1FASE ESTACIONARIADeterminar la concentracin bacteriana en la FE (18-24 hora!"1# m$ %e cal%o &'I con inc(lo %el analito a )orti)icar"Con ete %ato reali*ar %il(cione %e 1#-1 a 1#-+ ,ara %eterminar la %il(cin en la -(e e ten%r.a la concentracin a%ec(a%a ,ara inoc(lar la matri*"Determinar la c(enta bacteriana %e la %il(cione 1#-/ a 1#-+ ,or %(,lica%o en a0ar c(enta et1n%ar" Re0itrar lo c1lc(lo 2 %ato %e 3ol(men 2 %il(cin %e FE necearia ,ara lle0ar a la concentracin %eea%o en la al.c(ota %e la matri*"2 $.mite %e %eteccin ($D! En el cao %e -(e el m4to%o a 3ali%ar no c(ente con $D %eclara%o5el $D terico a er 3eri)ica%o e %e 6 ()c72/0 (%itrib(cin %e 8oion! ,ara (na ,robabili%a% %e +/9 %e %etectar el analito"C1lc(lo:El n;mero %e c4l(la neceario ,ara obtener (n re(lta%o ,oiti3o con +/9 %e con)ian*a eria:%on%e C< e el n;mero me%io %e microor0animo en la ,orcin anal.tica" En el cao %e -(e el m4to%o a 3ali%ar c(ente con $D %eclara%o5 el $D a er 3eri)ica%o er1 la con)irmacin %el 3alor %eclara%o"0 , 305 , 01log = = N c3 $.mite %e %eteccin ($D!1UFC 4UFC 10UFC=/# 0 matri*150 g150 g 150 g6 alcuotas de 25 g 6 alcuotas de 25 g 6 alcuotas de 25 gpreenriquecimientoenriquecimientopreenriquecimiento preenriquecimientoenriquecimiento enriquecimientoprobar ausencia del analito, 6 vecesR> R> R> TT TT TT'acer &? 2 erolo0.a150 g6 alcuotas de 25 gUFCpreenriquecimientoenriquecimientoR> TT1 alic23456-+-++-4 $.mite %e %eteccin ($D!concentracin UFC/ 25g o mLNo. de replicasresultado positivo / negativo 10 6 6/04 6 6/03 6 5/11 6 3/3En el caso de ue el mtodo declare elL!" se de#e replicar $0 veces % aplicar la siguiente &rmula'(ECU)E(*C+N, -No. positivos- . /00 con criterio de aceptacin igual o 0 152No. de replicas.)or e3emplo" aplicando el sistema de la ta#la anterior con 6 replicas'(ECU) , 6 ./00, /0026 (ECU) , 5 ./00,4$2 6)or de#a3o de 6 positivas %a no es con&ia#le la deteccin" el resultado de 4$2 esta por de#a3o del criterio de aceptacin del 152 5 Incl(i3i%a% (I!Se (tili*an ce,a -(e ,(e%en er catalo0a%a como analito5 ,(e%en er ce,a %el mimo analito en c(etin5 aila%a %e %i)erente ti,o %e alimento 27o re0ione 0eo0r1)ica" Se re-(ieren ,or lo meno 1/ ce,a ,(ra %el analito (! m1 ,re3alente en la re0in o m1 )rec(entemente aila%a en el laboratorio(,ara Salmonella e recomien%an 6# ce,a!"No e (tili*a la matri*" En ( l(0ar e (tili*a la ce,a ,(ra" $a Concentracin %e lo inc(lo %ebe etar entre 1# 2 1## 3ece el $D"6Incl(i3i%a% (I!!reparar la F" de los analitos # calcular el volumen # la diluci$n que permitan la concentraci$n deseada%&nocular 225 m' de preenriquecimiento (por separado por cada F" de los analitos) enriquecimientoagar cuenta est*ndar (preenriquecimiento)R> TTagar cuenta est*ndar (enriquecimiento)R>TT'acer &? 2 erolo0.a1 anal215....Nota' no se hace por duplicado.7 'acer (n rec(ento en 8CA5 ,ara conocer el n;mero real inoc(la%o en ca%a 8ASO" Re0itrar el n;mero %e @FC rec(,era%a en ca%a (no %e lo a0are electi3o 2 com,arar con 8CA" Re0itrar la caracter.tica coloniale5 i on t.,ica o no obre lo me%io electi3o" Re0itrar la re,(eta %e &? 