validación parcial del método espectrofotométrico del

UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU” DE LAS VILLAS FACULTAD DE QUÍMICA FARMACIA

TRABAJO DE DIPLOMA EN OPCIÓN AL TÍTULO DE LICENCIADO EN QUÍMICA

Título:

VALIDACIÓN PARCIAL DEL MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO

DEL ÁCIDO VANADOMOLIBDOFOSFÓRICO PARA LA DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO

DE FÓSFORO TOTAL EN PRODUCTOS DE FERMENTACIÓN DE

MICROORGANISMOS EFICIENTES

Autora: ELIZABETH GONZÁLEZ MARTÍNEZ

Tutoras:

DRA. PETRA G. VELAZCO PEDROSO DRA. DANIELLYS ALEJO SÁNCHEZ

2016 “Año 58 de la Revolución”

Índice

Resumen

Abstract Introducción ................................................................................................................. 1 Capítulo 1. Revisión bibliográfica ................................................................................ 4

1.1 Microorganismos eficientes ................................................................................ 4 1.2 Propiedades de los EM ...................................................................................... 5

1.3 Aplicaciones ....................................................................................................... 6

1.3.1 Aplicaciones en la agricultura ...................................................................... 6

1.3.2 Aplicaciones en el medio ambiente .............................................................. 7 1.3.3 Aplicaciones en la producción animal .......................................................... 8 1.3.4 Aplicaciones en la cría de aves de corral ..................................................... 9

1.3.5 Aplicaciones en la actividad pesquera ......................................................... 9 1.3.6 Aplicaciones en la industria ....................................................................... 10

1.4 Composición química de los EM ...................................................................... 10

1.5 El fósforo .......................................................................................................... 11 1.6 Determinación del contenido de fósforo ........................................................... 12

1.7 Parámetros estadísticos ................................................................................... 14

1.7.1 Linealidad .................................................................................................. 14 1.7.2 Precisión .................................................................................................... 16

1.7.3 Límites de detección y cuantificación ......................................................... 16 1.7.4 Veracidad ................................................................................................... 17

1.8 Fundamento teórico del análisis por Espectrofotometría UV-VIS .................... 18

Capítulo 2. Materiales y métodos .............................................................................. 20

2.1 Reactivos, materiales, equipos y disoluciones de trabajo ................................ 20

2.1.1 Reactivos empleados ................................................................................. 20 2.1.2 Instrumentos, equipos y materiales empleados ......................................... 21 2.1.3 Preparación de disoluciones y del material para el ensayo ....................... 21

2.2 Descripción de la técnica espectrofotométrica del ácido vanadomolibdofosfórico para la determinación del fósforo total en la muestra............................................. 22 2.3 Preparación de la curva de calibración con fosfatos ........................................ 23 2.4 Procedimiento para la determinación del contenido de fósforo total en la muestra de EM ..................................................................................................................... 24

2.4.1 Preparación preliminar de la muestra ........................................................ 24

2.4.2 Pre-tratamiento de la muestra por digestión .............................................. 24 2.4.3 Desarrollo de color en la muestra .............................................................. 25

2.5 Determinación de los parámetros estadísticos ................................................ 26

2.5.1 Linealidad .................................................................................................. 26 2.5.2 Precisión .................................................................................................... 27 2.5.3 Límites de detección y cuantificación ......................................................... 27 2.5.4 Veracidad ................................................................................................... 30

2.6 Determinación de la concentración de fósforo total en la muestra ................... 31

2.6.1 Cálculo de la concentración de fósforo aplicando el método de la curva de calibración ........................................................................................................... 31

2.6.2 Cálculo de la concentración de fósforo aplicando el método de adición de estándar .............................................................................................................. 31

Capítulo 3. Análisis y discusión de los resultados ..................................................... 32

3.1 Corroboración de la longitud de onda de trabajo ............................................. 32

3.2 Análisis de los resultados obtenidos en la validación del método .................... 33

3.2.1 Análisis de la linealidad del método ........................................................... 33 3.2.2 Análisis de la precisión del método ............................................................ 35

3.2.3 Análisis de la determinación de los límites de detección y cuantificación .. 37 3.2.4 Análisis de la veracidad del método ........................................................... 39

3.3 Determinación de fósforo total por el método espectrofotométrico del ácido vanadomolibdofosfórico en la muestra de los EM .................................................. 41

3.3.1 Método de la curva de calibración ............................................................. 41 3.3.2 Método de adición de estándar .................................................................. 42

Conclusiones ............................................................................................................. 45 Recomendaciones ..................................................................................................... 46 Bibliografía

Anexos

Resumen

En Cuba, la tecnología de los productos de fermentación de Microorganismos

Eficientes (EM) se encuentra en su fase inicial, sin embargo los resultados alcanzados

en el desarrollo del proceso han demostrado un alto nivel en la calidad de sus

aplicaciones en la agricultura y en otros campos de la ciencia. A pesar de esto, poco

se conoce sobre la composición química de estos productos; por tanto, se hace

necesario desarrollar las técnicas analíticas para dicha determinación. Este trabajo

tiene como objetivo realizar la validación parcial de la técnica analítica seleccionada

previamente para la determinación del contenido de fósforo en productos de

fermentación de Microorganismos Eficientes. En el proceso de validación se estudia la

linealidad, precisión en términos de repetibilidad y reproducibilidad intermedia, así

como la exactitud y el límite de detección y cuantificación. Además se estudia el efecto

matriz, por el método de adición del estándar. Para el procesamiento estadístico de

los datos se utilizaron los programas Statgraphic Centurion XV y Excel 2013. El método

resultó ser lineal, preciso y exacto en el intervalo de concentración analizada. El

contenido de fosforo total presente en las muestra de EM CBQ-VTC, lote: Investigación

200 L analizadas tiene un valor en el rango de 135,00 a 136,50 mg/L.

Palabras clave: Microorganismos Eficientes, fósforo, método espectrofotométrico,

técnica analítica.

Abstract

In Cuba, the technology of Effective Microorganisms (EM) products fermentation is in

the first phase, however the reached results in the development of its process have

demonstrated a high level in the quality of its applications, specifically in agriculture and

in other fields of the science. Despite of these facts, the chemical composition of the

fermentation products of effective microorganisms is poorly known, that is why it is

necessary to develop the analytical techniques in order to perform these

determinations. This work aimed to set analytical techniques for the determination of

the phosphorous content in samples of EM. The validation process includes the

linearity, precision within the repeatability and intermediate reproducibility terms, also

the exactitude and the detection limit and quantification limit. Moreover the matrix effect

is studied through the standard addition method as well. For the statistics processing

of data were used the following software: Statgraphic Centurion XV and Excel 2013.

The method came up to be lineal, precise and exact within the range of analyzed

concentrations. The phosphorus total contained in the analyzed EM samples (CBQ-

VTC, lote: Investigación 200 L) have a value within the range between 135,00 and

136,50 mg/L.

Keywords: Effective microorganisms, phosphorus, spectrophotometric method,

analytical technics.

1

Introducción

En el mundo actual se han incrementado considerablemente la contaminación y

aparejado a esto, el uso excesivo de sustancias químicas sintéticas, lo que ha causado

la proliferación de especies de microorganismos considerados degeneradores, los que

a grandes rasgos, son causantes de enfermedades en plantas y animales y generan

malos olores y gases nocivos al descomponer residuos orgánicos. Por otra parte

existen microorganismos que resultan beneficiosos al hombre por sus propiedades de

fermentación, producción de sustancias bioactivas y competencia y antagonismos con

otros que son patógenos para mantener el equilibrio entre los microorganismos que

conviven en el entorno; tal es el caso de las bacterias fotosintéticas, bacterias lácticas,

levaduras y en menor cantidad, los hongos de fermentación y actinomicetos

(Szymanski and Patterson 2003).

La mezcla de estos microorganismos, todos benéficos, ha constituido la base de lo

que es hoy la tecnología de los productos de fermentación de microorganismos

eficientes1. Se presenta esta tecnología como una alternativa útil para contribuir en la

solución de problemas que están amenazando a la humanidad; problemas como la

contaminación del medio ambiente y la producción de alimentos (Higa 1991).

Inicialmente, esta tecnología fue desarrollada como alternativa para obtener

fertilizantes químicos y pesticidas de alta calidad y no muy costosos, con parámetros

orgánicos y biológicos que no afectaran el medio ambiente. Se ha encontrado que los

microorganismos eficientes actúan como inoculante microbiano incrementando la

diversidad microbiana del suelo, mejorando sus condiciones físico-químicas y

aumentando a su vez la producción de los cultivos y su protección; además conservan

los recursos naturales generando así una agricultura sostenible. Sus aplicaciones en

las dos últimas décadas se han expandido a otras áreas para solucionar problemas

ambientales, de producción animal, de salud humana y de diversos tratamientos

1 Conocidos como EM por sus siglas en inglés de Effective Microorganisms.

Introducción

2

industriales siendo utilizada en más de 180 países del mundo para tales fines (Higa

1993, Namsivayam et al. 2011).

En Cuba, el desarrollo de la tecnología de los microorganismos eficientes se encuentra

en su fase inicial. Los resultados de sus aplicaciones en la agricultura y en la solución

de problemas ambientales como el saneamiento, tratamiento de aguas residuales y

control de malos olores han sido exitosos y han conllevado a extender su uso en otras

áreas. Tal es el caso, de su aplicación como plastificantes en el cemento.

A pesar de que las aplicaciones de esta tecnología en los diversos campos es un tema

actual pocos trabajos han sido realizados sobre el estudio de la composición química

de los productos de fermentación de microorganismos eficientes y teniendo en cuenta

la variedad de la materia prima a través de la cual se obtienen estos productos es

esencial llevar a cabo el control de la calidad del proceso de obtención para lo cual se

hace necesario la aplicación de técnicas analíticas que permitan cuantificar los

constituyentes principales.

El fósforo pertenece al número de los elementos más o menos abundantes. Es

importante destacar que los seres humanos obtienen fósforo de los alimentos, del

mismo modo, la ganadería obtiene fósforo del alimento ya sea natural, de pastos o

como complemento a la absorción natural, las plantas en vez obtener fósforo del suelo,

sus raíces absorben fósforo de la disolución del suelo. La importancia del fósforo para

la vida se hizo evidente en el mundo occidental cuando Liebig declaró que el fósforo

es un nutriente limitante en el crecimiento de las plantas. En el siglo XX, el fósforo se

convirtió en uno de los tres nutrientes esenciales: nitrógeno, fósforo y potasio,

ingredientes de los fertilizantes comerciales a nivel mundial (Valdiviezo 2008, Cordell

2010).

En una investigación previa se seleccionó para la determinación del contenido de

fósforo y sus derivados en muestras de productos de fermentación de

microorganismos eficientes la técnica espectrofotométrica del ácido

vanadomolibdofosfórico pero se han encontrado algunas incongruencias que son

necesarias corregir en aras de obtener resultados confiables.

