02-11 identificacion de virus dengue en poblaciones naturales de

IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE

Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA

Estudiante:

Laura Silvana Pérez Restrepo

Asesor:

Idalyd Fonseca González, M.Sc, Dr.Sc.

Profesor Asistente

INSTITUTO DE BIOLOGIA

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

MEDELLIN, OCTUBRE 2011


Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.

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El camino hacia una vida productiva,

llena de felicidad y éxito comienza cuando

logramos que nuestras acciones sean

congruentes con nuestros valores y

principios.

Benjamín Franklin



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DEDICATORIA

A mi Dios a quien le debo mi vida, gracias por iluminar mi camino y por todas las

bendiciones que me llegan cada día. A mi abuela, que aunque ya no está con nosotros, llenó

mi vida de bellas enseñanzas, gracias por brindarme todo el amor y ternura, por enseñarme

a vivir y por hacerme la mujer que soy ahora.



4

AGRADECIMIENTOS

Nuevamente le doy gracias a mi Dios por su eterno amor y compañía, por las mil cosas

maravillosas que me proporciona cada día.

A mis padres Deisy Restrepo y Ruben Pérez, por su compañía, amor, comprensión,

enseñanzas y por la fe que tienen en mí y el apoyo que me han brindado toda mi vida.

A mi asesora de tesis la Dra. Idalyd Fonseca por brindarme esta oportunidad y el apoyo

para hacer que mi sueño de ser bióloga se haga realidad.

A Julián Mosquera por estar siempre a mi lado en esta etapa de mi vida apoyándome y

brindándome sus consejos, amor y comprensión.

Al Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia en cabeza del Dr. Nicolás Jaramillo

por ayudarme en mi formación de pregrado.

Al Dr. Omar Triana por abrirme las puertas del grupo BCEI para realizar mi tesis y por

apoyar mi trabajo.

A José Usme Ciro por sus brindarme sus consejos, amistad y su ayuda.

A mis compañeros del grupo BCEI por su ayuda, por el conocimiento que me brindaron,

sus críticas constructivas, por estar pendientes de mi. En especial a Sebastián, Victor,

Nelson, Dahyana, Edilson, Laura, Yoman y Santiago.

A Duver y Sair por apoyarme y ayudarme en todo lo relacionado con el laboratorio y por

brindarme su amistad.

A la Universidad de Antioquia por brindarme, tantos espacios educativos y de formación, a

todos mis profesores del pregrado en especial al profesor Omar Ocampo Jiménez por

enseñarme a ver la biología con dedicación y a Silvia por ayudarme con todas los asuntos

administrativos.

A mis compañeros del pregrado en biología en especial a Andrea, Cristina, Sara, Edwin,

Rafa, Andrés, Laura Rueda y Ana, por brindarme esa amistad tan maravillosa y por estar

siempre pendientes de mi.

A mi familia materna y paterna por apoyarme y darme tantos consejos.

A los funcionarios de la Dirección Local de Salud de Bello por ayudarme en la colección

del material biológico y por su comprensión.



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Tabla de contenido

1. RESUMEN ......................................................................................................................... 9

2. ANTECEDENTES ........................................................................................................... 10

2.1 FIEBRE POR DENGUE EN EL MUNDO ................................................................ 10

2.2 FIEBRE POR DENGUE EN LAS AMERICAS ........................................................ 12

2.3 FIEBRE POR DENGUE EN COLOMBIA ................................................................ 13

2.4 BIOLOGIA DE A. aegypti .......................................................................................... 14

2.4.1 CICLO DE VIDA DE A. aegypti ......................................................................... 16

2.5 Biología del DENV ..................................................................................................... 18

2.5.1 Estructura y composición del DENV ................................................................... 19

2.5.1 Proteínas estructurales del DENV ........................................................................ 20

2.5.2 Proteínas no estructurales del virus ...................................................................... 21

2.6 Prevención y control de la fiebre por dengue ............................................................. 24

2.6.1 Vigilancia virológica ............................................................................................ 24

2.6.2 Vigilancia entomológica ...................................................................................... 25

2.6.3 Control vectorial ................................................................................................... 25

3. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA .................................................................................... 27

4. HIPÓTESIS: ..................................................................................................................... 30

5. OBJETIVOS: .................................................................................................................... 30

6. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................. 31

7. METODOLOGIA ............................................................................................................. 33

7.1 AREA DE ESTUDIO ................................................................................................. 33

7.1.1 Ubicación del municipio de Bello ........................................................................ 33

7.1.2 Características del municipio de Bello ................................................................. 34

7.2 Colección del material biológico ................................................................................ 34

7.3 Extracción y purificación de ARN .............................................................................. 35

7.4 Cuantificación de ARN ............................................................................................... 35

7.5 Identificación de DENV y serotipos de DENV .......................................................... 35

7.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR) ....... 36

7.6 Visualización de fragmentos virales ........................................................................... 37



6

7.7 Determinación de la tasa mínima de infección viral en mosquitos ............................ 37

8. RESULTADOS ................................................................................................................ 38

8.1 Colección del material biológico ................................................................................ 38

8.2 Identificación de los especímenes ............................................................................... 39

8.3 Análisis genético ......................................................................................................... 39

8.3.1 Extracción de ARN .............................................................................................. 39

8.3.2 Cuantificación del ARN ....................................................................................... 40

8.3.3 Evaluación de la integridad del ARN ................................................................... 40

8.3.4 Identificación de DENV y serotipos .................................................................... 41

8.3.5. Determinación de la mínima concentración. ....................................................... 41

9. DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 44

10. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 47

11. PERSPECTIVAS ........................................................................................................... 48

12. BIBLIOGRAFIA. ........................................................................................................... 49



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Lista de figuras

Figura 1 Países y áreas con riesgo para la transmisión de dengue 2008

Figura 2 Ciclo de transmisión de los DENV

Figura 3 Ciclo de vida de A. aegypti

Figura 4 Representación esquemática del virión maduro, E: envoltura proteica, M: proteína

asociada a membrana, C: proteína core

Figura 5 Genoma de los DENV. Se representa el marco de lectura abierto flanqueado por

dos regiones no traducidas, codifica para 3 proteínas estructurales: C, M y E, y 7 proteínas

no estructurales (NS): NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5

Figura 6 Mapa del municipio de Bello (Antioquia) mostrando su división administrativa en

10 comunas

Figura 7 Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio mostrando la amplificación

del gen ribosomal AAS7. M: machos; H: hembras; El numero indica la cantidad de

mosquitos por pool; CN: control negativo; la flecha indica el tamaño de la banda

amplificada (300pb)

Figura 8 Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio mostrando la amplificación de

los serotipos DENV-2 (carril 2: 362 pb), DENV-3 (carril 3: 265 pb) y DENV-4 (carril 4:

426 pb); Carril 5: muestra positiva correspondiente al serotipo DENV-3.

Figura 9. Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio mostrando la amplificación

de las diluciones seriadas realizadas para determinar la sensibilidad de la RT-PCR.



8

Lista de tablas

Tabla 1 Secuencias nucleotídicas, posiciones consenso (DV1) y primers de tipo específico

(DSP1-4) para la identificación de los serotipos virales

Tabla 2 Barrios muestreados en Bello y la comuna a la que pertenecen

Tabla 3 Distribución de mosquitos en pools y total de pools



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1. RESUMEN

La fiebre por dengue (FD) y su complicación más frecuente, la fiebre hemorrágica por

dengue (FHD) son, en Colombia, la enfermedad transmitida por vectores más prevalente

después de la malaria. Esta arbovirosis es una patología de alto poder epidémico que en los

últimos años se presenta en más del 80% del territorio colombiano, debido principalmente a

la extensa dispersión del vector A. aegypti. Dado el cada vez más creciente número de

casos confirmados de FD/FHD, es fundamental la vigilancia epidemiológica permanente, y

como parte de esta, la vigilancia virológica incluyendo la identificación del virus tanto en

las poblaciones humanas como en los mosquitos en áreas endémicas, con el fin de controlar

y prevenir epidemias, disminuyendo el riesgo de infección con el virus dengue (DENV).

La detección temprana de los casos con la identificación del serotipo circulante, unida al

monitoreo entomológico representan indiscutiblemente la forma más eficaz de evitar brotes

epidémicos; Considerando que la introducción de nuevos serotipos en las poblaciones

humanas susceptibles es uno de los mayores factores de riesgo para la emergencia de brotes

y epidemias de FHD, y que en el municipio de Bello (Antioquia) se registra co-circulación

de al menos dos serotipos virales y casos confirmados de FHD, el objetivo de nuestro

estudio fue identificar la presencia del DENV en poblaciones naturales de adultos del

mosquito vector A. aegypti en el área urbana del Bello, mediante la estandarización de la

reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR), empleando

primers específicos para la región NS3 del DENV. La colección del material biológico se

realizo durante los levantamientos de índices aédicos realizados en compañía del personal

de la Dirección Local de Salud de este municipio. De todo el material colectado (1182

larvas y 52 adultos), fue posible identificar la presencia del serotipo DENV-3 en dos

hembras de A. aegypti capturadas durante un brote epidémico de 2009 en el barrio Peréz, de

la comuna Suaréz; este serotipo DENV-3 estuvo co-circulando con los otros 3 serotipos en

Antioquia entre el 2009 y 2010 según los registros confirmados en aislados humanos. Lo

anterior apoya la posibilidad de que el virus puede mantenerse activo en la población de

insectos durante los periodos no epidémicos permitiendo la aparición permanente de casos

de FD y aumentando la probabilidad de ocurrencia de FHD en el municipio de Bello. Estos

resultados confirman que la técnica molecular empleada es específica para DENV y

sensible al detectar 0.2ng/ul de virus. Aunque la tasa mínima de infección en este estudio

fue de 1.621, a futuro esto puede aumentar si se realizan estrategias de búsqueda de

vectores focalizadas en los lugares con mayor infestación larvaria y reportes de casos de

FD/FHD. La vigilancia virológica en las poblaciones de mosquitos es una herramienta útil

en la predicción de epidemias y debería, en los casos en que sea posible, incluirse en la

vigilancia epidemiológica.

Palabras clave: Aedes aegypti, virus dengue, serotipo, vigilancia, Colombia.



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2. ANTECEDENTES

2.1 FIEBRE POR DENGUE EN EL MUNDO

La fiebre por dengue (FD) es una enfermedad viral, de carácter endémico-epidémico,

transmitida por mosquitos del género Aedes, principalmente por Aedes aegypti (Linnaeus

1762), que hoy constituye la arbovirosis más importante a nivel mundial en términos de

morbilidad, mortalidad y afectación económica (Henchal EA y Putnak JR, 1990).

Esta enfermedad se caracteriza por fiebre bifásica, cefalea, dolor generalizado, postración,

erupción, linfadenopatía y leucopenia. La más seria complicación de la FD es la fiebre

hemorrágica por dengue (FHD), caracterizada por anomalías de hemostasia y el aumento de

la permeabilidad vascular, resultando algunos casos en un síndrome de choque

hipovolémico denominado Síndrome de Choque por Dengue (SCD)(WHO, 1975).

