tubos cnicos son ms caros que los que generalmente se usan en laboratorio y no tan fcil de conseguir en el mercado.

b. Por el tamao de los tubos y su dimetro, se requieren de centrfugas con camisas adecuadas para ellos.

c. Algunos investigadores dicen que el ter y la centrifugacin pueden destruir los trofozotos.PRACTICA No. 7AMIBA EN FRESCO

OBJETIVOS: Conocer el mtodo de laboratorio para la toma de muestra en el estudio de la amiba en fresco.Realizar la bsqueda de trofozoitos y quistes de amibas.INTRODUCCION

El diagnstico de la amibiasis se realiza demostrando la presencia de trofozoitos o quistes de Entamoeba histolytica. En el caso de amibiasis intestinal aguda, se debern buscar a los trofozoitos en una serie de al menos tres muestras sucesivas de materia fecal, las muestras sern obtenidas de evacuaciones recientemente emitidas (frescas) o mediante examen de toma de muestra directa, sin administrar purgantes y debern ser observadas de inmediato sin haberlas sometido a cambios bruscos de temperatura, porque es posible que se lisen los trofozoitos y ya no se observe nada (soportan hasta 5 % de presin parcial de oxgeno). Cuando se trata de lactantes, no es conveniente obtener la muestra del paal, porque con frecuencia ya se habrn destruido los trofozoitos.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO Un paciente infantil

1 par de guantes

Materia fecal recin emitida o recolectada directamente del intestino. Portaobjetos de 7.5X2.5 cm 7.5X5 cm

Cubreobjetos de 22X22 mm, #1 #2 Aplicadores de madera

Sonda de alimentacin nasogstrica K 30 del No 7. Jeringa de 10 ml

Solucin salina fisiolgica (0.85%) AMA (azul de metileno) Marcador Microscopio

Tubo de 13 x 100 Contenedor con solucin desinfectante (Cloro al 5%) para descartar materialPreparacin de reactivos

Solucin salina fisiolgica

Cloruro de sodio..0.85 g

Agua destilada.100 ml

Mezclar hasta disolucin completa de los cristales. Guardar en frasco rotulado. Para uso diario mantener en frasco de gotero rotulado.

Tincin de Lugol fuerte (parasitolgico).Iodo metlico..1 parte

Ioduro de potasio2 partes

Agua destilada30 partes

Debe prepararse semanalmente.

Iodo1 g

Ioduro de potasio.10 g

Agua destilada.100 ml

Tincin de azul de metileno amortiguado (AMA)

La tincin de (AMA) es una tcnica rpida que se utiliza en preparaciones hmedas, cuando se sospecha la existencia de trofozotos en las preparaciones con solucin salina, los cuales han perdido su movilidad y tienden a redondearse haciendo difcil su identificacin.

Solucin A (solucin de cido actico)

1cido actico glacial

1.2 mL2Agua destilada

98.8 MlPreparacinDepositar el agua destilada en un matraz, aadir el cido actico y mezclar guardar bien tapado. Esta solucin es estable durante un mes

Solucin B (solucin de acetato sdico)

1Acetato sdico (CH3C00Na)

1.6 g.

Si se usa acetato sdico cristalino (CH3C00Na.3H20)

2.6 g.

2Agua destilada

100 mL

Preparacin

Disolver el acetato sdico en 100 mL de agua destilada, mezclar y guardar en frasco bien tapado. Esta solucin es estable durante 6 mesesSolucin de trabajo para la tincin

1Solucin A

46.3 mL

2Solucin B

3.7 mL

3Colorante azul de metileno

0.5 g.

4Agua destilada

50.0 mL

Preparacin

Colocar los 50 mL de agua destilada en un matraz y aadir las soluciones A y B mezclar perfectamente, posteriormente agregar el azul de metileno y agitar hasta que se disuelva. Guardar en frasco mbar. Esta solucin es estable indefinidamente, si se sedimenta un poco el colorante se recomienda filtrar la solucin.TCNICA (PROCEDIMIENTO).

1.- Se llena una jeringa de 10 ml con SSI, a la jeringa se le conecta una sonda de alimentacin nasogstrica K 30.

2.- Se purga la songa con la solucin salina3.- Se llena nuevamente la jeringa4.- Se pide al paciente, o en su caso a la mam que coloque al infante en posicin supina (boca abajo) se le introducen unos 5 10 cm del extremo libre de la sonda por el recto y se le inyecta suavemente la solucin contenida en la jeringa.

