tesis doctoral: factores pronosticos en la leucemia
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Universidad de Oviedo
Departamento de Biología Funcional
TESIS DOCTORAL: FACTORES PRONOSTICOS EN LA LEUCEMIA
LINFATICA CRONICA: PAPEL DEL SISTEMA INMUNITARIO
Ana Pilar González Rodríguez
Oviedo 2010
Universidad de Oviedo
Departamento de Biología Funcional
TESIS DOCTORAL: FACTORES PRONOSTICOS EN LA LEUCEMIA
LINFATICA CRONICA: PAPEL DEL SISTEMA INMUNITARIO
Ana Pilar González Rodríguez
Oviedo 2010
DEPARTAMENTO: BIOLOGIA FUNCIONAL
TESIS DOCTORAL: FACTORES PRONOSTICOS EN LA LEUCEMIA
LINFATICA CRONICA: PAPEL DEL SISTEMA INMUNITARIO
DOCTORANDO:
ANA MARIA PILAR GONZALEZ RODRIGUEZ
BAJO LA DIRECCION DE:
SEGUNDO GONZALEZ RODRIGUEZ
Profesor titular de Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad de
Oviedo
Investigador principal del grupo de Inmunología Tumoral del Instituto Universitario
de Oncología del Principado de Asturias (IUOPA).
FO
R-O
FE
-VC
E-0
24
Vicerrectorado de Ordenación Académica y �uevas Titulaciones
AUTORIZACIÓN PARA PRESENTACIÓN DE TESIS DOCTORAL
Datos del alumno: Curso: 2009/2010 Apellidos: GONZALEZ RODRIGUEZ �ombre: ANA MARIA PILAR D�I: 9387558Q Datos Académicos: Programa de Doctorado cursado: FISIOLOGIA Departamento responsable: BIOLOGIA FUNCIONAL Departamento en que presenta la tesis doctoral: BIOLOGIA FUNCIONAL Título definitivo de la Tesis: FACTORES PRONÓSTICOS EN LA LEUCEMIA LINFÁTICA
CRÓNICA: PAPEL DEL SISTEMA INMUNITARIO Autorización del director/es de la tesis D/Dª: SEGUNDO GONZALEZ RODRIGUEZ Departamento: BIOLOGIA FUNCIONAL Resolución El Departamento BIOLOGIA FUNCIONAL en su reunión de fecha 16 de Marzo de 2010, acordó dar su conformidad para la presentación de la tesis doctoral a la Comisión de Doctorado, en cumplimiento de lo establecido 35.2 de la “Modificación del Reglamento del tercer ciclo de estudios universitarios, la obtención y expedición del título de doctor y otros cursos de postgrado”, aprobada por el Consejo de Gobierno, en su sesión
del día 23 de octubre de 2008 (BOPA del 19 de diciembre de 2008).
Asimismo el director/directores de la tesis doctoral, cumplen con el requisito establecido en el artículo 2 de la “Modificación del Reglamento del tercer ciclo de estudios universitarios, la obtención y expedición del título de doctor y otros cursos de postgrado”, aprobada por el Consejo de Gobierno, en su sesión del día 23 de octubre de 2008 (BOPA del 19 de diciembre de 2008).
Oviedo, 16 de Marzo de 2010
El Director del Departamento
Fdo.: ANTONIO FUEYO SILVA
SR./SRA. PRESIDENTE/A DE LA COMISIÓN DE DOCTORADO DE LA UNIVERSIDAD DE OVIEDO
FO
R-O
FE
-VC
E-0
21
Vicerrectorado de Ordenación Académica y �uevas Titulaciones AUTORIZACIÓN PARA LA PRESENTACIÓN DE LA TESIS
DOCTORAL
Curso: 2009/2010 Datos personales: Apellidos: GONZALEZ RODRIGUEZ �ombre: ANA MARIA PILAR D.�.I. 9387558Q Datos Académicos: Programa de Doctorado cursado: FISIOLOGIA Departamento responsable: BIOLOGIA FUNCIONAL Departamento en el que presenta la tesis doctoral: BIOLOGIA FUNCIONAL Título definitivo de la Tesis: FACTORES PRONÓSTICOS EN LA LEUCEMIA LINFÁTICA
CRÓNICA: PAPEL DEL SISTEMA INMUNITARIO Autorización del director/es de la tesis D/Dª: GONZALEZ RODRIGUEZ, SEGUNDO Departamento: BIOLOGIA FUNCIONAL
Autoriza la presentación de la tesis doctoral en cumplimiento de lo establecido en el Art. 35.1a de la “Modificación del Reglamento del tercer ciclo de estudios universitarios, la obtención y expedición del título de doctor y otros cursos de postgrado”, aprobada por el Consejo de
Gobierno, en su sesión del día 23 de octubre de 2008 (BOPA del 19 de diciembre de 2008).
Oviedo, 02 de abril de 2010
Director de la Tesis
Fdo: GONZALEZ RODRIGUEZ, SEGUNDO
SR. DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA FUNCIONAL
DEDICATORIA:
A mis padres y mis hijos Carlos, Pablo y María.
1
AGRADECIMENTOS:
A mi Director y hermano, el Dr. Segundo González, por su entusiasmo contagioso y
su apoyo. Es un verdadero placer trabajar con él.
A Juan Contesti siempre buscando y encontrando artículos “interesantes”. Gracias
por su trabajo e interés.
A Leticia Huergo, por su ayuda durante la investigación y sus muchas horas de
trabajo en el laboratorio.
A Marisol y Lucia, siempre pendientes de que no perdiésemos ninguna muestra.
A Esther que siempre me animó a seguir adelante en los momentos de duda y a
Carmen por su ayuda en la redacción del texto; y el agradecimiento más
importante por su amistad.
A Cesar Morante, que me proporcionó su base de datos para poder iniciar el estudio
epidemiológico.
A todos los miembros del Servicio de Hematología del Hospital de Cabueñes que de
un modo u otro me han ayudado en las diferentes fases de este estudio.
A mis padres porque me han enseñado el valor del trabajo, del esfuerzo y la
coherencia personal y siempre estaré en deuda con ellos. Gracias.
2
3
ABREVIATURAS UTILIZADAS:
AcMo: anticuerpo monoclonal.
APC: Aloficocianina.
BCSH: British Committee for Standards in
Haematology.
BSA: Bovine Serum Albumin (Seroalbúmina
bovina).
CD: Clusters of Differentiation (Marcadores de
diferenciación).
CIFC: Cancer Incidence in Five continents.
CMB: componente monoclonal B.
Cy5: Ficoeritrina-cianina 5
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético.
ERp5: Endoplasmic reticulum protein 5
(Proteína del retículo endoplásmico 5).
FITC: Isotiocianato de fluoresceína.
GIMEMA: Gruppo Italiano Malattie
Ematologiche Maligne dell´Adulto.
GRP78: Glucose Regulated Protein 78kDa
(Proteína regulada por glucosa de 78kDa).
Hb: hemoglobina
HE: hematoxilina eosina.
IARC: International Agency for Research on
Cancer.
ICD-O-2: International Classification of
Diseases for Oncology 2nd Edition
IgVH: cadenas pesadas de las
inmunoglobulinas.
IWCLL: International Workshop on CLL.
IP MDACC: Índice pronóstico del MD. Anderson
Cancer Center.
KIRs: killer cell inmunoglobulina-like receptors
LDH: Lactato deshidrogenasa.
LLC: Leucemia linfática crónica B.
LP-T: Leucemia prolinfocítica T.
MBS: Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide
ester.
MFI: mediana de intensidad de fluorescencia
MHC-I o II: Major Histocompatibility Complex
Class Io II (Complejo Mayor de
Histocompatibilidad de Clase Io II).
MICA/B: MHC class I chain-related protein
A/B.
MICAs: MICA soluble
MICBs: MICB soluble.
NCIWG: National Cancer Institute-sponsored
Working Group.
NK: Natural Killer.
NK/CMB: ratio entre las células NK y el
componente monoclonal B en sangre
ns: no significativo
OMS: Organización Mundial de la Salud.
PBS: Phosphate Buffer Solution (Solución
tamponada de fosfato).
PDI: Protein Disulphide Isomerase (Proteína
disulfuro isomerasa).
PE: Ficoeritrina.
PerCP: Clorofila peridina.
pfp: perforina
PMBCs: Peripheral Mononuclear Blood Cells
(Células mononucleares de sangre periférica).
RBC: Receptor del linfocito B.
RE: retículo endoplásmico
REL: registro español de leucemias
RR: razón de riesgo
SEER: Survellance, Epidemiology and End
Results
SG: Supervivencia global
SLT: Supervivencia libre de tratamiento.
SLL: Linfoma linfocítico bien diferenciado.
SLPC: síndromes linfoproliferativos crónicos.
T/CMB : ratio entre los linfocitos T y el
componente monoclonal B en sangre
T CD4/CMB: ratio entre los linfocitos T CD4 y
el componente monoclonal B en sangre
T CD8/CMB: ratio entre los linfocitos T CD8 y
el componente monoclonal B en sangre
TA: Tasa ajustada por edad
TB: Tasa bruta de incidencia.
TEE: Tasa específica por edad.
TCR: T-cell Receptor (Receptor de células T).
ULBPs: UL16 binding proteins.
4
UPR: Unfolded Protein Response. (Respuesta al
mal plegamiento proteico).
vn: valor normal.
5
INDICE GENERAL Índice general
Índice de tablas
Índice de figuras
Introducción……………………………………………………………………………………...11
1. Concepto de leucemia linfática crónica…………………………………………………13
1.1 Criterios diagnósticos de la leucemia linfática crónica: morfología e
inmunofenotipo…………………………………………………………………………………………………………...15
1.2 Linfocitos B CD5+………………………………………………………………………………………………….17
1.3 Biología de los linfocitos de la leucemia linfática crónica.……………………………………17
1.4 Epidemiología de la leucemia linfática crónica……………………………………………………..18
1.5 Curso clínico de la leucemia linfática crónica e indicación de tratamiento………….19
1.6 Sistemas pronósticos en la leucemia linfática crónica: Estadios de Rai y Binet….20
1.7 Nuevos sistemas pronósticos: IP MDACC e índice GIMEMA...……………………………..22
1.8 Factores pronósticos en la leucemia linfática crónica…………………………………………..23
2. Concepto y funcionamiento del sistema inmunitario…………………………….25
2.1 Base celular de la respuesta inmunitaria adaptativa…………………………………………...25
2.2 Células NK……………………………………………………………………………………………………………...27
3. Sistema inmunitario frente al cáncer………………………………………………28 3.1 Sistema inmunitario: papel en el control de las proliferaciones neoplásicas……..28
3.2 Células del sistema inmunitario implicadas en la eliminación de las células
tumorales……………………………………………………………………………………………………………………..30
3.3 Receptor NKG2D y sus ligandos: MICA, MICB y ULBPs……………………………………….32
3.4 Mecanismos de escape al sistema inmunitario: MICA y MICB solubles……………...35
3.5 Liberación de MICA y MICB de la superficie celular: ERp5 y GRP78…………………..36
3.6 Importancia pronóstica del número de linfocitos en sangre en cáncer……………...39
4. Sistema inmunitario y leucemia linfática crónica………………………………40
4.1 Control sobre la leucemia linfática crónica por el sistema inmunitario…41
4.2 Escape de la leucemia linfática crónica al sistema inmunitario……………..42
4.3 Posible papel de MICA soluble en el escape de la leucemia linfática
crónica al sistema inmunitario……………………………………………………………………….43
Objetivos…………………………………………………………………………………………....47
6
Material y métodos………………………………………………………………………..51
1. Características epidemiológicas de los pacientes diagnosticados de
leucemia linfática crónica……………………………………………………………..53
1.1 Criterios de inclusión y exclusión………………………………………………………………………...54
1.2 Variables estudiadas…………………………………………………………………………………………….54
1.2.1 Síntomas y exploración física………………………………………………………………..54
1.2.2 Parámetros hematológicos…………………………………………………………………...55
1.2.3 Inmunofenotipo de sangre periférica…………………………………………………...55
1.2.4 Recuento de linfocitos T CD4 y CD8 y células NK en el momento del
diagnóstico……………………………………………………………………………………………………….56
1.2.5 Otros estudios al diagnóstico…………………………………………………………………57
1.2.6 Estadios de Binet, Rai, IP MDACC e Índice GIMEMA…………………………….57
1.2.7 Tratamiento y evolución………………………………………………………………………..57
2. Niveles de ERp5, GRP78, MICA en linfocitos B leucémicos y de MICA
y MICB solubles…………………………………………………………………………..58
2.1 Variables estudiadas………………………………………………………………………………………..59
2.2 Análisis de la expresión de ERp5, GPR78 y MICA en las células leucémicas..60
2.2.1 Determinación de ERp5………………………………………………………………………..60
2.2.2 Determinación de GRP78………………………………………………………………………61
2.2.3 Determinación de MICA………………………………………………………………………..61
2.2.4 Microscopía confocal……………………………………………………………………………..61
2.3 Determinación de los niveles de MICA y MICB soluble……………………………………….62
3. Métodos estadísticos utilizados…………………………………………………63
3.1 Tasa de incidencia bruta, específicas por edad y ajustada por edad………………….63
3.4 Supervivencia global y libre de tratamiento…………………………………………………………64
3.4 Descripción y asociación de variables…………………………………………………………………..65
4. Ética………………………………………………………………………………………65
Resultados………………………………………………………………………………..67
1. Descripción de la serie…………………………………………………………………..69
1.1 Distribución por sexo y edad………………………………………………………………………….69
1.2 Incidencia anual, tasa bruta de incidencia, tasa ajustada por edad y tasa
específica por edad………………………………………………………………………………………….70
7
1.3 Características clínicas y biológicas de los pacientes…………………………………….71
1.4 Neoplasias asociadas……………………………………………………………………………………….72
2. Distribución por estadios de Rai, Binet, IP MDACC e Índice
GIMEMA……………………………………………………………………….………………….73
2.1 Supervivencia libre de tratamiento según los distintos sistemas………………….74
2.2 Supervivencia global según los distintos sistemas pronósticos…………………….76
3. Cuantificación y valor pronóstico de los linfocitos T CD4, CD8 y células
NK en la leucemia linfática crónica……………………………………………………..80
3.1 Las subpoblaciones T/NK al diagnóstico presentan una distribución
anormal……………………………………………………………………………………………………..………………….80
3.2 Interés pronóstico del recuento relativo de linfocitos T CD4 y CD8………………83
3.3 Los valores relativos de linfocitos T CD8 y CD4 más elevados se asociaron
con mejor supervivencia global……………………………………………………………………….84
4. Análisis del papel de la respuesta inmunitaria mediada por NKG2D
frente a la leucemia linfática crónica………………………………………………….88
4.1 Características de los pacientes……………………………………………………………………..88
4.2 Expresión de MICA en los linfocitos B……………………………………….……………………90
4.3 Expresión de ERp5 y GRP78 en linfocitos B de donantes sanos y pacientes con
leucemia linfática crónica…………………………………………………………………………………92
4.4 Niveles de MICA y MICB soluble en pacientes con leucemia linfática
crónica…………………………………………………………………………………………..………………...97
4.5 Correlación entre la expresión de ERp5, GRP78 y MICA en la superficie de
las células leucémicas………………………………………………………………………..98
4.6 Correlación entre MICA y MICB solubles y ERp5, GRP78 y MICA en la
superficie de los linfocitos leucémicos……………………………………………….99
Discusión……………………………………………………………………………………………101
1. Elevada incidencia de la leucemia linfática crónica en nuestra área
sanitaria………………………………………………………………………………………..103
1.1 Mejor recogida de los casos diagnosticados de leucemia linfática crónica.…104
1.2 Mejor clasificación de esta enfermedad…………………………………………………….….106
1.3 Aumento de las tasas de incidencia por un mayor número de casos
diagnosticados……………………………………………………………………………………………………………107
1.4 Aumento real de la incidencia de LLC en nuestra área………………………………..108
8
2. Supervivencia de los pacientes con leucemia linfática crónica…………110
2.1 Análisis y validación de los distintos sistemas pronósticos en la
leucemia linfática crónica…………………………………………………………….……111
3. Linfocitos T y células NK en la leucemia linfática crónica…………………113
4. Mecanismos de control del sistema inmunitario sobre la leucemia
linfática crónica……………………………………………………………………………..117
4.1 ERp5 y GRP78 se expresan en la superficie de las células de la
leucemia linfática crónica…………………………………………………………………………….118
4.2 La expresión de MICA es baja en la leucemia linfática crónica………120
4.3 MICA soluble en la regulación de la respuesta inmunitaria…………….123
4.4 MICB soluble en la leucemia linfática crónica………………………………….123
Conclusiones………………………………………………………………………….127
Bibliografía……………………………………………………………………….…….131
Anexos……………………………………………………………………….……….……155
Anexo de publicaciones............................................................165
9
INDICE DE TABLAS:
Tabla 1. Clasificación de la OMS (2008) de las neoplasias de células B maduras………………………14
Tabla 2. Sistema de puntuación inmunofenotípico Moreau-Matutes (1997)…………………………….…17
Tabla 3. Estadiaje clínico de Rai (1975, 1987)...................................................................21
Tabla 4. Estadiaje clínico de Binet (1981)……………………………………………………………………………………21
Tabla 5. Indice pronóstico IP MDACC. a) Puntuación IP MDACC. b) Probabilidad de supervivencia
global y riesgo relativo según grupo de riesgo IP MDACC…………………………………………….22
Tabla 6. Indice GIMEMA para pacientes con leucemia linfática crónica en estadio A………………..23
Tabla 7. Características de los linfocitos T y B……………………………………………………………………………..27
Tabla 8. Valores de tendencia central y rango de los parámetros del hemograma y bioquímicos
de los pacientes diagnosticados de LLC………………………………………………………………………….71
Tabla 9. Tipos de neoplasias asociadas en pacientes con LLC…………………………………………………….72
Tabla 10. Distribución de los pacientes diagnosticados de LLC según los estadios de Binet, de Rai
modificados, grupo de riesgo IP MDACC e índice GIMEMA……………………………………………74
Tabla 11. Probabilidad de supervivencia libre de tratamiento a los 5 y 10 años según los estadios
de Rai, Binet, IP MDACC e índice GIMEMA…………………………………………………………………….75
Tabla 12. Probabilidad de supervivencia global a los 5 y 10 años según los estadios de Rai, Binet,
IP MDACC e índice GIMEMA…………………………………………………………………………………………...77
Tabla 13. Valores absolutos y relativos de linfocitos T, CD4 y CD8 y células NK………………………...82
Tabla 14. Análisis multivariante mediante regresión de Cox respecto a la supervivencia global…84
Tabla 15. Características clínicas y biológicas de los pacientes según los recuentos relativos de T
CD8 y CD4 bajos o altos………………………………………………………………………………………………….86
Tabla 16. Probabilidad de supervivencia global en 5 y 10 años según el recuento relativo de CD8
≤0,074 vs. >0,074 y CD4≤ 0,1 vs. >0,1……………………………………………………………………….87
Tabla 17. Características clínicas de los pacientes a los que se les determinó MICA……………………89
Tabla 18. Parámetros del hemograma y bioquímicos de la serie de pacientes a los que se
determinó MICA……………………………………………………………………………………………………………….89
Tabla 19. Características clínicas y biológicas en pacientes con enfermedad estable y progresiva.