Introducción

3

Por lo tanto se propone el siguiente problema científico:

¿Ofrece resultados confiables la técnica analítica seleccionada para la

determinación del contenido de fósforo total en productos de fermentación de

microorganismos eficientes?

Para contribuir a la solución de este problema, se plantea el siguiente objetivo

general:

Realizar la validación parcial de la técnica espectrofotométrica del ácido

vanadomolibdofosfórico para la determinación del contenido de fósforo total en

productos de fermentación de microorganismos eficientes.

Para alcanzar el objetivo planteado se proponen los siguientes Objetivos

Específicos:

Seleccionar las condiciones de trabajo adecuadas para el correcto desempeño

del método.

Verificar parámetros estadísticos del método tales como: linealidad, precisión,

límites de detección y cuantificación y veracidad.

Determinar el contenido de fósforo total en muestras de productos de

fermentación de microorganismos eficientes

4

Capítulo 1. Revisión bibliográfica

En el presente capítulo se describirá brevemente lo que se conoce como

microorganismos eficientes, sus propiedades, aplicaciones e importancia. Se hablará

del fósforo, uno de sus constituyentes principales y de interés en este trabajo por la

importancia que este tiene para la agricultura ya que es un nutriente limitante en el

crecimiento de las plantas. Además se enuncian diversos métodos establecidos para

la determinación del contenido de fósforo y los conceptos de los parámetros

estadísticos a evaluar para realizar la validación del método seleccionado.

1.1 Microorganismos eficientes

Los Microorganismos Eficientes son inoculantes microbianos de origen natural

compuestos por bacterias fotosintéticas, bacterias lácticas, levaduras y en menor

cantidad, los hongos de fermentación y actinomicetos. Estas especies pueden coexistir

en un medio líquido a un pH inferior a 3,5. La base tecnológica de los microorganismos

eficientes (EM en lo adelante) es la mezcla de diferentes tipos de microorganismos

todos ellos benéficos que poseen propiedades de fermentación, producción de

sustancias bioactivas y competencia y antagonismo con otros que son patógenos para

mantener un equilibrio natural entre los microorganismos que conviven en el entorno

(Balan and Maldonado 2007, Mayer et al. 2010).

Estos microorganismos son eficientes cuando actúan en condiciones convenientes y

óptimas para metabolizar sus substratos, incluyendo entre estos el agua disponible, el

oxígeno (dependiendo si los microorganismos son aeróbicos o anaeróbicos del tipo

facultativos), el pH y la temperatura de su medio ambiente (Higa and Parr 1994).

Los productos de fermentación de los microorganismos eficientes parten de una madre

sólida que consiste en una fermentación anaerobia preferentemente láctica realizada

a partir de un “pool” conformado por hojarasca colectada de suelos que contienen una

combinación de microorganismos beneficiosos de origen natural.

Esta tecnología inicialmente fue desarrollada como alternativa para los fertilizantes

químicos y pesticidas dentro de los parámetros orgánicos y biológicos para no afectar

el medio ambiente, así como, para lograr productos de alta calidad con bajos costos.


5

Sin embargo, sus aplicaciones en las dos últimas décadas se han expandido a otras

áreas para solucionar problemas ambientales, de producción animal, de salud humana

y de diversos tratamientos industriales siendo utilizada en más de 180 países del

mundo (Eco-Tecnologías Accedido en 2013).

1.2 Propiedades de los EM

Los EM actúan en dos vías primarias: por exclusión competitiva de otros

microorganismos que son nocivos y, por la producción de subproductos beneficiosos

que promueven la salud del medio ambiente como: enzimas, ácidos orgánicos,

aminoácidos, hormonas y antioxidantes. Además, los EM son facultativos, lo que

permite extender sus beneficios a ambientes anaeróbicos y aeróbicos. Los EM

provocan a que la materia orgánica se descomponga rápidamente por la vía de la

fermentación y no de la putrefacción. Sus propiedades están dadas por los

microorganismos que conforman la mezcla.

Bacterias fotosintéticas: Estas especies son autosuficientes e independientes,

sintetizan sustancias útiles a partir de secreciones de raíces, materia orgánica

y gases dañinos, usando la luz solar y el calor del suelo como fuentes de

energía. Las sustancias sintetizadas comprenden aminoácidos, ácidos

nucléicos, sustancias bioactivas y azúcares, promoviendo el crecimiento y

desarrollo de las plantas. Estos productos metabólicos pueden ser asimilados

directamente por las plantas y también actúan como sustratos que apoyan la

multiplicación de las bacterias. De esta manera las bacterias fotosintéticas

aumentan la cantidad de otros microorganismos deseables, confiriendo a los

EM la propiedad de neutralizar los malos olores y prevenirlos.

Bacterias lácticas: Estas especies producen ácido láctico a partir de azúcares y

otros carbohidratos provenientes de las bacterias fotosintéticas y levaduras. El

ácido láctico es un potente esterilizador, como tal combate microorganismos


6

prejudiciales a los cultivos y acelera la descomposición de la materia orgánica

reduciendo el tiempo de compostaje2.

Levaduras: Estas especies sintetizan y utilizan las sustancias antimicrobianas

que intervienen en el crecimiento de las plantas a partir de los aminoácidos y

azúcares producidos por las bacterias fotosintéticas así como, las de la materia

orgánica y de las raíces de las plantas.

Sustancias bioactivas: Estas comprenden las hormonas y enzimas producidas

por las levaduras, incrementan la actividad celular y el número de raíces. Sus

secreciones son sustratos útiles para ciertos microorganismos efectivos tales

como, las bacterias lácticas y los actinomicetos.

Hongos: A través de estas especies se forman fermentos activos y con estos el

material orgánico se desintegra más rápido produciendo alcohol, éster y

sustancias antimicrobianas que suprimen los malos olores y evitan la presencia

de insectos indeseables.

Actinomicetos: Su estructura intermedia entre la de las bacterias y hongos,

produce sustancias antimicrobianas a partir de los aminoácidos y azúcares

producidos por las bacterias fotosintéticas y por la materia orgánica. Las

sustancias antimicrobianas suprimen hongos dañinos y bacterias patógenas.

(BID 2009, Higa and Parr Accedido en 2013).

1.3 Aplicaciones

1.3.1 Aplicaciones en la agricultura

La aplicación de la tecnología EM en la agricultura depende de varios factores como

son: el clima, la calidad de la tierra y método de cultivo, entre otros. Los EM como

inoculantes microbianos restablecen el equilibrio microbiológico del suelo mejorando

sus características físicas, químicas y microbiológicas, por lo cual favorecen el

2 Compostaje: es un proceso dirigido y controlado de mineralización y pre-humificación de la materia

orgánica, a través de un conjunto de técnicas que permiten el manejo de las variables del proceso; y

que tienen como objetivo la obtención de un abono orgánico de alta calidad físico-química y

microbiológica.


7

incremento de la producción de los cultivos y su protección. Además conservan los

recursos naturales, generando una agricultura y medio ambiente más sostenible.

El uso de estos productos mejora la estructura y agregación de las partículas del suelo,

reduce su compactación, incrementa los espacios porosos y por consiguiente la

infiltración del agua. De esta manera se disminuye la frecuencia de riego, tornando los

suelos capaces de absorber 24 veces más las aguas de lluvia, evitando la erosión por

el arrastre de las partículas (Higa and Parr 1995, APROLAB 2007).

La aplicación de EM también favorece la disponibilidad de nutrientes en el suelo,

solubilizándolos, separando las moléculas que los mantienen fijos, dejando los

elementos disgregados en forma simple para facilitar su absorción por el sistema

radical. Suprime y controla las poblaciones de microorganismos patógenos que se

desarrollan en el suelo por competencia e incrementa la biodiversidad microbiana

generando las condiciones necesarias para que los microorganismos benéficos

nativos prosperen (Tovar and Erazo 2009).

Por lo tanto, cuando se emplea EM en el suelo, en un cultivo o en cualquier otro medio,

debe tenerse en cuenta que los microorganismos eficientes entran en competencia

con otros microbios autóctonos del medio por lo cual, a medida que se refuerza su

aplicación a través de un uso integral y repetido se logran mejores resultados ya que

son una población mayor de microorganismos benéficos actuando (BID 2009, Higa

and Parr Accedido en 2013).

1.3.2 Aplicaciones en el medio ambiente

Los EM tienen una amplia gama de aplicaciones para solucionar problemas

ambientales que van desde el tratamiento de aguas residuales, su uso en baños

secos3, el tratamiento de los residuos sólidos orgánicos hasta su aplicación en los

vertederos de residuos sólidos urbanos. Así, pues, los EM son aplicados para eliminar

3 El baño seco es un sistema de tratamiento basado en procesos naturales donde se separan las aguas

cloacales y las materias fecales. En este proceso, las aguas cloacales se depuran mediante filtros de

pedregullo y plantas acuáticas y las materias fecales se compostan. Los microorganismos eficientes

intervienen disminuyendo las moscas, los malos olores y acelerando el compostaje de las heces.


8

los malos olores generados por el metano, mercaptano, ácido sulfhídrico, sustancias

amoniacales, etc. producto de la descomposición de los materiales orgánicos, por otra

parte aceleran el compostaje y evitan la presencia de insectos indeseables (Higa

2003). También el uso de estos productos ayuda al aprovechamiento eficiente de los

desechos animales como subproductos enriquecidos y seguros, eliminando

microorganismos patógenos y semillas de malezas, promueve la transformación

aeróbica de compuestos orgánicos, evitando la descomposición de la materia orgánica

por oxidación; evita la proliferación de insectos vectores, como moscas, ya que estas

no encuentran un medio adecuado para su desarrollo; incrementa la eficiencia de la

materia orgánica como fertilizante. Durante el proceso de fermentación se liberan y

sintetizan sustancias y compuestos como: aminoácidos, enzimas, vitaminas,

sustancias bioactivas, hormonas y minerales solubles, que al ser incorporados al suelo

a través del abono orgánico mejoran sus características físicas, químicas y

microbiológicas. Acelera el proceso de compostaje a una tercera parte del tiempo de

un proceso convencional (Bernal 2012).

1.3.3 Aplicaciones en la producción animal

Debido a la capacidad de los EM de reprimir patógenos y crear un ambiente

antioxidante su aplicación en diferentes áreas de la producción animal permite mejorar

las condiciones ambientales del medio de crecimiento y desarrollo de los animales

(Yépez et al. 2002); disminuye la oxidación y formación de óxido en las superficies

metálicas de las instalaciones para el alojamiento de los animales; permite la supresión

de malos olores y la reducción de insectos nocivos y molestos, así como la reducción

de la tasa de mortalidad y la mejora de la calidad del alimento y del agua lo cual

promueve a la ganancia de peso, la reducción de la incidencia de enfermedades y

estrés en el animal, mejora el aspecto físico de los animales y disminuye el

requerimiento de desinfectantes y antibióticos. El uso de estos productos contribuye

significativamente a la reducción de las emanaciones provocadas por el estiércol y la

orina, amplía la calidad del compost, ayuda a la elaboración rápida del abono y

optimiza el tratamiento de lagunas de oxidación y aguas negras permitiendo

oxigenación y clarificación de las mismas; incrementa la producción de pastos y

forrajes con pasturas, heno y ensilaje de mejor calidad (Javaid and Bajwa 2011).