5.- Si el paciente est muy deshidratado, se vuelve a llenar la jeringa con otros 10 ml de SSI y se le aplica al paciente.

6.- Una vez que se ha vertido toda la SSI se deja reposar al paciente sin sacarle la sonda por unos 3 4 minutos, con la finalidad de que la SSI entre en contacto con la ltima porcin del intestino.

7.- Transcurrido el tiempo se aspira la SSI que ha estado en contacto con el intestino a travs de la sonda, rotando un poco la sonda para evitar que los orificios de la sonda entren en contacto con las paredes del intestino y se tape la sonda y evite la succin de la SSI.

8.- Si no se aspira liquido, retirar la jeringa de la sonda (sin retirar la sonda del recto)

9.- Llenar nuevamente la jeringa y se vuelve colocar en la sonda

10 -Inyectar el agua

11.- Aspirar el lquido, que vendr con la materia fecal12.- Ya que se hayan succionado unos 3 a 5 ml de SSI se retira la sonda poco a poco, luego una vez afuera del ano se absorbe aire de manera que todo el lquido contenido en la sonda pase a la jeringa.13.- Una vez que est llena la jeringa con la solucin con materia fecal, depositar sta solucin en el tubo de 13x100.14.- Pasar este tubo a bao mara a 37 oC.15.- Se colocan 2 gotas en un portaobjetos, una de las cuales se observa directamente y a la otra gota con AMA.Procedimiento de tincin y preparacin de la muestra.

1. Colocar una gota de colorante de azul de metileno (AMA) y otra de solucin salina sobre un portaobjetos

2. Con una pipeta pasteur colocar aproximadamente 50 L. de la muestra problema.

3. Agregar otra gota de solucin salina al 0.85% y homogeneizar.

4. Cubrir la preparacin con cubreobjetos

5. Dejar reposar la preparacin durante 10 m minutos para el AMA y 1 minuto para la SSI6. Observar al microscopio con objetivo de 10 a 40X.Interpretacin:

Las muestras obtenidas debern ser observadas de inmediato. Buscar los trofozoitos, stos son mviles. La identificacin se realiza diferenciando a los trofozoitos de los macrfagos, los trofozoitos presentan pseudpodos hilinos, son ms grandes (20 30 micromtros) que los macrfagos (12 14 micrmetros).

PRCTICA N 8OBSERVACIN DE PROTOZOARIOS DE TUBO DIGESTIVO Y VAS GENITOURINARIASOBJETIVOS

Aprender a realizar la bsqueda e identificacin de protozoarios de tubo digestivo y vas genitourinarias ms frecuentes en nuestro medio.

Conocer las caractersticas morfolgicas de algunas especies de protozoarios de tubo digestivo y de vas genitourinarias, de los grupos de los sarcodinos, flagelados, ciliados y coccidios en sus diferentes etapas de desarrollo; trofozotos, quistes u ooquistes.

Conocer la importancia y las ventajas del uso de algunas tcnicas de tincin permanente, as como de cortes histolgicos y los coproparasitoscpicos, en el diagnstico de las protozoosis.

INTRODUCCIN

Los protozoarios fueron descubiertos por Leeuwenhoek en el ao 1674 conjuntamente con la invencin del microscopio, y a la fecha se reconocen cerca de 50 000 especies de protozoarios. Aproximadamente 60 especies son parsitas del humano y cerca de 15 son comensales.

Concepto de protozoario: el protozoario es un organismo unicelular, eucaritico y hetertrofo, capaz de llevar a cabo por si solo sus funciones vitales de reproduccin, nutricin respiracin, excrecin y movimiento.

Los protozoarios de importancia mdica presentan un tamao microscpico que oscila entre 2 a 200 . Su forma es diversa; esfricos, ameboideos, alargados, piriformes, etc. Presentan ncleo(s), diversos orgnulos y citoesqueleto. Su reproduccin puede ser asexual o sexual, o de los dos tipos, y puede ser sencilla (divisin binaria) o compleja (esquizogonia, gametogonia, esporogonia). Se pueden localizar prcticamente en cualquier parte de nuestro organismo, y producir cuadros clnicos diversos con sintomatologa poco aparente, o en otros casos las lesiones pueden ser graves, deformantes e incluso mortales.

Por ejemplo la amibiasis es la tercera enfermedad parasitaria ms importante del mundo y su agente etiolgico Entamoeba histolytica, causa 40 000 100 000 muertes por ao por complicaciones.

