trabajo fin de estudios · esquema de los aminoácidos ser o thr glicosilados con los carbohidratos...

TRABAJO FIN DE ESTUDIOS

Síntesis de epítopos relacionados con la mucinaMUC1

David Madariaga Merino

MÁSTER EN QUÍMICA AVANZADA

Tutor: Jesús Manuel Peregrina GarcíaFacultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Curso 2010-2011

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2012

publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]

Síntesis de epítopos relacionados con la mucina MUC1, trabajo final de estudiosde David Madariaga Merino, dirigido por Jesús Manuel Peregrina García (publicado por la

Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los

titulares del copyright.

UNIVERSIDAD DE LA RIOJA FACULTAD DE CIENCIAS, ESTUDIOS AGROALIMENTARIOS E INFORMÁTICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA

Centro de Investigación en Síntesis Química (CISQ) Grupo de Síntesis Química de La Rioja U.A.-C.S.I.C.

SÍNTESIS DE EPÍTOPOS RELACIONADOS CON LA MUCINA

MUC1

Trabajo de investigación Proyecto Fin de Máster David Madariaga Merino

Junio 2011

Trabajo de investigación Nuria Martínez Sáez

Junio 2010

JESÚS MANUEL PEREGRINA GARCÍA, Catedrático de Química Orgánica del

Departamento de Química de la Universidad de La Rioja y

FRANCISCO CORZANA LÓPEZ, Profesor Contratado Doctor de Química Orgánica

del Departamento de Química de la Universidad de La Rioja.

HACEN CONSTAR:

Que la memoria " SÍNTESIS DE EPÍTOPOS RELACIONADOS CON LA MUCINA

MUC1" ha sido realizada por el Licenciado DAVID MADARIAGA MERINO en

el Departamento de Química de la Universidad de La Rioja, bajo su

inmediata dirección y reúne las condiciones exigidas para conseguir los 30

créditos ECTS correspondientes al período de investigación del Trabajo fin

de Máster.

Logroño, Junio 2011

Fdo.: Jesús Manuel Peregrina García Fdo.: Francisco Corzana López

A mi madre y a mi padre, por su apoyo incondicional desde siempre.

A mi hermana, por su ánimo y comprensión.

A mi familia y amigos, por estar siempre ahí.

Quién iba a imaginar que en escasamente dos años, que es lo que llevo

en el grupo, se pudiera aprender no solo a nivel académico sino a nivel personal,

la convivencia diaria y la ayuda que se me ha prestado siempre que la he

necesitado. Por eso, si hoy estoy aquí tan ilusionado es gracias a todos vosotros:

A Alberto, Pere, Héctor y Marimar por darme la oportunidad de entrar

en el grupo y haberme aconsejado, ayudado y formado, primero durante la

carrera y, posteriormente, en esta segunda etapa. También, agradecer

especialmente a Paco por su paciencia, su gran ayuda dentro y fuera del

laboratorio y su entusiasmo por la Química y el aprendizaje que hacen que se

contagien.

A todos y cada uno de mis compañeros de laboratorio sin los cuales el

trabajo de cada día no hubiera sido el mismo. Gracias a Fer, por conseguir tan

buen ambiente con su humor característico; a mi padre Charlie, por compartir

altruistamente su tiempo, dedicación y entusiasmo, aguantando, como nadie, mis

primeros pasos en la investigación; a Eva, por estar siempre con una sonrisa y

preocupada por suministrarme todo lo que fuera necesario consiguiendo que

todo fuera más cómodo; a Javi, del que siempre guardare un pequeño recuerdo,

que ha estado siempre a mano para solucionar cualquier pequeña duda; a Nuria,

por todas esas risas que cada día hacen que se vuelva con ganas cada mañana y su

paciencia con alguien que está todo el día acosándola a preguntas; a Victor S.,

por su gran sentido del humor y compañerismo, además de los buenos momentos

dentro y fuera del laboratorio; a Victor R., cuyo comportamiento modelo en el

laboratorio y su personalidad hacen que sea alguien indispensable en el día a día;

a Lara, no solo compañera de poyata, sino una gran persona a la que tengo

mucho que agradecer, que me ha ayudado cada día y que siempre ha estado

disponible para cualquier pequeña y tonta duda; a Iván, que desde el principio de

la carrera ha sido un apoyo incondicional y, aunque me robe sitio, sabemos que

todo lo puede solucionar una buena cerveza.

A los vecinos fotoquímicos, Alegría, Héctor, Marina, Pedro, Miguel

Ángel y Diego y su nueva adquisición, Anselmo, con los que ha sido imposible no

compartir más de un gran momento tanto fuera como dentro del edificio.

A mis compañeros de Máster: Ana, Manso, Patri, Irene, Pepetó e Iván, a

los que tanto he odiado las mañanas de los viernes.

A mis amigos, ellos saben quiénes son, que me han aguantado cuando

más lo he necesitado.

Por último, a toda mi familia, porque nunca han dejado de darme su

cariño y apoyo bajo ningún concepto.

Finalmente, me gustaría agradecer a las siguientes instituciones la ayuda

económica aportada para la realización de este proyecto:

• Gobierno de La Rioja, por la concesión del proyecto COLABORA

2010/05.

• Ministerio de Ciencia e Innovación, por la aportación económica al

proyecto CTQ2009-13814/BQU.

• Universidad de La Rioja, por la beca F.P.I. concedida en el 2011 y por

la subvención al grupo de investigación: Grupo de Síntesis Orgánica

Estereoselectiva.

• Universidad de La Rioja, por conformar el marco humano y científico

idóneo para el desarrollo de este trabajo.

ÍNDICE

Abreviaciones I

1. Introducción y objetivos 1

2. Antecedentes 9

2.1. Síntesis 11

2.1.1. Formación del enlace peptídico 11

2.1.2. Síntesis de péptidos en fase sólida 14

2.1.3. Formación del enlace O-glicosídico 17

2.2. Trabajos previos 20

3. Discusión de resultados 25

4. Conclusiones 39

5. Experimental 43

6. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear 63

I

Abreviaciones

δδδδ desplazamiento químico 1

H RMN resonancia magnética nuclear de protón 13

C RMN resonancia magnética nuclear de carbono-13

Ac acetilo

Ac2O anhídrido acético

AcOEt acetato de etilo

Ala, A alanina

Arg, R arginina

Asp, D ácido aspártico

Bn bencilo

Boc terc-butoxicarbonilo

Boc2O di-terc-butil dicarbonato

BOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-

tris(dimetilamino)fosfonio

tBu terc-butilo

BuOH butanol

tBuOK terc-butóxido potásico

c concentración (g/100 mL)

col. colaboradores

COSY COrrelated SpectroscopY

d doblete, día

DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida

dd doblete de dobletes

DIC N, N’-diisopropilcarbodiimida

DIEA diisopropiletilamina

DM dinámica molecular

DMF dimetilformamida

Et etilo

Et3N trietilamina

EtOH etanol

Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonilo

GalNAc N-acetilgalactosamina

II

Gly, G glicina

HBTU hexafluorosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-

dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio

His, H histidina

HOBt 1-hidroxibenzotriazol

J constante de acoplamiento

M molaridad

m multiplete

Me metilo

MeOH metanol

MeONa metóxido de sodio

MeSer metilserina

mmol milimol

NMP N-metilpirrolidona

NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY

Pro, P prolina

PyBOP hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-

tris(pirrolidin)fosfonio

R sustituyente alquilo o arilo, arginina

RMN resonancia magnética nuclear

s singlete, ázucar (del inglés, sugar)

Ser, S serina

SPPS solid-phase peptide synthesis

t triplete, tiempo

TBTU tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N´,N´-

tetrametiluronio

TFA ácido trifluoroacético

TfO triflato

THF tetrahidrofurano

TIS triisopropilsilano

Thr, T treonina

TMS trimetilsililo, tetrametilsilano

Val, V valina

3 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

Los glicopéptidos y las glicoproteínas son algunas de las moléculas de

mayor interés biológico1 y están constituidas por una parte peptídica o proteica y

uno o varios restos carbohidrato (azúcar), que se unen entre sí mediante lo que se

denomina enlace glicosídico (Figura 1).

Figura 1. Glicoproteína MUC1 donde la cadena peptídica se encuentra glicosilada en la

treonina del epítopo PDTR.

Muchas de las propiedades que presentan estas glicoproteínas se

atribuyen a su alto número de residuos glicosilados, ya que ha observado un

notable aumento de su estabilidad proteica, reduciendo así su vulnerabilidad a la

degradación proteolítica, tanto química como enzimática.1d

Una de las formas más usuales e importantes de unión entre un

aminoácido y un carbohidrato es mediante el enlace O-glicosídico donde el azúcar

1 a) Buskas, T.; Thompson, P.; Boons, G.-J. Chem. Commun. 2009, 5335-5349; b) Essentials of Glycobiology (Eds.: Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J.; Freeze, H.; Hart, G. W.; Marth, J.), Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York, 1999; c) Pratt, M. R.; Bertozzi, R. C. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58-68; d) Van den Steen, P.; Rudd, P. M.; Dwek, R. A.; Opdenakker, G. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1998, 33, 151-208; e) Strous, G. J.; Dekker, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1992, 27, 57-92; f) Varki, A. Glycobiology 1993, 3, 97-130; g) Glycopeptides and Glycoproteins: Synthesis, Structure, and Application en Topics in Current

Chemistry, (Ed.: Wittmann, V.), Springer-Verlag, Berlín, vol. 267, 2007.


se enlaza al grupo hidroxilo de una serina (Ser) o una treonina (Thr) de una cadena

peptídica. Este tipo de enlace puede ser de tipo α o β (Figura 2).