………………………………………………………………………………………………………………………………………….90
Tabla 20. Expresión de MICA en controles y en leucemia linfática crónica……………………………………91
Tabla 21. Expresión de MICA según características clínicas de los pacientes, diferentes factores
pronósticos y recuento relativo de linfocitos T CD4, CD8 y células NK………………………...92
Tabla 22. Expresión de ERp5 y GRP 78 en pacientes y controles medidas según su intensidad de
fluorescencia media………………………………………………………………………………………………………….95
Tabla 23. Expresión de ERp5 y GRP78 en pacientes con LLC estable vs. progresiva y CD38
positiva vs. negativa…………………………………………………………………………………………………………95
Tabla 24. Area bajo la curva ROC e intervalo de confianza de los niveles de ERp5, GRP78 y MICA
para detectar si la LLC es progresiva………………………………………………………………………………95
Tabla 25. Niveles de MICA soluble y MICB soluble en controles y en pacientes diagnosticados de
LLC con enfermedad estable y progresiva………………………………………………………………………97
Tabla 26. Correlación de MICA soluble y MICB soluble con Erp5, GRP78 y MICA en pacientes y
controles…………………………………………………………………………………………………………………………100
10
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Aspirado de médula ósea, frotis de sangre periférica y biopsia ganglionar de un
paciente con leucemia linfática crónica…………………………………………………………………………..15
Figura 2. Tinción de hematoxilina eosina e inmunohistoquímica en médula ósea de paciente con
leucemia linfática crónica…………………………………………………………………………………………………16
Figura 3. Inmunomodelado del cáncer: etapas del proceso………………………………………………………….30
Figura 4. “Pérdida de lo propio” e “Inducción de lo propio”. Dos modelos de activación de las
células NK…………………………………………………………………………………………………………………………32
Figura 5. Ligandos del receptor NKG2D………………………………………………………………………………………….34
Figura 6. Mecanismo de liberación de MICA soluble por ERp5………………………………………………………37
Figura 7. Modelo de corte de MICA en la superficie de las células tumorales………………………………39
Figura 8. Pirámide de población del área Sanitaria V (2001)……………………………………………………...63
Figura 9. Número de casos por grupos de edad según sexo…………………………………………………………69
Figura 10. Casos nuevos diagnosticados según el año del diagnóstico…………….……………………………70
Figura 11. Tasa específica por edad (TEE) para distintos grupos de edad y según sexo………………70
Figura 12. Curvas de supervivencia libre de tratamiento según los diferentes sistemas………………76
Figura 13. Curvas de supervivencia global según los diferentes sistemas pronósticos.……………….78
Figura 14. Curva de supervivencia global según el grupo de riesgo IP MDACC para pacientes en
estadio A…………………………………………………………………………………………………………………………..79
Figura 15. Distribución de linfocitos T con sus subpoblaciones CD4 y CD8 y células NK en los
pacientes diagnosticados de LLC…………………………………………………………………………………….81
Figura 16. Curvas de supervivencia global según el número relativo de las distintas
subpoblaciones linfocitarias…………………………………………………………………………………………….85
Figura 17. Curvas de supervivencia global según CD38 y CD8/CMB………………………………………………85
Figura 18. Expresión de MICA en los linfocitos de controles y en pacientes con enfermedad estable
y progresiva……………………………………………………………………………………………………………………..91
Figura 19. Análisis mediante citometría de flujo y microscopía confocal de la expresión de ERp5,
GRP78 en los linfocitos T y B de donantes sanos y pacientes con LLC…………………………94
Figura 20. A. Expresión ERp5, Grp78 en controles y pacientes con enfermedad estable y
progresiva. B. Curva ROC de la expresión de ERP5, GRP78 y MICA para detectar
enfermedad progresiva……………………………………………………………………………………………………96
Figura 21. Colocalización de ERp5-MICA y GRP78-MICA en la superficie de células mononucleares
de sangre periférica en pacientes con LLC mediante microscopía confocal…………………98
Figura 22. Correlación entre la expresión de ERp5 y GRP78, ERp5 y MICA y GRP78 y MICA en la
membrana de los linfocitos B en pacientes con LLC………………………………………………………99
Figura 23. Modulación de las distintas subpoblaciones linfocitarias por MICA soluble…………………123
11
Introducción
12
13
1. Concepto de leucemia linfática crónica
Las leucemias son proliferaciones clonales malignas de células hematopoyéticas en la
médula ósea que generalmente se suelen asociar con la presencia de células malignas
circulantes en sangre periférica. Pueden ser agudas o crónicas y de estirpe linfoide o
mieloide. De forma histórica, el término “leucemia aguda” hacía referencia a la evolución de
la enfermedad por tratarse de patologías con un comienzo muy rápido y un pronóstico fatal a
corto plazo, frente a la evolución de las “formas crónicas” que generalmente presentan un
curso más lento e indolente. Actualmente hace referencia a la naturaleza más o menos
indiferenciada de las células leucémicas; en las leucemias agudas la proliferación neoplásica
se produce a nivel de las células hematopoyéticas en los primeros estadios de diferenciación
o blastos y en las leucemias crónicas el origen celular se sitúa en estadios más diferenciados
o tardíos.
La clasificación utilizada en la actualidad para las neoplasias hematológicas es la
“Clasificación de la Organización Mundial de la Salud (OMS)” que data del año 2001, con una
revisión en el año 2008 y estratifica las neoplasias linfoides según su origen celular en
neoplasias de células B, neoplasias de células T y NK y enfermedad de Hodgkin1. Además,
dentro de cada tipo se distinguen “neoplasias de precursores” donde las células proliferantes
se encuentran en los primeros estadios de maduración y “neoplasias de células maduras”
que corresponden a los últimos estadios madurativos. Dentro de estas categorías se incluyen
“linfomas” en los se identifican masas linfoproliferativas y “leucemias” que son neoplasias en
las que existe una afectación generalizada de la médula ósea asociada a la presencia de
células neoplásicas circulantes en sangre. Esta distinción es arbitraria y algunos linfomas
tienen afectación medular y células malignas circulantes al diagnóstico o durante la
evolución. En cada grupo, las distintas entidades se distinguen en función de una serie de
características morfológicas, inmunofenotípicas, genéticas y clínicas y además para cada
entidad se postula una célula de origen, con un determinado grado de maduración. Algunas
veces el origen celular es aparente por criterios morfológicos, pero en otras ocasiones se
precisa del inmunofenotipo para identificar las características antigénicas de la superficie
celular.
La leucemia linfática crónica (LLC) se conoce como una entidad clínica diferenciada
desde hace casi 100 años y es la patología más representativa de los síndromes
linfoproliferativos crónicos; más concretamente está incluida dentro de las neoplasias de
células B maduras de la clasificación OMS. Los síndromes linfoproliferativos crónicos con
expresión hemoperiférica constituyen un grupo de enfermedades caracterizadas por la
circulación en sangre periférica de una población clonal de células linfoides en distintos
14
estadios de maduración. El estudio del inmunofenotipo nos permite demostrar la clonalidad
en la mayoría de los casos y nos ayuda a su clasificación.
En la tabla 1 se detallan las neoplasias de células B maduras. Según la clasificación
OMS se consideran conjuntamente la LLC, donde la afectación es fundamentalmente
leucémica, y el linfoma linfocítico de células pequeñas, donde la afectación es nodal o sólida2.
Neoplasias de células B maduras
Leucemia linfática crónica/Linfoma linfocítico bien diferenciado Leucemia prolinfocítica Linfoma esplénico marginal (linfocitos vellosos) Leucemia de células peludas Linfoma/leucemia esplénico inclasificable (provisional) Linfoma linfoplasmacítico Macroglobulinemia de Waldenström Enfermedad de las cadenas pesadas (alfa, gamma, mu) Mieloma Plasmocitoma óseo solitario Plasmocitoma extraóseo Linfoma de zona marginal extranodal (MALT) Linfoma de zona marginal nodal Linfoma de zona marginal nodal pediátrico (provisional) Linfoma folicular Linfoma folicular pediátrico (provisional) Linfoma cutáneo primario centrofolicular Linfoma de células del manto Linfoma B de célula grande difuso, no especificado (LNH DCBG) Linfoma B de célula grande rico en células T/Histiocitos Linfoma B de célula grande primario de SNC Linfoma B de célula grande cutáneo primario, de extremidades Linfoma B de célula grande EBV+ del anciano (provisional) Linfoma difuso de células grandes asociado con inflamación crónica Granulomatosis linfomatoide Linfoma de célula grande B mediastínico primario (tímico) Linfoma de célula grande intravascular Linfoma de célula grandes B ALK+ Linfoma plasmablástico Linfoma de células grandes B en enfermedad de Castleman multicéntrica (HHV8) Linfoma primario de cavidades Linfoma Burkitt Linfoma B, inclasificable, con caracteres intermedios entre LNH DCBG y Linfoma de Burkitt.
Tabla 1. Clasificación de la OMS (2008) de las neoplasias de células B
maduras.
Dameshek definió la LLC en 1967 como una “enfermedad caracterizada por la
acumulación progresiva de linfocitos no inmunocompetentes” 3; aunque como veremos este
concepto ha ido cambiando. La LLC se caracteriza por un incremento progresivo de linfocitos
B maduros monoclonales, con una morfología e inmunofenotipo característicos en sangre, en
médula ósea y en ganglios linfáticos, bazo e hígado. En algunos pacientes también se puede
observar afectación de órganos extranodales, y de hecho, se pueden encontrar células de
LLC en cualquier órgano o tejido donde tienden a preservar las estructuras preexistentes sin
15
provocar destrucción o necrosis. Las manifestaciones clínicas son debidas tanto a la
infiltración de los tejidos por los linfocitos neoplásicos como a las alteraciones inmunológicas
que con frecuencia acompañan a la enfermedad4.
1.1 Criterios diagnósticos de la leucemia linfática crónica:
morfología e inmunofenotipo
La clasificación OMS ha adoptado para definir la LLC los criterios diagnósticos
propuestos por el International Workshop on CLL (IWCLL)5; según estos se requiere la
presencia de más de 5x109/L linfocitos en sangre periférica con morfología y fenotipo
característicos de LLC durante al menos tres meses. Si el recuento de estas células
características no llega a ese límite se deben asociar citopenias o síntomas en relación con la
enfermedad para realizar el diagnóstico. El término linfoma linfocítico de células pequeñas
hace referencia a una neoplasia caracterizada por la presencia de adenopatías infiltradas por
células con las mismas características morfológicas y fenotípicas que la LLC pero con menos
de 5x109/L linfocitos en sangre periférica y sin citopenias debidas a infiltración de la médula
ósea.
Desde el punto de vista morfológico, los linfocitos de la LLC tienen aspecto de
linfocitos maduros, son pequeños, con una relación núcleo-citoplasma muy elevada, el
citoplasma es escaso, agranular y ligeramente basófilo y el núcleo es redondeado, con
cromatina densa en “grumele”, o sea con cromatina compacta separada por unas finas
franjas cromatínicas más claras. Los linfocitos leucémicos son anormalmente frágiles y en el
momento de realizar un frotis sanguíneo se rompen con facilidad; los restos nucleares
resultantes se denominan “sombras de Grumpecht”.
Figura 1. Aspirado de médula ósea, frotis de sangre periférica y biopsia ganglionar de
un paciente con leucemia linfática crónica.
16
CD5 CD20
CD10 Ciclina D1CD23
HE
Figura 2. Tinción de hematoxilina eosina (HE) e inmunohistoquímica en medula ósea de paciente con leucemia linfática crónica.
Además de la morfología, el inmunofenotipo suele ser característico, con positividad
para CD5, CD19 y CD23; expresión débil de inmunoglobulinas de superficie, CD20 y CD79b;
y negatividad para FMC7, CD10 y ciclina D1 en los linfocitos que nos encontramos en los
tejidos linfoides, médula ósea y sangre periférica6,7. El carácter monoclonal de los linfocitos
de la LLC se pone de manifiesto por la presencia de inmunoglobulinas de superficie con un
sólo tipo de cadenas ligeras kappa o lambda, pero nunca ambas. Según la OMS, la leucemia
linfática crónica es siempre una neoplasia de células B, pues cuando la proliferación clonal es
de linfocitos T recibe el nombre de leucemia prolinfocítica T8.
Debido a la heterogeneidad del fenotipo y su importancia en el diagnóstico diferencial
de los síndromes linfoproliferativos crónicos se ha descrito un “sistema de puntuación
inmunofenotípico” que nos puede ayudar al diagnóstico9. Se basa en la adjudicación de un
punto a cada una de las siguientes características fenotípicas: positividad para CD5 y CD23,
positividad débil para CD79b e inmunoglobulinas de superficie y negatividad para FMC7. El
98% de las LLC obtienen 3 o más puntos, mientras que sólo alcanzan esta puntuación el
5,4% de otros síndromes linfoproliferativos crónicos.
17
Tabla 2. Sistema de puntuación inmunofenotípico Moreau-Matutes (1997).
1.2 Linfocitos B CD5+
Se ha identificado una subpoblación de linfocitos B que desarrollan en su membrana
una glicoproteína reconocida por el anticuerpo monoclonal CD5. Esta proteína se consideraba
exclusiva del linaje linfocitario T, admitiéndose que en los linfocitos B su expresión se
limitaba a las células de la LLC. Actualmente se conoce la existencia de linfocitos B normales
CD5+. Los linfocitos B CD5+ son los primeros en aparecer en la ontogenia y durante la vida
fetal predominan sobre los linfocitos B CD5-; de este modo en el cordón umbilical
constituyen el 50-70% de los linfocitos B, durante la infancia el 40-60% y en personas
adultas entre el 10 y el 25%. Los receptores específicos para el antígeno (BCR) de los
linfocitos B CD5+ son poliespecíficos, lo que les permite interaccionar con muchos antígenos
diferentes. Se piensa que pueden ser importantes en el reconocimiento de antígenos
bacterianos (por ejemplo polisacáridos de la pared), contribuyendo al establecimiento inicial
de la respuesta inmunitaria de una manera casi innata. Los linfocitos B CD5+ tienen
capacidad de autorrenovación a diferencia del resto de linfocitos B. Para algunos autores
estos linfocitos son equivalentes en el linaje B a los linfocitos Tγδ. En los órganos linfáticos
secundarios se encuentran situados en el manto folicular y su proporción esta aumentada en
enfermedades autoinmunes aunque aún se desconoce el sentido biológico de esta población.
1.3 Biología de la los linfocitos de la leucemia linfática
crónica
Las células neoplásicas de la LLC presentan características de linfocitos activados
después de encontrarse con el antígeno10. Mediante estudios de perfil génico se observa que
las células de LLC asemejan a los linfocitos B de memoria11. Parece que su contrapartida
normal se puede encontrar en la zona del manto de los folículos linfoides.
1 0
Igs Débil Fuerte
CD5 + -
CD23 + -
FMC7 - +
CD22 o CD79b Débil Fuerte
18
La molécula clave del receptor del linfocito B (BCR) es la inmunoglobulina; cada
receptor está constituido individualmente de modo que cada linfocito B reconoce a un
antígeno específico. La organización de los genes que codifican las cadenas de las
inmunoglobulinas asegura la generación de la diversidad de anticuerpos necesaria para
responder a cualquier antígeno. Mientras que la mayoría de las proteínas son codificadas por
genes únicos con una copia de origen materno y otra de origen paterno, este no es el caso
de las inmunoglobulinas, ya que para codificar las regiones constantes y a menudo las
regiones variables de sus cadenas, el genoma dispone de múltiples versiones distintas de los
genes correspondientes. Cada precursor de linfocito B puede elegir para cada una de las
cadenas cualesquiera de las versiones disponibles que codifican para cada región. Este
fenómeno ocurre al azar y es el principal responsable de la gran diversidad de los BCR
posibles. En las células neoplásicas de la LLC se ha observado una tendencia en el
reordenamiento de sus inmunoglobulinas a usar ciertos segmentos variables (VH1-69,VH3-07,
VH4-34), que contrasta con la gran diversidad que nos encontramos en los linfocitos B
normales. Se han identificado al menos 35 “estereotipos” de BCR que están presentes en
más del 20% de pacientes con LLC. El uso no aleatorio de segmentos VH en reordenamientos
IgH funcionales en la LLC hace pensar que estos pueden tener una importancia patogénica en
el desarrollo de la enfermedad. Se piensa que la estructura del BCR está íntimamente ligada
a la etiología y que tal vez un limitado número de (auto-)antígenos podrían promover la
diferenciación de los precursores y su evolución clonal12,13.