La giardiosis se calcula que afecta a 16 millones (15%) de personas en las zonas rurales de Amrica Latina, y su agente etiolgico Giardia lamblia, ha sido identificado como uno de los principales responsables de episodios diarreicos en guarderas y asilos.

Los protozoarios se pueden clasificar desde diversos puntos de vista, adems de la clasificacin taxonmica (reino, phylum, orden, familia, gnero y especie), en:

Clasificacin por rganos de locomocin:

a) ciliados

b) flagelados

c) sarcodinos

d) esporozoarios

e) microsporidios.

Por su microhabitat o localizacin en el hospedero, se clasifican en:a) protozoarios de tubo digestivo o intestinal

b) protozoarios tisularesc) protozoarios sanguneosd) protozoarios de otras localizaciones; genitourinarias, vas respiratorias y bucales.Por su efecto en el hospedero los protozoarios pueden ser:a) comensales: no producen enfermedad, pero no deben estar en el humano.

b) parsitos: producen enfermedad.

Caractersticas generales de los protozoarios de acuerdo a la clasificacin por rganos de locomocin:

Gruporganos de locomocinTipo de reproduccinEspecies parsitas para el humanoOtras caractersticasEstadios que presentan

Sarcodinos

(amibas)SeudpodosFisin binariaAlgunas

Otras son comensales y otras de vida libreMembrana celular fina, pueden presentar diferenciacin del citoplasma en ecto y endoplasma, algunas carecen de mitocondrias.

Las caractersticas nucleares son taxonmicas.Trofozotos

Quistes

CiliadosCiliosConjugacin

Fisin binariaSlo unaPresentan; dos ncleos; citostoma, citoprocto, as como vacuolas contrctiles.Trofozotos

Quistes

Esporozoarios

o

AphycomplexaNo presentanEndodiogenia

Esporognica

Esquizogonia

Todas las que lo infectanGeneralmente son intracelulares Presentan una estructura caracterstica llamada complejo apical, con capacidad para penetrar clulas hospederas.Trofozotos

Quistes

Ooquistes

Esporozotos

Gametocitos

Esquizontes

Merozotos

*Microsporidios*Microsporidios:

Fisin binaria o mltiple.

Produccin de esporas.*Organismos primitivos.

Intracelulares obligados.

El esporoplasma es inoculado directamente en la clula hospedera por el tubo polar.Esporas

Esporoplasma

FlageladosFlagelos

Membrana ondulanteFisin binaria longitudinalAlgunas.

Otras son comensalesAlgunos presentan axostilo (rudimento de esqueleto).

Otros presentan kinetoplasto (organelo formado a partir de mitocondrias modificadas), con importancia taxonmicaTrofozotos

Quistes

Amastigotes

Promastigotes

Epimastigotes

Tripomastigotes

Clasificacin taxonmica de los protozoarios que afectan al humano

REINO

PROTISTA

Algunos gneros de importancia mdica

Subreino

Protozoa

Phylum

Sarcomastigophora

SubphylumSarcodina

Entamoeba, Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia

Subphylum

Mastigophora

Giardia, Leishmania, Trypanosoma, Trichomonas, Dientamoeba

Phylum

Apicomplexa

Cyclospora, Isospora, Sarcocystis, Plasmodium, Toxoplasma, Cryptosporidium

Phylum

Ciliophora

Balantidium

Phylum

Microspora

Enterocytozoon, Encephalitozoon, Nosema, otros

Reino

Subreino

Subphylum

Chromista

Chromobiota

Opalinata

Blastocystis

Fuente: Dra. Teresa Uribarren Berrueta. Protozoos. Modificacin a Clasificacin taxonmica. UNAMDESARROLLO DE LA PRCTICA.

1.- Coloque en el microscopio con mucho cuidado cada una de las laminillas que le proporcione su maestra(o), recordando los pasos a seguir para el enfoque.

2.- Recuerde que aunque vaya a observar con el objetivo de inmersin, primero debe enfocar con el objetivo de 10X, luego con el de 40X y luego con el de 100X.3.- Con el apoyo de algn esquema o atlas, realice las observaciones de la siguiente manera:

4.- Observe de cada protozoario; el estadio, la forma, las caractersticas tintoriales, los orgnulos que pueda identificar y el tamao (con respecto al rea del campo del objetivo con que est observando).