2 erolo0.a" E %eeable -(e el m4to%o en e3al(acin ea ca,a* %e rec(,erar to%o lo analito %e inter4 ,rioritario (1##9!"Incl(i3i%a% (I!8 EAcl(i3i%a% (E! Se (tili*an ce,a -(e ,(e%en er catalo0a%a como inter)erente5 e %ecir5 ce,a -(e com,itan en re,(eta con el analito en c(etin ()lora com,etiti3a %el analito en et(%io!" Se re-(ieren ,or lo meno 1/ ce,a ,(ra %el inter)erente (! m1 )rec(entemente com(ne como )lora acom,aBante" (lo -(e e recomien%a eta%.ticamente5 on 6# ce,a!"No e (tili*a la matri*" En ( l(0ar e (tili*a la ce,a ,(ra" $a Concentracin %e lo inc(lo %ebe etar entre 1### 2 1#5###"9EAcl(i3i%a% (E!!reparar la +ase estacionaria de los inter+erentes # calcular el volumen # la diluci$n que permitan la concentraci$n deseada%&nocular 225 m' de preenriquecimiento(por separado por cada FE de los cope!idores" enriquecimientoagar cuenta est*ndar (preenriquecimiento)R> TTagar cuenta est*ndar (enriquecimiento)R>TT'acer &? 2 erolo0.a1 in!er#er#2....15Nota' sin hacer duplicados.10'acer (n rec(ento en 8CA5 ,ara conocer el n;mero real inoc(la%o en ca%a 8ASO" Re0itrar el n;mero %e @FC rec(,era%a en ca%a (no %e lo a0are electi3o 2 com,arar con 8CA"Re0itrar la caracter.tica coloniale %e lo inter)erente obre lo me%io electi3o 2 c(ale no on inhibi%o com,letamente" Re0itrar la re,(eta %e &? 2 erolo0.a"E %eeable -(e el m4to%o en e3al(acin ea ca,a* %e inhibir to%o o la ma2or.a %e lo inter)erente %i)erenciarlo %e lo %e inter4 ,rioritario"EAcl(i3i%a% (E!11 $a re,(eta %e rec(ento %e la FE5 %eben er ,ro,orcionale a la re,(eta %e la %il(cione a,lica%a en la ,r(eba con relacin a la %i,erin %e microor0animo" E con3eniente -(e el ,rimer ,(nto %e )orti)icacin 2 ,or lo tanto %e la l.nea recta ea el $D" $a lineali%a% e 3e in)l(i%a ,or la concentracin %e ca%a ,(nto -(e inte0ra la l.nea a. como %e la cercan.a entre (na 2 otra %il(cin" e a,lica a m4to%o microbiol0ico c(antitati3o" $ineali%a% (,ro,orcionali%a%!Nota' En dia$raa %&'() #or!i#icar 10 * de a$ua es!+ril, a$re$ar a 90 * de dilu-en!e e inocular 0.1 lal &'(. .eali/ar el iso procediien!o para las si$uien!es #or!i#icaciones con las diluciones respec!i0as coo si #uese un 1lanco.12$ineali%a%4,10

UFC -,105 UFC 20,105 UFC6C#0 matri*60 g 60 g 60 g6 alcuotas .10 g 6 alcuotas. 10 g 6 alcuotas. 10 g/0 m' dilu#ente0%1 m'/0 m' dilu#ente /0 m' dilu#enteprobar ausencia del analito, 6 vecesD8CA &8'acer coa0(laa 2 termon(cleaa60 g 60 g6 alcuotas .10 g 6 alcuotas .10 g4,104 UFC 16,105 UFC/0 m' dilu#ente /0 m' dilu#ente1#-11#-11#-11#-11#-10%1 m' 0%1 m' de dil% 10020%1 m' de dil% 10020%1 m' de dil% 10028CA 8CA 8CA 8CA &8 &8 &8&81o% UFC esperadas4 @FC70 4# @FC70 8# @FC701C# @FC70 2## @FC70Nota' cada una de 6 al2cuo!as por #or!i#icaci3n se sie1ra por duplicado !eniendo 4ue se1rar por coluna 6 ca5as por duplicado, es decir, 12 ca5as.13$ineali%a%Se obtiene la re0rein lineal %el lo0" nat(ral %e la @FC rec(,era%a (2! 