El dengue también es capaz de expresarse mediante las llamadas formas “atípicas” que son

relativamente infrecuentes y resultan de la afectación particularmente intensa de un órgano

o sistema: encefalopatía, miocardiopatía o hepatopatía por dengue, entre otras (Martínez E,

1995; Martínez E, 1997).

Desde el año 1997, el virus del dengue (DENV) y su principal vector, el mosquito A.

aegypti presentan distribución mundial con más de 2,5 billones de personas viviendo en

zonas endémicas y un registro anual de cerca de 100 millones de casos de FD y varios

cientos de miles de casos de FHD, dependiendo de la actividad epidémica (Gubler DJ,

1998).

El DENV es miembro de la familia flaviviridae; está constituido por cuatro serotipos de un

virus ARN que son serológicamente diferenciables (DENV 1, 2, 3 y 4) y que comparten

analogías estructurales y patogénicas, por lo que cualquier ser humano puede producir las

formas graves de la enfermedad sin presentar inmunidad cruzada; Las personas que viven

en áreas endémicas pueden infectarse con cualquiera de los cuatro serotipos de DENV y

además pueden presentarse infecciones por dos serotipos simultáneamente (Wang WK et

al., 2003), lo cual determina la importancia de la identificación del serotipo y el genotipo de

la cepa infectante en relación con el desarrollo de la enfermedad.

La virulencia viral y la respuesta inmune son considerados los dos mayores factores en la

patogénesis de la FHD. Actualmente se considera la hipótesis de “infección secundaria”

como la principal causa del incremento en el número de casos de FHD y SCD en el mundo

(Guzmán MG et al., 2007).



11

La inmunidad que deja la infección por cada uno de los serotipos virales es duradera,

probablemente de por vida y se expresa por la presencia de anticuerpos (Ac) neutralizantes

hemotípicos. No existe inmunidad cruzada de serotipos, excepto durante las primeras

semanas o algunos meses después de la infección (Martínez, 1998). Sin embargo, cuando

una persona tiene Ac neutralizantes contra uno de los DENV y se infecta con otro serotipo,

se produce una respuesta exclusiva de la infección por DENV llamada amplificación

dependiente de anticuerpos (ADA) que es aumento de la viremia, lo cual condiciona y

favorece el desarrollo de la forma grave de la enfermedad (Guzmán MG et al., 1992;

Halstead, 2002).

En las últimas 4 décadas el DENV emergió como el mayor problema de salud en muchas

áreas tropicales y subtropicales en el mundo, especialmente en las áreas urbanas donde el

virus se mantiene y en el cual el hombre es el principal reservorio y el mosquito A. aegypti,

el principal vector (Morier, L. et al., 2000). Ahora hay un resurgimiento mundial con una

expansión de la distribución geográfica tanto de los mosquitos vectores como de los virus

(figura 1), además de la aparición de FHD en nuevos países (Gubler DJ, 1997).

Comparando con nueve países reportados en 1950, hoy la distribución geográfica del

DENV incluye más de 100 países en todo el mundo. Muchos de estos no habían reportado

FD/FHD en más de 20 años y algunos no presentan antecedentes de la enfermedad.

Comparado con los reportes de la década de 1950, el dengue se ha convertido en una de las

principales causas de mortalidad infantil en varios países de Asia y de América del Sur

(Guha-Sapir y Schimmer B, 2005).

Los factores responsables por el dramático resurgimiento y emergencia de las epidemias de

FD/FHD como problemas de salud pública global aun no se entienden completamente

(Gubler DJ y Clark GG, 1995); Se sabe que casi la mitad de la población mundial está en

riesgo de sufrir esta infección por habitar en áreas tropicales y subtropicales. Así mismo, el

incremento del transporte aéreo (mecanismo ideal para transportar los DENV a zonas

urbanas) durante el cual más de 400 millones de viajeros de Europa y Norteamérica cada

año cruzan las fronteras y regresan a sus países procedentes de zonas endémicas en Asia,

África y América Latina. Además se sugiere que el resurgimiento de la FD está

estrechamente relacionado con los cambios sociales y demográficos de los últimos 50 años.

La decadencia en las infraestructuras de los sistemas de salud pública de los países en

desarrollo durante los últimos 30 años (Gubler DJ, 1998), la vivienda deficiente, el

hacinamiento, la disponibilidad de depósitos de agua, la ausencia de sistemas de

alcantarillado y sistemas deficientes de manejo de residuos asociados con la urbanización

no planeada han creado condiciones ideales para el incremento en la transmisión de la

FD/FHD en los centros urbanos de las zonas tropicales (TDR, 2006). A todo esto se le



12

suma la falta de implementación de un control efectivo del mosquito en áreas donde el

dengue es endémico. El control vectorial es hasta ahora es la única estrategia de prevención

de la FD/FHD y la forma más efectiva de controla la transmisión de los DENV mediante el

uso de adulticidas y larvicidas; Lamentablemente, el desarrollo de resistencia a insecticidas

y la falta de métodos integrados de control han disminuido la efectividad del control

químico.

2.2 FIEBRE POR DENGUE EN LAS AMERICAS

Los cambios epidemiológicos en las Américas han sido muy dramáticos. Durante los años

1960s dos pandemias de dengue afectaron al Caribe y Venezuela. La primera epidemia

declarada en 1963, fue causada por el DENV-3 y azotó el Caribe después de casi 20 años

de inactividad, en zonas como Jamaica, Puerto Rico, las islas de las Antillas menores y

Venezuela. La segunda epidemia ocurrió en el Caribe y Venezuela entre 1968 y 1969 y los

serotipos circulantes fueron DENV-2 y DENV-3 (PAHO, 1997). Durante los años 1960s

estos dos serotipos causaron grandes epidemias en Colombia donde no se había observado

dengue desde 1951. Luego en los años 1980s cinco países sudamericanos (Brasil, Bolivia,

Paraguay, Ecuador y Perú) que no habían sufrido por el DENV anteriormente o que se

habían visto libres del virus por varios decenios, padecieron epidemias explosivas a causa

del DENV-1. En 1993 los últimos dos países latinoamericanos tropicales, Costa Rica y

Panamá los cuales se habían visto libres de dengue por varios decenios, informaron sobre

casos de transmisión indígena de dengue, con el serotipo DENV-1. En los años 1980s, la

introducción de nuevas cepas y serotipos del virus produjo grandes epidemias de FD en las

Américas. Varios países de la región cambiaron su estatus de no endémicos o

hipoendémicos (un solo serotipo presente) a hiperendémicos (múltiples serotipos

presentes), lo que llevó a la emergencia de epidemias de FHD con un patrón

epidemiológico semejante al visto 25 años antes en el sudeste asiático (Gubler DJ, 1987).

El primer brote de FHD reportado en las Américas ocurrió en 1981 en Cuba; durante esta

epidemia se notificó un total de 344.203 casos de dengue, de los que 10.312 se clasificaron

como graves por la OMS y 158 fueron mortales; este brote de FHD es el acontecimiento

más importante de la historia del dengue en las Américas. Ya que después de este, todos los

años, excepto en 1983, se informa en todo el continente americano sobre casos confirmados

de FHD.

Actualmente, la FD es endémica en casi todos los países de la región de las Américas,

presentando brotes cíclicos cada 3 a 5 años, siendo cada año epidémico mayor que el

precedente. Los cuatro serotipos del DENV circulan en la región. En el periodo 2001-

2007, más de 30 países de las Américas notificaron un total de 4.332.731 casos de FD,



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106.037 casos de FHD y una tasa de letalidad de 1,2% (OPS, 2008). Solo en el 2008, se

reportó un total de 1.050.590 casos de FD, incluyendo 38.066 casos de FHD y 554

defunciones (OMS, 2009). Hasta la semana epidemiológica 31 del 2011 se han notificado

en la Región de las Américas un total de 890.756 casos de dengue, incluido 10.840 casos de

dengue grave y 488 defunciones por dengue (PAHO, 2011).

Figura 1: Países y áreas con riesgo para la transmisión de dengue 2008. Fuente:

http://www.mosquitaire.com/cms/website.php?id=/en/tigermosquitos/dengue.htm

2.3 FIEBRE POR DENGUE EN COLOMBIA

En Colombia la FD es endémica en casi todos los asentamientos humanos ubicados por

debajo de los 1.800 msnm. A. aegypti es el principal transmisor del dengue en Colombia y

se encuentra distribuido en el 80% del territorio colombiano (MPS, 2006). Durante los

años 1960s, los serotipos DENV-2 y DENV-3 causaron grandes epidemias de FD; la

primera, ocurrió entre 1971 y 1972, y fue ocasionada por DENV-2, mientras que la de

1975-1977 se dio por DENV-3. En diciembre de 1989 se registró el primer caso de FHD en

Puerto Berrio (Antioquia); desde ese momento se observa en Colombia una tendencia

rápida al incremento en el número de casos, al pasar de 5.2 casos por cada 100.000

habitantes en la década de los 1990s a casi 18.1 casos por cada 100.000 habitantes en los

últimos siete años (INS, 2010). Los departamentos que históricamente presentan mayor

transmisión de dengue en el país son: Atlántico, Santander, Norte de Santander, Valle del

http://www.mosquitaire.com/cms/website.php?id=/en/tigermosquitos/dengue.htm



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Cauca, Antioquia, Tolima, Huila, Casanare y Cundinamarca, entre ellos se distribuye más

del 60% de los casos notificados anualmente en lo que ha transcurrido del presente siglo.

Hasta la semana epidemiológica No. 37 del 2011 se han notificado en el Sistema de

Vigilancia de Salud Pública (SIVIGILA) del Instituto Nacional de Salud: 24.408 casos

totales de dengue (23.408 casos FD y 1066 de FHD) y se han reportado 276 muertes

confirmadas (PAHO, 2011). Este problema de salud pública es debido a múltiples factores

entre estos la reemergencia e intensa transmisión viral con tendencia creciente, el

comportamiento de ciclos epidémicos cada vez más cortos, el aumento en la frecuencia de

brotes de FHD y otras formas graves de la enfermedad, la circulación simultánea de los

cuatro serotipos, la infestación por A. aegypti en más del 90% del territorio nacional situado

por debajo de los 2200 msnm, y la urbanización de la población por problemas de violencia

en el país, pone en riesgo a aproximadamente 25 millones de personas que habitan en zonas

urbanas con transmisión de esta enfermedad. El comportamiento epidemiológico de la

enfermedad en las últimas décadas es ascendente, caracterizado por aumento exponencial

de las áreas endémicas en las diferentes décadas. Su comportamiento cíclico se caracteriza

por picos epidémicos cada tres o cuatro años, relacionados con el reingreso de nuevos

serotipos al país (Root H, 1980).

2.4 BIOLOGIA DE A. aegypti

A. aegypti es un mosquito cuyo origen se ubica en la región etiópica, que nuclea la mayor

cantidad de especies del subgénero Stegomyia Theobald, 1901, de la cual hace parte este

culícido; en el África este mosquito es una especie silvestre, y ancestralmente desde allí

inició una dispersión pasiva, que lo llevó a convertirse en un mosquito cosmopolita. Está

presente en la mayor parte de las áreas tropicales o subtropicales comprendidas entre los

45º de latitud norte y los 35º de latitud sur, en las zonas isotermales intermedias a los 20ºC

(Agrelo SR, 1996). Sin embargo, la naturaleza doméstica de esta especie probablemente

ejerza más influencia en la distribución mundial que el clima o las variables climáticas. A.

aegypti está estrechamente relacionado con los asentamientos humanos y se encuentra

fácilmente entre los edificios o casas para poder así alimentarse de los humanos y descansar

(Jansen CC y Beebe NW, 2010).