5.- Compare las caractersticas entre las especies de amibas observadas: Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Endolimax nana y/o Iodamoeba butschlii.6.- Compare las caractersticas entre las especies de flagelados observados: Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Chilomastix mesnili y/o Enteromonas hominis.7.- Compare las caractersticas entre las especies de coccidias observadas: Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis y/o Isospora belli.8.- Observe el estadio, la forma, las caractersticas tintoriales, los orgnulos que pueda identificar y el tamao (con respecto al rea del campo del objetivo con que est observando), de los siguientes protozoarios; Blastocystis hominis y Balantidium coli.

9- Anote el estadio (forma, fase o etapa) del protozoario observado, as como el mtodo, material biolgico y tcnica de tincin, que se emplearon para obtener cada laminilla.PRCTICA N 9OBSERVACIN DE PROTOZOARIOS TISULARESOBJETIVOS

Aprender a realizar la bsqueda e identificacin de protozoarios tisulares comunes en nuestro medio.

Conocer las caractersticas morfolgicas de algunas especies de protozoarios tisulares de los grupos de; los flagelados y de los esporozoarios en sus diferentes etapas de desarrollo.

Conocer la importancia y las ventajas del uso de algunos mtodos de diagnstico para protozoarios sanguneos y de otros tejidos, tales como; frotes y tincin, hemocultivo corte histolgico e impronta.INTRODUCCIN

Continuando con la introduccin de la prctica anterior, otro grupo de protozoarios de inters mdico son los flagelados y los esporozoarios de localizacin en sangre y otros tejidos.

Dentro de la familia Tripanosomatidae existen dos gneros importantes, el gnero Trypanosoma, con varias especies, y el gnero Leishmania que incluye muchas especies.Los ciclos vitales de los protozoarios de ambos gneros, involucran dos hospederos, uno vertebrado que puede ser el humano, y uno invertebrado que es un artrpodo, que a la vez es el vector o transmisor de los protozoarios. Por lo que durante el ciclo biolgico se pueden desarrollar cuatro estadios que reciben los siguientes nombres; amastigote, promastigote, epimastigote y tripomastigote.

En el caso del gnero Leishmania, slo dos etapas se reconocen, el amastigote y el promastigote.

Las especies de Leishmania causan diferentes enfermedades llamadas Leishmaniosis, ya sea a nivel cutneo, mucocutneo o visceral, que pueden ser incapacitantes y mutilantes.

Las especies de Trypanosoma tambin causan diferentes enfermedades; Trypanosoma cruzi causa la enfermedad de Chagas; Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense causan la enfermedad del sueo, ambas llegan a ser mortales.

Dentro del grupo de los esporozoarios tisulares, se encuentran los gneros Plasmodium y Toxoplasma.

En el caso del gnero Plasmodium, existen muchas especies, pero slo cuatro se reconocen como importantes para el humano; Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malarie y Plasmodium falciparum, todos ellos son los causantes de la enfermedad llamada paludismo o malaria, que puede llegar a ser mortal dependiendo de la especie involucrada.

El ciclo vital de los plasmodios involucra dos hospederos; un artrpodo, que es el hospedero definitivo y a la vez el vector del protozoario, y un hospedero definitivo que es el humano. Durante el ciclo biolgico se desarrollan muchos estadios, siendo ms importantes los que se forman dentro de los eritrocitos humanos; trofozotos, esquizontes y gametocitos.

En el caso del gnero Toxoplasma, slo se conoce una especie que afecta al humano, Toxoplasma gondii, que causa la enfermedad llamada toxoplasmosis con dos modalidades, la adquirida y la congnita, siendo ms relevante la segunda porque se pueden presentar abortos o malformaciones congnitas.

El ciclo de ste protozoario involucra tambin dos hospederos; un felino, que es el hospedero definitivo y el hombre u otro animal, que es el hospedero intermediario.

Durante el ciclo se forman varias etapas, de las cuales dos se pueden identificar en el humano; el trofozoto y el quiste.

El diagnstico por el laboratorio de las enfermedades mencionadas anteriormente no es fcil por diversas razones; la ubicacin del parsito es intracelular, las enfermedades se presentan en etapas, y los parsitos cambian de forma y a veces de lugar en el hospedero, durante esas etapas, y la toma de muestra biolgica representa un riesgo de infeccin para el que la realiza.

DESARROLLO DE LA PRCTICA.