9

Además, la aplicación de los EM en la producción animal permite la reducción de los

costos de producción por la disminución en el requerimiento de productos químicos.

1.3.4 Aplicaciones en la cría de aves de corral

Los EM se han vuelto muy popular en la industria avícola. Los alimentos se fermentan

con EM antes de suministrarlos a las aves. También son usados en el agua de beber,

lo que ayuda a acentuar microbiológicamente la calidad de la misma, además de

enriquecerlas con sustancias benéficas (ALA 2007).

Según Bernal (2012) las formas más utilizadas de EM están enfocadas hacia tres

componentes principales:

Agua de bebida: Ayuda a mejorar microbiológicamente la calidad de la misma,

además de enriquecerla con sustancias benéficas (aminoácidos, vitaminas,

minerales, etc.), incrementa la digestibilidad y asimilación de nutrientes.

Además, al hacer más eficiente el proceso digestivo, los EM ayudan a reducir

la producción de gases nocivos desde el intestino mismo.

Tratamiento de excretas: Las aspersiones a los corrales o lugares donde se

mantienen las aves buscan establecer las poblaciones de microorganismos en

las excretas, impidiendo la proliferación de otros microorganismos que pudren

la materia orgánica. De esta manera, los EM por fermentación del material

reduce la generación de malos olores y la presencia de insectos plaga.

Fermentación para alimentación animal: Por medio de la fermentación de

componentes dietarios, los EM mejoran la disponibilidad de nutrientes

(aminoácidos) de los materiales y hacen más eficiente la nutrición de los

animales. Una porción de concentrado comercial fermentado con EM en la

ración total de los animales mejora sustancialmente los índices productivos de

las aves.

1.3.5 Aplicaciones en la actividad pesquera

De acuerdo a los estudios y experimentos, los EM son extremadamente beneficiosos

para la actividad pesquera, la comida de los peces se fermenta con EM antes de


10

alimentarlos. Una variedad de alimentos hechos con EM incluyen aquellos

excrementos de animales desechos sólidos con Bokashi y alimento comercial.

1.3.6 Aplicaciones en la industria

Los EM contienen sustancias y enzimas antioxidantes que evitan la oxidación de los

materiales de construcción proporcionándoles mayor dureza y duración. Así, pues, los

EM son aplicados como aditivo en hormigón, permitiendo un fraguado y un secado del

mismo mucho más rápido.

También son aplicados en la pintura de edificios, se sustituye el agua por los EM, no

afecta el color de la pintura ni la calidad, previene las emanaciones tóxicas de

formaldehídos, tolueno y xileno presente en algunos materiales usados en

contrachapado, empapelados, pegamentos o colas de parquets, entre otros (Earth-

Ecuador Accedido en 2013).

1.4 Composición química de los EM

Las aplicaciones de la tecnología EM en los diversos campos es un tema actual a nivel

mundial sin embargo, pocos trabajos se han realizado sobre la composición química

de los EM. Diferentes fuentes reportan la composición química de EM siendo marcada

la coincidencia en la presencia de algunos elementos químicos como se presenta en

la tabla 1.1 sacada de los estudios realizados por Balan y Maldonado en el 2007.

Tabla 1.1. Análisis químico de elementos contenidos en los EM

pH Cond. Elec.

(dSm/m)

Concentración (mg/L)

P K Ca Mg Fe Cu Zn Mn NO3-

EM 3,45 2,94 13,0 1897 550 192 13,1 4,1 0,1 1 35,3

Esta información permite tener un criterio sobre los posibles valores del contenido de

fósforo que pueden presentar los EM, no obstante en esta revisión no se hace

referencia a los métodos de análisis empleados para realizar estas determinaciones.


11

1.5 El fósforo

El fósforo es un elemento químico, su número atómico es 15 y su símbolo, P. Es un

no metal multivalente perteneciente al grupo del nitrógeno (Grupo 15) que se

encuentra en la naturaleza combinado en fosfatos inorgánicos y en organismos vivos

pero nunca en estado nativo. Es muy reactivo y se oxida espontáneamente en contacto

con el oxígeno atmosférico emitiendo luz (Oliveira 2007).

La importancia del fósforo para la vida se hizo evidente en el mundo occidental cuando

Liebig declaró que el fósforo es un nutriente limitante en el crecimiento de las plantas.

En el siglo XX, el fósforo se convirtió en uno de los tres nutrientes esenciales:

nitrógeno, fósforo y potasio, ingredientes de los fertilizantes comerciales a nivel

mundial. En las plantas una porción de 0,2 % de su masa es fósforo.

El fósforo es tan importante para la agricultura como el agua. Pero la falta de

disponibilidad y accesibilidad de fósforo para las plantas resulta ser un serio problema

emergente que amenaza la capacidad de abastecer los alimentos que demanda una

población mundial en incesante crecimiento. Como el nitrógeno y el potasio, es un

nutriente que las plantas absorben del suelo, siendo crucial para su fertilidad y el

crecimiento de los cultivos. Favorece el desarrollo de las raíces de las plantas, lo que

se conoce como proceso radicular, agilizándolo y mejorando el amarre de las raíces a

la tierra, esto beneficia la absorción de elementos y nutrientes que ayudan al correcto

desarrollo de las plantas (Lopes et al. 2002).

En los frutos, las semillas y las flores, el fósforo propicia un alto nivel de maduración y

evita el proceso conocido como “aborto”, este se refiere a la pérdida prematura de

flores y frutos de las plantas.

El fósforo existe en las aguas en varias formas: inorgánica, que incluyen los

ortofosfatos y polifosfatos (pirofosfatos, tripolifosfatos y metafosfatos) y fosfatos

orgánicos. La presencia de fósforo inorgánico se debe a una variedad de fuentes tales

como: uso de fertilizantes, los cuales pueden ser arrastrados por el agua de lluvia hacia

los cuerpos de agua superficiales; productos de limpieza, ya que los fosfatos son los

principales constituyentes de los detergentes y compuestos utilizados en el

acondicionamiento de aguas para calderas y potabilización de aguas, entre otros. El


12

fósforo orgánico se forma principalmente por procesos biológicos. Su presencia en

aguas residuales se debe a las heces fecales y residuos de alimentos, así como

también al formado a partir de los ortofosfatos utilizados en el tratamiento biológico o

el proveniente de la biota acuática (Standard 2005). La química de los compuestos

orgánicos de fósforo es muy compleja, se sabe que, su descomposición conduce a

ortofosfatos. La mejor forma de controlar el fósforo es mediante el ensayo de fósforo

total (Salazar 2011).

1.6 Determinación del contenido de fósforo

La determinación del contenido de fósforo puede ser realizada empleando métodos

clásicos e instrumentales. Dentro de los métodos clásicos, en el gravimétrico, los

ortofosfatos se pueden precipitar como fosfato amónico magnésico, MgNH4PO4 x

6H2O, con cloruro de magnesio y cloruro de amonio en disolución amoniacal (mezcla

magnesiana) mientras que en el método volumétrico se titula el fosfomolibdato de

amonio con solución estandarizada de hidróxido de sodio, empleando fenolftaleína

como indicador y como valorante permanganato de potasio 0,1 mol/L, o solución

estandarizada de bromato de potasio (Petrucci et al. 2003, Colectivo de autores 2013).

Los métodos gravimétricos presentan la ventaja de ser muy precisos sin embargo, la

determinación necesita mucho tiempo realizándose largas operaciones (precipitación,

filtración, lavado, calcinación del crisol vacío y con el precipitado, etc.). Por su parte

los métodos volumétricos presentan gran exactitud y se realiza una sola operación: la

titulación, que con cierta práctica del analista se realiza en algunos minutos, pero

suelen ser menos precisos que los métodos gravimétricos (Harris 2001).

Debido a estos inconvenientes, los métodos instrumentales han sido ampliamente

difundidos y utilizados para la determinación cuantitativa de fósforo. Estos métodos

encuentran cada día mayor aplicación por las siguientes razones: son más rápidos,

son mucho más sensibles pues mientras que para el análisis químico clásico la

concentración más pequeña a determinar es 10-5 mol/L para el análisis instrumental

puede ser de 10-10 mol/L, son métodos muy selectivos pudiéndose determinar un

elemento en presencia de otros sin necesidad de aislarlos, se pueden determinar

varios elementos simultáneamente con gran exactitud (Rodriguez and Monzon 1998).


13

Los métodos instrumentales más utilizados para la determinación de fósforo pueden

ser divididos en dos grupos: los métodos basados en las técnicas electroanalíticas

como son la potenciometría, la voltametría y la amperometría y, aquellos basados en

técnicas ópticas como son la espectrometría ultravioleta-visible, la espectrometría de

absorción atómica, la espectrometría de emisión atómica con plasma inductivamente

acoplado, la espectrofluorimetría y quimioluminiscencia (Neto 2006).

En este trabajo se selecciona el método espectrofotométrico del ácido

vanadomolibdofosfórico teniendo en cuenta fundamentalmente el nivel de

concentración esperado en el analito y que se encuentra establecido en normas

Nacionales e internacionales (COVENIN 1993, Standard Methods 2005, NMX-AA-029-

SCFI 2001, ME-IIT-367 2007, NCh 2009). El método espectrofotométrico del ácido

vanadomolibdofosfórico consiste en la reacción del ortofosfato con molibdato de

amonio bajo condiciones ácidas, para formar un heteropoliácido, el ácido

molibdofosfórico que en presencia del ion vanadato da lugar al ácido

vanadomolibdofosfórico de color amarillo, cuya intensidad es proporcional a la

concentración de fosfatos presentes en la muestra. Algunas sustancias pueden causar

interferencias como el hierro ferroso produciendo un color azul, pero no afecta los

resultados si su concentración es menor a 100 mg/L, valor que es mucho mayor que

el contenido en la matriz de estudio. El ion férrico causa interferencias cuando la

longitud de onda a la cual se mide la intensidad del color es baja, particularmente a

400 nm.

La longitud de onda a la cual es medido el color, depende de la sensibilidad deseada.

Debido a que en esta técnica, la sensibilidad varía 10 veces, con la longitud de onda

entre 400 y 490 nm, los intervalos de acuerdo con las concentraciones esperadas se

muestran en la tabla 1.2.

Tabla 1.2. Longitud de onda para diferentes intervalos de concentración de P.