Los hábitos del mosquito son netamente antropofílicos y domésticos, con radicación de

criaderos en la vivienda o su peridomicilio. Depósitos de agua ubicados en objetos o

construcciones como neumáticos, baterías viejas, recipientes de todo tipo, botellas, floreros

y piletas, entre otros, le sirven a A. aegypti para establecer sus criaderos en agua limpia, con

bajo tenor orgánico y de sales disueltas, mediante la puesta de huevos en la superficie del

recipiente a la altura de la interfase agua-aire (Agrelo SR, 1996). La hembra del mosquito

se alimenta durante el día con un alto pico de actividad en la mañana y en el atardecer.



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Ellas vuelan en sentido contrario al viento, desplazándose mediante lentas corrientes de

aire, siguiendo los olores y gases emitidos por el huésped. Cuando están cerca de los

asentamientos humanos utilizan estímulos visuales para localizar al huésped mientras sus

receptores táctiles y térmicos las guían hacia el sitio de alimentación. El propósito

primordial de la alimentación sanguínea es proporcionar una fuente de proteínas para el

desarrollo de los huevos. El hospedero infectado transmite el virus al mosquito y entre 8 -

10 días el virus se replica, primero en el epitelio intestinal y posteriormente a través de la

hemolinfa se disemina a otros tejidos como los ganglios nerviosos, cuerpo graso, cerebro,

esófago y glándulas salivales del mosquito hembra, el cual permanece infectado y

asintomático toda su vida (Martínez E, 2004; Sánchez VL, 2006). Los títulos virales más

altos ocurren entre los 7-10 días postinfección en el intestino medio y entre los 7-17 días en

el abdomen. Títulos virales altos en cabeza y glándulas salivales se detectan entre los 12-18

días después de la infección (Salazar MI et al., 2007). Luego de 7 a 14 días de incubación

en el mosquito (periodo extrínseco de incubación), el genotipo del virus y factores

ambientales como humedad y temperatura, el mosquito puede infectar a un humano

susceptible (Gubler DJ, 1998; Rice CM, 1996; Salazar MI et al., 2007) (Figura 2).

Figura 2: ciclo de transmisión de los DENV

Tomado de: http://www.diariodeciencias.com.ar/imagenes/transmission-of-

dengue.JPG&imgrefurl

Los mosquitos A. aegypti de diferentes orígenes geográficos presentan diferencias en la

susceptibilidad a la infección con el DENV (Gunther J et al., 2007). Aunque la transmisión

horizontal (humano-mosquito) es la más frecuente, existen reportes de transmisión vertical

o transovarica (donde la hembra infectada es capaz de transmitir el virus a su progenie)

experimental (Rosen L et al., 1983) y natural (Hull B et al., 1984). La presencia del DENV

fue demostrada en cerca del 40% de larvas y progenie de hembras de A. albopictus

infectadas oralmente con DENV-2 (Gonçalves CM et al., 2004) y en hembras de A. aegypti

http://www.diariodeciencias.com.ar/imagenes/transmission-of-dengue.JPG&imgrefurl

http://www.diariodeciencias.com.ar/imagenes/transmission-of-dengue.JPG&imgrefurl



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inoculadas intratoráxicamente con DENV-3 (Joshi V et al., 2002). Factores como el

serotipo y la cepa del virus, la especie del mosquito y la línea de A. aegypti (con alta o baja

susceptibilidad al DENV) afectan este mecanismo de infección (Agrelo SR, 1996; Kautner

I et al., 1997).

Algunos estudios sugieren que aunque la transmisión vertical ocurre a una muy baja tasa

para casi todos los arbovirus, esta puede ser un factor importante en la prevalencia y

mantenimiento del DENV en la naturaleza (Gunther J et al., 2007). Fouque F et al., (2004)

encontraron larvas de A. aegypti en plantas que estaban localizadas a 30km del

asentamiento humano más cercano en la Guinea Francesa respaldando la idea que estas

larvas pudieron haberse infectado verticalmente y ser un reservorio para el DENV.

Adicionalmente, se ha registrado que en regiones con temporadas secas de 3-6 meses, la

alta resistencia a la desecación que presentan los huevos del mosquito podría contribuir al

mantenimiento de algunos arbovirus como el virus de la fiebre amarilla y el DENV (Kuno

G y Chan GJ, 2005).

Un estudio en Asia mostró evidencias de cambios en los hábitats entre los dos principales

vectores del DENV en el cual A. aegypti se muestra mas exofílico y menos antropofílico

que A. albopictus (Gunther J et al., 2007), sugiriendo la ocurrencia de un intercambio entre

los ciclos urbano y selvático, lo cual a su vez puede relacionarse indirectamente con la

transmisión vertical del DENV y su papel en la epidemiologia de la enfermedad.

2.4.1 CICLO DE VIDA DE A. aegypti

Son insectos de metamorfosis completa (holometábolos), que durante su desarrollo

ontogénico pasan por los estados de huevo, larva (con cuatro estadios larvales), pupa y

adulto (Figura 3).

Huevos: miden aproximadamente 1 mm de longitud, en forma de cigarro, son más limpios

que los huevos de la mayoría de las especies que se crían en recipientes. En el momento

de postura son blancos, pero muy rápidamente adquieren un color negro brillante. Son

fecundados durante la postura y el desarrollo embrionario se completa en 48 horas si el

ambiente es húmedo y cálido, pero puede prolongarse hasta cinco días con temperaturas

más bajas. Los huevos eclosionan en un lapso de 2 a 3 días. Después de ese periodo, son

capaces de resistir la desecación y las temperaturas extremas con sobrevidas de siete meses

a un año. Una vez completado el desarrollo embrionario, un porcentaje reducido de huevos

pueden resistir largos períodos de desecación, y pueden prolongarse por más de un año en

algunas ocasiones. La capacidad de resistencia a la desecación es uno de los principales



17

obstáculos para el control del mosquito y ésta condición, además, permite transportarlos a

grandes distancias en recipientes secos.

Larvas: presentan un ciclo de cuatro estadios larvales, son netamente acuáticas y como la

mayoría de los insectos holometábolos, esta fase es el período de mayor alimentación y

crecimiento. Se alimentan de material orgánico sumergido o acumulado en las paredes y el

fondo de recipientes, para lo cual utilizan las cerdas bucales en forma de abanico. Se

asemejan a otras larvas de mosquitos por la cabeza y el tórax ovoide y el abdomen de nueve

segmentos. El segmento posterior del abdomen tiene cuatro branquias lobuladas para la

regulación osmótica y un sifón para la respiración en la superficie del agua. Las larvas son

fotosensibles. La duración del desarrollo larval depende de la temperatura, la disponibilidad

de alimentos y la densidad de larvas en el recipiente. Los primeros tres estadíos se

desarrollan rápidamente, mientras que el cuarto demora más tiempo con mayor aumento de

tamaño y peso. En condiciones rigurosas el cuarto estadío larval puede prolongarse por

varias semanas, hasta siete meses, previo a su transformación en pupa. Las larvas de A.

aegypti pueden diferenciarse a simple vista de las larvas de otras especies por su sifón más

corto que el de la mayoría de los otros culícidos.

Pupas: La pupa es el ultimo estado acuático de A. aegypti; estas no se alimentan, presentan

un estado de reposo donde se producen importantes modificaciones anatómico-fisiológicas

hasta la aparición de los adultos. Reaccionan inmediatamente a estímulos externos tales

como vibración y se desplazan activamente por todo el recipiente. Se mantienen en la

superficie del agua debido a su flotabilidad y ésta propiedad facilita la emergencia del

insecto adulto. El período pupal dura de 1 a 3 días en condiciones favorables, con

temperaturas entre 28 y 32°C. Las variaciones extremas de temperatura pueden rezagar este

período.

Adulto: Al emerger de la pupa, el insecto adulto permanece en reposo permitiendo el

endurecimiento del exoesqueleto y las alas. Dentro de las 24 horas siguientes a la

emergencia pueden aparearse iniciándose la etapa reproductora del insecto. El

apareamiento en general se realiza durante el vuelo pero en algunas ocasiones se lleva a

cabo en una superficie horizontal o vertical. A. aegypti es un mosquito oscuro con bandas

blancas en las bases de los segmentos torsales y un característico diseño en forma de lira en

el mesonoto (sección del tórax del mosquito). Las hembras son las únicas que succionan

sangre. Esta alimentación sanguínea es necesaria como fuente de proteína para el desarrollo

de los huevos. La alimentación sanguínea y la postura se llevan a cabo principalmente

durante el día, especialmente durante las primeras horas o a la media mañana y a media

tarde o al anochecer. Si una hembra completa su alimentación (2 o 3 mg de sangre)

desarrollará y pondrá aproximadamente 200 huevos, dispersos en distintos lugares. La



18

hembra grávida es atraída hacia recipientes oscuros o sombreados con paredes duras, sobre

las que deposita sus huevos y prefiere aguas relativamente limpias con poco contenido de

materia orgánica. El macho se diferencia de la hembra por sus antenas plumosas y sus

palpos más largos. Sus partes bucales no están adaptadas para chupar sangre por lo que se

alimentan de carbohidratos como el néctar de las plantas.

Figura 3: ciclo de vida de A. aegypti.

Tomado de:

http://ceibal.edu.uy/UserFiles/P0001/ODEA/ORIGINAL/101112_dengue_prevencion3.elp/

conociendo_al_aedes_aegypti.html

2.5 Biología del DENV

Los DENV pertenecen al genero flavirirus que forma parte de la familia Flaviviridae. Los

flavivirus son 70 virus, mayormente transmitidos por artrópodos (arbovirus) y están

clasificados en 10 grupos (o especies), entre ellos: Virus Dengue, Virus Encefalitis

Japonesa, Virus TBE (del inglés Tick-Borne Encephalitis), Virus Fiebre Amarilla, Virus

Modoc, Virus MBE (del inglés Mosquito-Borne Encephalitis), Virus Ntaya, Virus Río

Bravo, Virus Uganda S y Virus Tyuleniy (Henchal EA y Putnak JR, 1990). Gran número

de estos son patógenos para el hombre, por lo que son los causantes de problemas de salud

http://ceibal.edu.uy/UserFiles/P0001/ODEA/ORIGINAL/101112_dengue_prevencion3.elp/conociendo_al_aedes_aegypti.html

http://ceibal.edu.uy/UserFiles/P0001/ODEA/ORIGINAL/101112_dengue_prevencion3.elp/conociendo_al_aedes_aegypti.html



19

pública mundial. Todos los miembros de esta familia comparten los mismos antígenos

determinantes, lo que hace difícil la identificación de cada virus por las técnicas clásicas de

serología.