Figura 2. Esquema de los aminoácidos Ser o Thr glicosilados con los carbohidratos

N-acetilgalactosamina (GalNAc) y glucosa (Glc), mediante un enlace α-O-glicosídico y β-O-

glicosídico, respectivamente

De los diferentes tipos de O-glicoproteínas que se conocen, unas de las

más importantes son las mucinas. Estas moléculas están involucradas en diversos

procesos biológicos,2 como la inflamación, la respuesta inmunológica, la

comunicación intercelular, el crecimiento y adherencia celular y la actividad

anticongelante, entre otros. Además, tienen gran interés desde el punto de vista

terapéutico,3 especialmente en el desarrollo de vacunas para el tratamiento del

cáncer.4

En las mucinas, el primer residuo de carbohidrato unido a la cadena

peptídica es, generalmente, el N-acetilgalactosamina (GalNac), y se une a través de

2 a) Dwek, R. A. Chem. Rev. 1996, 96, 683-720; b) Sears, P.; Wong, C.-H. Cell. Mol. Life Sci.

1998, 54, 223-252. 3 a) Davis, B. G. Chem. Rev. 2002, 102, 579-601; b) Watt, G. M.; Lund, J.; Levens, M.; Kolli, V. S. K.; Jefferis, R.; Boons, G.-J. Chem. Biol. 2003, 10, 807-814; c) Lui, H.; Wang, L.; Brock, A.; Wong, C.-H.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1702-1703; d) Gamblin, D. P.; Garnier, P.; van Kasteren, S.; Oldham, N. J.; Fairbanks, A. J.; Davis, B. G. Angew. Chem., Int.

Ed. 2004, 116, 827-833; e) Davis, B. G. Science 2004, 303, 480-482. 4 a) Blattman, J. N.; Greenberg, P. D. Science 2004, 305, 200-205; b) Moingeon, P. Vaccine

2001, 19, 1305-1326; c) Jarcz, S.; Chen, J.; Kuznetsova, L. V.; Ojima, I. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5043-5054; d) Dziadek, S.; Hobel, A.; Schmitt, E.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 7630-7635; e) Buskas, T.; Ingale, S.; Boons, G.-J. Glycobiology 2006, 16, 113R-136R; f) Dube, D. H.; Bertozzi, C. R. Nature Rev. 2005, 4, 477-488; g) Hollingsworth, M. A.; Swanson, B. J. Nature Rev. Cancer, 2004, 4, 45-60; h) Trap, M. A.; Clausen H. Biochim.

Biophys. Acta 2008, 1780, 546-563.


un enlace α-O-glicosídico a serina o treonina. Esto es lo que se denomina antígeno

Tn (Figura 3).

Figura 3. Estructura del antígeno Tn

La mucina humana MUC1 es una glicoproteína asociada a la membrana

celular. Dicha molécula se encuentra sobreexpresada y deficientemente

glicosilada en una célula cancerosa, debido al mal funcionamiento de algunas

glicosiltransferasas. La pérdida de polaridad y la sobreexpresión de la MUC1 en

este tipo de células interfieren con la adhesión celular y evita el reconocimiento

por parte del sistema inmune de la célula tumoral, favoreciendo la creación de

metástasis. Por otro lado, la glicosilación parcial y con glicanos más cortos y

menos complejos de lo normal (Figura 4) hace que determinados antígenos (como

el Tn) que en las células normales se encuentran enmascarados por la presencia

de carbohidratos más externos, queden ahora expuestos en la superficie.5 Este

hecho convierte a las mucinas en prometedoras candidatas para la terapia contra

el cáncer (vacunas basadas en carbohidratos).6

5 a) Sell, S. Human Path. 1990, 21, 1003–1019; b) Hakomori, S.; Zhang, Y. Chem. Biol. 1997,

4, 97-104; c) Taylorpapadimitriou, J.; Epenetos, A. A. Trends Biotech. 1994, 12, 227–233; d) Gabius, H. J. Angew. Chem. 1988, 27, 1267–1276. 6 a) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112; b) Dziadek, S.; Kunz, H.

The Chem. Rec. 2004, 3, 308-321; c) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 836-863; d) Slovin, S. F.; Ragupathi, G.; Musselli, C.; Olkiewicz, K.; Verbel, D.; Kuduk, S. D.; Schwarz, J. B.; Sames, D.; Danishefsky, S. J.; Livingston, P. O.; Scher, H. I. J. Clin. Oncol. 2003, 21, 4292-4298; e) Chen, X.; Lee, G. S.; Zettl, A.; Bertozzi, C. R. Angew.

Chem. Int. Ed. 2004, 43, 6111-6116; g) Galonic, D. P.; Gin, D. Y. Nature 2007, 446, 1000-1007; f) Hang, H. C.; Bertozzi, C. R. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5021-5034.


Figura 4. Mucina sana y mucina con errores de glicosilación en una membrana celular

Estructuralmente, esta glicoproteína está formada por la repetición de la

siguiente secuencia de veinte aminoácidos: GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP; tiene

cinco puntos de O-glicosilación: las tres treoninas y las dos serinas. Además, esta

molécula presenta tres regiones importantes.

La primera de ellas es la secuencia GVTSA (glicina-valina-treonina-serina-

alanina), sustrato de partida para las enzimas GalNAc transferasas y un epítopo

reconocido por anticuepos.6a

La segunda es el fragmento PDTR (prolina-aspártico-treonina-arginina).

Esta secuencia peptídica también es un epítopo reconocido por distintos

anticuerpos del tipo anti-MUC1.7

7 a) Takeuchi, H.; Kato, K.; Denda-Nagai, K.; Hanisch, F.G.; Clausen, H.; Irimura, T. J.

Immunol. Methods. 2002, 270, 199-209. b) Burchell, J. M.; Gendler, S. J.; Taylor-Papadimitriou, J.; Girling, A.; Lewis, A.; Millis, R.; Lamport, D. Cancer Res. 1987, 47, 5476-5482.


La tercera ha sido la menos estudiada. Sin embargo, recientemente, el

grupo de Kun, lleva varios años dedicado al desarrollo de nuevas vacunas contra el

cáncer basadas en la MUC1, observando8 que la glicosilación de la Thr en el

fragmento GSTAP (Glicina-Serina-Treonina-Alanina-Prolina, marcado en rojo en la

secuencia de la página anterior) aumenta de forma sustancial la afinidad de las

nuevas moléculas por un anticuerpo anti-MUC1 llamado SM3.

Lógicamente, y con el fin de diseñar vacunas cada vez más eficaces, es

imprescindible conocer en detalle los factores que gobiernan la interacción entre

el anticuerpo (proteína) y la MUC1. En este sentido, varios autores9,10señalan que

el esqueleto peptídico de la MUC1, con una disposición extendida, puede

favorecer las interacciones anticuerpo-glicoproteína.

En el presente trabajo se pretenden sintetizar los dos glicopéptidos que

se muestran en la Figura 5 con el fin de, en un futuro, poder corroborar esta

hipótesis e intentar racionalizar los resultados obtenidos por el grupo de Kunz. De

esta forma, se sintetizarán los glicopéptidos y sus análogos sin glicosilar, y fuera ya

del ámbito de este trabajo, se estudiará su interacción con distintas lectinas y/o

anticuerpos, permitiéndonos comprobar hasta qué punto la disposición espacial

de la cadena peptídica modula la interacción anticuerpo-glicopéptido para su

reconocimiento celular.

8 Westerlind, U.; Schröder, H.; Hobel, A.; Gaidzik, N.; Kaiser, A.; Niemeyer, C. M.; Schmitt,

E.; Waldmann, H.; Kunz, H., Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 8263-8267. 9 Murray, A.; Spencer, D.I.R.; Missailids, S.; Denton,G.; Price M.R. Peptide Res. 1998, 52, 375-383. 10 Coltart, D.M.; Royyuru A.K.; Williams, L. J.; Glunz P.W.; Sames, D.; Kuduk, S.D.; Schwarz, J.B.; Chen, X-T.; Danishefsky, S.J; Live, D.H. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9833-9844.


Figura 5. Péptidos y glicopéptidos objeto de síntesis y estudio.

2. Antecedentes

11 ANTECEDENTES

En el presente capítulo se describen los procedimientos sintéticos más

habituales para la formación de enlaces peptídicos y glicosídicos, algunos de los

cuales han sido utilizados para la obtención de los glicopéptidos objetivo de este

trabajo. Además, se recoge un breve resumen de la síntesis en fase sólida de

péptidos, así como de los trabajos previos y conclusiones más importantes

obtenidas por nuestro grupo de investigación en este campo.

SÍNTESIS

Formación del enlace peptídico

Un enlace peptídico se forma a partir de los grupos amina y ácido

carboxílico de los residuos implicados. Para ello, se requieren condiciones de

reacción bastante enérgicas ya que a temperatura ambiente simplemente se

generan las correspondientes sales. Por este motivo, es necesaria la previa

activación del grupo carboxilo, haciéndolo más reactivo frente al ataque

nucleófilo de la amina.1

Para dar solución a este problema se han desarrollado diferentes

estrategias y reactivos para aumentar la electrofilia del grupo ácido, que han sido

de gran ayuda en el avance de la investigación en este campo.