Intervalos de P (mg/L) Longitud de onda (nm)

1,0 – 5,0 400

2,0 – 10 420

4,0 – 18 470


14

En el presente trabajo se determina el contenido de fósforo total, siendo este el de

importancia e implicaciones en las diferentes ramas donde se aplica, en una mezcla

de EM mediante el método seleccionado.

1.7 Parámetros estadísticos

La validación es la confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que

se han cumplido los requisitos del método para una utilización o aplicación específica

prevista. La validación examina las características de desempeño de un método para

identificar y establecer cualquier limitación que pueda esperarse del método, así como

identificar los factores que pueden influir en el cambio de dichos parámetros y

limitaciones; permite demostrar que el método es adecuado para el propósito, esto es,

para resolver un problema analítico particular y persigue conocer si la técnica de

análisis empleada es correcta y suficiente para la determinación de las

concentraciones del analito en cuestión. Entre los parámetros analíticos más utilizados

se encuentran: veracidad, precisión, linealidad, límite de detección y de cuantificación,

entre otros (IDEAM 2006, Regulación 2007, Rodríguez 2010, Rodriguez 2011).

1.7.1 Linealidad

La linealidad se define como la capacidad de un método analítico dentro de un intervalo

establecido, de dar resultados instrumentales linealmente proporcionales a la

concentración de analito en la muestra. Esta característica puede expresarse como la

pendiente de la línea de regresión y su varianza o como el coeficiente de determinación

R2 y el coeficiente de correlación R (Regulación 2007, Castellanos 2008).

La pendiente b es una medida de la sensibilidad, mientras mayor es la respuesta del

instrumento a un cambio en la concentración del analito, mayor es la sensibilidad. En

los gráficos de calibración, normalmente los valores del coeficiente de determinación

R2 son cercanos a 1. Cuando R2 es menor a 0,99 es una advertencia de que la relación

no es lineal o que, debe repetirse o revisarse el procedimiento. Por otra parte, un valor

de R2 alto no siempre significa linealidad (Zagal and Sadzawka 2007).

Dentro del término linealidad se incluye la proporcionalidad entre la concentración de

analito y la respuesta así como, el intervalo de concentraciones de analito para los


15

cuales el método es satisfactorio. Debe definirse la linealidad para concentraciones

que cubran el ámbito total de interés. Este estudio se efectúa tanto sobre disoluciones

de patrones del analito como sobre muestras problemas que contengan

concentraciones crecientes del analito. El número de disoluciones de patrón o de

muestra puede estar comprendido entre (3 – 10) y el intervalo de concentraciones se

selecciona de acuerdo con las cantidades esperadas de analito en la muestra. El

experimento debe repetirse al menos una vez. Los resultados pueden presentarse

gráficamente, se debe dar la ecuación de la regresión lineal así como el coeficiente de

correlación que indica el grado de relación entre la absorbancia y la concentración (NC

2010).

Por lo tanto para verificar la linealidad y proporcionalidad se evalúan los datos

estadísticamente según se describe a continuación:

1. Significación de la regresión: se determinará el coeficiente de correlación (R ≥

0,990) y el de determinación (R2 ≥ 0,980).

2. Verificación de linealidad: se evalúa la desviación estándar de la pendiente Sb

cuyo criterio de aceptación es Sb ≤ 2 %.

Se desea probar si existe entonces una correlación significativa entre

absorbancia y concentración:

La hipótesis nula, H0 es b = 0, indicando que no existe correlación entre la

absorbancia y la concentración.

La hipótesis alternativa, H1 es b ≠ 0.

Si fuera b = 0 significa que la recta es paralela al eje de las abscisas y no existiría

regresión.

Si b ≠ 0, se rechaza la hipótesis nula H0, siendo la correlación lineal significativa

con la probabilidad calculada.

3. Verificación de proporcionalidad: se evalúa el intervalo de confianza del

intercepto (a). Los resultados de este ensayo deben incluir el cero para el grado

de probabilidad definido.


16

Los límites de confianza del término del intercepto son: a ± t × Sa, siendo t el valor de

la distribución de Student para n – 2 grados de libertad a la probabilidad escogida

(generalmente ρ = 0,05). Si estos límites incluyen al cero, se cumple la condición de

proporcionalidad (Nazaré 2013).

1.7.2 Precisión

La precisión es el grado de concordancia entre los resultados de análisis

independientes obtenidos bajo condiciones específicas. Normalmente se expresa

como la desviación estándar de los resultados analíticos. Menores valores de

desviación estándar equivalen a una elevada o buena precisión y valores mayores

equivalen a una baja o pobre precisión. La precisión podrá establecerse en términos

de repetibilidad y reproducibilidad (Instituto de Salud Pública 2010, López 2010, NC

2010). La reproducibilidad también puede determinarse como reproducibilidad

intermedia que corresponde a aquella en que se varían dos o más factores (excepto

la muestra) y como reproducibilidad teórica calculada por la expresión de Horwitz.

Para determinar la precisión utilizando el diseño experimental basado en la evaluación

de la repetibilidad se preparan muestras patrones de 3 concentraciones diferentes (una

inferior, media y superior) del intervalo especificado y se realizan 3 réplicas de cada

una bajo las mismas condiciones (mismo laboratorio, mismo método, mismo operador,

utilizando el mismo equipamiento, dentro de intervalos cortos de tiempo). Se calcula la

desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación (CV%). Los resultados de los

estudios de precisión se expresarán en términos de CV, el cual debe ser CV ≤ 3 %

para los métodos espectrofotométricos (Regulación 2007, Instituto de Salud Pública

2010).

1.7.3 Límites de detección y cuantificación

Estos parámetros se relacionan con la cantidad de analito requerida para dar un

resultado significativo, cualitativo o cuantitativo.

El límite de detección (LD) es la cantidad de un analito que corresponde a la señal de

medición más baja que con cierta confianza estrictamente definida puede ser


17

interpretada como un indicador de que el analito está presente en la disolución, pero

no necesariamente permitiendo su exacta cuantificación mientras que, el límite de

cuantificación (LC) es la menor cantidad de un analito presente en la muestra que

puede ser determinada cuantitativamente con una confianza estrechamente definida

(López 2010, NC 2010).

Se determinarán el LD y el LQ a partir de todo el conjunto de datos utilizado para la

realización de la curva de calibración y el análisis de la regresión lineal.

1.7.4 Veracidad

Se define la veracidad como el grado de concordancia entre el resultado de un ensayo

y el valor de referencia. El término veracidad, está aplicado a un conjunto de resultados

de un ensayo, y supone una combinación de componentes aleatorios y un componente

común de error sistemático o sesgo. Se define la veracidad como el grado de

concordancia existente entre el valor medio obtenido de una serie de resultados y un

valor de referencia aceptado. La veracidad puede ser determinada por sesgo o

recuperación.

El sesgo se refiere a la diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un

ensayo o una medición y el valor verdadero. En la práctica el valor convencional de

cantidad puede sustituir el valor verdadero. El sesgo es el error sistemático total en

contraposición al error aleatorio. Para determinar el sesgo puede utilizarse material de

referencia, material fortificado, material control, material ensayo de aptitud. Para este

fin, se debe medir un analito de concentración conocido y se determina la diferencia

en valor absoluto entre el valor conocido y la media del valor obtenido. Una diferencia

sistemática importante en relación al valor de referencia aceptado se refleja en un

mayor valor del sesgo, cuanto más pequeño es el sesgo, mayor veracidad indica el

método.

La recuperación es la fracción de la sustancia agregada a la muestra (muestra

fortificada) antes del análisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar. La

recuperación permite ver el rendimiento de un método analítico en cuanto al proceso


18

de extracción y la cantidad del analito existente en la muestra original, por lo cual, la

recuperación está intrínsecamente relacionada a las características de la matriz de la

muestra. El porciento de recuperación se refiere a la proporción de la cantidad de

analito, presente o añadido al material de ensayo, el cual es extraído y cuantificado

(Canetti 2012).

1.8 Fundamento teórico del análisis por Espectrofotometría UV-VIS

La determinación de los componentes químicos en la región UV del espectro

electromagnético se fundamenta en la ley de Bouguer – Lambert – Beer, la que se

basa en 2 postulados fundamentales.

Cuando un haz de luz, cuyos rayos son paralelos y monocromáticos incide

perpendicularmente sobre una superficie en un medio homogéneo, cada capa o

segmento infinitesimal de ese medio hace decrecer la intensidad de la radiación

incidente en una fracción constante.

Fig 1.1. Atenuación de un rayo de luz monocromática al pasar a través de una celda

de espesor b

El decrecimiento infinitesimal dI con el espesor del medio absorbente también

infinitesimal db, puede ser denotado mediante la expresión:

-dI = K × db (1.1)

Donde:

K es una constante que depende de la longitud de onda y de la naturaleza del medio,

Rayo Incidente

b

Io I

Rayo Transmitido


19

I es la intensidad de la radiación incidente y

b es el camino óptico.

El incremento de la concentración del medio absorbente también disminuye la

intensidad de la radiación, en condiciones similares a las anteriormente citadas, lo que

se expresa según la siguiente ecuación:

−dlI0

⁄ = K × dc (1.2)

La combinación de las expresiones 1.1 y 1.2 integrada y expresada en forma

logarítmica es conocida clásicamente como ley de Bouguer – Lambert – Beer:

A= − log10

(II0

⁄ ) = a × b × c (1.3)

Donde:

I e I0 representan las intensidades de la luz incidente y transmitida por el disolvente

puro y la solución con la sustancia que absorbe,

c representa la concentración de la sustancia que absorbe,

b es el espesor del paso óptico de luz incidente sobre la muestra, y

a es el coeficiente de absortividad, también se conoce como el coeficiente de extinción

molar (ε) de la especie que absorbe, que es una constante de proporcionalidad

característica de cada sustancia.

El valor de a depende de la longitud de onda de la radiación utilizada para irradiar la

muestra y es característica para cada especie química. Por lo tanto, la función de

absortividad identifica la sustancia que absorbe.

La expresión 1.3 establece la relación lineal de la absorbancia en función de la

concentración de la solución, para un valor fijado del camino óptico. La construcción

de una curva de calibración empleando soluciones de diferentes concentraciones,

obtenidas a partir de un patrón, permite determinar la concentración de una muestra

problema (Skoog et al. 2001, Parra 2013).

20

Capítulo 2. Materiales y métodos

En el presente capítulo se describirán los materiales y métodos empleados para la

determinación de fósforo total en las muestras de productos de fermentación de

microorganismos eficientes, así como los reactivos y las disoluciones preparadas y los

métodos de cálculo de los parámetros estadísticos a evaluar, también se describe el

procedimiento para la determinación de la concentración de fósforo en la muestra.