El DENV incluye cuatro serotipos cercanamente relacionados pero antigénicamente

diferentes; cada serotipo comprende varios genotipos que exhiben diferencias en sus

características de infección tanto en el mosquito vector como el humano hospedador

(Holmes EC y Twiddy SS, 2003).

2.5.1 Estructura y composición del DENV

Los DENV se caracterizan por tener una cápside icosahédrica rodeada por una membrana

lipídica o envoltura, con un diámetro aproximado de 50 nm (Henchal EA y Putnak JR,

1990). En su interior contienen como genoma una molécula de ARN de cadena sencilla y

polaridad positiva de 10.7 kb. El genoma viral presenta la estructura “cap” en el extremo 5´

y carece de poli(A) en el extremo 3´terminal. El único marco de lectura abierto está

flanqueado por dos regiones no traducidas, que codifica a las tres proteínas estructurales: la

proteína de la envoltura E, la proteína asociada a la membrana M, y la proteína de la

cápside C, y a las siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y

NS5) (Linderbach BD y Rice CM, 2003) (Figura 4).

Figura 4: Representación esquemática del virión maduro, E: envoltura proteica, M:

proteína asociada a membrana, C: proteína core.



20

2.5.1 Proteínas estructurales del DENV

El virión maduro contiene tres proteínas estructurales: C, proteína de la nucleocápside o

núcleo; M, proteína asociada a la membrana y E, proteína de la envoltura. Los virus

inmaduros contienen una proteína conocida por prM; que es un precursor de M. Los genes

que codifican las proteínas estructurales del DENV se encuentran en el extremo 5' del

genoma y comprenden un poco más de una cuarta parte de la capacidad de codificación del

ARN viral. El orden de los genes para las proteínas estructurales del extremo 5' terminal es

C-prM(M)-E (Figura 5) (Henchal EA y Putnak JR, 1990).

La proteína C es componente básico de la nucleocápside, es el primer polipéptido viral

sintetizado durante la traducción y presenta un peso molecular de 13.5 kd. Es rica en

residuos de lisina y arginina los que le confieren un carácter altamente básico que permite

su interacción con el ARN viral, con el que forma la nucleocápside como componente

estructural. Esta proteína está involucrada en funciones biológicas de la partícula viral

como el tropismo celular, fusión de membranas e inducción de anticuerpos neutralizantes.

La infección con uno de los serotipos estimula la producción de anticuerpos neutralizantes

primarios contra la envoltura de la proteína, confiriéndole así larga vida inmune al serotipo.

La existencia de anticuerpos neutralizantes a un serotipo puede promover el ambiente de la

infección con otro serotipo. Este modelo anticuerpo-dependiente postula que la severidad

de la enfermedad es el resultado de anticuerpos heterólogos no neutralizantes los cuales

facilitan la infección del virus en células mononucleares durante una segunda infección con

un serotipo diferente (Lanciotti RS et al., 1992).

La prM (22 kb) es el precursor glicosilado de la proteína estructural M (8 kb). La

separación proteolítica de este precursor por una proteasa del aparato de Golgi, durante la

maduración viral, es lo que da origen a la formación de la proteína M. Esta escisión parece

estar ligada a la liberación del virus, pero no ocurre necesariamente en todas las moléculas

proteicas presentes en la membrana viral, ya que en ocasiones aparece la proteína M junto a

la prM en el virión maduro. Anticuerpos contra prM pueden mediar la inmunidad de tipo

protectora, quizás por la neutralización de los viriones liberados que contienen prM no

clivada.

La proteína M madura es una proteína de membrana extracelular o de virus maduros,

resultado de la proteólisis de prM y la eliminación de la porción amino terminal. Está

estrechamente asociada a la envoltura lipídica. La formación de proteína M a partir de prM

parece crucial en la morfogénesis del virus, lo que implica un incremento en la infectividad

y la reorganización de la estructura de la superficie viral. No obstante, a la fecha el papel de

la proteína M en el virión no es bien conocido.



21

La proteína E es una glicoproteína con un peso molecular entre 51 y 60 kD, es la

mayoritaria de la envoltura, glicosilada y la más conservada; la fusión con la célula huésped

es inducida a pH bajo. Está estrechamente asociada a la envoltura lipídica (Henchal EA y

Putnak JR, 1990). Se presenta como un homodímero en la superficie del virión maduro e

intracelularmente se puede encontrar como un heterodímero junto a la proteína prM. La

proteína E es el componente principal de las proyecciones de la superficie del virión

observadas por microscopía electrónica y contiene los determinantes antigénicos

responsables de la neutralización del virus y la hemaglutinación de eritrocitos, induciendo

respuesta inmunológica en el huésped infectado. Se ha propuesto que en ella están

localizados la mayoría de los marcadores moleculares para la patogenicidad (Leitmeyer KC

et al., 1999). La infección con uno de los serotipos estimula la producción de anticuerpos

neutralizantes primarios contra la envoltura de la proteína, confiriéndole así larga vida

inmune al serotipo. La existencia de anticuerpos neutralizantes a un serotipo puede

promover el ambiente de la infección con otro serotipo. En este modelo anticuerpo-

dependiente, la severidad de la enfermedad es postulada a ser el resultado de anticuerpos

heterólogos no neutralizantes facilitando la infección del virus en células mononucleares

durante una segunda infección con un serotipo diferente (Lanciotti RS et al., 1992).

2.5.2 Proteínas no estructurales del virus

Hasta la fecha se han identificado siete proteínas no estructurales del virus (NS): NS1,

NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5 (Figura 5).

La proteína no estructural NS1 es una glicoproteína de 48 kD que contiene dos señales del

tipo Asn -X-Ser/Thr, usadas para la adición de carbohidratos; estos sitios parecen estar

conservados en todos los flavivirus. Puede estar en forma secretada y no secretada. Es

sintetizada en el retículo endoplásmico rugoso como una proteína monomérica y en un

período corto se une formando un homodímero. Esta forma es más hidrofóbica y se

desconoce si el incremento de la hidrofobicidad es un resultado de la dimerización o alguna

modificación postraduccional. Una vez formado este dímero, la glicoproteína es

transportada al aparato de Golgi donde sufre modificaciones y de aquí pasa a la superficie

celular, liberándose al medio extracelular (Perera R y Kuhn RJ, 2008). La función de la

NS1 en la replicación viral no ha sido bien dilucidada. Se ha planteado que posee un papel

en la replicación temprana. Basados en análisis mutacional se ha relacionado con la

morfogénesis viral. A su vez, mutaciones de esta proteína afectan la virulencia de la

partícula viral. También se relaciona con la respuesta inmune específica de serotipo

(Henchal EA y Putnak JR, 1990).

La NS3 es la segunda proteína en tamaño, con un peso molecular entre 68 y 70 kD y se

encuentra asociada a la membrana. Es altamente conservada en los flavivirus y se piensa

que es un componente de la maquinaria enzimática de la replicación del ARN viral. La



22

comparación de sus secuencias nucleotídicas y los análisis bioquímicos sugieren que es

trifuncional, conteniendo actividad de proteasa (contra la poliproteína), de helicasa y de

ARN trifosfatasa trifosfato (formación de la estructura 5' cap). Su extremo N terminal

contiene el dominio catalítico de la proteasa NS2b-NS3, parecido a la serina-proteasa de las

subfamilias de las tripsinas. Esta triada catalítica está conformada por His 51, Asp 75 y Ser

135. Se cree que la actividad proteolítica de esta enzima sea la responsable del corte de

NS2b, NS3, NS4a, NS5 y del extremo carboxilo de la proteína C. En esta proteína existen

regiones homólogas con la familia de las helicasas, así como un fragmento C terminal de 50

kD derivado de la proteólisis, que tiene actividad ARN trifosfatasa y está involucrado en la

formación de la estructura de la caperuza del extremo 5´ del genoma del flavivirus (Xu T et

al., 2005).

Las proteínas no estructurales como NS1 y NS3, son capaces de inducir una respuesta

inmune protectora en modelos murinos y, al no estar asociadas con partículas vírales libres

no hay riesgo que la infección sea potenciada por anticuerpos facilitadores. Esta

característica las hace buenas candidatas para ser incluidas en el desarrollo de vacunas

contra el dengue (Antuñano FJ y Mota J, 2000).

Las regiones hidrofóbicas menos conservadas de la poliproteína del DENV son procesadas

en al menos cuatro proteínas no estructurales adicionales (NS2a, NS2b, NS4a y NS4b).

Poco se conoce de las funciones de estas en el ciclo de vida de los flavivirus. Sin embargo,

se conoce que la NS2b, de 27 kD, junto con la NS3 forman un complejo esencial para el

procesamiento de todos los sitios de corte de las proteínas no estructurales y las

estructurales (Henchal EA y Putnak JR, 1990).

La última proteína codificada es la NS5, que es la más grande de 103 a 104 kD, bifuncional

y una de las más conservadas en los flavivirus. Es una proteína básica y se cree que

funciona como una ARN polimerasa dependiente del ARN, aunque no se ha verificado

directamente. Esto se basa en la presencia de una región altamente conservada (YF NS5

666-668) característica de este tipo de enzima presente en los virus ARN con cadena

positiva. Se ha sugerido que puede estar involucrada en la metilación de la estructura de la

caperuza 5´ terminal (Henchal EA y Putnak JR, 1990).



23

Figura 5: Genoma de los DENV. Se representa el marco de lectura abierto flanqueado por

dos regiones no traducidas, codifica para 3 proteínas estructurales: C, M y E, y 7 proteínas

no estructurales (NS): NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5.



24

2.6 Prevención y control de la fiebre por dengue

La prevención y control de la FD/FHD es cada vez más necesaria conforme aumenta la

distribución geográfica de los mosquitos y de los virus así como el incremento en la

incidencia de la enfermedad. Desafortunadamente, las herramientas disponibles para

prevenir las infecciones por DENV son muy limitadas. Hasta la fecha no se dispone de

ningún medicamento específico para el tratamiento de la FD/FHD y aunque se están

desarrollando vacunas potencialmente eficaces para controlar los cuatro serotipos del virus,

tomará un tiempo antes de que estén licenciadas para su uso en salud pública. Por el

momento, los métodos más efectivos para prevenir y controlar la FD/FHD son el

diagnóstico inmediato de los casos de fiebre aunado al tratamiento clínico adecuado y la

reducción del contacto humano-vector (Parks W y Lloyd L, 2004).

En Colombia la vigilancia epidemiológica del dengue se basa en la vigilancia clínica

(síntomas y signos compatibles), serológica (determinación de anticuerpos IgM en suero de

pacientes), virológica (aislamiento viral y determinación del serotipo) y entomológica

(índices de infestación larvaria y de adultos del vector) (Ospina M, 2004).

2.6.1 Vigilancia virológica

El diagnóstico del laboratorio es esencial para la confirmación del dengue; este incluye

técnicas de aislamiento e identificación del virus, de diagnóstico serológico y de biología

molecular (detección del ARN del dengue). La detección de antígenos virales en sueros

virémicos es necesaria para las investigaciones clínicas y epidemiológicas y debe realizarse

rápidamente para implantar tempranamente el tratamiento anti-choque a los enfermos y la

detección precoz de un brote.