1.- Coloque en el microscopio con mucho cuidado cada una de las laminillas que le proporcione su maestra(o), recordando los pasos a seguir para el enfoque.

2.- Recuerde que aunque vaya a observar con el objetivo de inmersin, primero debe enfocar con el objetivo de 10X, luego con el de 40X y luego con el de 100X.

3.- Con el apoyo de algn esquema o atlas, realice las observaciones de la siguiente manera:

4.- Observe de cada protozoario; el estadio, la forma, las caractersticas tintoriales, los orgnulos que pueda identificar y el tamao (con respecto al rea del campo del objetivo con que est observando).

5.- Compare las caractersticas entre las especies de Leishmania observadas:

Leishmania donovani y Leishmania mexicana.6.- Compare las caractersticas entre las especies de Plasmodium observadas: Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum y Plasmodium malarie.7.- Observe el estadio, la forma, las caractersticas tintoriales, los orgnulos que pueda identificar y el tamao (con respecto al rea del campo del objetivo con que est observando), de los siguientes protozoarios; Trypanosoma cruzi y Toxoplasma gondii.

8- Anote el estadio (forma, fase o etapa) del protozoario observado, as como el mtodo, material biolgico y tcnica de tincin, que se emplearon para obtener cada laminilla.9.- Reporte las observaciones de acuerdo al formato que le indique su maestro(a).Prctica N 10Realizacin de tcnicas de tincin, cultivos y mtodos inmunolgicos.

Se incluye a las tcnicas de Tricrmico de Gomori, Ziehl-Neelsen modificado y Giemsa.De cultivos, se incluye a los descritos para Trichomonas vaginalis, amibas de vida libre, Trypanosoma cruzi.

De los inmunolgicos, se incluye a los descritos para amibiasis, toxoplasmosis, enfermedad de chagas.MTODOS DE COLORACIN PARA PROTOZOARIOSMTODO DE ZIEHL-NEELSEN (MODIFICADO PARA OBSERVACIN DE COCCIDIOS: CRYPTOSPORIDIUM Y OTROS)

Fundamento.

Se basa en el comportamiento cido resistente de la cubierta de estos parsitos, los cuales se tien de rojo y destacan sobre un fondo verde o azul, dependiendo del colorante de contraste usado.

REQUERIMENTOS- Lminas portaobjetos.

- Laminillas cubreobjetos.

- Soporte de varillas de vidrio para coloracin de lminas portaobjeto.

- Estiletes o pinzas punta curva.

- Fuscina fenicada- Verde de malaquita o azul de metileno acuoso

- Metanol.

- Hidrxido de sodio al 4%.

- Alcohol cidoProcedimiento.

- Colocar las lminas portaobjetos sobre el soporte de las varillas de vidrio.

- Con el estilete o pinza curva hacer un frotis de heces en la lmina portaobjeto y dejar secar.

- Fijar la lmina con alcohol metlico de 2 a 5 minutos y dejar secar.

- Agregar hidrxido de sodio sobre el preparado por un minuto, eliminar el exceso y lavar con agua.

- Cubrir la lmina con la fucsina fenicada (previa agitacin del frasco) por 5 minutos, diluida previamente en agua al tercio (1 mL colorante y 2 mL de agua).

- Lavar suavemente la lmina portaobjeto con agua corriente.

- Decolorar con alcohol cido, cubriendo el portaobjeto por unos segundos hasta quitar el colorante.

- Lavar suavemente el portaobjeto con agua.

- Colocar como colorante de contraste verde de malaquita 1% o azul de metileno 1 1,4% durante 5 minutos, diluidas previamente al tercio.

- Lavar la lmina suavemente con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente.

- Realizar el montaje con cytoseal, blsamo de Canad o Permount, usar una laminilla cubreobjeto y observar el microscopio.

Observacin.

Los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora aparecen de un color rojo fucsia sobre un fondo verdoso (con verde de malaquita) o azul (con azul de metileno). En algunos casos, no se colorean bien, pero la refringencia caracterstica permite diferenciarlos.Resultado.

Informar los estadios evolutivos de los parsitos encontradosCOLORACIN GRAM Y COLORACIN TRICRMICA (PARA MICROSPORIDIOS).

Fundamento.

Se basa en la identificacin de esporas de Enterocytozoon, Encephalitozoon, etc. por la combinacin de las coloraciones Gram y tricrmica.

REQUERIMENTOS- Lminas portaobjetos.

- Laminillas cubreobjetos.