2.1 Reactivos, materiales, equipos y disoluciones de trabajo

2.1.1 Reactivos empleados

Tabla 2.1. Reactivos empleados

Reactivos Firma Origen

Ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado p.a (95 - 98

%) UNI-CHEM China

Ácido nítrico (HNO3) concentrado p.a (56 %)

UNI-CHEM China

Ácido clorhídrico (HCl) concentrado p.a (35 -

37%) UNI-CHEM China

Hidróxido de sodio (NaOH), p.a

UNI-CHEM China

Reactivo Vanadato-molibdato p.a

Preparado –

Dihidrógeno fosfato de

potasio, (KH2PO4) p.a UNI-CHEM China

Fenolftaleína p.a UNI-CHEM China

Alcohol etílico p.a UNI-CHEM China

Agua destilada p.a – Cuba

Carbón activado p.a UNI-CHEM China


21

2.1.2 Instrumentos, equipos y materiales empleados

Tabla 2.2. Instrumentos, equipos y materiales

Instrumento Firma Origen

Espectrofotómetro UV-vis. Modelo: Genesys 10UV

– China

Bloc Digest, 6 plazas P-Selecta España

Estufa P-Selecta España

Plancha de calentamiento Raypa España

Balanza Analítica Sartorius China

Agitador magnético. MC – 8 Bunsen, S.A España

Agitador mecánico – –

Papel indicador – China

Papel de filtro – –

2.1.3 Preparación de disoluciones y del material para el ensayo

Disolución Patrón de fosfatos (50 mg/L):

Se disuelven en agua destilada 219,5 mg de KH2PO4 anhidro, previamente

secado durante 1 hora a 105 0C y se diluye a 1000 mL con agua destilada (1,0

mL = 50,0 mg/L de P como PO43-

).

Disolución de hidróxido de sodio (NaOH) 10 mol/L:

Pesar 400 g de NaOH al 98 % de pureza y diluir en 500 mL de agua destilada.

Se enfría la disolución a temperatura ambiente y se diluye a 1000 mL con agua

destilada.

Disolución de ácido clorhídrico (HCl 1:1):

Medir 50,0 mL de ácido clorhídrico concentrado, añadirlo lentamente y agitando

a 50,0 mL de agua destilada. La concentración del ácido no es crítica para la

determinación, pero se recomienda una concentración final en la muestra de

0,5 mol/L.

Indicador fenolftaleína:

Se disuelven 0,5 g de fenolftaleína en una mezcla de 50,0 mL de alcohol etílico

y 50,0 mL de agua destilada.


22

Reactivo Vanadato-Molibdato:

Solución A: Se pesan 12,5 g de NH4Mo7O24 x H2O y se disuelve en

aproximadamente 150 mL de agua destilada.

Solución B: Se calientan hasta ebullición 160 mL de agua destilada

aproximadamente en un beaker de 500 mL y se disuelven 0,625 g de NH4VO3,

se deja enfriar y se añaden 165 mL de HCl (conc), enfriar.

Una vez preparadas las disoluciones, añadir A sobre B, trasvasar a un matraz

de 500 mL y enrasar.

El material para el ensayo debe ser bien lavado con ácido clorhídrico diluido caliente

para evitar la adsorción de fosfatos en la superficie del vidrio. No se deben utilizar

detergentes comerciales que contengan fosfatos. Después de lavado se enjuaga con

agua corriente en forma abundante, luego se enjuaga por lo menos tres veces con

agua destilada. Preferiblemente se reserva esta cristalería sólo para la determinación

de fosfato.

2.2 Descripción de la técnica espectrofotométrica del ácido

vanadomolibdofosfórico para la determinación del fósforo total en la

muestra

El método espectrofotométrico del ácido vanadomolibdofosfórico consiste en la

reacción del ortofosfato con molibdato de amonio bajo condiciones ácidas, para formar

un heteropoliácido, el ácido molibdofosfórico que, en presencia del ion vanadato da

lugar al ácido vanadomolibdofosfórico de color amarillo, cuya intensidad es

proporcional a la concentración de fosfatos presentes en la muestra. Algunas

sustancias pueden causar interferencias como el hierro ferroso produciendo un color

azul, pero no afecta los resultados si su concentración es menor a 100 mg/L, valor que

es mucho mayor que el contenido en la matriz de estudio. El ion férrico causa

interferencias cuando la longitud de onda a la cual se mide la intensidad del color es

baja, particularmente a 400 nm.


23

La primera etapa consiste en realizar un barrido del espectro del complejo formado

entre el analito y el reactivo vanadato-molibdato en la región visible (400 – 490nm),

para corroborar lo planteado por las normas revisadas y seleccionar la longitud de

onda de trabajo, para la cual se utiliza la concentración intermedia de la curva de

calibración. Posteriormente se miden las absorbancias de las soluciones patrones

preparadas para la curva de calibración a la longitud de onda seleccionada para

evaluar el comportamiento lineal.

El cumplimiento de la relación lineal entre absorbancia y concentración dada por la ley

de Bouguer – Lambert – Beer depende de determinadas condiciones que deben

satisfacerse: la primera condición es que dicha ley es válida solo para disoluciones

diluidas, lo que evidencia que en la disolución no deben presentarse equilibrios que

dependen de la concentración de las especies. La segunda condición es que debe

utilizarse luz monocromática, lo que se logra cuando la anchura espectral de radiación

que abandona el monocromador sea sensiblemente menor que las anchuras medias

de las bandas de absorción a utilizarse. Por otra parte, la tercera condición es que los

errores en la determinación de absorbancia sean aceptables en el intervalo de 0,2 –

1,0; siendo recomendable trabajar en el intervalo de 0,3 – 0,8 que es la zona de menor

error fotométrico (Martinez and Toro 2010).

Una vez determinada, la longitud de onda es fijada para realizar las determinaciones.

Para el análisis, se miden primeramente las disoluciones de la curva de calibración y

posteriormente las muestras.

2.3 Preparación de la curva de calibración con fosfatos

A una serie de matraces aforados de 25,0 mL se transfieren alícuotas de 0; 1,0;

2,0; 3,0; 5,0 y 6,0 mL de la disolución patrón de fosfato (50,00 mg/L). Se agregan

5,0 mL de reactivo vanadato-molibdato y se diluye a 25,0 mL con agua destilada

para preparar patrones en el rango de concentraciones de 0 a 12,00 mg/L.

Dejar desarrollar el color durante 10 minutos.

Ajustar el espectrofotómetro con el blanco de reactivos y medir la absorbancia a

la longitud de onda seleccionada.


24

Realizar la curva de calibración llevando a un gráfico la absorbancia de los

patrones vs concentración de fósforo en los mismos.

2.4 Procedimiento para la determinación del contenido de fósforo

total en la muestra de EM

2.4.1 Preparación preliminar de la muestra

Para realizar el ensayo por el método seleccionado es necesario la eliminación del

color con carbón activado antes del tratamiento al blanco analítico y a la muestra. Si

resultara complicado filtrar la muestra se puede diluir previo a la adición de carbón

activado, tomando en cuenta todas las diluciones en el cálculo final de la concentración

de fósforo en la muestra.

Como la muestra de los EM es altamente coloreada se toman 100 mL de muestra y se

trasvasan a un vaso de precipitado de 250 mL donde previamente se pesaron cuatro

gramos de carbón activado, se agita durante cinco minutos y se filtra a través de un

papel de filtro (Filtrak # 45) para remover el carbón. Simultáneamente se toman 100

mL de agua destilada y se realiza el mismo tratamiento. Seguidamente se comprueban

los fosfatos en las muestras de carbón activado. La solución filtrada será la muestra

utilizada para la determinación de fósforo disuelto. Se lava bien el filtrado y se lleva

toda la muestra ya sin color a un matraz adecuado a la cantidad de muestra que se

desee preparar.

2.4.2 Pre-tratamiento de la muestra por digestión

Debido a que el fósforo se puede encontrar en combinación con la materia orgánica,

la determinación de fósforo total debe necesariamente contemplar una oxidación

efectiva de esta para transformar el fósforo a ortofosfato.

Existen tres métodos de digestión:

1. Digestión con ácido perclórico: es el más drástico y prolongado, se recomienda

sólo para muestras complejas, tales como sedimentos.

2. Digestión con ácido sulfúrico y ácido nítrico: es recomendada para la mayoría

de variedades de muestras de aguas.


25

3. Digestión con persulfato: es el método más simple, se recomienda que si es

adoptada, su efectividad de recuperación sea previamente contrastada contra

alguna de las digestiones más fuertes para verificar que sean equivalentes.

Para la conversión de todas las formas fosfóricas a ortofosfato la muestra de EM será

digerida con solución de ácidos fuertes (sulfúrico y nítrico) por ser recomendada para

la mayoría de variedades de muestras de aguas.

Preparar dos balones micro-Kjeldahl de 250 mL. Colocar en uno 50,0 mL de muestra,

previamente filtrada y en otro 50,0 mL de agua destilada sometida al mismo

tratamiento preliminar que la muestra y agregar a cada uno de ellos 1,0 mL de H2SO4

concentrado (95 – 98 % de pureza) y 5,0 mL de HNO3 concentrado (56 % de pureza).

Digestar a 150 0C durante 30 min en un digestor.

Terminada la digestión, se deja enfriar la mezcla y se transfiere a un matraz de 100

mL. Luego se adicionan 0,05 mL (una gota) de indicador fenolftaleína y se neutraliza

hasta desvanecer a un color rosa pálido con la disolución de hidróxido de sodio (NaOH

10 mol/L). Si el pH de la muestra es mayor que diez se debe ajustar agregando 0,05

mL (una gota) de indicador fenolftaleína y varias gotas de solución diluida de ácido

clorhídrico, HCl (1:1) hasta eliminar el color rosado y se enrasa a 100 mL con agua

destilada. A continuación se procede a la determinación espectrofotométrica por el

método seleccionado.

2.4.3 Desarrollo de color en la muestra

Preparar paralelamente un blanco de reactivos para la lectura en el equipo, en

el cual el volumen de muestra se sustituye por agua destilada sometida al

mismo tratamiento preliminar y se procede de igual forma que con la muestra.

Medir una alícuota de 10,0 mL de muestra en un matraz de 25,0 mL, adicionar

5,0 mL de reactivo vanadato-molibdato y enrasar a 25,0 mL con agua destilada.

Dejar desarrollar el color durante diez minutos.

Ajustar el espectrofotómetro con el blanco de reactivos y medir la absorbancia

de la muestra a la longitud de onda seleccionada.


26

El color es estable durante días y su intensidad no se ve afectada por la variación en

la temperatura ambiente.

2.5 Determinación de los parámetros estadísticos

2.5.1 Linealidad

Para evaluar la linealidad del método se preparan cinco disoluciones de

concentraciones 0; 2,0; 4,0; 6,0; 10,0 y 12,0 mg/L a partir de la solución patrón de

fosfatos de 50,00 mg/L. Según plantea el método, se procede al desarrollo de color de

estas disoluciones para obtener los valores correspondientes de las absorbancias a la

longitud de onda seleccionada y con estos, construir la curva de calibración que

relaciona absorbancia (y) vs. concentración (x), cuya relación debe ser lineal y es

representada por la ecuación 2.1. Se realizan tres réplicas por cada punto de la curva.