Por tanto, la idea clásica de que la LLC es una enfermedad derivada del acúmulo de
linfocitos poco proliferativos, relativamente inmaduros y poco inmunocompetentes está
cambiando a la luz de los nuevos conocimientos de la biología de la enfermedad.
1.4 Epidemiología de la leucemia linfática crónica
Pese a que la LLC es la forma más frecuente de leucemia en adultos en Europa y
América del Norte y supone aproximadamente el 30% de las neoplasias de células B
maduras (registro SEER-9)14, existen pocos estudios que evalúen la incidencia de las
diferentes neoplasias linfoides y casi todos se han basado en clasificaciones previas a la
clasificación OMS.
El riesgo de desarrollar LLC se incrementa progresivamente con la edad y predomina
ligeramente en varones4,15. Se considera una enfermedad de personas de edad avanzada,
aunque un tercio tienen menos de 55 años en el momento del diagnóstico. Debido a la
práctica creciente de realizar análisis de forma rutinaria, la LLC se diagnóstica cada vez con
19
mayor frecuencia en personas relativamente jóvenes y en fases asintomáticas de la
enfermedad. Se han observado grandes diferencias en la incidencia según la raza, siendo
muy infrecuente en países como Japón o China (3-5% de todas las leucemias). Estas
diferencias parecen ser debidas fundamentalmente a factores genéticos pues también se
observan cuando las personas procedentes de estos países emigran a Europa o América del
Norte. Por otra parte, también se han descrito diferencias en la incidencia según el área
geográfica de un mismo país16; tal vez algunas de estas variaciones no reflejan diferencias
reales sino en la disponibilidad de métodos diagnósticos.
1.5 Curso clínico de la leucemia linfática crónica e indicación
de tratamiento
Desde el punto de vista clínico, la LLC se caracteriza por ser una enfermedad muy
heterogénea, en cuanto a presentación, curso y evolución; en muchos pacientes tiene un
curso muy indolente y presentan una esperanza de vida normal, situándose la mediana de
supervivencia en torno a los 10 años, pero sin embargo otros presentan una enfermedad
progresiva, refractaria al tratamiento, con numerosas complicaciones infecciosas o
autoinmunes y evolución fatal en pocos meses. En el momento del diagnóstico, la mayoría
de los pacientes están asintomáticos, pero algunos ya presentan astenia, sudoración, pérdida
de peso, fiebre, infecciones, adenopatías, esplenomegalia, infiltrados extranodales u otros
síntomas. En la mayoría de los casos tiene un comportamiento lento e indolente durante
largos periodos de tiempo; en algunos de estos después de un periodo más o menos largo
puede progresar y evolucionar a estadios en los que el paciente precisa tratamiento y en una
minoría esta evolución puede ser rápida o incluso es necesario iniciar el tratamiento en el
momento del diagnóstico.
Por otra parte, no todos los pacientes diagnosticados de LLC precisan tratamiento. Se
han establecido por el Nacional Cancer Institute-sponsored Working Group (NCIWG) en el
año 1996 una serie de indicaciones de tratamiento como son: el fallo medular progresivo con
empeoramiento de la anemia o trombopenia; aparición de ganglios mayores de 10 cm o
esplenomegalia mayor de 6 cm o el aumento progresivo; aumento de los linfocitos en sangre
periférica en más del 50% en dos meses o tiempo de duplicación linfocitaria menor de 6
meses; presencia de síntomas sistémicos como pérdida de peso mayor del 10% en 6 meses,
fiebre mayor de 38º C durante dos semanas, fatiga extrema o sudor nocturno o la aparición
de anemia y/o trombopenia autoinmune que no responden al tratamiento con esteroides17.
Estos criterios han sido corroborados por el IWCLL en el año 2008, donde se vuelve a
20
resaltar la importancia de la presencia de enfermedad sintomática o progresiva como criterio
para considerar el inicio del tratamiento.
El tratamiento de pacientes en estos estadios precoces con agentes alquilantes no
proporciona ninguna mejoría en la supervivencia con respecto a esperar para iniciar el
tratamiento a que experimenten alguna progresión de la enfermedad18,19. Aproximadamente
la mitad de los pacientes permanecen asintomáticos tras 11 años de seguimiento sin
tratamiento19; por otra parte, los tratamientos que utilizamos actualmente no se consideran
curativos para esta enfermedad.
1.6 Sistemas pronósticos en la leucemia linfática crónica:
estadios de Rai y Binet
Como hemos descrito, la mayoría de los pacientes con LLC se diagnostican en
estadios precoces de la enfermedad; el curso clínico de este subgrupo es muy heterogéneo,
mientras algunos pacientes viven décadas sin necesitar ningún tratamiento otros
experimentan una progresión muy rápida de su enfermedad. Como ya hemos mencionado la
evidencia clínica disponible nos indica que el tratamiento de pacientes en estos estadios
precoces con agentes alquilantes no proporciona ninguna ventaja en la supervivencia con
respecto a esperar para iniciar el tratamiento a que experimenten alguna progresión de la
enfermedad18,19. Basado en esta evidencia, el manejo de los pacientes recién diagnosticados
en estadios precoces consiste en la monitorización activa demorando el tratamiento hasta
que la enfermedad progrese. En muchas ocasiones esta actitud es difícil de asumir para los
pacientes al existir la creencia de que uno de los principios fundamentales para la curación
en cáncer es la detección y tratamiento de la forma más precoz posible. Por tanto, a muchos
pacientes les cuesta asumir que les hemos diagnosticado una “leucemia” y la estrategia que
seguiremos es esperar a que empeore de su enfermedad antes de iniciar el tratamiento. Con
mucha frecuencia esta información causa gran ansiedad20 e incluso años después del
diagnóstico muchos pacientes piensan diariamente en su leucemia y en la posibilidad de
progresión con profunda preocupación, lo que afecta a su calidad de vida21. Por otra parte,
informar al paciente de que se trata de una leucemia “de curso benigno” tampoco es
adecuado pues en algunos pacientes diagnosticados en estadios precoces progresa
rápidamente y puede causar la muerte en pocos meses.
El uso de sistemas y factores pronósticos nos permite: informar a cada paciente de
un modo adecuado basándonos en su riesgo individual, estratificar a los pacientes en
ensayos clínicos y en ocasiones, nos proporciona conocimientos de la biología de la
21
enfermedad. En definitiva, juegan un papel importante en la orientación y manejo de los
pacientes con LLC.
Los estadios de Rai22,23 y Binet24 identifican grupos de riesgo basándose en
características clínicas y de laboratorio y reflejan fundamentalmente el volumen de masa
tumoral; se usan para definir la extensión de la enfermedad y el pronóstico. Aunque se
correlacionan de forma global con la supervivencia, no identifican correctamente a muchos
pacientes diagnosticados en estadios precoces que progresarán rápidamente y presentarán
una supervivencia muy inferior a la esperada25. En estadios iniciales, que es donde se sitúan
la mayoría de los pacientes al diagnóstico, algunos presentan una evolución benigna
permaneciendo estables durante muchos años mientras otros muestran un curso clínico
progresivo con una evolución rápida a estadios más avanzados y supervivencia corta. Por
este motivo continuamente se investigan nuevos factores pronósticos que permitan
identificar a los pacientes que presentarán una evolución agresiva.
Tabla 3. Estadiaje clínico de Rai (1975, 1987)22,23
Estadio Características Supervivencia
(años)
A Linfocitosis con menos de 3 áreas ganglionares sin
anemia ni trombopenia 15
B Linfocitosis con tres o mas áreas ganglionares sin anemia
ni trombopenia 5
C Linfocitosis con anemia (hemoglobina menor de 100
gr/L) o trombopenia (plaquetas menores de 100x109/L) 3
Tabla 4. Estadiaje clínico de Binet (1981)24.
Riesgo Estadio Características Supervivencia
Bajo 0 Linfocitosis aislada (sangre y
medula ósea) Más de 13 años
I Linfocitosis más adenopatías
Intermedio
II Linfocitosis más esplenomegalia
o hepatomegalia
8 años
III Linfocitosis mas anemia
(hemoglobina <110 gr/L) Alto
IV Linfocitosis mas trombopenia
(plaquetas< 100x109/L)
2 años
22
En general, distinguimos los estadios precoces o intermedios que se caracterizan por
linfocitosis con o sin linfadenopatías y/u organomegalias (Rai 0-II, Binet A y B) de los
estadios avanzados que presentan anemia y trombopenia (Rai III-IV, Binet C). La
supervivencia varía desde más de 10 años en los estadios precoces hasta 1-2 años en los
estadios más avanzados.
1.7 Nuevos sistemas pronósticos: IP MDACC y índice GIMEMA
Teniendo en cuenta las limitaciones del sistema de estadios de Rai y Binet ya
descritas, Wierda y colaboradores tras el análisis de 1674 pacientes diagnosticados de LLC
en el MD. Anderson Cancer Center han propuesto en el año 2007 un nomograma e índice
pronóstico (IP MDACC)26. Este se basa en los seis parámetros con influencia en la
supervivencia resultantes del análisis multivariante que fueron la edad, cuantificación de β2-
microglobulina, cifra de linfocitos, el sexo, el estadio de Rai y el número de áreas nodales
afectas. Se trata de un modelo predictivo de la supervivencia global de pacientes a los 5 y 10
años y que puede ayudar a tomar decisiones clínicas y en investigación.
Puntos
Características 0 1 2 3
Edad (años) --- <50 50-65 >65
β2-microglobulina (mg/L) < vn* 1-2 x vn* >2 x vn* ---
Linfocitos (x109/L) <20 20-50 >50 ---
Sexo Mujer Varón --- ---
Estadio de Rai 0-II III-IV --- ---
Numero de regiones nodales ≤2 3 --- ---
*vn: valor normal.
Grupo de
riesgo Índice Número
pacientes SG en 5 años SG en 10 años RR 95% CI
Bajo 1-3 194 0,97 (0,01) 0,80 (0,05) 1,00 Referencia
Intermedio 4-7 1236 0,80 (0,01) 0,52 (0,03) 3,89 2,42-6,26
Alto ≥8 187 0,55 (0,04) 0,26 (0,06) 10,48 6,27-17,53
SG: Supervivencia global, 95% CI: intervalo de confianza del 95%; RR: riesgo relativo.
Tabla 5. Índice pronóstico IP MDACC. a) Puntuación IP MDACC. b) Probabilidad de supervivencia global y riesgo relativo según grupo de riesgo IP MDACC.
Así mismo, teniendo en cuenta que la mayoría de pacientes en el momento del
diagnóstico se encuentran en estadios precoces, el Gruppo Italiano Malattie Ematologiche
Maligne dell´Adulto (GIMEMA) ha propuesto otro sistema pronóstico para predecir la
23
progresión de la enfermedad de los pacientes en estadios iniciales (A de Binet)27. El grupo
GIMEMA realizó un estudio multicéntrico donde se evaluaron 1138 pacientes con LLC en
estadio A de Binet con sus supervivencias libres de progresión, considerando que estas
posiblemente se correlacionen con la supervivencia global. Con los datos obtenidos se
elaboró un sistema estratificado de riesgo con tres estadios que resultan de sumar las
variables que fueron significativas en el análisis multivariante: tiempo de doblado linfocitario
menor de 12 meses, subestadio de Rai avanzado (I-II) y linfocitosis periférica (>30x109/L).
Además, si se tiene en cuenta el sexo, se observa que este sólo afecta a los pacientes con
escore 0. Finalmente, con los resultados anteriores se distinguen tres grupos de riesgo:
mujeres escore 0, varones escore 0 y ambos sexos escore 1-3 que presentan supervivencias
libres de progresión a los 10 años de 76,2%, 61,4% y 37,8% (p<0,01) respectivamente.
Características Puntuación
Tiempo de doblado linfocitario <12 m 1
Linfocitos >30x10 9/L 1
Subestadio de Rai I-II 1
Tabla 6. Índice GIMEMA para pacientes con leucemia linfática crónica en estadio A de Binet. Según el sexo se distinguen mujeres escore 0, varones escore 0 y ambos sexos escore 1-3.
1.8 Factores pronósticos en la leucemia linfática crónica
En los últimos años se han desarrollado numerosos estudios que han ido
estableciendo parámetros de mal pronóstico en la LLC como pueden ser los valores elevados
de β2-microglobulina28-30, deleciones del 17p31,32 u otras disfunciones del p5333,34, deleciones
del 11q31, mutaciones de los genes de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IgVH)35-37,
la expresión de ZAP-7038-40 o de CD38 en los linfocitos B clonales36,37,41,42. Por separado, el
valor pronóstico de cada uno de estos factores es limitado, algunos de ellos no son accesibles
en la práctica clínica diaria y aunque ayudan a predecir la progresión y supervivencia (incluso
en pacientes en estadios iniciales), presentan problemas por falta de estandarización,
diferentes puntos de corte en los distintos estudios y falta de validación en estudios
prospectivos. Por ese motivo se continúan investigando nuevos factores pronósticos que
sean aplicables en la clínica y/o nos ayuden a comprender el comportamiento de los
linfocitos leucémicos.
El estudio de algunos factores pronósticos nos ha ayudado a conocer la biología de
esta enfermedad; uno de los hitos más importantes ha sido el estudio de las mutaciones
somáticas en los genes de la región variable de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas
(IgVH). La descripción de que la LLC podía tener hipermutaciones en los genes de IgVH se
24
realizó ya en 199443, pero no fue hasta finales de los años 90 cuando dos grupos
independientes demostraron la diferente evolución clínica entre pacientes con mutaciones
somáticas en la región variable de los genes de IgVH o sin ellas35,36. Se ha demostrado en
numerosos estudios que el estado mutacional es clínicamente relevante ya que, mientras la
LLC con genes IgVH no mutados muestra un curso rápidamente progresivo y un pronóstico
desfavorable, las LLC que presentan genes IgVH mutados presentan tendencia a la
progresión lenta con supervivencias más prolongadas35,36,37.
En función del estado de mutación VH, se distinguen dos tipos de LLC con diferente
evolución:
• LLC con genes IgVH no mutados cuyo origen celular se sitúa a nivel pregerminal en
células sin memoria inmunológica.
• LLC con genes IgVH mutados cuyo origen celular esta situado en el centro germinal
en células con memoria inmunológica.
No obstante, en la mayoría de los centros donde se tratan pacientes con LLC no se
dispone de estas técnicas diagnósticas moleculares de rutina por lo que se ha tratado de
correlacionar el estado mutacional de los genes VH con otros marcadores que sean asequibles
a la mayoría de laboratorios. En 1999, Damle y cols. publicaron sus resultados sobre el
análisis del estado mutacional de IgVH y observaron una correlación entre la expresión del
antígeno de activación celular CD38 en las células de LLC y la ausencia de mutaciones y
viceversa36. Los casos CD38 positivos presentan una supervivencia inferior a los CD38
negativos. En otros estudios, se ha demostrado el valor pronóstico independiente del estado
mutacional y la expresión de CD3844. Los estudios realizados sugieren que el CD38 no sólo
es un marcador diagnóstico, sino que se le ha atribuido un papel en la patogenia de la
enfermedad. Se trata de un receptor transmembrana que induce proliferación e incrementa
la supervivencia de los linfocitos leucémicos tras interaccionar con células del microambiente
a través de CD31 un ligando que se expresa en células del estroma45.
La mayor parte de factores pronósticos que se han identificado se correlacionan con
características del clon celular neoplásico y no pueden ser modificados mediante el
tratamiento aunque algunos si se podrían utilizar como dianas terapéuticas. Por otra parte,
mediante el estudio de perfiles de expresión génica se ha observado una gran homogeneidad
en cuanto la firma genética de todos los casos de LLC independientemente de que se trate
de formas estables o agresivas11. La interacción con el microambiente y más concretamente
con el sistema inmunitario podría también explicar la diferente evolución de la enfermedad,
aunque esto es menos conocido. La principal importancia de la identificación de factores
relacionados con el control ejercido por el sistema inmunitario es que estos podrían ser
25
modificados mediante drogas inmunomoduladoras, vacunas o terapias celulares que
favorezcan este control.
2. Concepto y funcionamiento del sistema
inmunitario
El sistema inmunitario surgió durante la evolución de los vertebrados para combatir
las infecciones causadas por virus, bacterias, hongos, protozoos y helmintos que pueden ser
responsables de infecciones intracelulares y extracelulares, lo que implica una respuesta
inmunitaria diferente en cada caso. Además de combatir cualquier tipo de patógeno,
mantiene la tolerancia a los componentes del propio organismo y es responsable de la
erradicación de algunos tumores (derivado de su capacidad de tolerancia “a lo propio” y
rechazo a “lo extraño”).
Existe un sistema inmunitario innato que es capaz de reconocer de forma inmediata
ciertos microorganismos y destruirlos. No reconoce cada patógeno en particular sino
patrones moleculares comunes a un grupo o familia entera de patógenos, es capaz de
destruir microorganismos con los que no hemos estado en contacto previamente y no
presenta memoria inmunológica. Está constituido por las barreras exteriores de nuestro
organismo (piel, mucosas, secreciones), por las proteínas del complemento, fagocitos
(monocitos/macrófagos y neutrófilos) y células NK.