2 la @FC e,era%a (A!"Eta%.tica %e lineali%a% (criterio %e ace,tacin7recha*o!Coe)" %e correlacin %e:8earoni0(al E#"+/OlFin 2 8ratti0(al E #"+/9 %e recobro: +/-1#/9 C">": No ma2or %el /914Re,etibili%a% (r! 2 Re,ro%(cibili%a% (R!" 8ara 3eri)icar el 0ra%o %e concor%ancia entre lo re(lta%o obteni%o en %i)erente re,eticione reali*a%a ,or (n mimo analita en corto e,acio %e tiem,o (re,etibili%a%! 2 ,or %i)erente analita (re,ro%(cibili%a%!" Se reali*a a tra34 %e rec(ento en ,laca tratan%o %e rec(,erar lo -(e e inoc(la a ,artir %e %il(cione" Si el m4to%o %e rec(ento a%o,ta la inoc(lacin %e #"1 m$ en (,er)icie5 e )orti)ica la matri* con 6##5### a 4##5### @FC72/0 m$" En G4Aico la ,orcin e %e 1#0 ,ara S. aureus5 ,or lo tanto e )orti)ica con 12#5### @FCa 1C#5### ,or ,orcin"Nota' En dia$raa %&'() #or!i#icar 10 * de a$ua es!+ril, a$re$ar a 90 * de dilu-en!e e inocular 0.1 lal &'(. .eali/ar el iso procediien!o para las si$uien!es #or!i#icaciones con las diluciones respec!i0as coo si #uese un 1lanco.15120,000 UFC (12,000 UFC.g)12# 0 matri*60 g6 alcuotas de 10 g/0 m' del dilu#ente2il 1001de la dil% 1001!reparar dil% 1002!reparar dil% 100probar ausencia del analito, 6 vecesRe,etibili%a% (r!Conteo 120 Conteo 12 Conteo 10%1 m' 0%1 m'0%1m'1 m'1 m'6o!a7 con el o15e!o de !ener n8eros con!a1les en placas, se ca1ia de 12,000 9F'/$ a 20,000 9F'/$.D8CA1 23 4 5 6D8CAD8CA16200,000 UFC (20,000 UFC.g)12# 0 matri*60 g6 alcuotas de 10 g/0 m' del dilu#ente2il 1001de la dil% 1001!reparar dil% 1002!reparar dil% 100probar ausencia del analito, 6 vecesRe,etibili%a% (r!Conteo 200 Conteo 20 Conteo 20%1 m' 0%1 m'0%1m'1 m'1 m'6o!a7 con el o15e!o de !ener n8eros con!a1les en placas, se ca1ia de 12,000 9F'/$ a 20,000 9F'/$.200,000 UFC (20,000 UFC.g)12# 0 matri*60 g6 alcuotas de 10 g/0 m' del dilu#ente2il 1001de la dil% 1001!reparar dil% 1002!reparar dil% 100probar ausencia del analito, 6 vecesRe,etibili%a% (r!Conteo 200 Conteo 20 Conteo 20%1 m' 0%1 m'0%1m'1 m'1 m'6o!a7 con el o15e!o de !ener n8eros con!a1les en placas, se ca1ia de 12,000 9F'/$ a 20,000 9F'/$.D8CA1 23 4 5 6D8CAD8CA17 1! Calc(lar la me%ia 2 la %e3iacin et1n%ar ,or hilera %e %il(cin" 2! De,(4 calc(lar la %e3iacin et1n%ar relati3a (RSD! %e ca%a conH(nto %e re(lta%o %e la mima %il(cin:6! Ele3ar lo 3alore %e RSD encontra%o al c(a%ra%o %e ca%a %il(cin" 4! Calc(lar la me%ia c(a%r1tica %e la %e3iacin et1n%arrelati3a (man%o lo c(a%ra%o %e lac(enta ,or %il(cin 2 %i3i%en%o ,or el n;mero total %e ,laca le.%a (n!" /! I Calc(lar la ra.* c(a%ra%a %el re(lta%o ,ara obtener la %e3iacin et1n%ar %e re,etibili%a%"E3al(acin %e re(lta%o %e Re,etibili%a% (r!xsRSD =nRDSn RDS RDSRSDA2 2 2... 2 1 + + +=18E3al(acin %e re(lta%o %e Re,etibili%a% (r! "3emplo4 5e tuvieron las siguientes lecturas de 2 diluciones4dil% 1002dil% 1001260120 120011512510512641251260-050012781,121%578111%2%est%805%56 2%est816%/25980%262425980%1521 ::::::::::::::::::: (0.2724)2 + (0.1521)2 80%0642 ;0%021 8 0%00-118#"#+## (+9! 1212 $4Nota' al aplicar la prue1a de :ru11s se descar!a el 0alor a1erran!e de 500 - asi se calcula la ;