A = b × c (PO43-

) + a (2.1)

Donde:

b es la pendiente

a es la ordenada al origen (intercepto)

A es la absorbancia

c(PO43-

) es la concentración de PO43-

( mg L)⁄ .

A continuación se indican los criterios de aceptación definidos para evaluar la

capacidad del método analítico seleccionado para obtener resultados linealmente

proporcionales a la concentración de fósforo en las muestras de EM dentro del

intervalo de trabajo, a partir de los resultados obtenidos en el estudio de la linealidad:

Coeficiente de correlación: R ≥ 0,990

Coeficiente de determinación: R2 ≥ 0,980

Desviación estándar de la pendiente Sb cuyo criterio de aceptación es Sb ≤ 2%

Test de significación de la pendiente (test de linealidad): b ≠ 0


27

Límites de confianza del intercepto (test de proporcionalidad): debe incluir el

cero

2.5.2 Precisión

Para determinar la precisión se preparan, a partir de la solución patrón de fosfato de

50,00 mg/L, muestras patrones de concentraciones 2,00; 10,00 y 12,00 mg/L que

corresponden con un valor bajo, uno medio y uno alto y se procede según el método

seleccionado al desarrollo del color. A cada una de ellas se le realiza tres réplicas bajo

las mismas condiciones y se determina así la precisión en términos de repetibilidad.

Para evaluar la precisión en condiciones de reproducibilidad se preparan las muestras

patrones de 2,00; 10,00 y 12,00 mg/L a partir de la solución patrón de fosfato (50,00

mg/L) y se procede según el método seleccionado para desarrollar color, se realizan

tres réplicas en tres días diferentes. Con los resultados obtenidos se calcula la

desviación estándar y el coeficiente de variación (CV%). Los resultados de los estudios

de precisión, tanto en condiciones de repetibilidad como de reproducibilidad, se

expresan en términos de (CV%), cuyo criterio de aceptación definido para los métodos

espectrofotométricos por las normas es CV ≤ 3%.

2.5.3 Límites de detección y cuantificación

Para determinar el límite de detección y de cuantificación del método

espectrofotométrico empleado se realizaron las determinaciones de la regresión lineal

y se calculó a partir de todo el espectro de datos tomados para la confección de la

curva de calibración. El criterio de aceptación definido para el LD es 0,20 mg/L de

fosfato cuando se usan celdas de 1 cm de paso de luz, la cual se emplea en el

instrumento utilizado (NCh 2009). El método seleccionado puede ser utilizado en el

intervalo de 1,00 – 20,00 mg/L de fosfatos, según las normas (COVENIN 1993, NMX-

AA-029-SCFI 2001).

Varios son los procedimientos que según la literatura consultada pueden utilizarse para

la determinación de los límites de detección y cuantificación (NC 2010).


28

Basado en la evaluación visual:

El límite de detección es determinado por el análisis de muestras con concentraciones

decrecientes conocidas del analito, estimando el nivel mínimo al cual puede ser

detectado. El límite de cuantificación es generalmente determinado por este

procedimiento evaluando la menor cantidad de analito que puede ser cuantificado con

aceptable precisión y exactitud.

Basado en el valor de la ordenada de origen expresado en unidades de

concentración:

Si la recta de calibración del ensayo de linealidad se ha confeccionado con un rango

de concentraciones bajo, se admite utilizar el término independiente b para estimar

aproximadamente el límite de detección. El límite inferior de la respuesta se toma como

3 lbl / m.

Basado en la desviación estándar de la respuesta y en la pendiente:

El límite de cuantificación o detección puede ser expresado como:

Cl = K × Sbl / b (2.2)

Donde:

Cl = Límite de detección o cuantificación.

K es constante (K = 3 para límite de detección y K = 10 para límite de cuantificación)

SmL es la desviación estándar de la respuesta de los n blancos.

m es la pendiente de la recta de calibración.

La pendiente puede ser estimada por la curva de calibración del analito.

Basado en la desviación del blanco

Analizando un número apropiado (al menos 10) de muestras blanco y calculando la

desviación estándar de la respuesta. Este procedimiento es utilizado en métodos con

corrección de lectura. Frente al blanco como por ejemplo la espectrofotometría UV-

VIS, espectrofluorimetría, etc, en los que la lectura de la disolución problema se

obtiene por comparación con un blanco.


29

Basada en la curva de calibración

Realizando una curva de calibración específica para este estudio usando muestras

que contengan al analito en el intervalo del límite de detección y cuantificación. La

desviación estándar residual de una línea de regresión o la desviación estándar del

intercepto y de la línea de regresión pueden ser usadas como desviación estándar

(Pública, Ministerio de Salud Accedido en 2015).

A partir de la curva de calibración y aplicando ecuaciones matemáticas es posible

también calcular el LoD y LoQ del método. Vogelgesang y Hädrich (1998) proponen

ecuaciones matemáticas para el cálculo de estos.

Las ecuaciones son las siguientes:

LD= ycrit- a

b (2.3)

Donde a representa el intercepto, b la pendiente y Ycrítica representa la señal de

absorbancia crítica la cual se calcula de la siguiente manera:

ycrit

= Sy × tf;a × √1+ 1

n+

x̅2

∑ (x- x̅)2n

i=1

(2.4)

Donde

a es el intercepto,

Sy es el error estándar del modelo de regresión,

tf;a es la distribución de t con f = n – 2 dl y α = 0,05,

x̅ es el valor medio de la concentración de todos los análisis y,

n representa el número de determinaciones realizadas.

LQ= ydtm-a

b (2.5)

Donde ydtm es el punto más bajo de la distribución gaussiana cercana a 2×LoD.

ydtm

=y̅+ b × (2 × LD -x̅)+ Syx⁄ × √1+

1

n+

2 × LD - x̅2

∑ (x- x̅)2n

i=1

(2.6)


30

2.5.4 Veracidad

Para evaluar la veracidad se determina el porciento de recuperación (%R). La

recuperación representa la cantidad de analito añadido y recuperado en el análisis y

para su determinación se utilizará la expresión 2.7:

%R=(ce-c0)

ca×100 (2.7)

Donde:

ce se refiere a la concentración media de la muestra después de la adición del estándar,

c0 se refiere a la concentración media de la muestra original y

ca es la concentración añadida de estándar.

En validación, el porcentaje de recuperación aceptable está entre 85 y 115% (IUPAC

2014).

La veracidad puede ser determinada además por sesgo. Para determinar el sesgo

puede utilizarse material de referencia, material fortificado, material control, material

ensayo de aptitud. Una diferencia sistemática importante en relación al valor de

referencia aceptado se refleja en un mayor valor del sesgo, cuanto más pequeño es el

sesgo, mayor veracidad indica el método. El sesgo se refiere a la diferencia entre la

expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una medición y el valor verdadero

y se puede calcular usando la expresión 2.8:

S = x - xa (2.8)

Donde

S es el sesgo,

x es la lectura obtenida o valor promedio de las lecturas obtenidas y

xa es el valor asignado, valor certificado del material de referencia o valor esperado.

Para evaluar el sesgo, se debe realizar la prueba t, en la cual:

tcalc= (xa-x)

S × √n (2.9)

Si se cumple que tcalc < t tab, entonces, el sesgo obtenido para el método utilizado es

aceptable, y por lo tanto su veracidad es aceptable.


31

2.6 Determinación de la concentración de fósforo total en la muestra

de EM

2.6.1 Cálculo de la concentración de fósforo en la muestra de EM aplicando

el método de la curva de calibración

Primeramente se calcula la concentración de fósforo contenida en la muestra por

medio de la ecuación obtenida de la curva de calibración que es representada por la

ecuación 2.10:

y = bx + a (2.10)

Donde:

b es la pendiente,

a es la ordenada al origen (intercepto),

y es la absorbancia y

x es la concentración de PO43-

( mg L)⁄

Se reportan los resultados de la concentración de PO43-

con dos décimas. En caso de

haber dilución de la muestra a lo largo del desarrollo del método, aplicar la ley de la

volumetría o utilizar la ecuación 2.11:

mg/L de PO43-

= concentración × factor de dilución (2.11)

2.6.2 Cálculo de la concentración de fósforo en la muestra de EM aplicando

el método de adición de estándar

Se añaden a la muestra concentraciones de 2, 4, 6, 10 y 12 mg/L y se construye un

gráfico de A vs c. La concentración será determinada por interpolación en la recta

donde la concentración de fósforo estará dada por la relación entre el intercepto y la

pendiente:

c(PO43-

) = intercepto / pendiente (2.12)

Se reportan los resultados de la concentración de PO43-

con dos lugares decimales. En

caso de haber dilución de la muestra a lo largo del desarrollo del método, aplicar la ley

de la volumetría o utilizar la ecuación 2.9.

32

Capítulo 3. Análisis y discusión de los resultados

En el presente capítulo se evaluarán los resultados obtenidos en la validación del

método seleccionado para la determinación de fósforo total en las muestras de

productos de fermentación de microorganismos eficientes, así como los resultados

obtenidos en la determinación del contenido de fósforo total por el método de la curva

de la curva de calibración y el método de adición de estándar.

3.1 Corroboración de la longitud de onda de trabajo

Se realizó el espectro de absorción tomando las soluciones de los patrones de 5,00 y

12,00 mg/L de P, midiendo absorbancia en el rango de longitudes de onda de 400 y

hasta 650 nm (Anexos 3 y 4).

Fig. 3.1. Espectro de absorción para el patrón de 5 mg/L de P

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

390 410 430 450 470 490 510

Ab

so

rba

nc

ia

Longitud de onda

Espectro de absorciónc (P) = 5 mg/L

Absorbancia de la muestra

Absorbancia del blanco


33

Fig. 3.2. Espectro de absorción para el patrón de 12 mg/L de P

Como se observa, y según lo planteado en las normas revisadas, se puede realizar la

determinación en el rango de longitudes de onda comprendido entre 400 y 470 nm. Se

seleccionó la longitud de onda de 420 nm pues las interferencias no son significativas

existiendo diferencias elevadas entre la absorción del complejo y el reactivo

desarrollador de color, y además para garantizar el intervalo óptimo de absorbancia

requerido para este tipo de análisis, valor comprendido entre 0,2 y 1,0 siendo

recomendable trabajar en la zona de 0,3 a 0,8 que es la zona de menor error

fotométrico.