Además existe otro sistema inmunitario adaptativo caracterizado por ser inducible,
por su especificidad para reconocer antígenos mediante selección clonal y por presentar
memoria inmunológica; las células implicadas son los linfocitos.
2.1 Base celular de la respuesta inmunitaria adaptativa
La respuesta inmunitaria adaptativa es capaz de reconocer patógenos con los que
nunca hemos entrado en contacto previamente. Las células inmunológicas responsables de la
misma son los linfocitos. Existen dos tipos de linfocitos, T y B, que a su vez constan de
diversas subpoblaciones que pueden ser diferenciadas por sus características inmunológicas,
enzimáticas, morfológicas y funcionales. Son capaces de reconocer diferentes patógenos
tanto fuera (linfocitos B) como dentro de las células del organismo (linfocitos T). La base del
reconocimiento de los diferentes patógenos es la gran variabilidad de linfocitos T y B
diferentes; existen aproximadamente 1011 linfocitos B y T diferentes, cada uno de los cuales
26
porta un receptor capaz de reconocer a un antígeno de forma específica (BCR y TCR
respectivamente) lo que les permite reconocer prácticamente cualquier estructura molecular
de una forma específica.
Cada linfocito B presenta en su superficie una inmunoglobulina diferente (BCR), y por
tanto, cada uno reconoce de forma específica un antígeno de los patógenos extracelulares o
sus productos solubles. Cuando un linfocito B encuentra un antígeno específico para su
receptor, se divide rápidamente formando un clon de células que presentan el mismo
receptor BCR, proceso denominado “selección clonal”. Se requiere al menos una semana
para desarrollar esta proliferación; por este motivo la inmunidad innata es esencial para la
supervivencia del individuo mientras se pone en marcha la respuesta adaptativa. Una vez se
han generado suficientes células, estas dejan de dividirse y se diferencian en células
plasmáticas que son capaces de segregar al plasma sanguíneo una forma soluble del
receptor de membrana con el que reconoció al patógeno (anticuerpo). Estos anticuerpos se
unen al antígeno “marcándolo como extraño” y facilitando su destrucción por el sistema de
complemento y los fagocitos. Algunos de estos linfocitos B persisten como células de
memoria de forma que si contactamos posteriormente con ese antígeno, la respuesta
inmunitaria es mucho más rápida.
Algunos microorganismos como los virus o micobacterias evaden esta respuesta pues
penetran en el interior de las células donde no pueden penetrar los anticuerpos pues son
hidrosolubles y es necesario que el sistema inmunitario ponga en marcha otro tipo de
respuesta. Los linfocitos T no reconocen el antígeno en forma soluble sino que reconocen
pequeños fragmentos de ellos asociados a las moléculas de histocompatibilidad o MHC.
Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I, presentan sobre
la superficie celular péptidos derivados de proteínas degradadas en el citosol. En las células
sanas, los péptidos que se presentan en la superficie de las células por las moléculas MHC de
clase I son propias y no se produce respuesta, o sea, existe “tolerancia a lo propio”; pero
cuando estas células están infectadas y presentan péptidos derivados de microorganismos,
son reconocidas por los linfocitos T CD8, Tc o citotóxicos. Estos linfocitos T CD8 interaccionan
con las células diana y liberan una proteínas denominadas perforinas que las lisan en pocos
minutos o a través de determinadas moléculas de su membrana interaccionan con moléculas
de la célula diana induciendo apoptosis de las mismas. De este modo destruyen las células
infectadas fundamentalmente por virus e impiden el desarrollo de la infección.
Pero no todos los microorganismos celulares crecen en el citosol, algunas como las
micobacterias crecen en los lisosomas, se degradan en los mismos y son presentadas por las
moléculas MHC de clase II. Estas moléculas de clase II también unen péptidos procedentes
27
de proteínas extracelulares que han sido internalizadas por las células presentadoras de
antígenos mediante endocitosis o fagocitosis. Los péptidos unidos a moléculas de clase II son
reconocidos por otra subpoblación de linfocitos los T CD4 o helper o Th. Existen dos tipos de
linfocitos Th que difieren en algunas de las citocinas que pueden sintetizar: Th1 o
inflamatorios que cooperan con los macrófagos en la destrucción de microorganismos como
los micobacterias y los Th2 que cooperan con los linfocitos B en la producción de anticuerpos.
Características Linfocitos T Linfocitos B
Origen Célula germinal hemato-
poyética linfoide
Célula germinal hematopo-
yética linfoide
Órgano linfoide primario Timo Médula ósea
O. linfoides secundarios:
Ganglio
Bazo
Zona subcapsular interfolicular Zona periarteriolar de la pulpa blanca
Folículos linfoides primarios y secundarios Folículos de la pulpa blanca y dispersos en la pulpa roja
Porcentaje en sangre 65-75% 10-20%
Función primordial CD4 cooperar con linfocitos B
(Th2) y con los macrófagos
(Th1)
CD8 función citotóxica
Síntesis de inmunoglobulinas
Morfología Células pequeñas o medianas con gránulos citoplasmáticas ocasionales o ausentes y basofilia citoplasmática
Células medianas o grandes con gránulos citoplasmáticos ocasionales y menor basofilia.
Tabla 7. Características de los linfocitos T y B.
Los linfocitos T constituyen el 65-75% de los linfocitos de sangre periférica y la
relación entre linfocitos T CD4 y CD8 es de 1,5-2,5. El receptor TCR de los linfocitos T CD4 y
CD8 está constituido por dos cadenas α y β. Existe un tercer tipo de linfocito T denominado
linfocito Tγδ, que presenta un TCR distinto a los linfocitos T CD4 y CD8. Esta subpoblación
constituye una pequeña proporción de los linfocitos circulantes y no se conoce exactamente
su papel biológico, aunque podrían dedicarse a la lisis de células infectadas por virus herpes,
quizá por micobacterias y también están implicadas en la vigilancia antitumoral.
2.2 Células NK
Las células NK (Natural Killer o asesinas naturales) fueron identificadas
originariamente por su citotoxicidad, es decir su capacidad de matar “in vitro” células de
origen tumoral. Actualmente se sabe que desempeñan un papel importante en la defensa
frente a patógenos citoplasmáticos, especialmente virus y frente a tumores. Además de su
función citotóxica también tienen capacidad para producir diversas citocinas, y por tanto,
28
también tienen una función reguladora. Aunque son células de origen linfoide no expresan
CD3 ni reordenan el TCR ni expresan BCR ni reordenan los genes de las inmunoglobulinas.
Por tanto, no son linfocitos T ni B y se considera que constituyen un tercer tipo de células de
linaje linfoide. Suponen entre el 5 y el 15% de los linfocitos circulantes en sangre periférica y
están presentes en todo el organismo ya sea en órganos linfoides u otros tejidos. A
diferencia de los otros tipos de linfocitos no existe un marcador universal que permita
identificar a todas las células NK y su definición sigue siendo más funcional que fenotípica
aunque son útiles para su diferenciación la positividad de CD16 y CD56. Están
estrechamente relacionados con la respuesta inmunitaria innata ya que son capaces de
activarse en presencia de antígenos con los que no han sido previamente sensibilizados.
Su función depende de la activación de receptores inhibidores o activadores como los
receptores KIRs “killer cell inmunoglobulina-like receptors” que son receptores inhibidores
que interaccionan con moléculas MHC de clase I o receptores activadores como el “receptor
NKG2D” que tiene numerosos ligandos inducibles en las células tumorales o infectadas por
virus. Además son capaces de reconocer y lisar células tumorales que están opsonizadas por
IgG a través del receptor CD16 o Fcγ-RIII presente en su superficie, a este fenómeno se le
denomina citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC); aunque no se ha observado una
gran relevancia de este mecanismo en la eliminación de tumores primarios, si parece ser
importante cuando se utilizan anticuerpos monoclonales como el Rituximab en síndromes
linfoproliferativos crónicos. Las células NK contienen en su citoplasma gránulos portadores de
perforina, que es una proteína que polimeriza sobre la membrana de las células diana
formando poros y granzimas que son serin-proteasas que actúan en conjunción con la
perforina induciendo apoptosis en las células diana. También estimulan la respuesta
inmunitaria adaptativa mediante la producción de citocinas como el interferón-γ46.
3. Sistema inmunitario frente al cáncer
3.1 Sistema inmunitario: papel en el control de las
proliferaciones neoplásicas
El sistema inmunitario es capaz de destruir “lo extraño” y tolerar “lo propio”, por lo
que además de la defensa frente a las infecciones tiene la capacidad de destruir células
tumorales gracias a los cambios que presentan estas respecto a células normales.
Una de las primeras evidencias sobre la capacidad del sistema inmunitario de
destruir células cancerígenas fue publicada por el Dr. William Coley (1862-1936) cirujano del
29
Memorial Hospital de New York que describió la remisión de un sarcoma óseo en un paciente
que sufrió erisipela e hipotetizó por primera vez que la activación del sistema inmunitario en
respuesta a la infección indujo la remisión del cáncer. Era necesaria una base teórica para
explicar estos hechos y fue Paul Ehrlich en 1909 el primero que postuló que la incidencia de
cáncer sería mayor si no fuese por la vigilancia que ejerce el sistema inmunitario.
En 1967, Burnet y Thomas postularon la “Teoría de la inmunovigilancia” cuya
hipótesis consistía en que los linfocitos T son capaces de reconocer y destruir células
tumorales. La inmunodeficiencia debía aumentar la frecuencia de tumores y la potenciación
del sistema inmunitario por el contrario tendría el efecto opuesto. Esta teoría fue desafiada
por los trabajos de Osias Stutman en 1974, quien observó que ratones atímicos o nude no
mostraban mayor sensibilidad a la inducción de tumores por carcinógenos químicos y no
desarrollaban mayor frecuencia de tumores espontáneos no virales que los ratones
normales47. Estos trabajos fueron confirmados el mismo año por Rygaard y Polvsen mediante
el estudio de 10.800 ratones nude seguidos un periodo de 3-7 meses; por lo que la teoría de
la inmunovigilancia fue ampliamente rechazada48. A la luz de los conocimientos actuales
sabemos que los modelos murinos utilizados no eran completamente inmunodeficientes,
pues los ratones nude presentan una población de linfocitos Tαβ circulantes que persisten
durante cierto tiempo después de eliminar el timo de los ratones, y además poseen células
NK y linfocitos Tγδ pues son de maduración extratímica en los ratones y por otra parte, los
tiempos de seguimiento que emplearon eran muy cortos. Sin embargo, a raíz de estos
experimentos se impuso la idea entre los inmunólogos de que el sistema inmunitario no era
capaz de eliminar los cánceres de origen no vírico y el estudio de la respuesta inmunitaria
contra el cáncer permaneció por muchos años en el olvido. Sólo a partir del año 2000 se ha
podido estudiar el efecto del sistema inmunitario contra el cáncer en ratones modificados
genéticamente knock out completamente inmunodeficientes. El estudio de estos nuevos
modelos murinos ha llevado a la conclusión de que la vigilancia inmunológica tiene un papel
importante en el control de cánceres espontáneos e inducidos y en particular de neoplasias
hematológicás.
La teoría de la inmunovigilancia ha sido refinada a partir del año 2002 por Dunn y
colaboradores en la teoría denominada “inmunomodulado del cáncer”49; según esta teoría la
respuesta inmunitaria frente al cáncer es un proceso más dinámico y complejo que la simple
eliminación o no eliminación del tumor; incluso cuando el sistema inmunitario es incapaz de
eliminar las neoplasias, modela o esculpe su fenotipo. Es decir el sistema inmunitario
actuaría eliminando las variantes tumorales más inmunogénicas, seleccionando las variantes
menos inmunogénicas que serían capaces de evadir la respuesta inmunitaria. Este
“inmunomodulado” del cáncer tendría tres fases:
30
• Fase de eliminación: se eliminan las variantes celulares más inmunogénicas de
modo que son las variantes menos inmunogénicas las que pasan a la siguiente fase.
• Fase de equilibrio: en esta fase el tumor está más o menos controlado por el
sistema inmunitario, pero las células menos inmunogénicas van acumulando
mutaciones por la inestabilidad genética que presentan debida a la inestabilidad en
los mecanismos de reparación del ADN, de los microsatélites y de los cromosomas.
• Fase de escape: las células consiguen evadir la respuesta inmunitaria y dan lugar a
una proliferación incontrolada y progresión tumoral. Consecuentemente, las
neoplasias que se observan en la clínica presentan numerosos mecanismos para
evadir el sistema inmunitario.
Figura 3. Inmunomodelado del cáncer: etapas del proceso. a) Fase de eliminación en la que el sistema inmunitario reconoce y destruye a las células tumorales más inmunogénicas. b) Fase de equilibrio: las células menos inmunogénicas no son reconocidas y van acumulando mutaciones, mientras que el sistema inmunitario continua eliminando las variantes más inmunogénicas que aparecen. c) Fase de escape: las variantes tumorales poco inmunogénicas consiguen evadir la respuesta inmunitaria y proliferar.
3.2 Células del sistema inmunitario implicadas en la
eliminación de las células tumorales
En la inmunovigilancia participan tanto la respuesta inmunitaria innata como
adaptativa; en base a resultados experimentales y clínicos se postula que las células
implicadas en la respuesta inmunitaria frente al cáncer son principalmente los Tαβ citotóxicos
CD8+, los linfocitos Tγδ y las células NK. No parece que la producción de anticuerpos
constituya un mecanismo importante en la respuesta del sistema inmunitario frente a la
mayoría de los tumores.
Los linfocitos T citotóxicos o T CD8 reconocen a las células cancerosas a través de
“antígenos tumorales” que han sido procesados y presentados en combinación con
moléculas del MHC de clase I. Estos antígenos tumorales pueden ser muy diversos: proteínas
31
oncogénicas mutadas o normales con expresión aberrante, antígenos oncovirales,
oncofetales o de diferenciación específica de tejido.
Como ya hemos descrito, los linfocitos Tγδ representan una pequeña subpoblación de
linfocitos T. Se conoce muy poco sobre el mecanismo de activación y de las moléculas
antigénicas que estimulan a los linfocitos Tγδ, aunque parece que no necesitan que los
antígenos sean procesados y presentados unidos a moléculas del MHC.
Las células NK tienen un papel crucial en la respuesta frente a tumores, de hecho su
nombre “natural killer” proviene de la capacidad que tienen de destruir células tumorales de
forma no restringida por MHC “in vitro”. Sólo recientemente se ha comenzado a entender los
mecanismos que regulan y activan estas células. Su mecanismo de acción implica el
reconocimiento a través de sus receptores de un ligando en la superficie de las células diana
y la liberación de sus gránulos citoplasmáticos conteniendo perforinas y granzimas. La
activación de las células NK está sometida a una exquisita regulación por parte de receptores
inhibidores y activadores que posee en su superficie50. Existen dos teorías que pretenden
explicar los mecanismos involucrados en la regulación de su actividad.
o En 1986, Kärre y cols. propusieron la “teoría de pérdida de lo propio” o “missing
self theory”51, según la cual las células NK tienen en su superficie receptores
reguladores de su actividad citotóxica. Los ligandos de estos receptores son las
moléculas MHC de clase I: HLA-A, -B, -C y –G. La unión de los receptores inhibidores a
las moléculas de MHC de clase I protege a la célula diana de la lisis mediada por células
NK. Algunas células tumorales inhiben la expresión de moléculas MHC de clase I para
disminuir la inmunogenicidad del tumor, esto las permite evadir la respuesta inmunitaria
mediada por linfocitos T, pero permite el reconocimiento y destrucción por las células NK.
o En la última década, Bauer y cols. han propuesto un segundo mecanismo de
reconocimiento por parte de las células NK que constituye la “teoría de inducción de lo
propio” o “induced self theory”52 según la cual las células NK presentan en su
superficie receptores activadores, de los que el mejor conocido se denomina NKG2D, que
es capaz de activar las células NK e inducir respuestas citotóxicas en presencia de
moléculas MHC de clase I en la célula diana. Este receptor activador tiene una serie de
ligandos que no se expresan de forma constitutiva en las células, sino como
consecuencia del estrés o daño genotóxico. Las células NK reconocerían estos ligandos a
través del receptor NKG2D, y esto implicaría la activación de células NK y la eliminación
de las células sometidas a estrés.
32
Figura 4. “Pérdida de lo propio” e “Inducción de lo propio”. Dos modelos de activación de las células NK. A. La pérdida de la expresión de las moléculas de MHC-I en la superficie de las células infectadas o transformadas, tiene como efecto la ausencia de señales de inhibición en las células NK y se traduce en una activación de las mismas. B. La expresión de moléculas de estrés celular como MICA/B o ULBPs en la superficie de las células dañadas es detectada por el receptor activador NKG2D de las células NK y activa los mecanismos de citotoxicidad de las mismas53.
3.3 Receptor NKG2D y sus ligandos: MICA, MICB y ULBPs
El receptor NKG2D reconoce moléculas que se inducen en las células diana en
respuesta al daño y estrés celular. Se expresa en las células NK, en linfocitos T CD8 αβ,
linfocitos T γδ y también en algunos linfocitos T CD4 y su función es activar las células NK
además de generar señales que estimulan o coestimulan a los linfocitos T. El receptor
NKG2D, también conocido por KLRK1 o CD314, es una glicoproteína de membrana de 42
kDa, homodimérica, de tipo lectina que tiene como ligandos a dos familias de moléculas que
son miembros distantes de la familia de moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad MHC de clase I: una de estas familias está formada por MICA y MICB
(proteínas A y B relacionadas con la cadena de clase I del complejo mayor de
histocompatibilidad codificadas en la región MHC) y otro grupo constituido por al menos 5
proteínas de membrana llamadas “UL16 binding proteins” o ULBP1-5. La citotoxicidad
mediada por las células NK se correlaciona con la expresión y densidad de superficie en las
células diana de los ligandos MICA o ULBPs54.