En diferentes investigaciones como se ha podido constatar que la viremia ocurre en la

etapa temprana del período febril del dengue y su eliminación es cuando disminuye la

fiebre y aumentan los niveles de anticuerpos (Vaughn DW et al., 1997). Los primeros en

demostrar esto fueron Ashbur y Craig en una investigación en Manila en 1906. Si bien los

estudios virológicos de DENV son determinantes para la vigilancia de la enfermedad, la

capacidad instalada de laboratorios es limitada, la utilización de estos estudios debe ser

racional y oportuna, de acuerdo con la situación específica de cada región y los objetivos y

necesidades de información del sistema de vigilancia virológica.



25

2.6.2 Vigilancia entomológica

Se emplea para determinar cambios en la distribución geográfica del vector, para obtener

mediciones relativas de la población de vectores a lo largo del tiempo y para facilitar las

decisiones apropiadas y oportunas en lo referente a intervenciones. Puede servir para

identificar las zonas de alta densidad de infestación o los periodos de aumento de las

poblaciones. En zonas donde el vector ya no está presente, la vigilancia entomológica es

fundamental para detectar rápidamente nuevas introducciones antes que se generalicen y

sean difíciles de eliminar. La vigilancia de la susceptibilidad de la población de vectores a

los insecticidas también es parte integral de cualquier programa de control químico

vectorial. En Colombia las actividades de vigilancia entomológica del dengue son

realizadas por las autoridades locales de salud y en general se resumen en el levantamiento

clásico de índices aédicos.

2.6.3 Control vectorial

Saneamiento ambiental. Incluye estrategias para reducir los criaderos de mosquitos, tales

como el manejo de los recipientes de almacenamiento de agua (por ejemplo, cubiertas a

prueba de mosquitos para tinajas de almacenamiento de agua, partículas de poliestireno en

tanques de agua), abastecimientos de agua mejor diseñados y fiables, y reciclaje de residuos

sólidos, tales como neumáticos desechados, botellas y latas.

Control biológico. Uso de especies larvívoras como peces (Gambussia y Poecilia),

tortugas, algas del orden Chlorococcales, microsporidios y copépodos como Mesocyclops

longisetus. La estrategia más difundida de control biológico es el uso de la toxina del

Bacillus thuringensis var. Israelensis (Bti), el cual es un bacilo aeróbico, Gram positivo,

flagelado, que forma esporas. Durante la biogénesis se inicia la producción de la toxina

denominada también cuerpo cristalino, endotoxina- delta o cuerpo parasporal.la propiedad

insecticida del cristal se manifiesta cuando es ingerido por la larva durante su alimentación,

la pro-toxina se disuelve y activa (se convierte en toxina) por las proteasas y el pH alcalino

del intestino medio; la d-toxina se adhiere a las células epiteliales del intestino medio,

creando poros en la membrana intestinal y afectando al equilibrio de iones, y el tejido

pierde la capacidad de regular la permeabilidad. Como resultado, el intestino medio es

rápidamente inmovilizado, las células epiteliales se lisan, la larva deja de alimentarse, el pH

del intestino cae por la mezcla con la hemolinfa. Este pH bajo permite que las esporas

germinen y provoquen una septicemia y muerte de la larva. La muerte ocurre en 6 minutos

aproximadamente a altas concentraciones o a más de 24 horas a bajas concentraciones de

Bti (Chui VWD et al., 1995).



26

Control químico. Pese a que existen diversas estrategias de control, el control químico

sigue siendo la forma más efectiva en el control de brotes y epidemias de dengue. El uso de

insecticidas puede dividirse en dos métodos principales: atacar a los mosquitos adultos

(adulticidas) y/o atacar sus formas inmaduras (larvicidas). Una falencia de este sistema es la

resistencia a insecticidas la cual ya ha sido detectada en algunas poblaciones colombianas

de A. aegypti, por lo que es fundamental la vigilancia periódica de la susceptibilidad de este

vector (WHO, 2006; Santacoloma L et al, 2010; Fonseca-González I et al, 2011; Ocampo

CB et al, 2011)

Larvicidas. La finalidad de los larvicidas es matar los mosquitos en las etapas

inmaduras en los criaderos que se pueden destruir. Los efectos son duraderos pero necesitan

mantenimiento. El uso de larvicidas es común en las zonas que no cuentan con un

suministro adecuado de agua potable, agua para bañarse y para limpieza del hogar. A.

aegypti a menudo se desarrolla en contenedores para el almacenamiento de agua, por lo

cual los larvicidas deben tener poca toxicidad a mamíferos y no deben cambiar

significantemente el sabor, olor o color del agua.

Adulticidas: Estos productos se encargan de matar los mosquitos en la etapa adulta,

lo cual se consigue generalmente con la nebulización del insecticida. El efecto es inmediato

y de corta duración; al rociarlos, no duran más que unos pocos minutos y solo son eficaces

contra los vectores adultos presentes. El rociamiento se recomienda solo durante las

epidemias para concentrarse en las hembras infectadas y lograr su eliminación reduciendo

así la circulación del virus en la comunidad.

Reguladores de Crecimiento de Insectos (IGRs). Son compuestos químicos

similares a las hormonas que regulan el crecimiento en los insectos mediante la inhibición

de síntesis de quitina y los análogos a hormonas juveniles. Los reguladores del crecimiento

de los insectos, tanto juvenoides como ecdisoides, han sido muy utilizados en las últimas

décadas como una de las alternativas más promisorias al uso de insecticidas

convencionales, con vistas al control de insectos que constituyen plagas tanto en la salud

pública como en la agricultura. Esto es porque, en lo fundamental, son compuestos

biológicamente específicos, no tóxicos al hombre y otros organismos beneficiosos,

biodegradables y menos propensos al desarrollo de resistencia por los insectos.

Participación comunitaria. La cooperación de la comunidad es fundamental para un

control efectivo y sostenible de A. aegypti, al controlar la presencia de criaderos artificiales

en casas, edificios u alrededores, reduciendo así la densidad de este vector en la zona

domiciliar. De esta forma, la educación primaria en la salud y movilización social deben ser

partes integrales de los programas de control (WHO, 2006).



27

3. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

En Colombia, la FD/FHD es la enfermedad transmitida por vectores más prevalente,

después de la malaria. El dengue es una patología de alto poder epidémico que en los

últimos años se presenta en sus formas clásica y hemorrágica en una gran parte del

territorio colombiano debido, entre otros casos a la alta dispersión del vector A. aegypti en

el país. Hasta el mes de octubre de 2011 se registraron 25.929 casos totales de dengue entre

estos 24.810 de FD y 1.119 casos de FHD. La letalidad alcanzó las 41 muertes confirmadas

mientras que 40 aún se encuentran en estudio. En Colombia, el 95% de los casos de dengue

se presentan en poblaciones ubicadas por debajo de los 1.000 metros de altitud siendo los

departamentos más afectados Valle, Norte de Santander, Casanare, Huila, Tolima,

Antioquia y Atlántico (MPS, 2010; PAHO, 2011). Considerando la alta incidencia

presentada en los tres primeros meses del año 2010 y las condiciones ambientales como el

fenómeno del niño que contribuyen a la reproducción del mosquito vector y en

consecuencia aumentan la probabilidad de infección, las autoridades de salud en Colombia

declararon la alerta epidemiológica para la FD/FHD (PAHO, 2010).

Desafortunadamente, las herramientas disponibles actualmente para prevenir, detectar y

tratar la FD/FHD son limitadas; no existe un test diagnóstico que sea específico, práctico y

económico; no hay medicamentos contra el DENV (WHO, 2007) y aunque se ha diseñado

una vacuna tetravalente aun no ha sido licenciada. Esto obliga a las autoridades locales y

departamentales de salud a intensificar las acciones de vigilancia epidemiológica de la

enfermedad, incluyendo la vigilancia entomológica y virológica.

Desde la aparición del primer caso de FHD en diciembre de 1989, en Puerto Berrío

(Antioquia), se observa en el departamento una tendencia al rápido incremento en el

número de casos. Entre 1994 y 2003 la incidencia osciló entre 0.02 y 4.2 casos por 100.000

habitantes, registrándose en 1998 el mayor número de casos, con una letalidad del 6%,

debido a una gran epidemia que afectó el departamento de Antioquia. De acuerdo a la

presentación de casos las regiones más afectadas son: Magdalena Medio, Nordeste,

Occidente y Valle de Aburrá, con compromiso principalmente de la población entre 15 y 44

años (Ospina M, 2004).

La vigilancia entomológica en Antioquia se limita a la determinación de los índices

aédicos. Diferentes estudios han demostrado que los actuales indicadores entomológicos

no parecen evaluar efectivamente el riesgo de transmisión o definir umbrales para

epidemias de dengue (Focks et al., 2000) dado que la densidad mínima del vector bajo la

cual no hay transmisión de dengue aun no está definida. En Antioquia los tanques, canecas

y llantas son los principales criaderos del vector. Los índices de infestación larvaria (Índice



28

de Breteau) oscilan entre 10.2 y 11.6 y sitúan al departamento entre los de alto riesgo, de

acuerdo a los criterios definidos por la OMS.

Como el dengue es una enfermedad de áreas tropicales es necesario la continua vigilancia e

identificación del virus en las poblaciones en especial en áreas endémicas donde se

presentan casos todo el año, con el fin de controlar y prevenir epidemias y así disminuir el

riesgo, controlar la prevalencia y el mantenimiento del virus en la naturaleza.

En 1992 se inició la vigilancia virológica en Antioquia, demostrando la circulación de los

serotipos 2 y 4. Desde el año 1993 hasta el 2001 circularon los serotipos 1,2 y 4. En

Antioquia el serotipo 3 se detectó por primera vez en el año 2002 en los municipios de

Bello, Medellín, Cáceres, Valdivia, San Pedro de Urabá, Cisneros y Turbo, en coincidencia

con un aumento en el número de casos. En los años posteriores se determino la circulación

de los cuatro serotipos (1 (2002, 2004-2008); 2 (2002); 3 (2002-2006) y 4 (2006)). En

Colombia, los cuatro serotipos están circulando hace más de 20 años y el genotipo ha sido

documentado para todos menos el serotipo 3 (Romero-Vivas et al., 1998; Diaz F, 2005;

Ocazionez R et al., 2006; Ocazionez R et al., 2007).

La detección temprana de casos, unida al monitoreo entomológico representan

indiscutiblemente, la forma más eficaz de evitar brotes epidémicos. Sin embargo, la

vigilancia virológica está afectada por la baja especificidad y sensibilidad de las pruebas

utilizadas (la alta frecuencia de reacción cruzada de los anticuerpos con los determinantes

antigénicos que comparte el DENV con otros miembros de la familia Flaviviridae)

(Kautner I et al., 1997), por lo que en ocasiones deben prevalecer los criterios clínicos y

epidemiológicos para la clasificación de casos y toma de decisiones, los cuales dependen de

la experticia del médico tratante, quienes en muchos casos no son los profesionales clínicos

en áreas tropicales.