3.2 Análisis de los resultados obtenidos en la validación del método

3.2.1 Análisis de la linealidad del método

En la tabla 3.1 se indican los valores experimentales de absorbancia y concentración,

que corresponden a la curva de calibración obtenida para la concentración de fosfato

en el intervalo de 0 a 12,00 mg/L, con los cuales se realiza el test de linealidad y de

proporcionalidad.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510

Ab

so

rba

nc

ia

Longitud de onda

Espectro de absorciónc (P) = 12 mg/L

Absorbancia de lamuestra

Absorbancia del blanco


34

Tabla 3.1. Valores experimentales de la curva de calibración de PO43-

mediante el

método espectrofotométrico seleccionado

V (mL)

c (ppm)

A Media

Desviación Estándar

Varianza CV % I II III

1 2 0,082 0,078 0,080 0,080 0,0020 4,00x10-6 2.50

2 4 0,180 0,180 0,183 0,181 0,0017 3,00x10-6 0,96

3 6 0,295 0,296 0,297 0,296 0,0010 1,00x10-6 0,34

5 10 0,501 0,503 0,505 0,503 0,0020 4,00x10-6 0,40

6 12 0,590 0,588 0,590 0,589 0,0012 1,33x10-6 0,20

A continuación se muestra la curva de calibración de fosfato, en la cual se observa el

cumplimiento de la Ley de Lamber-Beer.

Fig 3.3. Curva de calibración para el PO43-

obtenida por el método espectrofotométrico

seleccionado.

Donde y se refiere al valor de la absorbancia y x sería la c (PO43-

) expresada en mg/L.

y = 0,0515x - 0,0207R² = 0,9988

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0 2 4 6 8 10 12 14

A

c (mg/L)

Curva de calibración a 420 nm


35

Tabla 3.2. Resultados estadísticos del estudio de la linealidad del método:

(parámetros, resultados y criterio de aceptación)

Parámetros Resultados Criterios de aceptación

Coeficiente de correlación múltiple 0,9993 R ≥ 0,990

Coeficiente de determinación R2 0,9987 R2 ≥ 0,980

Desv. Estándar de la pendiente Sb 1,1 x 10-4 Sb ≤ 2%

ttab (0,05/2, n-2) 4,303 –

texp = b/Sb 446,2918 texp > ttab

a ± t × Sa -0,0167 a 0,0246 Debe incluir el cero

Como se puede observar en la tabla 3.2 el coeficiente de correlación lineal es

significativo (0,9999 > 0,990) pues aplicando la prueba t para n – 2 grados de libertad

el texperimental = 446,2918 > ttabulada = 4,303 lo cual indica que la probabilidad de ser b ≠

0 es muy elevada por lo que se rechaza la hipótesis nula y se concluye que existe una

correlación significativa entre la absorbancia y la concentración. Se cumple la

condición de proporcionalidad pues los límites de confianza del intercepto incluyen el

cero, siendo t el valor de la distribución de Student para n – 2 grados de libertad a la

probabilidad escogida (ρ=0,05). Por lo tanto, los parámetros de linealidad calculados

cumplen con los criterios de aceptación correspondientes, lo que indica que el método

para la determinación de fósforo es lineal en el intervalo de 0 a 12,00 mg/L y no es

necesario trabajar a otras longitudes de onda.

3.2.2 Análisis de la precisión del método

3.2.2.1 Precisión en términos de repetibilidad

En la tabla 3.3 se muestran los resultados de la precisión del método obtenidos del

estudio de la repetibilidad donde, se prepararon muestras patrones de concentraciones

2,00; 6,00 y 12,00 mg/L y a cada una de ellas se realizaron tres réplicas bajo las

mismas condiciones.


36

Tabla 3.3. Resultados de la precisión en términos de repetibilidad para la

determinación de PO43-

c (mg/L) 2 6 12

A

I 0,082 0,295 0,590

II 0,078 0,296 0,588

III 0,080 0,297 0,590

Media 0,080 0,296 0,589

Varianza 4,0x10-06 1,0x10-6 1,33x10-06

Desv. Estándar 0,002 0,001 0,0011

CV % 2,5 0,3378 0,1959

Como se puede observar en la tabla 3.3, los coeficientes de variación (CV%) de la

repetibilidad del método son inferiores a 3 %, lo cual está acorde con el criterio de

aceptación definido para los métodos espectrofotométricos, por lo que el método es

preciso en el intervalo estudiado.

3.2.2.2 Precisión en términos de reproducibilidad intermedia

En la tabla 3.4 se muestran los resultados de la precisión del método obtenidos del

estudio de la reproducibilidad donde, se prepararon muestras patrones de

concentraciones 2,00; 6,00 y 12,00 mg/L y a cada una de ellas se realizaron tres

réplicas en días diferentes y manteniendo el resto de las condiciones experimentales

sin variación.

Tabla 3.4. Resultados de la precisión en términos de reproducibilidad intermedia para

la determinación de PO43-

c(P) mg/L

Día 1 Día 2 Día3 Media DE

Varian-za

CV % A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3

2 0,082 0,078 0,080 0,080 0,081 0,083 0,083 0,081 0,084 0,081 0,0019 3,50x10-6 2,300

6 0,295 0,296 0,297 0,292 0,290 0,295 0,293 0,290 0,292 0,293 0,0025 6,50x10-6 0,869

12 0,590 0,588 0,590 0,592 0,591 0,593 0,594 0,601 0,596 0,593 0,0039 1,52x10-5 0,658

Como se puede observar en la tabla 3.4, los coeficientes de variación (CV%) de la

reproducibilidad intermedia del método son inferiores a 3 %, lo cual está acorde con el

criterio de aceptación definido para los métodos espectrofotométricos, por lo que se


37

puede afirmar que el método es preciso en el intervalo estudiado, también en

condiciones de reproducibilidad intermedia.

3.2.3 Análisis de la determinación de los límites de detección y

cuantificación

A partir de los valores (Xn, Yn) de la curva de calibración que se muestran a

continuación:

Tabla 3.5. Datos de la curva de calibración para la determinación de los límites de

detección y cuantificación

Concentración (mg/L)

Absorbancia

2 0,082

2 0,078

2 0,080

4 0,180

4 0,180

4 0,183

6 0,295

6 0,296

6 0,297

10 0,501

10 0,503

10 0,505

12 0,590

12 0,588

12 0,590

Se realizan los cálculos estadísticos de regresión, obteniendo los siguientes

parámetros:

Tabla 3.6. Estadísticas de la regresión

Estadísticas de la regresión

Coeficiente de correlación multiple 0,999370781

Coeficiente de determinación R2 0,998741957

R2 ajustado 0,998645185

Error típico 0,007289871

Observaciones 15


38

Tabla 3.6. Resultados del análisis de la varianza

ANÁLISIS DE VARIANZA

Suma de

cuadrados Promedio de los

cuadrados F

Valor crítico de F

Regresión 0,1828183 0,182818 2477 1,8x10-5

Residuos 0,0002214 7,38x10-5

Total 0,1830397

Error típico Estadístico

t Probabi-

lidad Inferior 95,0 %

Inferior 95,0 %

Superior 95,0 %

Intercepción 0,0080224 -2,57564 0,08 -0,04619 -0,05 0,005

Variable X 1 0,0010357 49,77227 0 0,04825 0,05 0,055

Calculando otros valores necesarios:

tf:a = 1,77

x̅ = 6,8

(n-1) × Var(x) = 206,40 (sumatoria de los errores cuadráticos de las concentraciones)

y̅ = 0,33

Despejando en la ecuación 2.4 se observa que ycrit = -0,01. Teniendo el valor de ycrit y

los valores a y b, se sustituyen en la ecuación 2.3 y se obtiene el límite de detección:

LD = 0,3.

Ya con todos los parámetros para realizar el cálculo de ydtm se sustituyen en la

ecuación 2.6 los valores y obtenemos que ydtm = 0,02.

A partir de los resultados obtenidos anteriormente se realiza el cálculo del límite de

cuantificación utilizando la ecuación 2.5, sustituyendo los valores de a, b y de ydtm se

obtiene un valor de LQ = 0,85.

LD = 0,30 mg/L

LQ = 0,85 mg/L

Como se observa la concentración mínima detectada por el método seleccionado

corresponde a 0,30 mg/L y el instrumento puede medir con un nivel de confianza


39

definido por el método seleccionado a partir de 0,85 mg/L lo cual se corresponde con

el criterio establecido para el intervalo de trabajo. Se puede apreciar que el LD

calculado es adecuado para los propósitos del análisis.

3.2.4 Análisis de la veracidad del método

3.2.4.1 Cálculo del porciento de recuperación (% R)

Para determinar la veracidad se utiliza el método de adición de estándar y se determina

el porciento de recuperación. En la tabla 3.7 se muestran los resultados de este

análisis.

Tabla 3.7. Resultados del cálculo del porciento de recuperación.

Adiciones de estándar

2 mg/L 4 mg/L 6 mg/L 10 mg/L

% R 89,70874 92,86408 98,28185 99,42071

Se concluye que el porciento de recuperación se encuentra dentro del rango aceptado

de 85 a 115 %. Se constató así que los efectos provocados por la matriz no son

significativos y esta no influye en la determinación del contenido de fósforo en la

muestra.

3.2.4.2 Cálculo del sesgo

Adición de estándar 2 mg/L

Muestra Lectura Obtenida Valor

esperado Sesgo

1 6,5184 7,9864 8,5184 0,5320 2 6,4214 8,1417 8,4214 0,2796 3 6,4796 7,8893 8,4796 0,5903 4 6,4796 8,2000 8,4796 0,2796 5 6,4408 8,3359 8,4408 0,1049 6 6,4602 8,2971 8,4602 0,1631 7 6,4796 8,1612 8,4796 0,3184 8 6,5184 8,3165 8,5184 0,2019 9 6,4019 8,3359 8,4019 0,0660

Media 6,4667 8,1849 8,4667 0,2818

Desviación estándar 0,1691

tcalc 0,5553


40


Muestra Lectura obtenida Valor esperado Sesgo

1 6,5184 9,9476 10,5184 0,5709 2 6,4214 10,1029 10,4214 0,3184 3 6,4796 9,6369 10,4796 0,8427 4 6,4796 10,2000 10,4796 0,2796 5 6,4408 10,2777 10,4408 0,1631 6 6,4602 10,0835 10,4602 0,3767 7 6,4796 10,2000 10,4796 0,2796 8 6,5184 10,2777 10,5184 0,2408 9 6,4019 12,2777 10,4019 -1,8757

Media 6,4667 10,3338 10,4667 0,1329


tcalc 0,0567



1 6,5184 12,1223 12,5184 0,3961 2 6,4214 12,5107 12,4214 -0,0893 3 6,4796 12,3553 12,4796 0,1243 4 6,4796 12,4524 12,4796 0,0272 5 6,4408 10,2777 12,4408 2,1631 6 6,4602 12,2777 12,4602 0,1825 7 6,4796 12,4524 12,4796 0,0272 8 6,5184 12,4136 12,5184 0,1049 9 6,4019 12,2777 12,4019 0,1243

Media 6,4667 12,1266 12,4667 0,3400


tcalc 0,1627



1 6,5184 16,3165 16,5184 0,2019 2 6,4214 16,3942 16,4214 0,0272 3 6,4796 16,3359 16,4796 0,1437 4 6,4796 16,3553 16,4796 0,1243 5 6,4408 16,5107 16,4408 -0,0699 6 6,4602 16,4136 16,4602 0,0466 7 6,4796 16,4136 16,4796 0,0660 8 6,5184 16,4913 16,5184 0,0272 9 6,4019 16,4524 16,4019 -0,0505

Media 6,4667 16,4093 16,4667 0,0574


tcalc 0,2161


41

En todos los casos tcalc < ttab, por tanto no hay diferencias significativas, el sesgo

obtenido para el método utilizado es aceptable, y su veracidad es aceptable.