Una vez que el receptor NKG2D se une con sus ligandos, involucra en su
acoplamiento a cuatro unidades de una proteína adaptadora de membrana conocida como
DAP10. Esta proteína conformada como 2 homodímeros forma una estructura hexadimérica
NKCél. �K Cél. �K
Célula �ormal
InfecciónTransformación
ReceptoresInhibidores
KIRCD94-�KG2A
MHC clase I MHC clase I
NK�K
Célula �ormal
InfecciónTransformación
ReceptoresInhibidores
KIRCD94-�KG2A
MHC clase I MHC clase I
NKCél. �KCél. T
Cél. �KCél. T
Cél. �KCél. T
Cél. �KCél. T
Célula �ormal
Estrés
Activación
ReceptoresActivadores
�KG2D
MICULBP
NKT
Célula �ormal
Estrés
Activación
ReceptoresActivadores
�KG2D
MICULBP
Activación
�K �K
T�K
Inhibición
A. Perdida de lo propio B. Inducción de lo propio
33
con NKG2D y activa la vía de la fosfatidilinositol 3 cinasa (PI3K) lo que conlleva, en último
término, a la liberación de los gránulos citoplasmáticos de perforina y granzima de las células
NK sobre su célula diana y de este modo induce su apoptosis55-57. Adicionalmente se
producen citocinas como el interferón-γ que inducen la estimulación de otras células del
sistema inmunitario. Las señales de activación son dominantes frente a las de inhibición por
lo que la expresión de los ligandos de NKG2D en una célula puede desencadenar una
respuesta citotóxica aunque también exprese moléculas inhibidoras en su superficie55.
Mientras que las moléculas MHC de clase I se expresan de manera ubicua, una de las
características de los ligandos NKG2D es que su expresión es restringida en células benignas
e inducible en respuesta al estrés celular, fenómeno que se observa frecuentemente en
células infectadas por virus y células neoplásicas como en leucemias58 y además la expresión
es diferente en los distintos tipos tumorales. No se sabe el motivo de la existencia de tal
cantidad de ligandos para un mismo receptor. Una de las características más interesantes del
receptor NKG2D es su capacidad para reconocer y unirse a diferentes ligandos con similar
afinidad. Este hecho, llamativo en sí mismo, lo es más si se tiene en cuenta que estas
moléculas muestran una baja similitud en cuanto a secuencia proteica (20-40%)59.
Los genes que codifican para estas moléculas se encuentran localizados en el cromosoma
6, con la diferencia de que MICA se encuentra incluido en el brazo corto, en la región del
MHC, mientras que las ULBPs se encuentran localizadas en el brazo largo del cromosoma.
o MICA y MICB constituyen una familia muy polimórfica de proteínas de modo que se
conocen más de 60 alelos de MICA y unos 25 de MICB y a pesar de que comparten una
similitud con sus vecinas las MHC de clase I (28-35%), existen claras diferencias en su
estructura. Como ya hemos comentado son miembros distantes de la familia de las
moléculas de MHC de clase I y como ellas poseen dominios extracelulares α1, α2, α3 y
un corto dominio transmembrana, pero no se unen a β2-microglobulina ni son
presentadoras de antígenos59. Las moléculas MIC tienen una expresión restringida en
células normales, pero su expresión se induce por shock térmico, estrés oxidativo,
infecciones por patógenos, en respuesta al daño genotóxico y a la exposición a
determinadas moléculas como el ácido trans-retinoico60-62. Su expresión es un marcador
de daño que se produce en la célula estresada, transformada o infectada, para favorecer
su eliminación por parte del sistema inmunitario. Numerosas líneas tumorales expresan
MICA/B en contraste con las células primarias, lo que indica que estas moléculas están
asociadas con el proceso tumoral.
o Las ULBPs reciben su nombre por su capacidad de unión a la glicoproteína UL16 del
citomegalovirus63, característica que comparten con MICB. En esta familia hay 5
34
miembros conocidos denominados ULBP1-5; a diferencia de las moléculas MIC, las ULBPs
son codificadas fuera de la región génica del MHC, en el cromosoma 6q2560. Las ULBPs
carecen del dominio α3, pero mantienen semejante la región α1 y α2 que es la zona de
reconocimiento del receptor NKG2D y se unen a la membrana bien por medio de
glicosifosfatidilinositol (GPI) en el caso de ULBP1, 2 y 363,64 o por un dominio
transmembrana típico en el caso de ULBP4 y 565,66. Como ya hemos comentado, estas
moléculas presentan una expresión restringida en células sanas, pero su expresión se
induce en respuesta al estrés celular60,64. Aunque no existen muchas evidencias, se ha
descrito que su expresión es más frecuente en cánceres hematológicos, sin embargo no
se expresan frecuentemente en tumores epiteliales. Nuestro grupo ha descrito
recientemente que la expresión de las ULBPs en cánceres epiteliales está reprimida por
mecanismos epigenéticos, concretamente se ha demostrado que su expresión es inhibida
por la histona desacetilasa 3 (HDAC3) en células de cáncer de cerviz uterino y en
carcinoma de colon67.
Uno de los principales mecanismos que induce la expresión de estas moléculas, tanto
MICA como las ULBP es el daño genotóxico. Cuando existe un daño al DNA, la respuesta
además de parar el ciclo celular para permitir funciones de reparación o inducir la apoptosis,
alerta al sistema inmunitario de la presencia de células potencialmente peligrosas. En
conjunto, este sistema constituye un nuevo paradigma de reconocimiento del sistema
inmunitario, en el que no se reconocen antígenos extraños, sino que el sistema inmunitario
reconoce los cambios que las infecciones o transformación tumoral causan a nuestras
células. Los resultados “in vitro” e “in vivo” sugieren que este sistema tiene una gran
relevancia en la inmunovigilancia frente al cáncer, por lo que la inducción farmacológica de la
expresión de estas moléculas puede suponer una estrategia muy atractiva en su tratamiento.
Figura 5. Ligandos del receptor NKG2D. Existen dos familias de ligandos de NKG2D, codificadas en distintas regiones del cromosoma 6. Los números y las letras indican el nombre de la molécula en cada familia.
ULBP MIC HLA-I
Cromosoma 6
B CB A A52 413
MHC
α1 α2
α3
β2
α1 α2
α1 α2
α3
GPI
35
3.4 Mecanismos de escape al sistema inmunitario: MICA y
MICB solubles
Cuando el sistema inmunitario es incapaz de eliminar completamente un tumor,
esculpe su fenotipo, eliminando las variantes más inmunogénicas y favoreciendo el desarrollo
de tumores que no son reconocidos por el sistema inmunitario49. Por ello, las células
cancerosas desarrollan numerosos mecanismos de evasión de la respuesta inmunitaria que
favorecen la progresión tumoral. Una de las tareas más difíciles a las que se enfrenta el
campo de la inmunología tumoral es descifrar estas estrategias de evasión y truncarlas para
que el sistema inmunitario pueda recuperar su competencia en la lucha contra los procesos
tumorales que se encuentran en la fase de escape inmunológico, lo que nos posibilitaría
intervenciones inmunoterapéuticas específicas.
Básicamente los mecanismos de evasión del tumor por el sistema inmunitario pueden
diferenciarse en dos categorías: inducción de tolerancia por el tumor y resistencia a la
muerte por las células efectoras del sistema inmunitario activadas. La inducción de tolerancia
por el sistema inmunitario puede ser debida a que el tumor es ignorado por el sistema
inmunitario o a que de forma activa induce “anergia” 68.
Por tanto, uno de los mecanismos de escape al sistema inmunitario puede ser la
disminución de la inmunogenicidad del tumor y puede estar motivado por la disminución o
pérdida de moléculas presentadoras de antígeno MHC de clase I en las células tumorales,
evitando así que los linfocitos citotóxicos reconozcan los antígenos extraños que se generan
en los tumores. Este mecanismo se ha descrito en muchos tumores por mutaciones o
deleción de los genes de la β2-microglobulina o por mecanismos epigenéticos reversibles.
Los estudios que se han realizado buscando correlación entre la expresión de MHC de clase I
y el pronóstico no son consistentes, pues además debemos tener en cuenta que las células
NK pueden reconocer y destruir células con bajos niveles de moléculas MHC de clase I (teoría
de pérdida de lo propio). Otro mecanismo para disminuir la inmunogenicidad consiste en la
pérdida de antígenos asociados al tumor, pero pese a que se han realizado muchos estudios,
este mecanismo no se ha podido demostrar “in vivo”. También puede ser que el tumor
induzca de una forma activa inmunosupresión a través de la elaboración de citocinas como
TGF-β o IL-10 en el microambiente tumoral que modulan el sistema inmunológico inhibiendo
la proliferación de los linfocitos T o a través de linfocitos T reguladores (Tregs) que son
linfocitos T (CD4+CD25+Foxp3+) que suprimen la respuesta de los linfocitos T CD8, NK,
células dendríticas y linfocitos B por contacto célula-células de forma dosis dependiente68.
36
Por otra parte, en las células cancerosas también se observan numerosos mecanismos
para evadir la respuesta inmunitaria mediada por NKG2D. Uno de los mejores estudiados es
la reducción de la expresión de determinados ligandos NKG2D en la superficie de las células
tumorales, para evitar así el reconocimiento por las células NK. Se ha observado que
numerosos cánceres (sobre todo epiteliales) evitan el reconocimiento de NKG2D al cortar
proteolíticamente MICA y MICB de la superficie tumoral y liberarlo en el plasma en forma
soluble69-73. Estas moléculas solubles actúan de doble modo: por una parte disminuyen la
expresión de ligandos de NKG2D sobre la célula tumoral, y por otra causan endocitosis y
degradación del receptor NKG2D sobre la membrana de las células NK y linfocitos T CD8 y
estimulan la expansión de linfocitos T CD4 NKG2D con funciones supresor-like74,75. Se ha
visto que los niveles de MICA y MICB solubles en suero no se correlacionan con los niveles de
MICA y MICB sobre la superficie celular y se ha postulado que los niveles de MICA soluble
podrían ser utilizados como factor pronóstico. Igualmente ha sido descrita la presencia de la
forma soluble de algunas ULBPs en algunos tumores y que su detección se asocia con un
peor pronóstico76-78.
3.5 Liberación de MICA y MICB de la superficie celular: ERp5
y GRP78
Nuestro grupo ha participado recientemente en la descripción del mecanismo
implicado en la producción de MICA soluble en las células tumorales. MICA interacciona en la
superficie de la célula tumoral con dos chaperonas del retículo endoplasmático denominadas
ERp5 y GRP78, que posiblemente estén implicadas en su liberación en forma soluble79.
El retículo endoplásmatico (RE) es una organela esencial para la síntesis y plegado de
proteínas secretorias y de membrana. Cuando la cantidad de proteínas excede la capacidad
del RE para plegarlas, se pone en marcha una respuesta “unfolded protein response” (UPR)
que activa vías que dan lugar a un aumento de la expresión de chaperonas para plegar estas
proteínas, además de otros mecanismos que aumentan la degradación de proteínas no
plegadas y disminuyen la síntesis proteica. En las células neoplásicas se produce estrés sobre
el RE por factores extrínsecos e intrínsecos debido al aumento de su actividad glicolítica que
conlleva deprivación de glucosa, acidosis e hipoxia. Esto da lugar a un acúmulo de proteínas
sobreglicosiladas y mal plegadas en el RE que pone en marcha la “UPR”, lo que implica la
sobreexpresión de chaperonas como ERp5 y GRP78 en el microambiente tumoral. Estas
pueden trasladarse por mecanismos no conocidos desde la luz del RE a la superficie celular.
ERp5 (también llamada PDIA6 o P5) es una proteína perteneciente al grupo de las
proteínas disulfuro isomerasas o tiol isomerasas (PDI), ampliamente estudiadas por su
37
función oxidoreductora de los puentes disulfuro de las proteínas de nueva generación,
ayudando de este modo al buen plegamiento de las mismas. En un principio se creyó que su
localización era exclusiva del citoplasma, anclada al retículo endoplásmatico de las células
eucariotas gracias a que posee el motivo KDEL de señalización en su secuencia proteica80,81.
Sin embargo, también se ha localizado en la superficie celular en plaquetas82, en células
endoteliales de aorta bovina83, en hepatocitos de rata84,85 y en linfocitos B humanos86. Las
funciones conocidas de esta proteína son el mantenimiento de un plegamiento adecuado de
las proteínas celulares80,87, la activación plaquetaria88 y además esta implicada en la entrada
del VIH en las células linfoides, en la modificación del heterodímero de la toxina diftérica y
más recientemente se la ha implicado en el desarrollo del cáncer.
En el año 2007, un trabajo realizado entre el laboratorio del Dr. Spies (Fred
Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA.) con la colaboración del laboratorio del
director de esta Tesis, el Dr. González de la Universidad de Oviedo, describía el papel de
ERp5 y GRP78 en el corte de las moléculas MICA y MICB de la superficie de las células
tumorales, como parte de un mecanismo de evasión de la respuesta inmunitaria mediada por
NKG2D79. ERp5 produce un cambio conformacional en el dominio α3 del MICA unido a la
superficie celular lo que permite su digestión proteolítica y liberación en forma soluble. Las
moléculas MIC solubles son liberadas al medio extracelular y son capaces de inhibir la
respuesta inmunitaria asociada a las células NKG2D. Esto es posible pues una vez que se
unen estas moléculas solubles (MICAs o MICBs) al receptor NKG2D, se produce una
endocitosis del mismo y secundariamente una regulación negativa de la expresión de dicho
receptor. Este modelo explica cómo las células tumorales son capaces de evadir la respuesta
inmunitaria inhibiendo la citotoxicidad mediada por NKG2D.
Figura 6. Mecanismo de liberación de MICA soluble por ERp5. Inicialmente se produce una reducción de un puente disulfuro en el dominio alfa 3 de MICA que provoca un cambio conformacional que implicará su digestión proteolítica y liberación en forma soluble.
ss
ERp5ss α3
sReduction
sHERp5
ss α3
-
s
sERp5
sHs α3-
Mixed disulphide
s
sERp5
sHs α3-
ss
ERp5
ss α3
Resolutionand clevage
sMICA release
Reducción
Puentes disulfuro
Resolución
Liberación de MICA soluble
38
A pesar de la relevancia de este modelo, no se ha llegado a analizar las implicaciones
de esta proteína, ERp5, en la evasión de la respuesta inmunitaria en la leucemia in vivo.
La proteína GRP78 (también conocida como Bip o immunoglobulin heavy chain
binding protein o HSPA5) es un miembro de la familia HSP70 o de proteínas de shock
térmico de localización principalmente citoplásmica y más concretamente, unida a la
membrana del retículo endoplasmático. GRP78/Bip es otra una chaperona del RE con
propiedades antiapoptóticas y que confiere resistencia a la lisis por linfocitos T citotóxicos89.
Su función más estudiada es la respuesta al mal plegamiento proteico o UPR, pero también
se le atribuyen otras muchas funciones como son asistir al plegamiento de las proteínas de
nueva generación o el control de la activación de los sensores transmembrana de estrés del
retículo endoplasmático90. En los últimos años se ha investigado su implicación en los
procesos oncológicos debido a que su expresión es regulada positivamente por deprivación
de glucosa y por hipoxia, ambas características del microambiente tumoral.
La expresión de GRP78 se mantiene en niveles bajos en órganos como el cerebro,
pulmón y corazón, pero se ha visto que está fuertemente inducida en algunos tumores.
Además su expresión en niveles elevados se correlaciona con alto grado histológico, peor
supervivencia y resistencia al tratamiento en numerosos tipos de cánceres89. GRP78 se
sobreexpresa en tumores en los que interfiere con las vías de señalización apoptóticas lo que
confiere resistencia a estas células91; por esta razón, se asocia con un aumento de la
radiorresistencia y quimiorresistencia de las células tumorales92. GRP78, al igual que ERp5 se
puede expresar en la superficie celular, y aunque su función a nivel de la membrana celular
no está bien caracterizada, también está implicada en el corte y liberación de las moléculas
MIC de la superficie de las células tumorales, y por tanto, en la evasión de la respuesta
inmunitaria mediada por NKG2D79. En cuanto a la relación funcional con ERp5, se ha visto
que GRP78 interacciona con diversas chaperonas de la familia PDI, lo que probablemente sea
necesario para que pueda ejercer su función93,94. Hay evidencia de que varias chaperonas
entre las cuales se encuentran GRP78 y ERp5 forman un complejo funcional en el RE95.
Además se ha descrito que se encuentran unidas a MICA en la superficie celular79.
Teniendo en cuenta todos los datos expuestos, la detección de los niveles ERp5,
GRP78, MICA y MICB nos podría servir como un marcador del comportamiento tumoral y de
la respuesta al tratamiento en la LLC. Por otra parte, el conocimiento de su forma de
interacción con los leucocitos leucémicos nos abre la posibilidad de interesantes vías de
actuación terapéutica mediante la utilización de mecanismos inmunomoduladores que
favorezcan el control por el sistema inmunitario.
39
Figura 7. Modelo de corte de MICA en la superficie de las células tumorales. A. ERp5 interacciona en la membrana de las células tumorales con MICA y cambia su conformación permitiendo el corte de MICA por una proteasa. B. MICA soluble liberada al medio extracelular es capaz de unirse al receptor NKG2D y producir su internalización. Este mecanismo produce una inhibición de la respuesta inmunitaria citotóxica en el entorno tumoral.