Aunque la vigilancia virológica en humanos es importante (para el sondeo del virus y los

estudios patogénicos) esta es limitada por el tiempo de la muestra, el diagnostico

confirmatorio es post-mortem (muchos pacientes mueren en el estado de efervescencia o

poco después); en relación con la toma de muestras para la identificación del serotipo, esta

debe realizarse entre los días 4-5 del inicio de la enfermedad donde el pico de viremia es

alto (la viremia varia considerablemente dependiendo de los días de evolución de la

enfermedad) ya que con los días aumenta los títulos de IgM y disminuyen las partículas

virales. Adicionalmente en zonas tropicales donde confluyen simultáneamente diversas

enfermedades con síntomas similares a la FD/FHD sumado a las deficiencias en la atención

médica complican aun más la identificación del serotipo viral dado que es improbable que

las muestras de pacientes sean tomadas durante los primeros 5 días de iniciados los

síntomas.



29

Teniendo en cuenta que la introducción de nuevos serotipos en las poblaciones humanas

susceptibles es el mayor factor de riesgo para la emergencia de brotes y epidemias de FHD,

y que en el municipio de Bello se registra co-circulación de al menos dos serotipos virales y

casos confirmados de FHD, es necesaria buscar metodologías alternativas que permitan la

identificación de los serotipos circulantes en este municipio endémico para la enfermedad.

En este sentido, la determinación del DENV y sus serotipos en poblaciones de mosquitos

colectados en campo es una forma sensible, especifica y rápida para el diagnostico precoz

de la infección del dengue y la delimitación de zonas geográficas en riesgo epidémico. La

vigilancia virológica en mosquitos infectados naturalmente puede ser un componente

adicional de los sistemas de alerta temprana ya que es posible determinar la infección

durante el periodo extrínseco de incubación.



30

4. HIPÓTESIS:

Considerando que Bello presenta características ecológicas como altitud, humedad y

temperatura que favorecen la presencia del vector de la fiebre por dengue A. aegypti y que

el registro permanente de casos de FD determinan el carácter endémico de este municipio,

es posible identificar la presencia del virus dengue en poblaciones naturales de adultos de

A. aegypti.

5. OBJETIVOS:

OBJETIVO GENERAL

Identificar la presencia del virus dengue en poblaciones naturales de adultos del mosquito

vector A. aegypti en el municipio endémico de Bello.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Participar en los levantamientos trimestrales de índices aédicos durante 2009-2010

mediante visitas domiciliarias, junto con el personal de la Dirección Local de Salud de

Bello (DLSB) en todas las 10 comunas de este municipio.

Determinar los serotipos circulantes del virus dengue mediante RT-PCR (reacción en

cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa) en mosquitos A. aegypti adultos de

poblaciones naturales colectados en las 10 comunas de Bello.



31

6. JUSTIFICACIÓN

El incremento de la transmisión del DENV es causado principalmente por fallas en el

control de las poblaciones mosquito vector A. aegypti, la introducción y la rápida

diseminación de nuevas cepas de virus en una región, por los viajes aéreos y la creación de

condiciones ecológicas adecuadas en ciudades del trópico que permiten la coexistencia de

serotipos del DENV. La causa principal de brotes epidémicos de FD/FHD es la presencia

de nuevos serotipos circulando especialmente en áreas endémicas, además de la

variabilidad de estos serotipos y la virulencia de las cepas del virus.

Los brotes epidémicos de dengue pueden ser mitigados grandemente usando métodos de

diagnóstico rápido y confiable que permitan el control y manejo de los pacientes. Un

diagnóstico confirmatorio depende del aislamiento viral y solo puede ser realizado

mediante la detección del antígeno viral, genoma o partículas virales. Hasta hace poco esto

solo era posible a través de los diferentes métodos de aislamiento viral como los cultivos

celulares lo cual implicaba una alta inversión en infraestructura y personal. En la actualidad

hay disponibilidad de técnicas como la RT-PCR que permiten detectar ARN especifico del

virus en diferentes muestras incluyendo mosquitos (Lanciotti RS et al., 1992; Chow VTK

et al., 1993; Seah CLK et al., 1995)

Estudios en Singapur, Venezuela y México han demostrado que las pruebas de RT-PCR

pueden detectar pequeñas cantidades de virus. Esta metodología ha sido empleada para

detectar y serotipificar el DENV en mosquitos A. aegypti recogidos en campo durante bajos

y altos periodos de transmisión determinando la tasa mínima de infección en poblaciones

locales de mosquitos. La técnica es suficientemente sensible como para detectar un

mosquito infectado entre 60 mosquitos no infectados (Chow VTK et al., 1993; Seah CLK

et al., 1995; Urdaneta L et al., 2005); la técnica también es útil en la estimación de la

capacidad vectorial de los mosquitos al detectar el virus en los diferentes tejidos del

mosquito.

El uso de RT-PCR en investigaciones epidemiológicas permite no solo localizar

geográficamente los mosquitos infectados sino detectarlos hasta seis semanas antes del

inicio del brote epidémico, permitiendo una correlación entre los mosquitos infectados con

la vivienda o los sitios de trabajo de las personas afectadas por la enfermedad. Además, la

vigilancia de los mosquitos infectados con el DENV puede ayudar a monitorear las tasas de



32

infección en el vector identificando específicamente el serotipo causal y eliminando las

frecuentes reacciones cruzadas que se presentan entre los arbovirus.

Lo anterior provee una herramienta adicional que puede incorporarse en los sistemas de

alerta temprana para predecir una epidemia en una región particular. Estos procedimientos

resaltan la importancia de los estudios vectoriales para producir resultados rápidos y

reproducibles. Igualmente, este tipo de investigaciones moleculares son una aproximación

para el control de estas enfermedades, brindando así una importante relación de la

información sobre la biología molecular del vector y las interacciones ventor-patógeno.

La identificación temprana de un brote epidémico de cualquier enfermedad infecciosa es

un paso fundamental en la implementación de medidas efectivas de control y en la

reducción de la morbilidad y mortalidad en las poblaciones humanas. Si se identifica el

DENV en poblaciones naturales del mosquito entonces puede ser posible determinar el

riesgo epidémico de FD al identificar la introducción de un nuevo serotipo en una

población humana susceptible así como el riesgo epidémico de FHD al determinar la

frecuencia de segundas infecciones asociadas con el desarrollo de esta complicación. La

circulación de nuevos o antiguos serotipos fácilmente identificados en poblaciones

naturales de mosquito constituye un elemento importante de los sistemas de alerta temprana

de la enfermedad. Igualmente, la estandarización e implementación de nuevas y sencillas

herramientas moleculares por parte de las autoridades de salud puede mejorar las

estrategias de prevención y control en un área endémica como el municipio de Bello.



33

7. METODOLOGIA

7.1 AREA DE ESTUDIO

Este trabajo se realizó en las 10 comunas del área urbana del municipio de Bello (Figura 6).

La tabla 1 presenta los barrios muestreados.

7.1.1 Ubicación del municipio de Bello

Bello hace parte del Valle de Aburrá. El municipio cuenta con un área total de 142,36 Km²

de los cuales 19,7 Km² son suelo urbano y 122,66 km² son suelo rural. Este valle está

totalmente urbanizado en su parte plana, y muy poblado en sus laderas. Al valle lo cruza el

Río Medellín, el cual corre en dirección sur-norte, y a lo largo de sus 70 kilómetros recibe

en su recorrido el tributo de 57 quebradas. La ciudad, por estar ubicada en la zona tórrida,

no registra cambios estacionarios del clima. El índice promedio de precipitación es de

1.347 mm., y su temperatura está determinada por pisos térmicos que van del páramo,

pasando por el frío hasta llegar al medio, en donde está la cabecera, la cual tiene una

temperatura promedio de 23 °C durante todo el año, intercalando períodos secos y lluviosos

y se ve refrescada por los vientos que se encañonan a lo largo del valle y que soplan durante

todo el año.

Figura 6: mapa del municipio de Bello (Antioquia) mostrando su división administrativa

en 10 comunas.



34

7.1.2 Características del municipio de Bello

De acuerdo con las cifras del censo del DANE en 2005, Bello cuenta con 371.973

habitantes. Es la segunda aglomeración urbana del área metropolitana del Valle de Aburrá,

que suma en total 3.312.165 personas. El municipio cuenta con una densidad poblacional

de aproximadamente 2.496 por kilómetro cuadrado. El 47.1% de sus habitantes son

hombres y el 52,9% mujeres. La tasa de alfabetismo en la población mayor de 5 años de

edad es del 92.9%. Según las cifras de la Gobernación de Antioquia basadas en la encuesta

de Calidad de Vida 2004, el estrato socio-económico predominante en el municipio es el 2

(bajo) con el 39.3%, seguido por el estrato 3 (medio-bajo) con el 36.1% y el estrato 1 (bajo-

bajo) con un 20.2%. En una menor proporción también están los estratos 4 (medio) y 5

(medio-alto) con un 4.3% y 0.1% respectivamente, que son principalmente viviendas

campestres ubicadas en las veredas del municipio. En los últimos años la ciudad ha venido

teniendo un crecimiento descontrolado principalmente por la migración de poblaciones

desplazadas procedentes de otros municipios del departamento, con asentamientos tipo

invasión en algunos barrios. La mayoría de la población desplazada vive en viviendas

construidas informalmente en un alto nivel de hacinamiento. El 96.4% de la población tiene

servicio de acueducto aunque en el estrato 1 el suministro de agua es inconstante. Índices

de Breteau (IB) mayores al 5% se registran en 49 (59.7%) de los 82 barrios del área urbana.

7.2 Colección del material biológico

Durante el periodo comprendido entre Mayo del 2009 a Febrero del 2011 con la

colaboración de los funcionarios de la Dirección Local de Salud de Bello (DLSB) se

participó en el levantamiento de índices aedicos con el fin de recolectar larvas y adultos de

A. aegypti para la determinación de la infección y el serotipo viral. Los índices aédicos

evalúan la situación entomológica en una localidad determinada y permiten la vigilancia y

monitoreo de las medidas de control de A. aegypti en dicha localidad. La DLSB realiza 4

levantamientos anuales en todas las comunas de Bello, específicamente dos levantamientos

durante época seca (Dic-Feb; Jun-Ago) y dos durante época de lluvias (Mar-May; Sept-

Nov). Estos levantamientos se realizan mediante visitas domiciliarias durante las cuales se

recolectan larvas y/o pupas y adultos de A. aegypti en los diferentes tipos de criaderos del

mosquito.

Las larvas y pupas fueron transportadas directamente en agua desde criadero al insectario

del Grupo de Biología y Control de Enfermedades Infecciosas (BCEI). Los adultos se

transportaron vivos en bolsas ziploc con un poco de aire. Los insectos inmaduros se

tuvieron en condiciones estándar de 28°C y 70-80% de humedad relativa en recipientes con

agua y se alimentaron con pescarina diariamente hasta que llegaron al estado adulto.



35

Se colectaron varias larvas en un solo criadero puesto que las hembras de A. aegypti

ovipositan pequeñas cantidades de huevos en numerosos sitios (Reiter, 2007); sabiendo

esto, se deduce que varias hembras pusieron sus huevos en el mismo sitio durante la época

de postura. Esto descarta la posibilidad de muestrear hermanos o individuos muy

cercanamente relacionados (Ravel S et al., 2001).