En este sentido, y para que se minimicen los procesos de racemización,

el procedimiento más extendido se basa en el empleo de agentes de

acoplamiento, ya que son capaces de generar especies muy reactivas, facilitando

en gran medida la formación del enlace amida (Esquema 1).

Las carbodiimidas son los reactivos de acoplamiento más utilizados en la

síntesis de péptidos convencional. La N,N’-diciclohexilcarbodiiamida (DCC) fue la

primera descrita y todavía hoy sigue siendo la más popular. Sin embargo, uno de

los mayores problemas asociados al uso de este agente de acoplamiento es el

elevado porcentaje de epimerización (en torno a un 10%). Otra de las

1 Herzner, H.; Reipen, T.; Schultz, M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4537.

12 ANTECEDENTES

carbodiimidas más empleadas es la N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC), debido a la

gran solubilidad de las ureas que se forman como subproductos. Cuando se

emplean las carbodiimidas como agentes de acoplamiento, se recomienda la

utilización de aditivos como el 1-hidroxibenzotriazol (HOBt),2 que aceleran la

reacción y reducen el riesgo de racemización. En la Figura 1 se muestran las

estructuras de estos compuestos.

Figura 1. Estructura de las carbodiimidas y aditivos utilizados en la síntesis de péptidos.

En los últimos años han surgido nuevos reactivos que minimizan la

formación de subproductos no deseados a la vez que reducen los tiempos de

reacción, lo que hace que su utilización se haya extendido considerablemente

(Figura 2).

Figura 2. Estructura de algunas sales de fosfonio (BOP, PyBOP) y sales de uronio (HBTU, TBTU)

utilizadas como agentes de acoplamiento.

2 Konig, W.; Geiger, R. Chem. Ber. 1970, 103, 788-798.

13 ANTECEDENTES

La mayoría son sales de fosfonio o uronio que, en presencia de una

base, pueden convertir el carboxilato del aminoácido protegido en una especie

activada. Las más empleadas son el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-

tris(dimetilamino)fosfonio (BOP) y el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxil-

tris(pirrolidin)fosfonio (PyBOP).3 Entre las sales de uronio se encuentran el

hexafluorosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)-dimetilaminometilen]-N-

metilmetanaminio (HBTU)4 y el tetrafluoroborato de N-óxido de N-[(1H-

benzotriazol-1-il)-dimetilaminometilen]-N-metilmetanaminio (TBTU),5 entre los

más comunes.

Esta metodología, basada en los agentes de acoplamiento, ha sido muy

utilizada por nuestro grupo de investigación, en particular el empleo de TBTU y

HBTU, ya que se obtienen buenos rendimientos. Por ello, es el procedimiento que

se empleará en este estudio para la formación del enlace peptídico (Esquema 1).

Esquema 1. Ejemplo de reacción de formación de un enlace peptídico con un agente de

acoplamiento

3 Martínez, J.; Bali, J. P.; Rodríguez, M.; Castro, B.; Magous, R.; Laur, J.; Lignon, M. F. J.

Med. Chem. 1985, 28, 1874-1879. 4 Knorr, R.; Trzeciak, A.; Bannwarth, W.; Gillessen, D. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-

1930. 5 Poulain, R. F.; Tartar, A. L.; Deprez, B. P. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 1495-1498.

14 ANTECEDENTES

Tanto la cadena peptídica creciente, como el aminoácido que se desea

incorporar a ésta, son compuestos bifuncionales que poseen un grupo ácido y un

grupo amino en sus extremos. Para asegurar la formación del enlace amida entre

los dos grupos deseados, evitando reacciones laterales y polimerizaciones

incontroladas, se debe bloquear o proteger convenientemente la amina y el

carboxilo que no se desee que reaccionen. De este modo, en la construcción de la

cadena peptídica, se deben ir alternando pasos de protección, formación de

enlaces amida y desprotección, para liberar los grupos reactivos que van a

participar en la formación del siguiente enlace.

Los grupos protectores de aminas más usuales suelen ser el

9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o el terc-butoxicarbonilo (Boc), que dan lugar a

carbamatos, fácilmente eliminables cuando ya no son necesarios. Los ácidos

carboxílicos se protegen comúnmente en forma de ésteres: terc-butílico (CO2tBu),

alílico (CO2Allyl), bencílico (CO2Bn), etc.

Esto es la base de la síntesis en fase sólida de péptidos que ahora se

desarrollará en mayor profundidad.

Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, solid-phase peptide synthesis)

En 1963 Merrifield describió por primera vez la idea de una síntesis de

péptidos en fase sólida6 (en inglés, SPPS: solid-phase peptide synthesis) y hoy en

día es la manera más habitual y sencilla de obtener péptidos. Este método se basa

en la unión del aminoácido a través del grupo carboxilo terminal a un soporte

insoluble (llamado resina) y la posterior elongación secuencial, aminoácido tras

aminoácido, de la cadena peptídica. El método de síntesis en fase sólida presenta

numerosas ventajas respecto a la síntesis de péptidos en disolución:

• Buenos rendimientos ya que, debido a la fijación del péptido a un soporte

sólido, se pueden emplear excesos de reactivos que se eliminan

fácilmente tras sencillos procesos de lavado y filtrado. No se producen

6 Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154.

15 ANTECEDENTES

pérdidas de péptido puesto que el soporte sólido al que está unido

permanece en el mismo recipiente durante todo el proceso.

• Las operaciones de lavado y filtrado son más sencillas y susceptibles de

automatización.

El crecimiento de la cadena peptídica tiene lugar siempre por el extremo

N-terminal mediante la adición sucesiva de los aminoácidos que tienen el grupo

ácido libre, mientras que el extremo amino y las cadenas laterales están

convenientemente protegidos.

La estrategia de trabajo seguida ha sido la conocida como Fmoc/tBu que

emplea el primero como protector temporal del grupo amino y grupos del tipo

terc-butil para proteger las cadenas laterales de los aminoácidos.

La cadena peptídica se sintetiza sobre un soporte polimérico insoluble

llamado resina por la unión del aminoácido C-terminal. El crecimiento de la

cadena tiene lugar desde el extremo carboxilo hacia el extremo amino del

péptido. El conector entre el soporte polimérico y el primer aminoácido variará

dependiendo del tipo de péptido que se desee obtener (carboxilo, amida,

aldehído, etc.).

El grupo protector del amino se elimina antes de la unión del siguiente

aminoácido. La eliminación del grupo protector Fmoc se realiza en medio básico,

con piperidina. Una vez que el grupo amino se encuentra libre, se une el

aminoácido siguiente, previa activación, al aminoácido anterior formando el

enlace peptídico. El proceso de acoplamiento requiere la activación del grupo

carboxilo del aminoácido entrante de modo que éste sea susceptible de

reaccionar con el grupo amino de la cadena de péptido creciente. Este proceso de

desprotección y acoplamiento se repite tantas veces como sea necesario hasta

completar la secuencia del péptido deseado. Una vez sintetizada la cadena

peptídica, ésta se separa del soporte polimérico y se eliminan los grupos

protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos, habitualmente en una

única etapa

16 ANTECEDENTES

En el Esquema 2 se muestra una visión global de las reacciones que

tienen lugar desde que se introduce la resina en el sintetizador junto a los

aminoácidos hasta la obtención de un péptido.

Esquema 2. Etapas llevadas a cabo en SPPS hasta la obtención de un tetrapéptido.

17 ANTECEDENTES

Formación del enlace O-glicosídico

En la mayor parte de las glicoproteínas, los carbohidratos se encuentran

unidos a la cadena peptídica mediante enlaces O-glicosídicos. Esta incorporación

de la parte carbohidrato al péptido es un paso clave en la obtención de estos

productos y se ha llevado a cabo mediante la síntesis de un building block: un

aminoácido que, previamente glicosilado, se incorpora en el sintetizador

automático para producir el esqueleto peptídico completo de la molécula

objetivo. Otra alternativa sería llevar a cabo la glicosilación directa del aminoácido

deseado que ya forma parte de la cadena peptídica final. Sin embargo, esta última

glicosilación suele darse con bajos rendimientos.

En la formación de un enlace O-glicosídico pueden obtenerse dos

estereoisómeros distintos: los anómeros α y β. En general, para una silla 4C1,

presente en la mayor parte de los monosacáridos, el enlace α tiene el grupo OR

en axial, mientras que en un enlace β-O-glicosídico, éste ocupa la posición

ecuatorial (Figura 3).

Figura 3. Anómeros α y β para un enlace O-glicosílico, en una silla 4C1.

Como ya se ha comentado en el apartado Introducción, el enlace O-

glicosídico entre el GalNAc y el grupo hidroxilo de la L-serina o la L-treonina

muestra generalmente configuración α. Aunque en la bibliografía se han

publicado varias revisiones acerca de la formación de enlaces O-glicosídicos,1,7

a

continuación, se pasa a describir algunas de las metodologías más habituales para

la formación del enlace α-O-glicosídico, con GalNAc.

7 a) Taylor, C. M. Tetrahedron 1998, 54, 11317-11362; b) Boons, G. J. Tetrahedron 1996,

52, 1095-1121; c) Davis, B. G. J. Chem. Soc. Perk. T 1 2000, 2137-2160; d) Arsequell, G.;

Valencia, G. Tetrahedron-Asymmetr. 1997, 8, 2839-2876; e) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg.

Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112.

18 ANTECEDENTES

Método del tricloroacetimidato

Uno de los métodos para obtener mayoritariamente el anómero α es el

desarrollado por Wong y colaboradores,8 que utilizan el tricloroacetimidato como

activador para la glicosilación de un derivado de treonina. Con esta metodología

en dos pasos se forma el enlace α-O-glicosídico mejorando el rendimiento global y

obteniendo los anómeros α y β en proporción 2:1, respectivamente (Esquema 3).