- Colorante chromotrope

- Coloracin Gram

- Pinza o estilete punta curva.

- Alcoholes 85% y 95% y xilol.

- Mechero de alcohol.

- Microscopio binocular.

- Placas petri 10 x 150 mm.Procedimiento.- Preparar el set de placas petri 10 x 150 mm.

- Realizar un frotis fino en una lmina o laminilla y dejar secar.

- Fijar el frote pasndolo 3 veces por una llama, un segundo de tiempo por vez.

- Agregar el colorante cristal violeta y esperar 1 minuto.

- Enjuagar en agua corriente y eliminar totalmente el agua.

- Adicionar el yodo de Gram por 30 segundos, remover el exceso con el decolorante y enjuagar con agua.

- Agregar el colorante chromotrope por 5 minutos de 50C a 55 C.

- Pasar por el decolorante (alcohol 90% y cido actico 1%) de 1 a 3 segundos.

- Pasar por alcohol 95% y por alcohol etlico absoluto por 1 minuto.

- Pasar un minuto por xilol buscando que la coloracin sea adecuada para visualizar el parsito.

- Realizar el montaje y observar al microscopio.Observacin.Observar al microscopio a 10X y 40X. Para observar al microscopio a 100X, cubrir con aceite de inmersin.

Se observan las esporas de Enterocytozoon, Encephalitozoon, Nosema, etc., que aparecen de un color rosado o rojo tenue o fucsia sobre el fondo verde o azul.

Resultado.Informar los parsitos encontrados

COLORACIN TRICHROME (GOMORI WHEATLEY).

Fundamento.

Permite colorear las estructuras internas de los protozoos para su caracterizacin. Esta tcnica utiliza muestras de heces frescas, preservadas con PVA o fijadas con Schaudinn. Es un mtodo rpido y de utilidad en el estudio de Entamoeba, Giardia, Balantidium, Cyclospora y otros protozoarios.

REQUERIMENTOS- Lminas portaobjetos.

- Laminillas cubreobjetos.

- Asa de platino.

- Estilete curvo o pinza curva.

- Agua destilada.

- Tintura de Yodo.

- Cytoseal o blsamo de Canad.

- Alcoholes 85%, 90% y 95% y absoluto.

- Xilol.

- Colorante chromotrope.

- Acido actico.

- Solucin Schaudinn.

- Frascos coplin o placas Petri.Procedimiento.- Preparar un set de placas Petri 15 x 150 mm con los reactivos correspondientes, sujetar la laminilla con el porta-laminillas y con el estilete o pinza curva hacer el frote fino de la muestra sobre la laminilla.

- Fijar la muestra con solucin Schaudinn por 2 a 5 minutos.

- Pasar por alcohol 70% con 2 3 gotas de tintura de yodo.

- Pasar por un minuto por alcohol 70%.

- Pasar por el colorante chromotrope de 8 a 15 minutos.

- Pasar por alcohol 90% con cido actico al 1% de 10 a 15 segundos y ver tono de coloracin.

- Pasar por alcohol 95% y alcohol absoluto durante 3 minutos.

- Pasar por xilol de 1 a 5 minutos. No debe verse opaco.

- Realizar el montaje con cytoseal, blsamo de Canad o Permount.Observacin.Observar con objetivo de inmersin 100X. El citoplasma de los parsitos se tien de color verde y el ncleo de color rosadoResultado.Informar el nombre del parsito y su estadio evolutivoENSAYOS INMUNOENZIMATICOS (ELISA)

Fundamento.El metodo de ELlSA debe este nombre a sus siglas en ingls: Enzime Linked Immunosorbent Assay, utiliza como principio una reaccin antgeno-anticuerpo especfica, que se hace evidente con el empleo de anti- inmnunoglobulinas acopladas a una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina). Este conjugado IgG-enzima reacciona de manera especfica con su antgeno, sin perder sus caractersticas de reactividad inmunolgica o enzimtica. La accin de la enzima sobre un sustrato genera productos de reaccin coloridos, lo que permite la realizacin de pruebas cualitativas interpretadas por la intensidad del color desarrollado y de pruebas cuantitativas utilizando un colormetro o espectrofotmetro (lector de ELISA),

La tcnica de ELlSA tiene dos variantes:

1. Para determinacin de anticuerpos

2. Para captura de antgeno

En parasitologa la tcnica de ELlSA tiene gran aplicacin en el diagnstico, tanto en parasitosis intestinales como extraintestinales.