7.3 Extracción y purificación de ARN

Para la extracción del ARN se siguió la metodología tradicional descrita por Cáceres

(2003); brevemente, los adultos fueron homogenizados en pools de máximo 5 mosquitos en

un tubo (eppendorf) con 500 ul de trizol y macerados para la extracción de ácidos

nucleicos; después se adicionaron otros 500 ul de trizol y se centrifugó a 12000 r.p.m a 4°C

por 10 min. El sobrenadantte se transfirió a un nuevo vial, se incubó el homogenizado por 5

min a temperatura ambiente y luego se adicionaron 200ul de cloroformo; se incubó a

temperatura ambiente por 15 min, y la suspensión se centrifugó 12000 r.p.m por 15min,

luego se transfirió la fase superior a un nuevo vial, se adicionaron 500ul de isopropanol y se

mezcló para precipitar el ARN; se incubó por 10 min a temperatura ambiente, se centrifugó

de nuevo a 12000 r.p.m por 10 min, se descartó el sobrenadante y se lavó el precipitado

con 1ml de etanol al 75% tratado con agua DEPC. El precipitado se centrifugó a 7500 r.p.m

por 5min, se descartó el etanol y se secó el pellet. El precipitado se resuspendió en 25ul de

agua libre de RNAsas y se incubó por 10 min a 55-60°C y se almacenó -80°C hasta ser

utilizado.

7.4 Cuantificación de ARN

La cuantificación del ARN total se realizó en un NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer

mediante un procedimiento espectrofotométrico, para lo cual se midió la absorbancia a 260

nm de las muestras de ARN. La pureza del ARN se determinó midiendo la absorbancia a

280 nm y calculando la razón A260/A280 (valor que debe ser superior a 1.8). La

concentración aproximada de la muestra se calculó utilizando la siguiente relación: 1

unidad de absorbancia a 260 nm equivale a 40 μg/ml de ARN.

7.5 Identificación de DENV y serotipos de DENV

La presencia de DENV en larvas y adultos colectados en campo se evidenció mediante RT-

PCR (reacción en cadena de la polimerasa después de la transcriptasa reversa) usada

anteriormente para detectar el DENV en saliva de Aedes (Chow et al., 1998). La

identificación de los serotipos circulantes se realizó mediante análisis moleculares sobre los

adultos de A. aegypti colectados vivos en campo. Los individuos fueron sacrificados por

congelamiento y mantenidos en solución de RNA later® (QIAGEN) hasta la extracción del

ARN. El ARN obtenido se sometió a transcripción reversa (RT) para ser convertido en



36

cADN y luego se realizó la reacción de PCR utilizando los iniciadores y el protocolo

descrito por Seah CLK et al., (1995).

7.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR)

Antes de realizar la identificación del serotipo se evaluó la integridad del ARN mediante

amplificación del gen ribosomal AAS7 usando los primers específicos para A. aegypti

descritos en Günther J et al., 2007 5_- ACGTGAAATCGTTCGTGACATTAAG(sentido)

y 5 _-TTAACTTAGAAGCACTTGCGGTGAA (anti-sentido).

La retro-transcripción (RT) fue realizada usando el kit para RT-PCR QUANTITECT

SYBR GREEN (Quiagen®); La RT se realizó a 48° por 45 min. Luego 35 ciclos de PCR de

30s, 55° por 60s y 68° por 60s, y un ciclo final de 68° por 10 min.

Para detectar el serotipo de DENV se usaron los primers para el gen NS3 descritos por Seah

CLK et al., 1995 (Ver tabla 1).

Tabla 1: Secuencias nucleotídicas, y posiciones consenso arriba (DV1) y primers de tipo

específico abajo (DSP1-4) para la identificación de los serotipos virales.

Primer

(orientación) Secuencia

Posición

nucleotídica

Tamaño

en pb

DV1 (+) 5’-GGRACKTCAGGWTCTCC-3’

DSP1 (-) 5’-AGTTTCTTTTCCTAAACACCTCG-3’ 5067-5045 169

DSP2 (-) 5’-CCGGTGTGCTCRGCYCTGAT-3’ 5279-5260 362

DSP3 (-) 5’-TTAGAGTYCTTAAGCGTCTCTTG-3’ 5174-5152 265

DSP4 (-) 5’-CCTGGTTGATGACAAAAGTCTTG-3’ 5342-5320 426

Nucleótidos ambiguos: K (G/T), R (A/G), W (A/T), Y(C/T).



37

7.6 Visualización de fragmentos virales

La identificación del serotipo viral se verificó considerando el tamaño en pb obtenido por

visualización en electroforesis en agarosa al 1.5% (DEN1: 169 pb, DEN2: 362 pb, DEN3:

265 pb, DEN4: 426 pb). El ARN viral utilizado como control positivo procedió de cultivos

celulares infectados con los diferentes serotipos, los cuales fueron gentilmente facilitados

por José Ciro Usme del Laboratorio Neurociencias de la SIU-UdeA.

7.7 Determinación de la tasa mínima de infección viral en mosquitos

Se determinó la tasa mínima de infección (MIR) de A. aegypti con el DENV en poblaciones

naturales como se describe en Urdaneta L et al., 2005, basándonos en el supuesto básico

en que sólo un individuo infectado existe en un pool positivo. Por definición, la MIR tiene

define el límite inferior de la verdadera tasa de infección. Cuando las tasas de infección son

bajas y/o el pool es de tamaño pequeño, MIR proporciona una buena

estimación de la verdadera tasa infección de infectados ya que la posibilidad de que exista

más de un individuo en un pool positivo es insignificante (Gu W et al., 2004)

MIR= (numero de mosquitos positivos / numero total de mosquitos analizados)*1000



38

8. RESULTADOS

8.1 Colección del material biológico

Los insectos fueron colectados en los Barrios de Bello que tenían reportes de ser áreas de

alto riesgo o de tener una alta densidad vectorial, que hacen parte del programa de

vigilancia entomológica de la DLSB; estos barrios fueron visitados al menos una vez

durante los levantamientos de índices médicos: Las casas muestreadas en cada barrio

fueron escogidas al azar por los integrantes de la DLSB; cada casa visitada fue sometida a

una búsqueda meticulosa de larvas y adultos de mosquitos, dentro y en sus alrededores,

teniendo en cuenta las horas de mayor actividad hematofágica del mosquito es decir entre

las 9am y las 12m. Los individuos adultos fueron colectados con pequeñas redes de barrido

y los estadios inmaduros se colectaron con pipetas paster y luego se mantuvieron en viales

o en bolsas con agua del mismo criadero hasta su transporte al insectario del BCEI. Cada

espécimen colectado se identificó con el nombre del barrio, la dirección de la casa y la

fecha de colección. Los barrios visitados se muestran en la tabla 2. Los principales

criaderos donde el mosquito realiza parte de su ciclo de vida son canecas, tanques, plantas

en agua y recipientes de plástico que puedan contener agua reposada, donde las hembras

realizan su oviposición.

En el insectario del BCEI los individuos adultos fueron llevados a -20°C para provocarles

un choque térmico y luego ser almacenados en viales eppendorff con solución RNA later

(Quiagen®) a -80°C para conservar la integridad del ARN.

Tabla 2: Barrios muestreados en Bello y la comuna a la que pertenecen

BARRIO COMUNA FECHA

Prado # 8. Niquía Mayo 2009

Prado #8. Niquía Septiembre 2009

Granjas #8. Niquía Mayo 2009

Bucaros #3. Santa Ana Mayo 2009

Santa Ana #3. Santa Ana Mayo 2009

Villa María #5. La Cumbre Mayo 2009

Pachelly #6. Bellavista Mayo 2009

Altos de Niquía #7. Altos de Niquía Mayo 2009

Altos de Niquía #7. Altos de Niquía Septiembre 2009

Ciudad Niquía #8. Niquía Mayo 2009

Cafetal #5. La Cumbre Septiembre 2009

Buenos Aires #4. Suárez Septiembre 2009

Sonora #5. La Cumbre Septiembre 2009



39

Selva #7. Altos de Niquía Septiembre 2009

Niquía #8. Niquía Septiembre 2009

La Camila #9. Fontidueño Septiembre 2009

La Camila #9. Fontidueño Agosto 2010

Guasimalito #7. Altos de Niquía Septiembre 2009

Bellavista #6. Bellavista Diciembre 2009

Gran avenida #2. Madera Diciembre 2009

Pérez #4. Suárez Diciembre 2009

Pérez #4. Suárez Junio 2010

Pérez #4. Suárez Agosto 2010

Cabañitas #2. Madera Diciembre 2009

La Gabriela #10. Acevedo Diciembre 2009

Villa María #5. La cumbre Diciembre 2009

Playa Rica #6. Playa Rica Diciembre 2009

Espíritu Santo #4. Suárez Diciembre 2009

Madera #2. Madera Diciembre 2009

París #1. París Diciembre 2009

Primavera #5. La Cumbre Junio 2010

Maruchenga #1. París Junio 2010

San Gabriel #6. Bellavista Agosto 2010

Riachuelo #4. Suaréz Agosto 2010

Urapanes #8. Niquía Agosto 2010

Hermosa provincia #7. Altos de Niquía Agosto 2010

Tierra adentro Agosto 2010

8.2 Identificación de los especímenes

Todas las hembras y machos analizados fueron primero identificadas correctamente con

ayuda de un estereomicroscopio como A. aegypti siguiendo la clave taxonómica de Rueda

(2004).

8.3 Análisis genético

8.3.1 Extracción de ARN Se realizó la extracción de ARN de 1000 mosquitos colectados

en los barrios registrados en la tabla 2. Los mosquitos fueron agrupados en un total de 282

pools, distribuidos en máximo 5 mosquitos por pool y separados según el sexo y el lugar de

colección.



40

Tabla 3: Distribución de mosquitos en pools y total de pools

Numero de

mosquitos por pool

Total de mosquitos

por pool

Total de

pools

1 72 72

2 82 41

3 76 25

4 182 45

5 822 164

Total 1234 347

8.3.2 Cuantificación del ARN

Al realizar la cuantificación se pudo apreciar que la cantidad de ARN que se obtuvo de

cada pool estuvo entre 270.5 ng/ul – 1535.6 ng/ul, con una pureza promedio de 1.85

(260/280) por pool. Se realizaron diluciones para realizar todas las RT-PCR con el ARN a

una concentración de 50 ng/uL.

8.3.3 Evaluación de la integridad del ARN

Para verificar la integridad del ARN extraído se realizó la amplificación del gen ribosomal

AAS7 (300 pb) de A. aegypti (Figura 6). De este análisis solo el 0.002% de los pools

analizados no tuvo amplificación lo que pudo deberse a una degradación del ARN. Estas

muestras fueron descartadas.

Figura 7: Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio mostrando la amplificación

del gen ribosomal AAS7. M: machos; H: hembras; El numero indica la cantidad de

300pb



41

mosquitos por pool; CN: control negativo; la flecha indica el tamaño de la banda

amplificada (300pb).