Esquema 3

Otro ejemplo en el que se obtiene mayoritariamente el anómero α a

partir de tricloroacetimidatos es el realizado por el grupo de Toyokuni, para la

serina debidamente protegida, donde la mezcla de anómeros se separa por

cromatografía flash (Esquema 4).9

Esquema 4

8 Payne, R. C.; Ficht S.; Tang S.; Brik A.; Yang Y-Y.; Case D.A.; Wong C-H. J. Am. Chem. Soc.

2007, 129, 13527-13536. 9 Toyokuni, T.; Dean, B.; Hakomori, S. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2673-2676.

19 ANTECEDENTES

Metodología de Schmidt

Otra de las metodologías más extendidas es la desarrollada por el grupo

de Schmidt para la obtención del enlace α-O-glicosídico con GalNAc.10,11

Este método se basa en una adición de tipo Michael, en medio básico,

de un alcohol al 2-nitro-D-galactal o 2-nitro-D-glucal adecuadamente protegidos,

formándose los correspondientes productos de glicosilación (Esquema 5).

Esquema 5

En general, este método permite obtener mayoritariamente el anómero

α, si bien, el control de la selectividad depende de la base empleada. Así, se

obtiene una alta selectividad α con bases fuertes como tBuOK, mientras que las

bases tipo amina, como NEt3, favorecen la formación del anómero β.

Metodología de Koenigs-Knorr

El método Koenigs-Knorr es uno de los procedimientos más antiguos de

glicosilación.12

Se basa en el empleo de haluros derivados de carbohidratos, como

grupos dadores, y del alcohol correspondiente, como grupo aceptor. Un ejemplo

de glicosilación α, mediante la metodología Koenigs-Knorr, es el utilizado por

Liebe y Kunz en la síntesis de un antígeno asociado a tumores (Esquema 6).13

Este

10

Das, J.; Schmidt, R. R. Eur. J. Org. Chem. 1998, 1609-1613. 11

Kogan, T. P.; Gaeta, F. C. A. Synthesis 1988, 706-707. 12

Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber. 1901, 34, 957-981. 13

Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.

20 ANTECEDENTES

procedimiento permite el escalado a gramos fácilmente con rendimientos

elevados.

+

CO2tBu

HO NHFmoc

O

AcO

AcO

BrN3

OAc O

AcO

AcON3

OAc

O

NHFmoc

CO2tBu

Me

MeAgClO4/Ag2CO3 (1:11)CH2Cl2/tolueno (10:9)

47%

Esquema 6

Este será el procedimiento experimental que se ha desarrollado en el

presente trabajo y que dará lugar a la síntesis de los building blocks que aparecen

incluidos en los compuestos 3 y 4, ello es debido a la baja reproducibilidad de la

metodología anterior, ya que al obtenerse un nitro derivado debe llevar asociado

un paso de hidrogenación a un grupo amino que se realiza con amalgama de

níquel platinado con los riesgos que ello supone.

TRABAJOS PREVIOS

Ya se ha comentado en la Introducción la gran importancia de las

glicoproteínas en los procesos biológicos.

Es conocido que la α-O-glicosilación de proteínas tiene un profundo

efecto de organización sobre el esqueleto del péptido, forzándolo a una

conformación extendida.14,15

Varias investigaciones han intentado encontrar una

explicación para este hecho, puesto que para discernir cómo las glicoproteínas

interaccionan con sus blancos biológicos, es esencial mejorar nuestra

comprensión de los mecanismos que permiten que el carbohidrato modifique el

equilibrio conformacional del esqueleto peptídico.

En la actualidad, esta conformación extendida de la cadena peptídica se

explica mediante la formación de un enlace de hidrógeno que tiene lugar entre el

NH del GalNAc y el oxígeno carboxílico del aminoácido al que está unido, como se

14

Coltart, D. M.; Royyuru, A. K.; Williams, L. J.; Glunz, P. W.; Sames, D.; Kuduk, S.; Schwarz,

J. B.; Chen, X.-T.; Danishefsky, S. J.; Live, D. H. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9833-9844. 15

Pratt, M. R.; Bertozzi, C. R. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58-68.

21 ANTECEDENTES

propone en el estudio llevado a cabo por Danishefsky y col.1b

(Figura 4a). Este

enlace de hidrógeno “bloquea” la orientación del carbohidrato con respecto al

esqueleto peptídico.16

a b

Figura 4. a) Interacciones entre el GalNAc y el residuo de treonina de la cadena peptídica a través de

enlaces de hidrógeno. b) Interacciones entre el GalNAc y el residuo de serina de la cadena peptídica a

través de moléculas de agua.

Sin embargo, y atendiendo a la geometría, el enlace de hidrógeno

propuesto entre el GalNAc y el aminoácido al que está unido presenta valores

fuera del intervalo de un enlace de hidrógeno convencional.17

Debido a esta controversia, nuestro grupo de investigación se planteó

demostrar si esta interacción es la responsable o no de la conformación extendida

del esqueleto peptídico.

16

a) Mimura, Y.; Inoue, Y.; Maeji, N. J.; Chûjô, R. Int. J. Pept. Prot. Res. 1989, 34, 363-368;

b) Shuman, J.; Qiu, D.; Koganty, R. R.; Longenecker, B. M.; Campbell, A. P. Glycoconjugate

J. 2000, 17, 835-848; c) Tachibana, Y.; Monde, K.; Nishimura, S.-I. Macromolecules 2004,

37, 6771-6779. 17 Corzana, F.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.; Asensio, J. L.; Jiménez-Barbero, J.; Peregrina,

J. M.; Avenoza, A. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 14640-14648.

22 ANTECEDENTES

Los resultados experimentales y teóricos obtenidos en este estudio

apuntan en la dirección de la existencia de una molécula de agua puente entre las

partes carbohidrato y peptídica e indican que las moléculas de agua circundantes

son también esenciales para mantener la conformación bien definida (Figura 4b).

Aunque estos resultados son para el glicopéptido modelo más pequeño, la

existencia de tales interacciones carbohidrato-péptido a través de moléculas de

agua puente podría explicar las características particulares de las glicoproteínas

tipo mucina.

Tras obtener estas conclusiones, se decidió abordar la molécula análoga

de treonina, ya que es conocido que la rotación alrededor de la cadena lateral, en

α-O-D-GalNAc-L-Thr está restringida, característica que no se observa en sus

análogos de serina.18

El estudio estructural llevado a cabo por nuestro grupo19

indica que no

solo la rotación de la cadena lateral está restringida en los derivados de treonina

sino que, más importante, se produce un cambio en la orientación del

carbohidrato (Figura 5) lo que podría conllevar unas implicaciones biológicas

asociadas a dicha disposición espacial.

18

a) Naganagowda, G. A.; Gururaja, T. L.; Satyanarayana, J.; Levine, M. J. J. Pept. Res. 1999,

54, 290-310. b) Kindahl, L.; Sandström, C.; Norberg, T.; Kenne, L. Carbohyd. Res. 2001, 336,

319-323. c) Kogelberg, H.; Solis, D.; Jiménez-Barbero, J. Curr. Opin. Struct. Biol. 2003, 13,

646-653. 19 Corzana, F.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.;García de Luis, M.; Asensio, J. L.; Jiménez-

Barbero, J.; Peregrina, J. M.; Avenoza, A. J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 9458-9467.

23 ANTECEDENTES

Figura 5. Diferentes orientaciones del carbohidrato según el aminoácido al que se una:

disposición casi paralela en Ser y perpendicular en Thr.

Como la orientación tridimensional del residuo GalNAc en distintos

glicopéptidos previamente estudiados17,20 difiere considerablemente cuando el

aminoácido al que está unido es serina o treonina (Figura 5) y, teniendo en cuenta

que estas diferencias estructurales entre serina y treonina pueden jugar un papel

decisivo en la actividad biológica, se decidió, como continuación lógica del

trabajo, estudiar en detalle los factores que están directamente implicados en

esta alteración del comportamiento conformacional. Por tanto, en el presente

trabajo se ha abordado, en primer lugar, la síntesis de la región de la mucina

MUC1 correspondiente a la secuencia GSTAP tanto sin glicosilar (compuesto 1),

como glicosilado con α-O-GalNAc (compuesto 2). En segundo lugar, se

sintetizaron los análogos de GSSAP (compuesto 3 y 4) para conocer el efecto

producido al glicosilarse y los efectos de la orientación del carbohidrato en cada

uno de los derivados.

20

a) Tachibana, Y.; Fletcher, G. L.; Fujitani, N.; Tsuda, S.; Monde, K.; Nishimura, S.-I.

Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 856-862. b) Yeh, Y.; Feeney, R. E. Chem. Rev. 1996, 96,

601-617. c) Ben, R. N. ChemBioChem 2001, 2, 161-166.

3. Discusión de

resultados

27 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Como ya se ha comentado en el capítulo Introducción, el objetivo de

esta investigación es la síntesis de la secuencia GSTAP (glicina-serina-treonina-

alanina-prolina), GSSAP (glicina-serina-serina- alanina-prolina) y sus derivados

glicosilados (Figura 1), ya que es uno de los epítopos principales de la MUC1.

Figura 1. Péptidos y glicopéptidos objeto de síntesis.