3.3 Determinación de fósforo total por el método espectrofotométrico

del ácido vanadomolibdofosfórico en la muestra de los EM

Para determinar el contenido de fósforo total por el método espectrofotométrico del

ácido vanadomolibdofosfórico se analizaron varias muestras. El procedimiento para el

ensayo (véase el Anexo 5), cuyos resultados se presentan a continuación. Es

importante considerar que para la determinación de fósforo total en esta matriz la

digestión ácida resulta ser eficaz cuando es realizada en un digestor, lo que permite

evitar la pérdidas de analito que se verifican en la digestión en una plancha de

calentamiento.

3.3.1 Método de la curva de calibración

A continuación se presentan los resultados obtenidos en el cálculo de la concentración

de fósforo en las muestras usando el método de la curva de calibración.

Tabla 3.8. Resultados obtenidos en la determinación de fósforo total en la muestra de

EM por el método de la curva de calibración

Réplicas Día 1 Día 2 Día 3 Día 4

cf1 cf2 cf3 cf4

Muestra

I 137,23 136,41 136,41 136,41

II 135,18 135,59 137,23 136,00

III 136,41 136,00 134,77 135,59

media 136,27 136,00 136,14 136,00

varianza 1,0646 0,1681 1,5689 0,1681

DE 1,0318 0,4100 1,2526 0,4100

CV % 0,7572 0,3015 0,9201 0,3015

¿Existen diferencias entre las medias obtenidas?

La prueba t-Student permite comparar las medias de dos grupos de datos y determinar

si entre estos parámetros las diferencias son estadísticamente significativas. Si se

intenta un test de t-Student con estos valores hay que verificar si las varianzas no son


42

significativamente diferentes; porque si son diferentes, el test de t-Student no podrá

ser utilizado, para ello se utiliza la prueba F (Fisher):

F= Varianza mayor

Varianza menor (3.1)

Por tanto Fcalc = 9,33 < Ftab = 19 y se concluye que las dos varianzas no son

significativamente diferentes. Por lo tanto, hacer el test de t es una decisión legítima.

Día 1 Día 2 xΔ

137,23 136,41 0,82

135,18 135,59 -0,41

136,41 136,00 0,41


Media 0,2733

xΔ se refiere a la diferencia entre las mediciones

tcalc= x∆̅̅ ̅

S√n

⁄ (3.2)

Entonces, tcalc = 0,7550 y ttab = 4,303, por tanto: tcalc < ttab y se concluye que no existen

diferencias significativas entre las medias determinadas.

La concentración de Ptotal presente en la muestra de los EM se calculó por medio de

la ecuación obtenida de la curva de calibración, teniendo en cuenta que hubo dilución

de la muestra a lo largo del desarrollo del método se aplicó la ley de la volumetría, y

la concentración de PO43-

resultó ser igual a 136,10 ± 0,2045 mg/L. Se puede observar

que el CV% calculado es inferior a 3% en todos los casos, lo cual está acorde con el

criterio de aceptación establecido para los métodos espectrofotométricos.

3.3.2 Método de adición de estándar

A continuación se presentan los resultados obtenidos en el cálculo de la concentración

de fósforo en las muestras usando el método de la adición de estándar.


43

Tabla 3.9. Datos obtenidos para el método de adición de estándar

Réplicas

Adiciones (mg/L) c (PO43-

) en la muestra (mg/L)

2 4 6 10

Día 1 0,4455 0,5453 0,6640 0,8645 135,78

Día 2 0,4470 0,5453 0,6583 0,8667 135,21

Día 3 0,4467 0,5497 0,6583 0,8680 135,73

Día 4 0,4447 0,548 0,6577 0,8647 135,84

media 0,4460 0,547 0,6596 0,8660 135,64

varianza 1,16x10-6 4,65x10-6 8,77x10-6 2,82x10-6 0,0852

DE 0,0011 0,0022 0,0030 0,0017 0,2920

CV % 0,2410 0,3940 0,4489 0,1940 0,2152

Para cada uno de los días en que se analizó la concentración de fósforo en la muestra

utilizando el método de adición de estándar se construye la curva correspondiente y

se determina la concentración expresada en mg/L.

c = intercepto / pendiente

Fig 3.4. Curvas para el método de adición de estándar.

y = 0,0527x + 0,3399R² = 0,999

y = 0,0528x + 0,3391R² = 0,9996

y = 0,0528x + 0,3404R² = 0,9999

y = 0,0526x + 0,3394R² = 0,99990,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

1,000

0 2 4 6 8 10 12

A

c (mg/L)

Adición de estándarDía1 Día 2 Día 3 Día 4


44

La concentración de Ptotal presente en la muestra de los EM se calculó por medio de la

ecuación obtenida de la curva de adición de estándar, teniendo en cuenta que hubo

dilución de la muestra a lo largo del desarrollo del método la concentración de PO43-

resultó ser igual a 135,64 ± 0,4642 mg/L.

45

Conclusiones

Se establecen las condiciones de trabajo adecuadas para el correcto

desempeño del método espectrofotométrico del ácido vanadomolibdofosfórico

propuesto para la determinación de fósforo total en productos de fermentación

de microorganismos eficientes.

El proceso de validación demuestra que el método es lineal, preciso en términos

de repetibilidad y reproducibilidad y veraz en el intervalo de concentraciones de

2,00 a 12,00 mg/L. Siendo el límite de detección 0,30 mg/L y el límite de

cuantificación de 0,85 mg/L. Se demuestra que la contribución del efecto matriz

no tiene influencias significativas en la determinación.

Se aplica el método propuesto a la muestra de microorganismos eficientes

CBQ-VTC, lote: Investigación 200 L siendo la concentración de fósforo total

determinada por el método de la curva de calibración y por el método de adición

del estándar iguales a 136,10 ± 0,2045 mg/L y 135,64 ± 0,4642 mg/L

respectivamente. No existiendo diferencias significativas entre las

concentraciones calculadas por ambos métodos.

46

Recomendaciones

Aplicar el método espectrofotométrico del ácido vanadomolibdofosfórico

propuesto para la determinación de fósforo total en otras muestras de

microorganismos eficientes.

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Anexos

Anexo 1. Bloc digest 6 plazas (equipo utilizado para la digestión de la muestra)

Anexo 2. Espectrofotómetro UV-VISIBLE, Genesys 10UV

Anexos

Anexo 3. Datos para la confección del gráfico, espectro de absorción para la solución patrón de 5 mg/L.

λ (nm) A Promedio

de A I II III

400 0,396 0,402 0,411 0,403

405 0,353 0,357 0,367 0,359

410 0,313 0,315 0,325 0,318

415 0,278 0,279 0,287 0,281

420 0,246 0,247 0,254 0,249

425 0,218 0,218 0,225 0,220

430 0,194 0,194 0,20 0,196

435 0,172 0,173 0,178 0,174

440 0,155 0,155 0,160 0,157

445 0,140 0,138 0,144 0,141

450 0,126 0,126 0,131 0,128

455 0,115 0,115 0,118 0,116

λ (nm) A Promedio

de A I II III

460 0,104 0,103 0,107 0,105

465 0,094 0,094 0,096 0,095

470 0,084 0,082 0,085 0,084

475 0,073 0,076 0,075 0,075

480 0,062 0,062 0,065 0,063

485 0,052 0,052 0,055 0,053

490 0,043 0,043 0,045 0,044

500 0,027 0,027 0,028 0,027

550 0,001 0,002 0,004 0,002

600 0,001 0,003 0,001 0,002

650 0,004 0,001 0,004 0,003

Anexo 4. Datos para la confección del gráfico, espectro de absorción para la solución

patrón de 12 mg/L.

λ (nm)

A Promedio de A I II III

400 0,970 0,988 0,940 0,966

405 0,870 0,880 0,838 0,863

410 0,774 0,775 0,748 0,766

415 0,682 0,691 0,665 0,679

420 0,605 0,612 0,588 0,602

425 0,540 0,545 0,520 0,535

430 0,478 0,483 0,465 0,475

435 0,428 0,434 0,413 0,425

440 0,383 0,390 0,372 0,382

445 0,346 0,352 0,336 0,345

450 0,314 0,319 0,305 0,313

455 0,285 0,290 0,279 0,285

λ (nm)

A Promedio de A I II III

460 0,258 0,262 0,255 0,258

465 0,232 0,236 0,225 0,231

470 0,207 0,211 0,201 0,206

475 0,182 0,185 0,177 0,181

480 0,157 0,160 0,153 0,157

485 0,132 0,135 0,128 0,132

490 0,109 0,112 0,106 0,109

500 0,069 0,073 0,068 0,070

550 0,001 0,004 0,002 0,002

600 0,000 0,003 0,001 0,001

650 0,001 0,008 0,002 0,004

Anexos

Anexo 5. Diagrama de flujo para la determinación de PTotal:

Dig

es

tió

n á

cid

a

Tomar 50 mL de muestra en

un block de digestión

Añadir 5 mL de HNO3(conc) y 1 mL de H2SO4(conc)

Digestar por 30 minutos a 150ºC

Enfriar

Añadir 0.1 mL (2 gotas) de fenolftaleína

Neutralizar con NaOH 10 mol/L hasta que aparezca el

color rosa

Trasvasar a un matraz de 100 mL, enfriar a temperatura

ambiente y enrasar

Eli

min

ac

ión

de

co

lor

Tomar 100 mL y añadir 4 g

de carbón activado

Agitar durante 5 minutos

Filtrar a vacío y lavar bien el filtrado

(Si fuera necesario filtrar más de una vez pudiera usarse la filtración a

gravedad)

Trasvasar a un matraz de 2 L

todo el contenido inicial de la

muestra ya decolorada

Tomar 500 mL de muestra y diluir a

1000 mL en un matraz volumétrico

Des

arr

olla

do

r d

e c

olo

r

Medir 10 mL y llevar a un matraz

de 25 mL

Preparar paralelamente

Añadir 5 mL de la solución vanadato-molibdato (reactivo

desarrollador de color)

Enrasar y dejar desarrollar color durante 10 minutos

Ajustar espectrofotómetro con el blanco de reactivos a la

longitud de onda seleccionada (420 nm)

Registrar resultados

validación parcial del método espectrofotométrico del

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