8.3.4 Identificación de DENV y serotipos

Solo el 0.002% del total de mosquitos analizados resultó positivo para DENV por RT-PCR;

El pool positivo contenía 2 mosquitos hembras los cuales fueron colectados en el barrio

Pérez en Diciembre de 2009. La determinación del serotipo identificó la presencia de

DENV-3 en la muestra positiva (Figura 8).

Figura 8: Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio mostrando la amplificación

de los serotipos DENV-2 (carril 2: 362 pb), DENV-3 (carril 3: 265 pb) y DENV-4 (carril 4:

426pb); Carril 5: muestra positiva correspondiente al serotipo DENV-3.

8.3.5. Determinación de la mínima concentración.

Para corroborar la sensibilidad de la RT-PCR después de haber obtenido nuestros

resultados decidimos realizar un ensayo con diluciones seriadas a partir de la concentración

inicial de 85.8 ng/ul las cuales fueron desde 1:10 hasta 1: 10000000 del ARN del DENV.

La figura 9, muestra los resultados de los productos de amplificación obtenidos por RT-

PCR para el serotipos DENV- 2 en una electroforesis en gel de agarosa al 1%.

Marcador DENV-2 DENV-3 DENV-4 Muestra + CN



42

Figura 9. Gel de agarosa al 1% mostrando la amplificación de las diluciones a partir de

DENV-2. Carril 1: marcador de peso, 2: DENV-2 (85.8ng/ul), 3: dilución 1:10 (18ng/ul), 4:

1:100 (2.3ng/ul), 5: 1:1000 (1.9ng/ul), 6: 1:10000 (1ng/ul), 7: 1:100000 (0.2ng/ul), 8:

1:1000000 (0.001ng/ul), 9: 1: 10000000 (0.00001ng/ul), 10: control negativo.

El límite de detección fue 1:100000 para nuestro serotipo estudiado de DENV; esto nos

muestra una sensibilidad de detección del virus obtenido a partir de una concentración viral

de 0.2 ng/ul. Al comparar esto con la baja sensibilidad en la detección del DENV en los

pools de mosquitos capturados en campo observamos que pudo ser debido a un bajo titulo

viral en los moquitos inferior a 0.2 ng/ul.

8.3.6 Determinación de la tasa mínima de infección viral en mosquitos

Se determinó la tasa mínima de infección de A. aegypti con el DENV en poblaciones

naturales como se describe en Urdaneta L et al., 2005.

Determinación de la tasa mínima de infección para A. aegypti larvas y adultos

colectados en campo

MIRA.aegypti= (numero de mosquitos positivos / numero total de mosquitos analizados)*1000

MIRA.aegypti = 2/1234 x 1000 = 1.621



43

Determinación de la tasa mínima de infección para larvas de A. aegypti colectados

en campo.

MIRlarvas = (numero de larvas positivas / numero de larvas totales)* 1000

MIRlarvas= 0/ 1182 x 1000 = 0

Determinación de la tasa mínima de infección para A. aegypti adultos colectados en

campo.

MIRadultos = (numero de adultos positivos / numero de adultos totales)* 1000

MIRadultos= 2/ 52 x 1000 = 38.462



44

9. DISCUSIÓN

En las últimas dos décadas, la epidemiología del dengue en Colombia ha cambiado

dramáticamente con un incremento en la frecuencia e intensidad de los brotes epidémicos, a

pesar de los esfuerzos realizados por los programas locales de control. Para disminuir el

riesgo a la salud humana y los costos sociales y económicos asociados a las enfermedades

arbovirales como la FD/DHF, es necesario conocer la dinámica de transmisión de los

DENV y desarrollar con estos datos programas de vigilancia epidemiológica. La vigilancia

virológica debería incluir la detección temprana de la circulación del virus y su serotipo no

solo en humanos sino también en los mosquitos vectores, a fin de disponer de verdaderos

sistemas de alerta temprana de epidemias y/o brotes de esta enfermedad. Para cumplir con

esto es clave el diagnóstico seguro y la correcta identificación del serotipo que causa la

patología, para lo cual la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa con

transcripción reversa (RT-PCR) ha demostrado ser ampliamente eficiente. La vigilancia

virológica de mosquitos recogidos en campo y analizados por esta técnica ha sido sugerida

como herramienta en el monitoreo y en los sistemas de alerta temprana para brotes de

DENV en áreas endémicas y para la detección de los serotipos que sean introducidos

recientemente en dichas áreas (Chow et al., 1998, Méndez F et al., 2006).

El desarrollo e implementación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha

facilitado la aparición de un gran número de ensayos de diagnóstico para detectar virus,

incluyendo varias pruebas para detectar el DENV (Lanciotti RS, 1992). Estudios enfocados

en usar esta técnica molecular para detectar los serotipos del DENV en mosquitos han sido

realizados en zonas endémicas de Venezuela y Singapur (Chow VTK et al., 1998, Castro

et al., 2004, Urdaneta L et al., 2005). Aunque algunos de estos trabajos se limitaron solo al

análisis de datos epidemiológicos, cuando la epidemia ya se había establecido, la técnica

demostró alta sensibilidad y especificidad para DENV comparada con los métodos

serológicos usados con este mismo objetivo pero en humanos. Considerando la importancia

de conocer los serotipos que circulan en el municipio endémico de Bello y conociendo

que la segunda infección con algunos serotipos y genotipos del virus se asocian con

manifestaciones clínicas graves como la FHD y el SCD, y dado que existen reportes

previos de co- circulación de dos o más serotipos en este municipio, nuestro trabajo evaluó

el potencial de la detección del DENV en mosquitos traídos directamente de campo y

colectados en barrios con registros de infestación por A. aegypti.

En este estudio, la aproximación molecular usada involucró múltiples primers que estaban

dirigidos al gen que codifica la proteína no estructural NS3, lo cual permitió no solo

identificar la infección específica con virus dengue eliminando la posibilidad de reacciones

cruzadas con otros flavivirus, además de identificar el serotipo viral causante de esta

infección en el mosquito. Para corroborar la sensibilidad de la RT-PCR después de haber



45

obtenido nuestros resultados se realizó un ensayo con diluciones seriadas desde 85.8 ng/ul

hasta 0.0001 ng/ul del ARN obtenido a partir del DENV-2. El límite mínimo de detección

fue 0.2 ng/ul; la baja sensibilidad en la detección del DENV con los pools de mosquitos

capturados en campo podría entonces relacionarse con un titulo viral en los moquitos

menor a esta concentración. Otra posibilidad es que dado que las extracciones de ARN en

nuestro estudio fueron realizadas a partir de todo el mosquito, esto podría haber resultado

en un efecto inhibitorio originado por la cantidad de tejido del mosquito.

La tasa mínima de infección (MIR) de 1.621 calculada en este estudio para A. aegypti en

Bello contrasta con resultados anteriores obtenidos en otras ciudades hiperendémicas como

Maracay en Venezuela donde se encontraron 16 por cada 1000 mosquitos (Urdaneta et al.,

2005) y en Singapur donde fue de 57,6 por cada 1000 mosquitos (Chow et al., 1998). No

obstante, la MIR podría aumentar si se incrementa el número de especímenes como en el

estudio de Urdaneta et al. (2005) en Venezuela donde se colectaron 4,597

aproximadamente. Para obtener una cantidad de mosquitos significativa se deben

considerar diversos factores como el tipo de instrumentos para realizar las colectas, el uso

de ovitrampas pegajosas, o las trampas de mosquitos BG-centinela (Ritchie et al., 2004).

Las colecciones del material de campo para nuestro trabajo se realizaron dentro de las

actividades convencionales del levantamiento de índices aédicos, las cuales están limitadas

en términos de recurso humano (el cual es contratado directamente por la DLSB y en

muchos casos carece de entrenamiento en entomología o es temporal) y de recurso físico (el

personal solo dispone de redes de barridos de fabricación casera). Lo anterior también

permitiría confirmar la transmisión vertical, sugerida en otros estudios como el de Gunther

J et al. (2007) en donde las larvas colectadas directamente de campo sobrepasaron las

4.000. En nuestro periodo de estudio, el DENV solo fue detectado en hembras adultas de A.

aegypti lo que sugiere que en la población está ocurriendo transmisión horizontal. Nosotros

detectamos la presencia de DENV-3 en estas hembras, las cuales fueron colectadas en

diciembre del 2009 en una casa donde habitaban personas con diagnóstico clínico de FD,

según información de la DLSB. Durante este mismo año, el Laboratorio Departamental de

Salud de Antioquia confirmó la circulación de DENV-3 en el municipio de Bello y sus

municipios vecinos en sueros aislados de pacientes con diagnostico confirmado de FD

(comunicación personal Dra. Marta Ospina); lo anterior está directamente relacionado con

el brote de la enfermedad ocurrido a finales del 2009 y principios del 2010. Chow et al.

(1998) en Singapur detectaron mosquitos infectados con DENV seis semanas antes de que

se presentaran casos en los humanos. Aunque nuestro estudio no permite determinar el

momento preciso del periodo epidémico durante el cual nuestro pool infectado se detectó, si

nos muestra que la técnica puede incluirse en estudios epidemiológicos a mayor escala,

donde los resultados obtenidos en la población de mosquitos puedan correlacionarse con los

obtenidos a partir de pruebas serológicas humanas.



46

Los resultados del presente estudio confirman la importancia de la vigilancia epidemio-

virológica a través de la detección de mosquitos infectados naturalmente con DENV, como

una forma eficiente y rápida para la predicción de brotes de dengue.



47

10. CONCLUSIONES

De la muestra de mosquitos analizados se identificó un pool de dos hembras

infectado con DENV-3, lo que muestra la utilidad de la técnica RT-PCR empleada

para detectar el virus en poblaciones naturales de A. aegypti.

Nuestros resultados confirman que la región del virus NS3 amplificada, es sensible

y específica para detectar y tipificar los serotipos de DENV circulantes en

poblaciones naturales del mosquito A. aegypti.

La tasa mínima de infección (MIR) baja (1.621) que se observa en poblaciones

naturales del mosquito se ve reflejada en este estudio, encontrando un solo pool de

dos mosquitos hembras infectado de un total de 282 pools.

Este estudio enfatiza la utilidad de las herramientas moleculares en los sistemas de

alerta temprana, contribuyendo a la disminución del riesgo de epidemias en una

región particular, al predecir el/los serotipos del virus DENV circulantes en la

naturaleza.



48

11. PERSPECTIVAS

Es recomendable incluir una mayor cantidad de especímenes y disponer de

controles positivos de mosquitos infectados, se debe conocer la cantidad de virus

con la que están infectados para así poder determinar hasta que rango de titulo viral

puede detectar la técnica RT-PCR.

Deben implementarse estrategias de recolección de mosquitos más efectivas con el

fin de obtener un mayor número de adultos, y por lo tanto una mayor probabilidad

de encontrar infección por DENV en A. aegypti.

Con el fin de una mejor aplicación epidemiológica, es fundamental correlacionar los

datos de la vigilancia virológica en mosquitos con los datos obtenidos a partir de

muestras humanas.



49

12. BIBLIOGRAFIA.

Agrelo SR.1996. Aedes aegypti, Aedes albopictus (Diptera, Culicidae) y su papel como

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