A. Síntesis de los péptidos 1 y 2

La síntesis de los compuestos 1 y 2 se llevó a cabo mediante la

metodología de SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) que se ha explicado en

el capítulo Antecedentes. Por ello, ahora abordaremos el tema desde un punto de

vista más aplicado.

La elección de la resina (Figura 2) es una etapa muy importante ya que,

por un lado, determina cómo se va a obtener el extremo C-terminal (en nuestro

caso -CONH2) y, por otro, condiciona la etapa de cleavage (liberación del péptido)


que, en la mayoría de los casos desprotege simultáneamente las cadenas laterales

de los aminoácidos. La activación de la resina, que es el paso siguiente, consiste

en la liberación del grupo protector del grupo amino, en nuestro caso Fmoc, con

piperidina (base) en DMF y así tener lista la resina para acoplar el primer

aminoácido.

Figura 2. Resina utilizada en SPPS (Rink Amide MBHA resin, Novabiochem®)

A continuación, siguiendo la estrategia de Fmoc/tBu, se añade la prolina

ya que es el primer aminoácido que se quiere acoplar, protegido el grupo amino

en forma de –NHFmoc. Para que la unión sea efectiva se añade HBTU como

pegador y diisopropiletilamina (DIEA) como base en dimetilformamida (DMF)

como disolvente. Hay que tener en cuenta que se trabaja con 10 equivalentes de

amina por cada equivalente de resina.

Seguidamente, para que el proceso continúe, hay que desproteger el

grupo N-terminal de forma análoga a la desprotección de la resina.

El proceso de acoplamiento y desprotección de Fmoc se repite tantas

veces como aminoácidos se acoplen; en nuestro caso, al sintetizar un

pentapéptido se repetirá cinco veces este ciclo.

Posteriormente, como queda el extremo del péptido como un amino

terminal, se procede a la acetilación del último residuo, en nuestro caso de la

glicina con anhídrido acético y piridina (Figura 3).


Figura 3. Acetilación del último residuo de la cadena peptídica.

Finalmente, se procede a la liberación o cleavage del péptido de la

resina mediante la combinación de ácido trifluoroacético (TFA), triisopropilsilano

(TIS) y agua (Figura 4). Tras la adición de éter frío precipita el péptido 1 que

finalmente se purifica con un cartucho C-18 de fase reversa.

Figura 4. Proceso de liberación del péptido (cleavage).

Cuando se introduce como building block un glicosil-aminoácido, los

grupos hidroxilo del carbohidrato vienen protegidos en forma de acetatos, lo que

implica una etapa de liberación de dichos acetatos extra que consiste en una

mezcla de MeO-/MeOH que se añade justo antes de su purificación. Además, al no

tratarse de un aminoácido sencillo, el tiempo de acoplamiento en el sintetizador

se ve incrementado para favorecer su unión en la cadena peptídica.

En el apartado Experimental se encuentran las especificaciones de este

proceso para cada uno de los péptidos y glicopéptidos de estudio. El resumen de

toda la síntesis del compuesto 1 queda reflejado en el Esquema 1.


Esquema 1. Síntesis en fase sólida del péptido 1.


B. Síntesis de los glicopéptidos 3 (GST*AP) y 4 (GSS*AP)

La estrategia sintética seguida para la obtención de los

pentaglicopéptidos 3 y 4 fue idéntica para ambos y consistió en la síntesis del

building block correspondiente, acondicionando convenientemente el

carbohidrato y el aminoácido para llevar a cabo el acoplamiento de ambos

mediante la reacción de Koenigs-Knorr.

B.1. Síntesis de los building blocks

Los glicosil-aminoácidos 5 y 6 que aparecen en la Figura 5 son el objetivo

de este apartado. Éstos serán los que se utilicen en la SPPS para obtener los

compuestos 3 y 4, respectivamente.

Figura 5. Building blocks utilizados en la síntesis de los compuestos 3 y 4.

B.1. a. Preparación del carbohidrato

El galactal 7 se hace reaccionar con nitrato de cerio y amonio (CAN) y

azida de sodio (NaN3) bajo atmósfera inerte, una metodología1 que ha

1 a) Lemieux, R. U.; Ratcliffe, R. M. Can. J. Chem. 1979, 57, 1244. b) Heggemann, C.; Budke, C.; Schomburg, B.; Majer, Z.; Wißbrock, M.; Koop, T.; Sewald, N. Amino Acids 2010, 38, 213-222.


demostrado ser bastante eficaz en este tipo de derivados, ya que tras su

purificación se obtiene el compuesto 8 con un 81% de rendimiento (Esquema 2).

Esquema 2

Tras hacer la columna al crudo de reacción se obtiene el compuesto 8

como mezcla de varios de varios isómeros posibles, pero al hacerlo reaccionar con

un LiBr se obtiene el derivado que tiene el bromo en α (Esquema 3).2 Así, se

obtiene la bromoazida (compuesto 9), que es sensible a la humedad y a la luz.

Esquema 3

B.1. b. Preparación del aminoácido

A continuación, se prepara el aminoácido con los grupos funcionales

dispuestos de tal forma que la reacción con el producto 9 sea óptima.

Utilizaremos como ejemplo la treonina teniendo en cuenta que para la serina se

2 Liu, M.; Young Jr, V. G.; Lohani, S.; Live, D.; Barany, G. Carbohyd. Res. 2005, 340, 1273-

1285.


actúa exactamente igual, apareciendo su descripción detallada en la parte

Experimental.

Se parte de treonina comercial (compuesto 10) cuyo grupo amino se

protege con Fmoc y el alcohol con tritilo (Trt). Como se quiere tener libre el grupo

alcohol para realizar la unión al carbohidrato, hay que realizar una protección

ortogonal. Por ello, se protege el grupo ácido carboxílico en forma de éster

carboxílico mediante una sencilla reacción con tricloroacetimidato de terc-butilo

bajo atmósfera de argón (Esquema 4).

Esquema 4

El siguiente paso de la síntesis fue la desprotección del –OH del derivado

de treonina 11 con triisopropilsilano y ácido trifluoroacético en diclorometano

(Esquema 5).

Esquema 5

B.1. c. Acoplamiento mediante Koenigs-Knorr

Una vez que ya se tienen los productos 9 y 12, se sigue la metodología

descrita por Koenigs-Knorr 3 que emplea derivados de plata para que la reacción

3 a) Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber. 1901, 34, 957-981; b) Liebe, B.; Kunz, H. Angew.

Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.


tenga lugar con un rendimiento aceptable, como se ilustra en el Esquema 6,

obteniéndose el precursor del building block 5.

Esquema 6. Reacción de Koenigs-Knorr

A continuación, es necesario reducir la azida del carbohidrato a amina y

posteriormente, acetilar. El primer paso se realiza mediante una disolución de

trimetilfosfina 1M y agua,4 desechando dos métodos que antes se habían probado

y fueron menos eficaces dando peores rendimientos (trifenilfosfina5 en lugar de

PMe3 o ácido tioacético para reducir y acetilar en un solo paso6).

Finalmente, el tratamiento con anhídrido acético y piridina y una

posterior etapa de desprotección del tBu con TFA y CH2Cl2 permiten obtener el

compuesto 5, que tras realizar una purificación por columna cromatográfica, se

consiguió aislar con un rendimiento del 64 % (Esquema 7).

4 Avenoza, A.; Peregrina, J. M.; San Martín, E. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 6413-6416. 5 Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154. 6 Elofsson, M.; A. Salvador, L.; Kihlberg, J. Tetrahedron 1997, 53, 369-390.


Esquema 7

El producto 5 es el building block adecuado para poder obtener el

glicopéptido 3, mediante síntesis en fase sólida.

En los Esquemas 8 y 9 se muestra un resumen de la síntesis de los dos

building blocks que se necesitan para llevar a cabo la SPPS de nuestros

glicopentapéptidos 3 y 4.

B.2. Síntesis en fase sólida incorporando glicoaminoácidos

Finalmente, se llevó a cabo la SPPS de forma análoga a la descrita en el

apartado A de este mismo capítulo. Lo único que hay que tener en cuenta es que

al tratarse de compuestos que se obtienen en la escala del miligramo, el exceso

que se debe utilizar en el sintetizador no es de 10 equivalentes por equivalente de

resina, sino que se baja hasta 5 equivalentes/equivalente de resina. Además, con

el objetivo de que el acoplamiento sea más efectivo, la etapa de acoplamiento del

glicosil-aminoácido aumenta hasta 1 h. Se necesita una etapa adicional para la

eliminación de los grupos acetato del carbohidrato, mediante una mezcla

MeO-/MeOH. Así, se completaría la síntesis de los compuestos 3 y 4.

Un esquema general de la SPPS de ambos glicopéptidos se muestra en el

Esquema 10.