1. Determinacin de anticuerpos.-En algunas parasitosis es difcil demostrar la presencia del parsito, pero podemos detectar la respuesta inmune del paciente (anticuerpos) frente a la presencia del agente extrao como en el caso de infecciones por Toxoplasma gondii, Taenia solium (fase larvaria-cisticerco), Toxocara canis y Entamoeba histolytica. La prueba se realiza en muestras de suero, leche, saliva, lgrimas, humor acuoso y LCR.

2. Captura de antgeno.- Molculas antignicas de parsitos presentes en diversos productos biolgicos pueden ser identificadas con el empleo de anticuerpos especficos. La tcnica que se utiliza para este fin es la captura de antgeno en heces, coproantgeno, para el caso de infecciones intestinales por Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum y Entamoeba histolytica.BANCO DE PREGUNTAS PARA LAS PRCTICAS DE LABORATORIO DE PARASITOLOGA I

EXAMEN FSICO, ORGANOLPTICO O MACROSCPICO DE LA MATERIA FECAL.

1- Qu es la materia fecal?

2- Qu elementos constituyen a la materia fecal?

3- Qu aspectos deben considerarse para la recoleccin y obtencin de las heces?

4- Desde el punto de vista parasitolgico, qu informacin nos proporciona el examen fsico de las heces?

5- Cules son las caractersticas fsicas, organolpticas o macroscpicas normales de las heces?

6- A qu se debe el color normal de la materia fecal?

7-A qu se debe el olor normal de las heces?

8-Qu significa la presencia de sangre en la materia fecal?

9-Qu significa la presencia de moco en las heces?

10-A la observacin macroscpica de la materia fecal, qu parsitos (gnero y especie) y qu estadios de los mismos, se pueden encontrar?

11-Con qu sustancias se pueden contaminar las heces si no son recolectadas adecuadamente?

12-De qu manera pueden interferir en el examen fsico de las heces, las sustancias mencionadas en la respuesta anterior? MTODO COPROPARASITOSCPICO DIRECTO

1-Etimolgicamente, qu significa el trmino coproparasitoscpico?

2-Qu es un mtodo coproparasitoscpico?

3-Por qu se le llama tambin CPS en fresco a ste mtodo?

4-Qu es la solucin salina isotnica? y por qu mantiene vivos a los trofozoitos?

5-Qu es la solucin de yodo o lugol parasitolgico? y por qu colorea a las formas parasitarias?

6-Diga el concepto de trofozoito, quiste y ooquiste de los protozoarios.

7-Diga el concepto de huevo, larva y adulto de los helmintos.

8-Qu otras estructuras aparte de las formas parasitarias, tanto normales como anormales se encuentran en las heces a nivel microscpico?

9-Cules son las ventajas y las desventajas de ste mtodo?

12- Cmo debe reportarse el resultado de un coproparasitoscpico?

MTODO COPROPARASITOSCPICO DE FAUST

1-A qu tipo de CPS pertenece ste mtodo?

2-Qu finalidad tiene el hacer la suspensin de las heces?

3-Qu finalidad tiene el realizar el colado de la suspensin de las heces?

4-Cul es la finalidad de los lavados con agua de la materia fecal?

5-Para qu y por qu se utiliza la solucin de sulfato de zinc a densidad de 1.18 Baum?

6-Qu ventajas presenta ste mtodo con respecto a otros CPS, razones por las que se utiliza de rutina en la mayora de los laboratorios clnicos?

7-Qu formas parasitarias se pueden recuperar con ste mtodo?

8-Qu desventajas presenta ste mtodo con respecto a otros CPS?

9-Actualmente, cmo se realiza el mtodo?

10-Qu es un conservador qumico?

11-Cules son los componentes del conservador PAF y cmo actan cada uno de ellos en la materia fecal?

12-Qu ventajas nos proporciona ste conservador en el trabajo rutinario?

13-Qu formas parasitarias preserva el PAF?

MTODO COPROPARASITOSCPICO PARA MUESTRAS PRESERVADAS CON MIF (MIFC).

1-A qu tipo de mtodos CPS pertenece el MIFC?

2-Qu funcin desempea el ter etlico anhdro en este mtodo?

3-Qu funcin desempea el conservador MIF en este mtodo y cules son sus componentes?

4-Qu formas parasitarias se pueden recuperar con este mtodo?