3.6 Importancia pronóstica del número de linfocitos en
sangre en cáncer
Hace más de 100 años que se conoce que existen cantidades variables de linfocitos
infiltrando los tumores sólidos conocidos como “tumor infiltrating lymphocytes (TILs)”96.
Inicialmente se pensó que reflejaban el origen del cáncer en los sitios de inflamación crónica,
pero posteriormente se comenzó a pensar que posiblemente estos linfocitos puedan crear un
ambiente favorable para el crecimiento tumoral o por el contrario que se trataba de una
evidencia de que el sistema inmunitario del huésped tiene mecanismos para intentar
erradicar el cáncer97. Apoyando esta última hipótesis se observa una relación entre la
detección de TILs y el pronóstico en diversos tipos de cáncer98-100. En los últimos tiempos se
han publicado varios estudios en los que se ha observado la importancia pronóstica del
recuento de linfocitos en sangre periférica, como un marcador de la inmunidad del huésped,
en diversas hemopatías malignas y se ha observado que se trata de un factor pronóstico
muy consistente en diversos tipos de cáncer tanto en adultos como en niños e
independientemente de la fase de tratamiento.
40
Inicialmente se demostró la importancia de la cifra de linfocitos en sangre tras
diversos tratamientos como el trasplante autólogo de médula ósea en pacientes con mieloma
múltiple o linfoma no Hodgkin101 y durante la quimioterapia estándar en leucemia mieloide
aguda102. Se trataba de un factor pronóstico indicador del tiempo de reconstitución del
sistema inmunitario del huésped, sugiriendo el papel antitumoral del sistema inmunitario
autólogo durante el tratamiento del cáncer. En estos últimos años se ha demostrado también
la importancia pronóstica de la cifra de linfocitos en el momento del diagnóstico y no solo en
relación con el tratamiento en numerosas enfermedades malignas como linfomas
foliculares103, linfomas de célula B grande104,105, diversos tumores sólidos106 y también en
niños con sarcoma de Edwing107 y con leucemia aguda108. Además en linfomas se trata de
un factor pronóstico independiente frente a otros utilizados en la práctica clínica103,104 y
resulta útil para predecir la eficacia de algunos tratamientos109,110.
A pesar de que no disponemos de muchos datos sobre la distribución de las distintas
subpoblaciones linfocitarias y su actividad funcional en las hemopatías malignas, los
diferentes estudios publicados sugieren que el sistema inmunitario juega un importante
papel en la patogenia de estas enfermedades pues las cifras mas elevadas de linfocitos al
diagnóstico parecen ser un factor de buen pronóstico en linfomas y en mielomas tanto frente
a la supervivencia global como de la respuesta al tratamiento.
4. Sistema inmunitario y leucemia linfática crónica
Aunque el papel del sistema inmunitario en el control de LLC no ha sido
extensamente estudiado, los datos epidemiológicos y experimentales que se conocen indican
que la LLC se caracteriza por múltiples defectos en el sistema inmunitario, que pueden estar
implicados en la mayor susceptibilidad a infecciones y fenómenos autoinmunes que
caracterizan a esta enfermedad. Por un lado, evidencias recientes sugieren la posibilidad de
que un estímulo antigénico a través del BCR pueda estar implicado en la selección y
posiblemente en la expansión del clon maligno111,112. Es posible que las interacciones
bidireccionales entre las células no neoplásicas del estroma, las células del sistema
inmunitario y linfocitos leucémicos sean importantes para el mantenimiento y progresión del
clon leucémico.
El curso clínico de la enfermedad se caracteriza por eventos asociados con disfunción
inmunitaria además de presentar un riesgo aumentado de segundas neoplasias. En la LLC se
han descrito numerosos defectos cuantitativos y cualitativos en las células efectoras del
sistema inmunitario tanto en la liberación de citocinas como en el contacto célula-célula113.
Los linfocitos B clonales no se comportan como células presentadoras de antígenos eficaces y
41
además es característica la hipogammaglobulinemia debida a la disminución de la producción
de anticuerpos frente a diferentes antígenos. Por otra parte, aunque los linfocitos T en la LLC
no forman parte del clon maligno y parecen morfológicamente normales, están descritas
numerosas alteraciones en esta población como puede ser el aumento del número absoluto
de linfocitos T, la inversión del ratio CD4/CD8 y el aumento del número de células T CD4 y
CD8 fenotípicamente activadas114,115. Mediante el estudio de patrones de expresión génica en
LLC se han observado diferencias en genes que afectan a la diferenciación de linfocitos T CD4
y también en genes claves en la función citotóxica de linfocitos T CD8 que implican defectos
en la formación del citoesqueleto, en el tráfico de vesículas y en la citotoxicidad116.
Posiblemente las células neoplásicas de la LLC producen cambios en las linfocitos T CD4 y
CD8 que comprometen su función a través de factores solubles y del contacto célula-célula;
así se ha observado una producción alterada de citocinas como IL-4 e IFN-γ una expresión
reducida del ligando CD40L, de la cadena zeta de TCR y de CD28117,118. También se han
descrito alteraciones funcionales en otras células que contribuyen a la función inmunitaria.
Por ejemplo, Kay ya describió en el año 1984 que las células NK pierden sus gránulos
azurófilos lo que puede explicar la pérdida de su función normal119. En conjunto, todas estas
alteraciones conducen a un defecto fundamentalmente de la inmunidad celular, que se asocia
con aumento de la susceptibilidad a numerosas infecciones y elevada prevalencia de
segundas neoplasias. Es presumible que estos defectos de la inmunidad celular que se
observan en la LLC, también puedan tener un papel relevante en la evolución de la propia
leucemia.
4.1 Control sobre la leucemia linfática crónica por el sistema
inmunitario
Son pocos los datos que conocemos acerca del control ejercido por el sistema
inmunitario sobre la LLC. Se han descrito numerosos casos de remisión espontánea en los
que se observa un aumento de linfocitos grandes granulares como evidencia del control por
el sistema inmunitario en la progresión de la enfermedad, pero sin embargo en contra de
esta hipótesis se detectan menores cantidades de citocinas: IFN-γ y TNF-α120. También se ha
descrito la existencia de linfocitos T autorreactivos, sobre todo en las primeras fases de la
enfermedad121. Por otra parte, los pacientes con LLC que presentan ratios más elevados de
linfocitos T o células NK respecto al componente B monoclonal en el momento del
diagnóstico tienen mayor supervivencia libre de tratamiento y ambos factores resultaron
independientes en un análisis multivariante realizado sobre 166 pacientes122. Todos estos
datos previos sugieren una evidencia del control que el sistema inmunitario ejerce sobre la
enfermedad y su posible relación con la evolución.
42
La expresión de MICA o las ULBPs en células de LLC es poco conocida aunque se ha
estudiado en otros tipos de leucemias y síndromes linfoproliferativos54,58,123-126. Los pocos
datos que se manejan de expresión “in vivo” de ligandos de NKG2D son poco concluyentes,
pero coinciden en que existe una importante variabilidad entre pacientes58. Como únicos
representantes de los ligandos de NKG2D sobre las células de la LLC se ha descrito una
expresión baja de MICA y de ULBP354,58,125 , mientras la expresión de otras ULBPs como
ULBP1, 2 y 4 es negativa125.
En relación con ULBP3 y su interacción con células NKG2D en LLC se ha visto que en
pacientes en estadios precoces se detectan niveles más elevados de linfocitos Tγδ que
estadios más avanzados y además en pacientes con bajos niveles de linfocitos Tγδ y niveles
indetectables de ULBP3 en los linfocitos neoplásicos, la enfermedad progresó en un año. En
este estudio, los linfocitos Tγδ son capaces de proliferar “in vivo” como respuesta a células B
leucémicas autólogas y también eran capaces de lisar células autólogas de LLC cuando se
transcribía o expresaba MICA o se sobrerregulaba ULBP3 tras la exposición a ácido trans-
retinoico125.
4.2 Escape de la leucemia linfática crónica al sistema
inmunitario
Aunque se sabe que las neoplasias de origen linfoide son bastante resistentes a la
citotoxicidad mediada por NK127-129, son poco conocidos los mecanismos utilizados por el
sistema inmunitario para intentar controlar esta proliferación clonal y los mecanismos de
evasión que utilizan las células leucémicas. Disponemos de algunos datos en referencia a las
alteraciones en la expresión de las moléculas MHC de clase I sobre las células de la LLC y a
alteraciones en los receptores de las células implicadas en el control antitumoral como los
linfocitos T CD8 o las células NK.
En los últimos años se ha extendido la idea de que la expresión de MHC de clase I en
las células de la LLC es normal, por lo que a diferencia de los tumores sólidos, este no parece
ser un mecanismo de escape al sistema inmunitario130. Esto no es del todo cierto, en
estudios recientes se ha observado disminución de la expresión de ciertos alelos como el
HLA-Bw6 lo que sugiere que este mecanismo podría permitir un escape de los linfocitos T
citotóxicos131. Por otra parte, se ha descrito que la respuesta de aumento de expresión de las
moléculas MHC de clase I al interferón es anormal132. También se ha detectado en la LLC una
expresión aberrante de HLA-G que es un antígeno MHC de clase I no clásico que no se
expresa en células normales salvo en las trofoblásticas y que interacciona con receptores
inhibidores tipo KIR como el KIR2DL4 presente en células NK y algunos linfocitos T. Esta
43
expresión aberrante de HLA-G y su interacción con el receptor inhibidor permite el escape de
la enfermedad al sistema inmunitario y de esta manera una mayor expresión de HLA-G se
correlaciona con menor supervivencia libre de progresión y mayor inmunodepresión
asociada133,134.
Aunque en la LLC el número de células NK está aumentado se observa disminución o
anormalidades del nivel de receptores NK que implica una disminución de su actividad 135-137.
Se ha descrito que los linfocitos T CD8 de pacientes con LLC presentan una disminución de
los receptores NKG2D en comparación con los controles138. Además los pacientes en fases
avanzadas presentan porcentajes más elevados de células T CD8+ citotóxicos que expresan
receptores inhibidores KIRs y CD94 comparados con las LLC no progresivas139.
4.3 Posible papel de MICA soluble en el escape de la leucemia
linfática crónica al sistema inmunitario
Las células de la LLC son muy resistentes a la citotoxidad de las células NK y la
expresión de MICA y otros ligandos de NKG2D en los linfocitos leucémicos es baja. Esto ha
sido interpretado por algunos inmunólogos como una ausencia de papel del sistema NKG2D
en el control de este tipo de neoplasias. Sin embargo, en consonancia con el
“inmunomodulado” del cáncer esto podría ser también debido a los mecanismos de evasión
del sistema inmunitario que desarrolla la LLC. Aunque no existen muchas evidencias al
respecto se ha descrito la producción de MICA soluble en algunos pacientes con LLC125,
sugiriendo que la liberación de MICA soluble, y consecuentemente ERp5 y GRP78 que están
implicadas en su liberación, podrían tener un papel relevante en la patogenia de la
enfermedad. En la actualidad, hay muy pocos datos descritos referentes a la expresión de
ERp5 y/o GRP78 en la membrana de las células procedentes de síndromes linfoproliferativos.
Hace más de una década se había observado una expresión aumentada de chaperonas con
actividad proteindisulfide isomerase (PDI) en la membrana de linfocitos B de la LLC respecto
a linfocitos B controles. Esta expresión aumentada confiere a las células leucémicas
resistencia a diversos citostáticos como clorambucil86,140. En otra neoplasia de células B
maduras, el mieloma múltiple, se ha descrito que la presencia de ERp5 en la membrana
celular está asociada con la mayor liberación de MICA soluble y a una peor evolución de la
enfermedad124. También se ha visto que en la respuesta antitumoral contra diversos
síndromes linfoproliferativos en ratón se generan anticuerpos anti-ERp5126.
Referente a GRP78, existe mucha información relacionada con sus implicaciones a nivel
del RE y como protagonista de la UPR, pero apenas se ha estudiado su expresión a nivel de
membrana y aún menos asociada a síndromes linfoproliferativos. Únicamente se ha descrito
44
que está relacionada con el plegamiento del BCR (receptor de células B) de las células de la
LLC por medio de su unión con CD79a y CD79b (Igα e Igβ), componentes del BCR implicados
en la recepción y trasducción de la señal141. No se han publicado otros datos de expresión, ni
información funcional de GRP78 en la LLC. Tampoco hasta el momento se ha publicado
ningún dato que relacione MICA con ERp5 y/o GRP78 en la LLC “in vivo” y la información
disponible de la expresión de MICA en la LLC es muy escasa y no concluyente.
Por estos motivos resulta de especial interés estudiar el posible papel de estas
moléculas en la LLC y su relación con la evolución. Posiblemente la LLC es una patología
idónea para el estudio de la respuesta inmunitaria contra el cáncer por los siguientes
motivos:
o Es muy sencillo obtener grandes cantidades de células tumorales de sangre periférica.
o Se trata de una enfermedad que generalmente progresa lentamente lo cual permite que
se pueda generar respuesta inmunitaria y la convierte en un modelo atractivo para
estudiar terapias inmunológicas.
o Nos puede ayudar a comprender los mecanismos de evasión de la respuesta inmunitaria
pues se trata de una proliferación neoplásica derivada de células del propio sistema
inmunitario.
o Existen proteínas de membrana en los linfocitos B como el CD40, un miembro de la
familia del factor de necrosis tumoral (TNF) que se expresa a través del desarrollo de las
células B, que además de promover la proliferación de células T regula la citotoxicidad
NK142,143.
o Las células NK se activan específicamente tras el trasplante de médula ósea, pero no tras
trasplante de otros órganos144. Tras el trasplante alogénico de médula ósea se ha
observado que las células NK están implicadas en el control y erradicación de la
leucemia145. Además se ha observado que tras el trasplante alogénico de medula ósea se
pone en marcha reacción de injerto contra leucemia que consigue remisiones muy
prolongadas de la LLC146.
o Los linfocitos NK se localizan en sangre periférica, folículos linfoides de los ganglios
linfáticos y zona marginal del bazo, y tanto la sangre como los órganos linfoides son los
lugares de afectación de la LLC.
o En los últimos tiempos se utilizan en el tratamiento de primera línea de la LLC
combinaciones de anticuerpos monoclonales como Rituximab asociados a citostáticos,
obteniendo mejores resultados que con los tratamientos consistentes en quimioterapia
sola147. Aunque de mecanismo no totalmente conocido, parece que el Rituximab actúa
favoreciendo la erradicación de la LLC por el sistema inmunitario fundamentalmente a
través de la citotoxicidad celular mediada por anticuerpos mediada por células NK148,149.
45
o La inmunoterapia resulta muy prometedora en esta enfermedad y se piensa que una
buena estrategia puede ser revertir la deficiencia inmunitaria adquirida asociada a la LLC
y la capacidad de las células leucémicas de inducir tolerancia150. Están en marcha
numerosos estudios que demuestran la efectividad de la Lenalidomida en esta
enfermedad y aunque su mecanismo no está totalmente aclarado, se sabe que no induce
apoptosis de forma directa y parece que actúa a través de un efecto inmunoestimulador
en parte debido al aumento de la citotoxicidad mediada por NK151,152.
46
47
Objetivos
48
49
Teniendo en cuenta los datos siguientes:
o La leucemia linfática crónica es el tipo de leucemia más frecuente y una de las patologías
hematológicas de mayor trascendencia debido a la incidencia y prevalencia que presenta
en nuestro país.
o El comportamiento clínico es extraordinariamente variable y de ahí la utilidad de
parámetros predictores del mismo que nos puedan ayudar en su manejo y mejorar e
individualizar las estrategias de seguimiento, información a los pacientes, indicaciones de
inicio de tratamiento, etc.
o Es de gran interés el estudio de los motivos causantes de las diferencias entre unos
pacientes que fallecerán en pocos meses a causa de la leucemia linfática crónica y otros
que permanecen asintomáticos sin ninguna evolución de su enfermedad y sin precisar
tratamiento durante muchos años.
o La leucemia linfática crónica se trata de un modelo muy atractivo para estudiar las
células del sistema inmunitario pues están en íntima relación con las células tumorales
circulantes.
Nos planteamos los siguientes objetivos:
1. Valorar la magnitud y el impacto de la leucemia linfática crónica en nuestro medio.
2. Valorar en nuestra población el valor pronóstico de las clasificaciones de los estadios de
Binet, Rai modificado, IP MDACC e índice GIMEMA con el fin de validar la posible utilidad de
estos dos últimos sistemas pronósticos.
3. Estudiar el valor pronóstico de la cuantificación de las subpoblaciones de linfocitos T y de
las células NK en el momento del diagnóstico respecto a la supervivencia de estos pacientes.
4. Analizar la evasión de la respuesta inmunitaria mediada por NKG2D frente a la leucemia
linfática crónica.
50
51
Material y métodos
52
53
1. Características epidemiológicas de los pacientes
diagnosticados de leucemia linfática crónica
Para conocer la incidencia y características de la LLC en nuestro medio hemos
realizado un estudio epidemiológico observacional, retrospectivo, sobre las características
clínicas, epidemiológicas y la evolución clínica de los 265 pacientes diagnosticados de LLC en
el Hospital de Cabueñes (centro de referencia para una población de unos 300.000
habitantes) durante un periodo de 10 años (1997-2007). El Hospital de Cabueñes es el
Hospital público de referencia del Área Sanitaria V del Principado de Asturias, cuenta con 493
camas y presta atención especializada en Hematología a todos los pacientes del Área
Sanitaria.