Esquema 8. Ruta sintética del glicoaminoácido 5 (derivado de treonina)


Esquema 9. Ruta sintética del glicoaminoácido 6 (derivado de serina)


R

R'

FmocHN COOHPro

Ala

A. Desprotecciónde la resina

H3CO O

HN

Nle

O HN

O

O

1 mL piperidina3 mL DMF H3CO O

NH2

Nle

O HN

FmocHN COOH

FmocHN COOH

FmocHN COOH

H3CO O

NH

Nle

O HN

O

Pro

N

O

NH

Ala

Ser

OHN

R' R

Thr

O

NH

OH

FmocHN COOH

Gly

O

H2N

SerGly

NH2

O

Pro

N

O

NH

Ala

OHN

R' R

Thr

O

NH

OHO

AcHN

SerGly

1. 1 mL Ac2O, 2 mL piridina, 2h2. 1.9 mL TFA, 50 L TIS, 50 L H2O, 1h

178 mg (0.1 mmol NH2)

Rink Amide MBHA resin

B. Acomplamiento ydesprotección Fmoc

C. Acetilación de residuos finalesy liberación de la resina

SPPS

a) 3.40 mg HBTU, 1 mL DIEA, 2 mL DMFb) 1 mL piperidina, 3mL DMF

B

= Polímero (estireno - 1% DVB)

Nle = Norleucil

5: R = Me, R' = -O-GalNAc(OAc)36: R = H, R' = -O-GalNAc(OAc)3

3': R = Me, R' = -O-GalNAc(OAc)34': R = H, R' = -O-GalNAc(OAc)3

NH2

O

Pro

N

O

NH

Ala

OHN

R' R

Thr

O

NH

OHO

AcHN

SerGly

2 mL MeOH

1 mL MeO-/MeOHD. Desprotección de los grupos

-OH del carbohidrato

3: R = Me, R' = -O-GalNAc4: R = H, R' = -O-GalNAc

Esquema 10. Síntesis en fase sólida de los glicopéptidos 3 y 4.

4. Conclusiones

41 CONCLUSIONES

Se ha llevado a cabo la síntesis de una de las secuencias más

importantes de la mucina MUC1, el epítopo GSTAP (1), así como del derivado con

serina GSSAP (2). También se han obtenido los dos análogos glicosilados en el

tercer residuo, es decir, GST*AP (3) y GSS*AP (4) (* = α-O-GalNAc).

La síntesis se ha realizado mediante una metodología en fase sólida

donde el primer paso ha sido la preparación del building block a partir del

carbohidrato GalNAc y el aminoácido correspondiente, usando la reación de

Koenigs-Knorr. Posteriormente, este building block se incorporó al sintetizador

automático de pétidos utilizando Fmoc como grupo protector de amina y TBTU

como agente de acoplamiento para la formación del enlace amida.

De este modo, se ha conseguido sintetizar los pentapéptidos 1 y 2 y los

glicopentapéptidos 3 y 4 (Figura 1), en la escala del miligramo. Se obtuvieron 20

mg de los compuestos 1 y 2 mientras que de los derivados glicosidados 3 y 4 se

consiguieron 19 y 17 mg, respectivamente.

Figura 1. Péptidos y glicopéptidos objeto de estudio.

42 CONCLUSIONES

Todos los compuestos que aparecen en la Figura 1 fueron caracterizados

por técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y análisis de masas.

Posteriormente a este trabajo, se realizará el análisis conformacional de los

glicopéptidos sintetizados combinando resonancia magnética con cálculos de

Dinámica Molecular. También se pretende estudiar su interacción con distintas

lectinas y/o anticuerpos, como ya se ha hecho en el grupo, permitiendo

comprobar hasta qué punto la disposición espacial de la cadena peptídica y del

carbohidrato modula la interacción anticuerpo-glicopéptido.

Del mismo modo, en un futuro, se pretenderá llevar a cabo la síntesis,

estudio conformacional y de afinidad biológica cuando está asociado a otro

epítopo de reconocimiento de la MUC1, la secuencia PDTR, mediante un trabajo

similar al anteriormente descrito.

5. Experimental

45 EXPERIMENTAL

Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y

13C se realizaron en un

espectrómetro Bruker Avance-400 para todos los compuestos. Los

desplazamientos químicos se expresaron en ppm en la escala δ y las constantes

de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron como disolventes deuterados cloroformo,

con TMS como referencia interna y agua deuterada, con referencia interna del

propio disolvente.

Los análisis de electrospray-espectrometría de masas (ESI-MS) se

realizaron en un equipo microTOF-Q-BRUKER con fuente Multi Mode, ionización

ESI+APCI y se registraron en modo de ión positivo.

La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel

(Polychrom SI F254) sobre soporte de poliéster y para su visualización se utilizó luz

ultravioleta, disolución reveladora de H2SO4 al 5% en etanol y revelador de ácido

fosfomolíbdico en etanol.

La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04-0.06

mm (230-240 mesh).

Todas las reacciones se llevaron a cabo empleando disolventes secos.

La síntesis en fase sólida se realizó en un sintetizador de péptidos Model

433A Peptide Synthesizer de Applied Biosystems, cuyo tratamiento de datos se

hizo con el software SynthAssist 2.0.

46 EXPERIMENTAL

Nitrato de 3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi-αααα-D-galactopiranosa (8)

Se añaden en un schlenk nitrato de cerio y amonio (30.20 g, 55.1 mmol)

y azida de sodio (1.79 g, 27.5 mmol) bajo atmósfera inerte a -20 °C. Se adiciona

gota a gota una disolución de tri-O-acetil-D-galactal (5.00 g, 18.6 mmol),

compuesto 7, en CH3CN seco (80 mL) dejándose 10 h en agitación. Se extrae con

éter (50 mL) y con H2O (3 x 50 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con

Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía de

columna sobre gel de sílice (hexano/AcOEt, 6:4) obteniéndose el compuesto 8

(2.622 g, 81%) como un aceite amarillo.

1H RMN (400 MHz, CD3Cl) δ (ppm): 2.03, 2.10, 2.18 (3s, 9H, 3CH3), 3.82 (q, 1H, J2,3

= 10.8Hz, H-2), 5.08 (q, 1H, J3,4 = 3.2 Hz, H-3), 5.42 (m, 1H, H-4), 5.60 (d, 1H, J1,2 =

9.0 Hz, H-1)

47 EXPERIMENTAL

αααα-D-Tri-O-acetil-2-azido-1-bromo-2-desoxigalactosa (9)

Se hace reaccionar bajo atmósfera inerte y durante 8 h una disolución

del compuesto 8 (2.62 g, 6.68 mmol) en CH3CN seco (50 mL) con LiBr (2.90 g, 33.4

mmol). Se añade CH2Cl2 (100 mL) y H2O (50 mL), extrayéndose la fase orgánica con

H2O (3 x 50 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4 anhidro, se

filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía de columna sobre gel

de sílice en hexano/AcOEt (de 8:2 a 6:4) obteniéndose el compuesto 9 (2,03 g,

77%) como un aceite amarillo.

1H RMN (400 MHz, CD3Cl) δ (ppm): 2.02, 2.04, 2.14 (3s, 9H, 3CH3), 3.96 (q, 1H, J2,3

= 10.5 Hz, H-2), 4.48 (m, 1H, H-5), 5.33 (q, 1H, J3,4 = 3.25 Hz, H-3), 5.49 (q, 1H, J4,5 =

2.7 Hz, H-4), 6.47 (d, 1H, J1,2 = 4.0 Hz, H-1)

48 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Thr(OTrt)-tBu (10)

El compuesto 10 (3.00 g, 5.14 mmol) se disuelve en una mezcla

CH2Cl2/THF 4:1 (10:2.5 mL) bajo atmósfera inerte. Se adiciona 2,2,2-

tricloroacetimidato de terc-butilo (4.49 g, 20.55 mmol) dejando en agitación 10h.

Después, se añade AcOEt (50 mL) y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 al 10%

(2 x 100 mL) y NaCl saturado (1 x 100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se

seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por

cromatografía de columna sobre gel de sílice en proporción hexano/AcOEt, 8:2

obteniéndose el compuesto 11 (2.81 g, 87%), como un sólido blanco.

1H RMN (400 MHz, CD3Cl) δ (ppm): 1.38 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3 Thr), 1.53 (s, 9H,

tBu),

2.06–2.20 (m, 9H, Ac), 3.67 (dd, 1H, J = 11.5 Hz, 3.7 Hz, H2S), 4.10–4.15 (m, 2H, CH2

Fmoc), 4.27–4.50 (m, 6H, Hα Thr, Hβ Thr, CHFmoc, H5S, 2 H6S), 5.14 (d, 1H, J = 3.6 Hz, H1S),

5.37 (m, 1H, H3S), 5.50 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H4S), 7.33–7.44, 7.65–7.67, 7.78–7.80 (m,

8H, Fmoc)

13

C RMN (100 MHz, CD3Cl) δ(ppm): 19.3 (Cγ Thr), 21.0, 21.0, 28.7 (Ac), 28.3 (tBu),

47.8 (CHFmoc), 58.1 (C2S), 59.6 (Ca Thr), 62.2 (CH2 Fmoc), 67.4 (C4S), 67.6 (C5S), 67.9 (C6S),

68.4(C3S), 76.7 (Cβ Thr), 83.3 (CtBu), 99.6 (C1S), 120.3, 120.3, 125.3, 125.3, 125.7,

125.7, 127.5, 128.0, 141.7, 141.7, 144.2, 144.2 (arom.), 157.4, 169.5, 169.6, 170.2,

170.8 (C=O).

49 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Thr-tBu (12)

El compuesto 11 (1.78 g, 2.84 mmol) se disuelve en CH2Cl2 (100 mL). Se

añade tetraisopropilsilano (5 mL) y ácido trifluoroacético (1 mL). Después de 2h de

reacción, se purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice

(hexano/AcOEt, 1:1), obteniéndose el compuesto 12 (0,345 g, 82%) como un

sólido blanco. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los

descritos en la bibliografía.1

1 Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621.