5-Qu ventajas y desventajas presenta este mtodo con respecto al CPS de Faust?OBSERVACIN DE PROTOZOARIOS INTESTINALES Y CAVITARIOS

1-Describa la morfologa de los trofozotos y quistes de los siguientes protozoarios:

Entamoeba histolytica, Entamoeba coli y Balantidium coli .2-Indique cul es el microhabitat en el hospedero humano, de cada uno de los protozoarios anteriores.

3-Qu enfermedad producen cada uno de los protozoarios arriba mencionados?

4-De manera breve explique el ciclo vital de cada uno de los protozoarios anteriormente mencionados.

5-Diga los mtodos de diagnstico directo que pueden utilizarse para la identificacin de los protozoarios anteriores, as como la muestra biolgica y las etapas o formas diagnsticas que se hallaran con cada uno de ellos.

6-Diga qu otras amibas intestinales pueden establecerse en el humano y describa la morfologa de la etapa diagnstica de las mismas.

7-Cul es la diferencia entre un protozoario parsito y uno comensal?8-Qu ventajas presentan el uso de las tcnicas de tincin permanente en la identificacin de los protozoarios intestinales?

9-Diga qu tcnicas de tincin permanente existen para la identificacin de los protozoarios anteriormente mencionados.

10-Clasifique a los protozoarios anteriores de acuerdo a sus rganos de locomocin.

1- Describa la morfologa del trofozoto de Trichomonas vaginalis.

2- Describa la morfologa del quiste y del trofozoto de Giardia lamblia.

3- Indique el microhabitat en el hospedero humano de cada uno de los parsitos mencionados.

4- Qu enfermedad producen cada uno de los protozoarios arriba mencionados?

5- De manera breve explique el ciclo vital de cada uno de los protozoarios anteriormente mencionados.

6- Diga los mtodos de diagnstico directo que pueden utilizarse para la identificacin de los protozoarios anteriores, as como la muestra biolgica y las etapas o formas diagnsticas que se hallaran con cada uno de ellos.

7- Diga qu otros protozoarios flagelados intestinales y cavitarios pueden establecerse en el humano y describa la morfologa de la etapa diagnstica de las mismas.

8- Diga qu tcnicas de tincin permanente existen para la identificacin de los protozoarios anteriormente mencionados.

9- Cules son las caractersticas tintoriales de Giardia lamblia y de Trichomonas vaginalis con las tcnicas de tincin mencionadas anteriormente?

OBSERVACIN DEPROTOZOARIOS TISULARES1-Describa la morfologa del tripomastigote, del epimastigote y del amastigote de

Trypanosoma cruzi.

2-Cul es el microhabitat de Trypanosoma cruzi en el hospedero humano?3-De manera breve explique el ciclo vital de Trypanosoma cruzi.

4-Qu enfermedad produce Trypanosoma cruzi?

5-Diga los mtodos de diagnstico directo que pueden utilizarse para la identificacin de Trypanosoma cruzi, as como la muestra biolgica y las etapas o formas diagnsticas que se hallaran con cada uno de ellos.

6-Qu es un nido de amastigotes?

7-Cules son las caractersticas tintoriales del tripomastigote en el frotis sanguneo teido con Giemsa?

8-Describa las caractersticas morfolgicas del transmisor de este parsito y mencione las etapas por las que pasa durante su ciclo vital.

1-Describa la morfologa del amastigote y del promastigote de Leishmania sp.

2-Cul es el microhabitat de ste parsito en el humano?

3-De manera breve explique el ciclo vital de Leishmania sp.

4-Qu tipo de Leishmaniasis se presentan en nuestro pas?

5-Diga los mtodos de diagnstico directo que pueden utilizarse para la identificacin de las diferentes especies de Leishmania sp, as como la muestra biolgica y las etapas o formas diagnsticas que se hallaran con cada uno de ellos.6-Describa las caractersticas morfolgicas del transmisor de ste parsito.

1- Cules son las especies de Plasmodium sp que se presentan en nuestro pas?

2- De manera breve explique el ciclo vital de los parsitos del paludismo.

3- Cul es el microhabitat en el humano, de stos parsitos?

4- Describa la morfologa de las diferentes etapas de desarrollo que se presentan en el ciclo eritroctico, de cada una de las especies arriba indicadas.

5- Diga los mtodos de diagnstico directo que pueden utilizarse para la identificacin de las diferentes especies de Plasmodium sp, as como la muestra biolgica y l