50 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Thr(αααα-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-tBu (13)

Se añade el compuesto 12 (345 mg, 0.868 mmol) con tamiz molecular,

tolueno (5 mL) y CH2Cl2 (8 mL) bajo atmósfera de argón y la mezcla se agita

durante 1h. Se baja la temperatura a -5°C y se añade Ag2CO3 (263 mg, 0.955

mmol) y AgClO4 (23 mg, 0.113 mmol), manteniéndose la agitación durante 1 h. Se

añade el compuesto 9 (342.15 mg, 0.868 mmol) disuelto en una mezcla de

tolueno/CH2Cl2 1:1 (20 mL). Después de 8 h de reacción, se filtra en tierra de

diatomeas, se evapora y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 saturado (1 x 100

mL) y H2O (2 x 100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4

anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por columna sobre gel de

sílice (hexano/AcOEt, 6.5:3.5) obteniéndose el compuesto 13 (376 mg, 61%) como

una espuma blanquecina. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son

idénticos a los descritos en la bibliografía.2

2 Elofsson, M.; A. Salvador, L.; Kihlberg, J. Tetrahedron 1997, 53, 369-390.

51 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Thr(αααα-O-D-tri-O-acetil-N-acetilgalactosaminil)-tBu (5)

Sobre el compuesto 13 (387 mg, 0.545 mmol) se añade una disolución

1M de PMe3 (1.09 mL, 1.09 mmol) y H2O (20 µL, 1.11 mmol), dejándose con

agitación durante 3 h. Se evapora la disolución y se añade Ac2O (3 mL) y piridina (6

mL). Se deja reaccionar durante 2h y se evapora. Se añade TFA (2.5 mL) en CH2Cl2

(2.5 mL). El residuo se purifica por columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 9:1)

obteniéndose el compuesto 5 (258 mg, 64%) como un sólido blanco. Sus

propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los descritos en la

bibliografía.2

52 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Ser(OTrt)-tBu (15)

El compuesto 14 (2.00 g, 3.51 mmol) se disuelve en una mezcla

CH2Cl2/THF 4:1 (10:2.5 mL) bajo atmósfera inerte. Se adiciona 2,2,2-

tricloroacetimidato de terc-butilo (3.07 g, 14.04 mmol) dejando en agitación 10h.

Después, se añade AcOEt (50 mL) y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 al 10%

(2 x 100 mL) y NaCl saturado (1 x 100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se

seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por

cromatografía de columna sobre gel de sílice en proporción hexano/AcOEt, 8:2

obteniéndose el compuesto 15 (1.91 g, 87%), como una espuma blanquecina. Sus

propiedades físicas y datos espectroscópicos son iguales a los descritos en la

bibliografía.1

53 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Ser-tBu (16)

2t

El compuesto 15 (1.43 g, 2.29 mmol) se disuelve en CH2Cl2 (100 mL) y, a

continuación, se añade tetraisopropilsilano (5 mL) y ácido trifluoroacético (1 mL).

Tras 2 h de reacción, se purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice

(hexano/AcOEt, 1:1), obteniéndose el compuesto 16 (0.720 g, 82%), como un

sólido blanco. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los

descritos en la bibliografía.1

54 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Ser(αααα-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-tBu (17)

Se añade el compuesto 16 (650 mg, 1.69 mmol) y tamiz molecular, en

una disolución de tolueno (5 mL) y CH2Cl2 (8 mL), bajo atmósfera de argón y la

mezcla se agita durante 1 h. Se baja la temperatura a -5°C y se añade Ag2CO3 (512

mg, 1.86 mmol) y AgClO4 (46 mg, 0.22 mmol), manteniéndose la agitación durante

1 h. Se añade el compuesto 9 (342 mg, 1.69 mmol) disuelto en una mezcla de

tolueno/CH2Cl2 1:1 (20 mL). Después de 8h, se filtra en tierra de diatomeas, se

evapora y se extrae la fase orgánica con NaHCO3 saturado (1 x 100 mL) y H2O (2 x

100 mL). El conjunto de las fases orgánicas se seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y

se evapora. El residuo se purifica por columna sobre gel de sílice (hexano/AcOEt,

6.5:3.5) obteniéndose el compuesto 17 (853 mg, 71%) como una espuma

blanquecina. Sus propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los

descritos en la bibliografía . 2

55 EXPERIMENTAL

Fmoc-L-Ser(αααα-O-D-tri-O-acetil-N-acetilgalactosaminil)-tBu (6)

Sobre el compuesto 17 (387 mg, 0.556 mmol) se añade una disolución

1M de PMe3 (1.09 mL, 1.09 mmol) y H2O (0.02 mL, 1.11 mmol), dejándose con

agitación durante 3 h. Se evapora la disolución y se añade Ac2O (3 mL) y piridina (6

mL). Se deja reaccionar durante 2h y se evapora. Se añade TFA (2.5 mL) en CH2Cl2

(2.5 mL). El residuo se purifica por columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 9:1)

obteniéndose el compuesto 6 (253 mg, 64%) como un sólido blanco. Sus

propiedades físicas y datos espectroscópicos son idénticos a los descritos en la

bibliografía. 2

56 EXPERIMENTAL

Procedimiento general para la obtención de péptidos y

glicopentapéptidos por SPPS.

En el reactor tipo Vessel del sintetizador automático de péptidos se

introduce la resina Rink Amide MBHA de Novabiochem® (178 mg, 0.1 mmol de

NH2). En los diferentes cartuchos se introduce 1 mmol del correspondiente

aminoácido o glicosil-aminoácido convenientemente protegidos.

El proceso se inicia lavando la resina con una disolución al 22% de

piperidina en N-metilpirrolidona (NMP) durante 10 minutos. Posteriormente, el

equipo expulsa el cartucho de iniciación y añade al reactor el del primer

aminoácido junto con DIEA (1 mL), HBTU (3.4 mg) y DMF (2 mL). Después de 10

min, hace lavados sucesivos con piperidina (1 mL) y DMF (3 mL) durante 30 min.

El proceso continúa con la expulsión del cartucho cogiendo el siguiente,

repitiéndose el proceso tantas veces como (glicosil)aminoácidos haya para

acoplar. Cuando se opera con un glicosil-aminoácido, el tiempo de acoplamiento

se eleva a 60 min. Por último, se retira la resina del reactor y se introduce en un

tubo de plástico añadiéndose piridina (1 mL) y Ac2O (2 mL) manteniéndose la

agitación durante 2 h. A continuación, se filtra y se lava con DMF y CH2Cl2.

Seguidamente, se añade TFA (1.90 mL), TIS (50 µL) y H2O (50 µL) y se

deja agitando durante 2 h. Transcurrido este tiempo, se añade éter frío a la

mezcla, observándose la precipitación del péptido. Seguidamente, se filtra

lavándose con éter. El sólido se desecha y se lava con H2O, recogiéndose esta

disolución acuosa para obtener, tras la purificación por un cartucho C-18, el

péptido o glicopéptido deseado.

Si se trata de un glicopéptido, antes de la purificación se añade MeOH (2

mL) y una mezcla 0.5 M en MeO-/MeOH (1 mL) en agitación durante 1h. A

continuación, se añade resina Dowex®, que previamente ha sido lavada con DMF

57 EXPERIMENTAL

y CH2Cl2, hasta que se comprueba que el pH es neutro. Finalmente, se filtra y se

lava con H2O, obteniéndose el glicopéptido tras su evaporación.

En la Imagen 1 se puede observar el modelo utilizado para llevar a cabo

la SPPS así como las diferentes partes y reactivos de las que dispone.

Imagen 1. Fotografía del dispositivo instrumental Model 433A Peptide Synthesizer de Applied

Biosystems, utilizado para la síntesis de péptidos en el presente trabajo.

58 EXPERIMENTAL

N-Acetil- L-glicinil- L -serinil- L - treoninil- L alaninil- L -prolinamida

Ac-L-Gly-L-Ser- L-Thr- L-Ala-L-Pro-CONH2 (1)

Siguiendo la metodología general para la obtención de síntesis de

péptidos en SPPS, se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1mmol),

Ser(OtBu)-Fmoc (383 mg, 1 mmol), Thr(O

tBu)-Fmoc (341 mg, 1 mmol), Ala-Fmoc

(311 mg, 1 mmol) y Pro-Fmoc (337 mg, 1 mmol) obteniéndose el péptido 1.

HRMS (ESI) (m/z) 473.2354 [M+H]+; calculado C19H33N6O8

+: 473.2315

1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm): 1.19 (d, 3H, J = 6.4 Hz, MeThr), 1.35 (d, 3H, J = 7.1

Hz, MeAla), 1.88 – 1.97 (m, 1H, Hγ Pro ), 1.98 – 2.08 (m, 5H, Ac, Hβ Pro, Hγ Pro), 2.29 (m,

1H, Hβ Pro), 3.65 (dt, 1H, J = 10.1, 6.7 Hz, Hδ Pro), 3.75 – 3.92 (m, 3H, 2Hβ Ser , Hδ Pro),

3.96 (s, 2H, 2Hα Gly), 4.17 – 4.25 (m, 1H, Hβ Thr), 4.32 – 4.40 (m, 2H, Hα Pro, Hα Thr),

4.53 (t, 1H, J = 5.5 Hz, Hα Ser), 4.60 (q, 1H, J = 7.0 Hz, Hα Ala).

13C RMN (100 MHz, D2O) δ(ppm): 15.4 (CH3 Ala), 18.8 (CH3 Thr), 21.7 (CH3CO), 24.6

(Cβ Pro), 29.5 (Cγ Pro), 42.5(CGly), 47.8 (Cδ Pro), 55.4 (Cα Ser), 58.9 (Cα Thr), 60.3 (Cα Pro),

61.0 (Cβ Ser), 66.9 (Cβ Thr), 171.2, 171.9, 172.2, 172.8, 174.9, 177.0 (6 CO).

59 EXPERIMENTAL

N-Acetil- L-glicinil- L -serinil- L - serinil- L alaninil- L -prolinamida

Ac-L-Gly-L-Ser- L-Ser- L-Ala-L-Pro-CONH2 (2)

2


péptidos en SPPS, se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol),

Ser(OtBu)-Fmoc (383 mg, 1 mmol), Ser(O

tBu)-Fmoc (383 mg, 1 mmol), Ala-Fmoc

(311 mg, 1 mmol) y Pro-Fmoc (337 mg, 1 mmol) obteniéndose el péptido 2.

HRMS (ESI) (m/z) 481.2005 [M+Na]+; calculado C18H30N6O8 Na

+: 481.2017

1H RMN (400 MHz, D2O) δ (ppm): 1.33 (d, 3H, J = 7.1 Hz, MeAla), 1.85 – 1.96 (m, 1H,

Hγ Pro ), 1.96 – 2.07 (m, 5H, Ac, Hβ Pro, Hγ Pro), 2.20 – 2.32 (m, 1H, Hβ Pro ), 3.63 (dt,

1H, J = 10.2, 6.7 Hz, Hδ Pro), 3.73 – 3.90 (m, 5H, 4Hβ Ser, Hδ Pro), 3.94 (s, 2H, 2Hα Gly),

4.34 (dd, 1H, J = 8.5, 5.5 Hz, Hα Pro), 4.42 – 4.52 (m, 2H, 2Hα Ser), 4.59 (q, 1H, J = 7.0

Hz, Hα Ala).

13C RMN (100 MHz, D2O) δ(ppm): 15.4 (CH3 Ala), 21.7 (CH3CO), 24.6 (Cγ Pro), 29.5 (Cβ

Pro), 42.5(CGly), 47.7 (Cα Ala), 47.7 (Cδ Pro), 55.3 (2 Cα Ser), 58.9 (Cα Thr), 60.3 (Cα Pro), 61.0

(2Cβ Ser), 170.9, 171.9, 171.9, 172.7, 174.9, 177.0 (6 CO)

60 EXPERIMENTAL

N-Acetil- L-glicinil- L -serinil- L-(αααα-O-D-N-acetilgalactosaminil)- treoninil- L-

alaninil- L-prolinamida

Ac- L-Gly- L-Ser- L-Thr-(αααα-O-D-GalNHAc)- L-Ala- L-Pro


péptidos en SPPS, se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol),

Ser(OtBu)-Fmoc (383 mg, 1 mmol), el building block de Thr (compuesto 5, 318 mg,

0.474 mmol), Ala-Fmoc (311 mg, 1 mmol) y Pro-Fmoc (337 mg, 1 mmol)

obteniéndose el glicopéptido 3.


+: 698.2968

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.27 (d, 3H, J = 6.3 Hz, MeThr), 1.38 (d, 3H, J =

7.1 Hz, MeAla), 1.89 – 2.14 (m, 9H, NHCH3 S, NHCH3, Hβ Pro, 2Hγ Pro), 2.27 – 2.36 (m,

1H, Hβ Pro), 3.64 – 3.80 (m, 4H, Hδ Pro, H3S, 2H6S), 3.85 – 4.05 (m, 7H, 2Hβ Ser , Hδ Pro,

2Hα Gly, H4S, H5S), 4.11 (dd, 1H, J = 11.0, 3.8 Hz, H2S), 4.34 – 4.42 (m, 2H, H2S, , Hα Pro

), 4.51 - 4.62 (m, 2H, Hα Thr, Hα Ser), 4.66 (m, 1H, Hα Ala), 4.92 (d, 1H, J = 3.8 Hz, H1S).

13C RMN (100 MHz, D2O) δ(ppm): 18.0 (CH3 Ala), 20.8 (CH3 Thr), 24.2,24.8 (2 CH3CO),

27.2 (Cβ Pro), 32.1 (Cδ Pro), 32.8 (Cγ Pro), 45.0(Cα Gly), 50.10 (C2S), 57.7 (Cα Ala), 59.8 (Cα

Thr), 62.65 (Cβ Ser), 63.67 (C6S), 63.88 (Cα Ser), 70.59 (C3S), 71.13 (C4S), 73.90 (C5S),

77.65 (Cβ Thr), 101.1 (C1S), 173.3, 174.3, 174.9, 175.1, 176.4, 177.4, 179.5 (7 CO).

61 EXPERIMENTAL

N-Acetil- L-glicinil- L -serinil- L-(αααα-O-D-N-acetilgalactosaminil)-serinil- L-

alaninil- L-prolinamida

Ac- L-Gly- L-Ser- L-Ser-(αααα-O-D-GalNHAc)- L-Ala- L-Pro

2


péptidos en SPPS, se introduce en cartuchos Gly-Fmoc (297 mg, 1 mmol), Ser(tBu)-

Fmoc (383 mg, 1 mmol el building block de Ser (compuesto 6, 328 mg, 0.50

mmol), Ala-Fmoc (311 mg, 1 mmol) y Pro-Fmoc (337.4 mg, 1 mmol) obteniéndose

el glicopéptido 4.


+: 684.2811

1H NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm): 1.36 (d, 3H, J = 7.1 Hz, MeAla), 1.93 (m, 1H, Hγ Pro),

1.98 – 2.08 (m, 8H, NHCH3 S, NHCH3, Hβ Pro, Hγ Pro), 2.28 (dt, 1H, J = 15.7, 7.8 Hz, Hβ

Pro), 3.60 – 3.92 (m, 11H, 2Hδ Pro, 4Hβ Ser, H3S, H4S, H5S, 2H6S), 3.94 (s, 2H, 2Hα Gly), 4.14

(m, 1H, H2S), 4.34 (dd, 1H, J = 8.5, 5.5 Hz, Hα Pro), 4.50 (t, 1H, J = 5.5 Hz, Hα Ser), 4.56

– 4.62 (m, 1H, Hα Ala), 4.65 (t, 1H, J = 5.2 Hz, Hα Ser-S), 4.86 (d, 1H, J = 3.8 Hz, H1S).

13C RMN (100 MHz, D2O) δ(ppm): 15.5 (CH3 Ala), 22.1 (2 CH3CO), 24.7 (Cγ Pro), 29.5

(Cβ Pro), 42.5(CGly), 47.5 (Cα Ala), 47.7 (C2S), 55.2 (Cα Ser-S), 55.3 (Cα Ser-S), 60.3 (Cα Pro),

61.1 (2Cβ Ser), 66.8 (C6S), 67.7 (C3S), 68.5 (C4S), 71.3 (C5S), 97.7 (C1S), 170.5, 171.8,

172.6, 174.4, 174.9, 177.0 (6 CO)

6. Anexo:

Espectros de Resonancia

Magnética Nuclear

65 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

A continuación se presentan los espectros de RMN mono y

bidimensionales de los productos 1 – 4.

Los espectros de 1H,

13C, COSY y HSQC fueron tratados y representados

con el software MestreNova (5.2), a partir de los archivos fid y ser obtenidos del

espectrómetro Bruker Avance- 400 MHz.


1H RMN 400 MHz en D2O

13C RMN 100 MHz en D2O

1.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.8f1 (ppm)

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

15.4

18.8

21.7

24.6

29.5

30.2

42.5

47.8

55.4

58.9

60.3

61.0

66.9

171.2

171.9

172.2

172.8

174.9

177.0


COSY en D2O

HSQC en D2O

0.81.21.62.02.42.83.23.64.04.44.85.25.6f2 (ppm)

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

f1 (ppm)




1.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.0f1 (ppm)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

15.4

21.6

24.6

29.5

42.5

47.7

47.7

55.3

55.4

60.3

61.0

170.9

171.9

172.8

174.9

176.9


COSY en D2O

HSQC en D2O

f1 (ppm)

f1 (ppm)




3.00

2.95

9.37

1.02

1.27

3.07

7.40

0.81

1.94

2.18

1.41

0.54

1.26

1.28

1.37

1.39

1.94

1.96

1.97

1.99

2.28

2.30

2.32

2.33

2.35

3.68

3.69

3.70

3.72

3.73

3.75

3.76

3.77

3.77

3.78

3.79

3.80

3.81

3.87

3.88

3.89

3.91

3.92

3.94

3.97

3.98

4.01

4.03

4.05

4.09

4.10

4.12

4.13

4.36

4.37

4.38

4.39

4.58

4.58

4.59

4.65

4.66

4.92

4.93

18.0

20.8

24.2

24.8

27.2

32.1

32.8

45.0

50.1

50.2

52.2

57.7

59.8

62.6

63.7

63.9

70.6

71.1

73.9

77.7

101.1

173.3

174.3

174.9

175.1

176.4

177.4

179.5

N

OH2N

O

O

HN

OO

NH

HOO

HN

AcHN

O

OH

HO

AcHN

3

HO

3


COSY en D2O

HSQC en D2O

f1 (ppm)

f1 (ppm)




1.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.05.2f1 (ppm)

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

15.5

21.7

22.1

24.7

29.5

42.5

47.7

49.7

53.2

55.3

60.3

61.1

61.2

66.8

67.7

68.5

71.3

97.7

170.5

171.8

172.6

174.4

174.9

177.0


COSY en D2O

HSQC en D2O

f1 (ppm)

f1 (ppm)

trabajo fin de estudios · esquema de los aminoácidos ser o thr glicosilados con los carbohidratos...

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