La población diana es la población total del Área Sanitaria V del Principado de
Asturias que incluye los concejos de Gijón, Carreño y Villaviciosa. Para conocer la población
total y su distribución por edad y sexo se han utilizado los Censos de Población del
Principado de Asturias de estos tres concejos del año 2001 facilitados por el Instituto
Nacional de Estadística y los padrones municipales de los años 1998 y 2007.
La población de estudio es la población del Área sanitaria V del Principado de Asturias
que ha sido diagnosticada de LLC entre enero de 1997 y diciembre de 2007 y cuyos datos
han sido recogidos, analizados y seguidos hasta julio de 2009. El estudio comienza en esta
fecha pues previamente no existía base de datos en el Servicio de Hematología. Durante los
años 2006 a 2009 todos los casos fueron seguidos activamente por la autora, como Médico
Especialista de Hematología en Consulta externa en este Área sanitaria.
Las fuentes para conocer los casos de LLC diagnosticados entre enero de 1997 y
diciembre de 2007 fueron el Registro del Hospital (Registro de Tumores y Servicio de
codificación), según la Clasificación Internacional de Enfermedades para Oncología novena
revisión (CIE-0-9) y las bases de datos del Servicio de Hematología. Los códigos del ICD-0-3
que se corresponden con la LLC y el SLL son el 9823 y el 9670 respectivamente, aunque
actualmente la OMS agrupa ambas categorías en una sola entidad. Todos los datos
necesarios para el estudio epidemiológico fueron recogidos de las historias clínicas del
Hospital de Cabueñes. Se ha elaborado una hoja de recogida de datos que incluía fecha de
diagnóstico, edad y diferentes características clínicas y biológicas de la enfermedad, factores
pronósticos, evolución y datos relacionados con el tratamiento (anexo 1). Todos los datos
fueron recogidos por un médico especialista en Hematología y Hemoterapia.
54
1.1 Criterios de inclusión y exclusión
Se han revisado todos los diagnósticos realizados y se ha realizado una
reclasificación según los criterios indicados por la OMS para las neoplasias hematológicas.
Sólo se han incluido los casos con un incremento de más de 5 x10 9/L linfocitos en sangre
periférica con morfología e inmunofenotipo de LLC5,153 y los casos de SLL confirmados por
biopsia ganglionar. Los criterios de inclusión se basaron en los datos del momento del
diagnóstico. El examen del aspirado y biopsia de médula ósea no se consideró necesario para
el diagnóstico17.
Se incluyeron pacientes en los que la sospecha de LLC se produjo al realizar un
hemograma por otro motivo y se encontraban asintomáticos al igual que pacientes con
enfermedad sintomática con criterios de iniciar tratamiento. Todos los casos diagnosticados
de LLC del Área se siguen periódicamente en la consulta externa de Hematología, con
revisiones al menos una vez al año (en los casos más estables). Se incluyeron también en el
estudio los pacientes que fallecieron antes de que pasase un año desde el diagnóstico.
1.2 Variables estudiadas
Se han recogido de la historia clínica la fecha de nacimiento, la fecha del diagnóstico,
la edad en el momento del diagnóstico y el sexo en cada caso. Se ha dividido a la población
en grupos de edad de 5 en 5 años desde los 40 hasta los 84 años. Esta distribución por
grupos de edad es la que se sigue en el padrón municipal (INE). Los grupos de edad
comienzan a los 40 años pues no se ha diagnosticado de LLC ningún paciente más joven en
el Área sanitaria.
1.2.1 Síntomas y exploración física
Se han recogido los síntomas que presentaba el paciente al diagnóstico agrupados de
la siguiente forma: asintomático, adenopatías sintomáticas, sudor nocturno, astenia, pérdida
de peso, fiebre, síntomas por anemia, síntomas por infección u otros síntomas y así como
datos referentes al estado general según la escala ECOG. También se han recogido datos
procedentes de la exploración física en el diagnóstico como son la presencia y número de
adenopatías y organomegalias.
55
1.2.2 Parámetros hematológicos
A todos los pacientes se les realizó un hemograma con un autoanalizador ADVIAS
(Bayer Diagnostica, Tarrytown, NJ). Este equipo proporciona un recuento diferencial de 5
poblaciones leucocitarias, tras analizar por un lado el tamaño y contenido de peroxidasa en
los leucocitos (canal PEROX) y por otro, la lobularidad leucocitaria en el canal de basófilos
(canal BASO). Se han recogido los siguientes parámetros: leucocitos y recuento diferencial
leucocitario, hemoglobina, índices eritrocitarios y cifra de plaquetas. Todos los hemogramas
fueron validados por un médico especialista en Hematología y Hemoterapia.
Se estudió la morfología de los linfocitos en sangre periférica tras tinción de May
Grumwald Giemsa por un Hematólogo experto en citología. Se incluyeron los casos con
morfología típica o atípica según la Clasificación de Matutes y colaboradores154. La LLC
atípica sólo se incluyó en el análisis si presentaban un inmunofenotipo característico de la
enfermedad.
1.2.3 Inmunofenotipo de sangre periférica
Se ha realizado a todos los pacientes un estudio de inmunofenotipo utilizando
muestras de sangre periférica con fluorescencia directa mediante Citometría de flujo en el
Servicio de Citometría del Hospital Universitario Central de Asturias.
El protocolo de estudio de síndromes linfoproliferativos incluye los siguientes
anticuerpos conjugados: Anticuerpos FL1, conjugados con Isotiocianato de Fluoresceína
(FITC): CD4 (clon SK3 de Becton Dickinson), CD8 (clon SK1 de Becton Dickinson), CD19
(clon SK25C1 de Becton Dickinson), CD20 (clon L27 de Becton Dickinson), CD22 (clon S-
CHL-1 de Becton Dickinson), FMC7 (clon FMC7 de Becton Dickinson), CD79b (clon SN8 de
Becton Dickinson), CD103 (clon B-ly7 de IQP); Anticuerpos FL2 conjugados con Ficoeritrina
(PE): CD3 (clon SK7 de Becton Dickinson), CD5 (clon L17F12 de Becton Dickinson), CD8
(clon SK1 de Becton Dickinson), CD38 (clon HB-7 de Becton Dickinson), CD23 (clon EBVCS-5
de Becton Dickinson), CD11c (clon S-HCL-3 de Becton Dickinson), CD56 (clon MY31 de
Becton Dickinson), CD10 (clon HI10a de Becton Dickinson); Anticuerpos FL3 conjugados con
Clorofila Peridina-Ficoeritrina Cianina 5 (PerCP-Cy 5.5): CD19 (clon SJ25C1 de Becton
Dickinson), CD45 (clon 2D1 de Becton Dickinson) y conjugados con Clorofila Peridina PerCP:
CD20 (clon L27 de Becton Dickinson), CD3 (clon SK7 de Becton Dickinson); Anticuerpos FL4
conjugados con Aloficocianina (APC): CD4 (clon SK3 de Becton Dickinson), CD20 (clon L27
de Becton Dickinson), CD10 (clon HI10a de Becton Dickinson) y CD25 (clon 2A3 de Becton
Dickinson).
56
Para demostrar clonalidad se utilizaron: anti kappa/lambda/CD19 o anti kappa/
lambda/CD20 de Becton Dickinson y como solución de lisis FACS Lysing solution. Se
considera positividad cuando al menos un 20% de las células expresan un anticuerpo
monoclonal, excepto para el CD38 donde se estableció el punto de corte en 30% de acuerdo
el estudio de Damle36.
Solo se han incluido casos con escore de Matutes mayores de 3 (Royal Mardson
Scoring System)9 y se han excluido del análisis los casos en los que según los criterios
previos no existía diagnóstico de certeza de LLC.
1.2.4 Recuento de linfocitos T CD4 y CD8 y células NK en el momento del
diagnóstico
De forma simultánea al estudio por citometría de la población monoclonal B en el
momento del diagnóstico se realizó un recuento del porcentaje y número absoluto de
linfocitos T y de sus subpoblaciones CD4 y CD8 y de las células NK en sangre periférica. El
análisis de las subpoblaciones linfocitarias se realizó mediante citometría del flujo con el uso
de los anticuerpos monoclonales CD3, CD4, CD8 y CD56 y se consideró:
o % de linfocitos T: se cuantificó el porcentaje de células CD3 positivas sobre el área de
linfocitos.
� CD3+/CD4+/CD8-: porcentaje y valor absoluto de linfocitos T positivos para el
anticuerpo monoclonal CD4 y negativos para el CD8 sobre el área de las células
CD3 positivas.
� CD3+/CD8+/CD4-: porcentaje y valor absoluto de linfocitos T positivos para el
anticuerpo monoclonal CD8 y negativos para el CD4 sobre el área de las células
CD3 positivas.
o CD3-/CD56+: porcentaje y valor absoluto de células NK sobre el total de linfocitos.
La proporción de las subpoblaciones T y las células NK se realizó normalizando al
100% de linfocitos y el “recuento absoluto” se calculó analizando de forma simultánea la
muestra en un autoanalizador hematológico ADVIAS (Bayer Diagnostica, Tarrytown, NJ) para
obtener el número de linfocitos totales. Se consideraron los “recuentos relativos” de linfocitos
T o células NK como la cuantificación de estas poblaciones con respecto al tamaño del
componente monoclonal B (CMB) en sangre periférica (ratios T/CMB, T CD4/CMB, T
CD8/CMB y NK/CMB).
57
1.2.5 Otros estudios al diagnóstico
Se han recogido los siguientes datos realizados en el momento del diagnóstico: test
de Coombs directo, bioquímica que incluye creatinina, urea, ácido úrico, transaminasas,
fosfatasa alcalina, bilirrubina, proteinograma, dosificación de inmunoglobulinas, LDH y β-2
microglobulina. El test de Coombs se realizó en el Banco de sangre y el resto de
determinaciones en el Servicio de Análisis Clínicos del Hospital de Cabueñes.
Se han realizado pruebas de imagen que incluían radiografía de tórax y ecografía
abdominal o TAC toracoabdominal.
1.2.6 Estadios clínicos de Rai, Binet, IP MDACC e Índice GIMEMA
Todos los pacientes han sido clasificados con los datos obtenidos al diagnóstico de
acuerdo con la Clasificación de Binet24 y de Rai modificada22,23,155 y según el grupo de riesgo
de acuerdo al índice pronóstico propuesto por el MD Anderson IP MDACC26. A los pacientes
con LLC diagnosticados en estadio A de Binet se les clasificó según el Índice pronóstico
propuesto por el grupo GIMEMA27. Se ha recogido también si presentaban un tiempo de
duplicación linfocitaria menor de un año156.
1.2.7 Tratamiento y evolución
Se ha recogido el motivo y la fecha de inicio de tratamiento y el tratamiento
utilizado. Se consideraron los criterios clásicos para iniciar el tratamiento por el NCIWG
(1996)17:
• Fallo medular progresivo con empeoramiento de la anemia o trombopenia.
• Ganglios mayores de 10 cm o esplenomegalia mayor de 6 cm sobre el reborde costal
o aumento progresivo.
• Aumento de la cifra de linfocitos mayor del 50% en dos meses o tiempo de
duplicación menor de 6 meses.
• Síntomas sistémicos como pérdida de peso mayor del 10% en 6 meses, fiebre mayor
de 38ºC durante dos semanas, fatiga extrema o sudor nocturno.
• Anemia y/o trombopenia autoinmunes que no responden al tratamiento con
esteroides.
El tratamiento de primera línea consistió en clorambucil con o sin corticoides o
fludarabina asociada o no a ciclofosfamida. El tipo de tratamiento utilizado depende
fundamentalmente de la edad del paciente y del año en que se inició el mismo. Los pacientes
58
con enfermedad resistente a clorambucil se han tratado con fludarabina. Los pacientes con
enfermedad estable no fueron tratados.
Se recogió la presencia de segundas neoplasias en los pacientes, el tipo y la fecha del
diagnóstico.
En caso de fallecimiento, se recogió la fecha y la causa del mismo. Se ha considerado
si la muerte fue debida a la leucemia (LLC activa, infección, anemia hemolítica autoinmune)
u otras causas (problemas cardiacos, neoplasias, accidentes o enfermedad cerebrovascular
en ausencia de trombopenia).
2. Niveles de ERp5, GRP78, MICA en linfocitos B
leucémicos y de MICA y MICB solubles
Para valorar el perfil de expresión de ERp5, GRP78 y MICA en las células leucémicas
y los niveles MICA y MICB solubles de pacientes diagnosticados de LLC se ha realizado un
estudio epidemiológico observacional analítico de casos y controles.
La población estudiada fueron los 100 primeros pacientes diagnosticados de LLC
según los criterios expuestos previamente que acudieron a consulta desde enero de 2009 y
que no habían recibido tratamiento en el año previo. Se incluyeron pacientes con
enfermedad estable en estadios iniciales y pacientes con enfermedad avanzada y progresiva
con factores de mal pronóstico. Se finalizó el reclutamiento de pacientes en junio de 2009.
No se utilizó ningún sistema de muestreo aleatorio. Todos los pacientes aceptaron ser
incluidos en el estudio mediante la firma de un documento de consentimiento informado
generado al efecto (anexo 2).
En estos 100 pacientes se analizó la expresión de ERP5, GRP78, MICA en los
linfocitos leucémicos y de forma paralela los niveles de MICAs y de MICBs en suero. Los
mismos parámetros se han analizado de forma paralela en 21 donantes sanos, que
presentaban recuentos hemoperiféricos normales y que no habían presentado fiebre en la
semana previa, ni recibían ninguna medicación, no estaban embarazadas y no tenían historia
previa de enfermedades agudas o crónicas. Las muestras control se han procesado y
almacenado de manera idéntica a las de los pacientes.
59
2.1 Variables estudiadas:
En el mismo momento de obtención de las muestras se han recogido las siguientes
variables (anexo 3):
o Edad y sexo.
o Presencia de síntomas.
o Datos de la exploración física que incluyen adenopatías y organomegalias.
o Hemograma convencional mediante un autoanalizador ADVIAS (Bayer Diagnóstica,
Tarrytown NJ), que nos proporciona el recuento leucocitario y el diferencial de las 5
subpoblaciones leucocitarias: neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos.
o Morfología en sangre periférica mediante tinción de May Grumwald-Giemsa (Merck)
examinada por un médico hematólogo experto en citología.
o Coombs directo.
o Bioquímica con pruebas de función renal (urea y creatinina), hepática (aspartato-amino-
trasferasa, alanil-amino-trasferasa, gamma-glutamil-traspeptidasa y fosfatasa alcalina).
o Proteinograma y cuantificación de inmunoglobulinas.
o Determinación de ß2-microglobulina.
o Estadios de Rai, Binet e Indice pronóstico MDACC.
o Se ha considerado que un paciente tenia una “enfermedad progresiva” en base a los
siguientes factores: aparición de linfadenopatías, esplenomegalia, hepatomegalia o
infiltrado de algún órgano o aumento mayor del 50% de adenopatías, esplenomegalia, o
hepatomegalia previas; aumento del número de linfocitos mayor del 50%, trasformación
a una histología más agresiva como el síndrome de Ritcher, citopenias atribuibles a la
LLC definidas de la siguiente forma: descenso de la cifra de hemoglobina más de 20g/L o
hemoglobina menor de 100g/L o disminución de la cifra de plaquetas mayor del 50% o
cifra de plaquetas menor de 100 × 109/L. La presencia de una de estas características
fue suficiente para considerar “enfermedad progresiva”5 y si no presentaban las
características previas se consideró “enfermedad estable”.
o Tiempo de duplicación linfocitaria (tiempo en que se produce una duplicación numérica
en los linfocitos en sangre periférica) menor de un año.
o Positividad de CD38: se calculó el porcentaje de células CD38 positivas y se consideró
que la LLC era CD38 positiva cuando se expresaba en más del 30% de los leucocitos
leucémicos36. Para el estudio del CD38 se utilizó el clon HB-7 de Becton Dickinson.
El hemograma, morfología en sangre periférica y test de Coombs directo se
realizaron en el Laboratorio del Servicio de Hematología y Banco de sangre del Hospital de
Cabueñes. Las determinaciones bioquímicas incluido proteinograma, cuantificación de
inmunoglobulinas y determinación de ß2-microglobulina se realizaron en el Laboratorio de
60
Bioquímica del Hospital de Cabueñes. Los datos de la exploración necesarios para clasificar a
los pacientes según los diferentes sistemas pronósticos se recogieron el mismo día de la
extracción de sangre en la consulta externa de Hematología del Hospital de Cabueñes.
El mismo día que acudieron los pacientes a la consulta se extrajo sangre para las
determinaciones anteriores y para la medición de los niveles de ERP5, GRP78, MICA en los
linfocitos leucémicos y de MICA y de MICB solubles en suero.
2.2 Análisis de la expresión de ERp5, GPR78 y MICA en las
células leucémicas
El material biológico utilizado ha sido sangre total de 100 pacientes diagnosticados
de LLC y de 21 donantes sanos. La extracción se realizó mediante punción venosa y se
extrajeron 5 cc. de sangre que se introdujo en un tubo que contenía como anticoagulante
K2EDTA. Todos los experimentos “in vitro” se realizaron en la unidad de Inmunología
Tumoral del Instituto Universitario Oncológico del Principado de Asturias de la Universidad de
Oviedo.
En menos de dos horas desde la extracción se separaron las células mononucleares
de sangre periférica (PMBC) mediante su centrifugación en gradientes de densidad de Ficoll
(Lymphopred TM, Axis Shield PoAc).
Se realizaron estudios de inmunofluorescencia con anticuerpos marcados con
fluorocromos frente a ERp5, GRP78 y MICA en linfocitos B de controles y pacientes
diagnosticados de LLC, el mismo día de la extracción. Las células marcadas se analizaron por
citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo de Becton Dickinson FACScalibur (Becton
Dickinson, Sunnyvale, CA). Los anticuerpos policlonales de conejo anti ERp5 humana y anti
GRP78/Bip humana fueron adquiridos a ABR Affinity Bioreagents y Sigma respectivamente.
El anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG murino conjugado con PE y el policlonal de cabra
anti-IgG de conejo conjugado con FITC fueron obtenidos en AbD serotec (Oxford). Para
diferenciar las células leucémicas de otras poblaciones leucocitarias se emplearon
conjuntamente los anticuerpos específicos de CD3, CD5 y CD19 (Beckton Dickinson).
2.2.1 Determinación de ERp5
La unidad de Inmunología Tumoral del Instituto Universitario Oncológico del
Principado de Asturias generó un anticuerpo policlonal de conejo contra un péptido derivado
61
de la proteína ERp5 humana mediante la inmunización repetida de un macho de 3 meses del
tipo “blanco de Neuseeland”. El oligopéptido utilizado para la inmunización fue sintetizado
por la empresa NeoMPS SA (Estrasburgo, Francia) y se corresponde con los residuos
aminoacídicos comprendidos entre las posiciones 476 y 492 de la proteína ERp5 humana. El
péptido se suministró conjugado con KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin3) y MBS
(Maleimidobenzoyl-N-hydrosysuccinimide ester4) en su extremo amino terminal (KHL-MBS-
CDIDLSDVELDDLGKDEL). Se realizaron 4 inmunizaciones separadas entre sí 15 días. Para
validar los resultados también se empleó un anticuerpo comercial α ERp5 (dilución 1:200 en
PBS) de ABR, Affinity Bioreagents.
Se incubaron 106 células con el anticuerpo primario durante 60 minutos a 4ºC en
oscuridad y posteriormente con el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con
fluoresceína “FITC Goat Rabbit ABD” (dilución 1:100 en PBS) durante 60 minutos a 4º C en
oscuridad y se analizó con el citómetro.
2.2.2 Determinación de GRP78
Se incubaron 106 células con el anticuerpo primario anti-GRP78/Bip de Sigma
(dilución 1:200 en PBS) durante 60 minutos a 4º C en oscuridad y posteriormente con el
anticuerpo secundario anti IgG de conejo conjugado con fluoresceína “FITC Goat Rabbit ABD”
(dilución 1:100 en PBS) durante 60 minutos a 4º C en oscuridad y se analizó con el
citómetro.
2.2.3 Determinación de MICA
Los anticuerpos anti-MICA humana fueron una donación del Dr. Spies (Fred
Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, EEUU). Se incubaron 106 células con anticuerpo
anti-MICA (dilución 1:1000 en PBS) durante 60 minutos a 4º C en oscuridad y con el
anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG murina conjugado con PE (dilución 1:100 en PBS),
durante 60 minutos a 4º C en oscuridad y se analizó con el citómetro.
2.2.4 Microscopía confocal
Las muestras de células mononucleares de sangre periférica de pacientes y controles
en fresco y sin permeabilizar fueron marcadas con una dilución 1:200 del anticuerpo
policlonal de conejo anti-ERp5 (ABR, Affinity Bioreagents) o con una dilución 1:200 del
anticuerpo policlonal de conejo anti-GRP78/BiP (Sigma). Tras lavar se marcaron con un
62
anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-IgG de conejo unido al fluorocromo Cy2 (GE
Healthcare) con una dilución 1:100 en PBS.
A partir de las células marcadas con ERp5 y GRP78 se realizaron otros marcajes para
realizar estudios de colocalización y diferenciación celular:
o Para marcar linfocitos B se usó una dilución 1:10 del anticuerpo monoclonal de ratón anti
CD20 unido a FITC (Beckton Dickinson).
o Para marcar linfocitos T se usó una dilución 1:10 del anticuerpo monoclonal de ratón
anti CD3 unido a FITC (Beckton Dickinson).
o Para marcar CD38 se usó una dilución 1:10 del anticuerpo monoclonal de ratón anti-
CD38 (Beckton Dickinson).
o Para marcar MICA las células fueron incubadas con un anticuerpo primario anti MICA
humano 6G6 (amablemente cedido por el Dr. Spies, Fred Hutchinson Cancer Research
Center) a una dilución 1:1000 en PBS y con un anticuerpo secundario policlonal de cabra
anti-IgG de ratón unido al fluorocromo Cy3 (GE Healthcare) a una dilución 1:100.
Una vez marcadas y lavadas las muestras con las distintas combinaciones de
anticuerpos se dispusieron en portaobjetos de vidrio con medio de montaje con DAPI
(VectaShield) y se analizaron con el Microscopio confocal Ultra-Espectral Leica TCS-SP2-
AOBS. El estudio de las muestras con microscopia confocal fue realizado por Leticia Huergo,
miembro de nuestro grupo.
2.3 Determinación de los niveles de MICA y MICB solubles
Las muestras de suero de los pacientes y controles se obtuvieron mediante
centrifugación de muestras de sangre en tubos de separación de suero Vacuette ® a 3000
rpm durante 10 minutos y se congelaron a -80º C hasta el análisis. Los niveles de MICAs y
MICBs se midieron mediante ELISA.
Se realizó un ELISA tipo sándwich con el Kit comercial DY1300 de R&D, compuesto
por un anticuerpo monoclonal murino de captura anti sMICA humana, un anticuerpo
policlonal biotinilado caprino de detección anti sMICA y una proteína MICA soluble de origen
recombinante siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Para la determinación de MICB soluble se realizó un también un ELISA de tipo
sándwich a partir del kit comercial DY1599 de R&D, compuesto por un anticuerpo monoclonal
murino de captura anti sMICB humana, un anticuerpo policlonal biotinilado caprino de
63
detección anti sMICB humana y una proteína MICB soluble de origen recombinante. El rango
de los estándares utilizados fue de 3,3 a 25 pg/ml.
3. Métodos estadísticos utilizados
3.1 Tasas de incidencia bruta, específicas por edad y
ajustada por edad
La tasa de incidencia cruda o bruta anual (TB) se calculó dividiendo el número de
casos incidentes de LLC entre el total de la población en un año. Las tasas brutas se
expresan en tantos por 100.000 habitantes y año. Para calcular las diferentes tasas brutas
anuales, se han estimado las pirámides de población anuales a partir de datos
correspondientes a los Censos de Población del Principado de Asturias para los concejos de
Gijón, Candas y Villaviciosa del año 2001 (datos estadísticos de 1 de noviembre de 2001)
facilitados por el Instituto Nacional de Estadística y los padrones municipales de los años
1998 y 2007. La población total del Área Sanitaria V del Principado de Asturias en 1998 era
de 290.031 habitantes y en el año 2007 se incrementó a 299.383 habitantes (3,1%).
Las tasas especificas por edad (TEE) se calcularon dividiendo el número de casos
incidentes de LLC para cada grupo de edad determinado en un periodo de tiempo entre la
población total de este grupo de edad a mitad del periodo. Se expresan en tantos por
100.000 habitantes y año. Para conocer la población y su distribución por grupos de edad se
consideraron los siguientes periodos: 40-44, 45-49, 50-54, 55-59, 60-64, 65-69, 70-74, 75-
79, 80-84 y más de 85 años.
Figura 8. Pirámide de población del área Sanitaria V (2001). Datos extraídos del padrón municipal 2001 (municipios de Gijón, Carreño y Villaviciosa). 290.031 habitantes.
20000 10000 0 10000 20000
De 0 a 4
De 10 a 14
De 20 a 24
De 30 a 34
De 40 a 44
De 50 a 54
De 60 a 64
De 70 a 74
De 80 a 84
Eda
d
Población
Hombres
Mujeres
64
El cálculo de las tasas ajustadas por edad (TA) se realizó según el método directo,
con respecto a la población mundial estándar utilizada en los estudios comparativos
internacionales157. La TA indica el número teórico de enfermos que tendría una población
predeterminada, si los riesgos que actúan en la población real para producir la enfermedad
actuaran sobre la población teórica de referencia, que habitualmente está compuesta por
100.000 habitantes para cada género. La TA resulta de sumar las tasas estandarizadas
ponderándolas según el porcentaje de individuos en cada intervalo y permite hacer
comparaciones entre diferentes periodos de tiempo o entre diferentes poblaciones, pero no
representan el valor real de la incidencia.
3.2 Supervivencia global y libre de tratamiento
Para estimar la supervivencia global (SG) se consideró la fecha de diagnóstico
recogida en la historia clínica de cada paciente y la fecha de la defunción por cualquier causa
o la fecha final del estudio, en caso de que el paciente se encuentre vivo en esta fecha. Se
consideran pacientes vivos si no constan como muertos, aunque esto puede producir cierto
sesgo en el sentido de sobreestimar la supervivencia. Se consideró supervivencia libre de
tratamiento (SLT) como el tiempo trascurrido desde el diagnóstico hasta la fecha de inicio del
tratamiento.
Para el estudio de la supervivencia según el IP MDACC se calculó un tamaño muestral
para detectar diferencias de un 50% en la SG a 10 años y según el índice GIMEMA para
detectar diferencias de un 30% en la SLT a los 10 años entre los grupos de mayor y menor
riesgo, con un error α de 5% y una potencia del 80% (tamaño muestral de 14 y 42 pacientes
en cada grupo respectivamente). Se determinaron las curvas ROC y se calcularon las áreas
bajo la curva para los diferentes sistemas pronósticos.
Las SLT y SG se estimaron por el método de Kaplan Meier y para comparar grupos se
utilizó el Log rank test. Para conocer la probabilidad de supervivencia global a los 5 y 10
años se utilizaron las tablas de mortalidad y para compararlas el test de Wilconson (Gehan).
En muchos casos no se expresó la mediana de supervivencia pues no se había alcanzado en
los grupos de menor riesgo. Se estimó el hazard rate (HR) mediante los métodos de
regresión univariante y multivariante de Cox para identificar factores de riesgo pronósticos
con respecto a la supervivencia.
Para dicotomizar los números relativos de linfocitos T CD4 y CD8 con respecto al
componente monoclonal (ratios T CD4/CMB y T CD8/CMB) se testaron diferentes puntos de
corte entre los percentiles 25 y 75. Se eligieron como puntos de corte del número relativo de
65
T CD4 el 0,1 y del número relativo de T CD8 el 0,074 pues se trataba de los valores que
distinguían pacientes con la máxima diferencia en la SG según el log rank test, basados en
tests de Χ2. Con estos valores se dividió en dos la variable y se realizaron las curvas de
supervivencia.
3.3 Descripción y asociación entre variables
Para la descripción de variables cualitativas se realizó la distribución de frecuencias y
se expresaron en porcentaje. En la elaboración de variables cuantitativas se realizaron test
de Kolmogorov Smirnov para valorar si las variables siguen una distribución normal. Se
describió la media o mediana, desviación estándar, rango de valores y se calcularon
intervalos de confianza del 95% para las variables significativas (IC 95%).
En la comparación de dos variables cualitativas se utilizó la prueba de Χ2 o el test de
Fisher en caso de tablas 2x2. En la comparación de una variable cualitativa con una
cuantitativa se utilizaron la t de Student o Mann Whitney en variables con dos niveles y
ANOVA o Kruskall-Wallis en variables con tres o más niveles. En la comparación entre dos
variables cuantitativas se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson o de Spearman
cuando no cumple las condiciones de aplicabilidad del test previo.
En todo el análisis estadístico se mantuvo el valor de significación estadística en una
probabilidad del 5% (p<0,05). Se tuvieron en cuenta las condiciones de aplicación de cada
test. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS 15.00.
4. Ética
En todo el trabajo se aplicaron los principios fundamentales de Bioética médica
concernientes a la confidencialidad y el secreto medico. Antes de iniciar el estudio se solicitó
autorización a la Dirección Médica del Hospital de Cabueñes para acceder a las historias de
pacientes diagnosticados de LLC.
Se obtuvo consentimiento informado de los pacientes a los que se les extrajeron
muestras de sangre total o suero para el estudio mediante la firma del documento generado
al efecto según la Declaración de Helsinki (anexo 2).
66
67
Resultados
68
69
1. Descripción de la serie
1.1 Distribución por sexo y edad
Nuestro primer objetivo fue conocer las características de los pacientes
diagnosticados de LLC en nuestro medio. Existen pocos estudios epidemiológicos de esta
enfermedad, la mayoría de estos utilizan criterios anteriores a la clasificación OMS y se
basan en datos procedentes de registros hospitalarios del cáncer que no reflejan la realidad
de esta enfermedad pues su manejo es fundamentalmente ambulatorio; por otra parte, se
han descrito importantes diferencias raciales en su incidencia. Por estos motivos resulta de
gran interés conocer las características que presentan los pacientes con LLC en nuestra área
al no disponer de ningún estudio publicado previamente. Siguiendo los criterios diagnósticos
establecidos en la introducción, el número de casos de LLC diagnosticados en el área
sanitaria V del Principado de Asturias entre enero de 1997 y diciembre de 2007 fue 265. Sólo
se diagnosticaron 18 pacientes (6,8%) de linfoma linfocítico bien diferenciado,
correspondiendo el resto de los casos a leucemia linfática crónica. La incidencia fue superior
en varones 58,5% (155 casos) que en mujeres 41,5% (110 casos), por lo que la razón de
género es de 1,39:1. La edad media fue de 71,7 años (rango 42-94); siendo en mujeres de
72,7 años (rango 47-94) y en varones de 70,8 años (rango 42-92), aunque la diferencia no
es significativa.
La figura 9 muestra en número de casos diagnosticados en cada tramo de edad
según el sexo. El número de casos va aumentando progresivamente con la edad hasta
alcanzar el máximo en varones de 75 a 79 años y en mujeres de 70 a 74 años.
0
10
20
30
40
50
60
De 4
0 a
44
De 4
5 a
49
De 5
0 a
54
De 5
5 a
59
De 6
0 a
64
De 6
5 a
69
De 7
0 a
74
De 7
5 a
79
De 8
0 a
84
De 8
5 a
89
Mas de 9
0
Edad
Num
ero
de c
asos
Total
Hombres
Mujeres
Figura 9. Número de casos por grupos de edad según sexo.
70
1.2 Incidencia anual, tasa bruta de incidencia, tasa ajustada
por edad y tasa específica por edad
La media anual de casos diagnosticados de LLC es de 26,5 casos (15,5 varones y 11
mujeres). El número de nuevos casos diagnosticados cada año osciló entre 36 en los años
1997 y 2007 y 16 en los años 2002 y 2005 (Fig. 10). Para conocer la repercusión de esta
enfermedad en nuestro medio comenzamos analizando las distintas tasas de incidencia. La
tasa bruta fue de 8,99/100.000 habitantes/año, siendo más elevada en varones que en
mujeres (11,04 vs. 7,11).
.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007
Año del diagnóstico
Cas
os n
uevo
s de
LLC
-B
Figura 10. Casos nuevos diagnosticados según el año del diagnóstico.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
De
0 a 4
De 10
a 14
De 20
a 24
De 30
a 34
De 40
a 44
De 50
a 54
De 60
a 64
De 70
a 74
De 80
a 84
90 o
mas
Edad
TEE
Hombres
Mujeres
Total
Figura 11. Tasa específica por edad (TEE) para distintos grupos de edad y según sexo.
71
Para poder establecer comparaciones con otras poblaciones calculamos la tasa
ajustada por edad según el método directo usando como referencia la población mundial
estándar y fue de 3,47/100.000 habitantes/año (3,99 en varones y 2,95 en mujeres). Las
tasas específicas por edad aumentan de forma progresiva con la edad tanto en varones como
en mujeres; las TEE más elevadas se observan en el grupo de edad de más de 90 años,
sobre todo en varones (81,93 frente a 38,56/100.000 habitantes/año en mujeres) (Fig. 11).
1.3 Características clínicas y biológicas de los pacientes
En el momento del diagnóstico la mayoría de los pacientes tenían un estado general
medido por la escala ECOG de 0 (43%) o de I (32%) y estaban asintomáticos (60,4%). Los
síntomas más frecuentes fueron astenia (22,6%), seguida de pérdida de peso (11,3%) y
sudor nocturno (6,4%). El 67% no presentaban adenopatías; se palpaban adenopatías en un
territorio ganglionar en el 9,8%, en dos territorios en el 6,4% y en tres o más en el 5,8% y
esplenomegalia en un 18,6% del total de casos. En la tabla 8 se muestran los principales
parámetros de hemograma y bioquímicos de la serie de pacientes.
Hemograma Mediana Media Rango
Leucocitos x109/L (0)* 15,6 25,7 2,3-334,4
Linfocitos x109/L (0)* 10,2 18,5 0,38-277
Segmentados x109/L (0)* 3,8 4,2 0,1-25,6
Hemoglobina gr/L (0)* 138 134 42-180
Plaquetas x109/L (0)* 186 196 22-483
Reticulocitos x109/L (61)* 68,20 74,421 90,90-40,70
Bioquímica Mediana Media Rango
Creatinina mg/dL (2)* 1,1 1,1 0,4-2,3
GOT U/L (6)* 22 24,6 8-227
GPT U/L (3)* 20 23,45 5-175
Bilirrubina mg/dL (1)* 0,53 0,62 0,1-3,8
LDH U/L (9)* 324 344 147-979
Albúmina gr/L (10)* 38 37,5 23-51,3
Gammaglobulinas gr/L (6)* 9,4 9,7 3-20,1
IgG gr/L (11)* 9,3 14,1 2,8-65,2
IgA gr/L (11)* 1,5 1,8 0,2-9,3
IgM gr/L (11)* 0,5 1,1 0,1-76,3
β2-microglobulina mg/L (15)* 2,3 2,7 0,5-12
*número de casos perdidos.
Tabla 8: Valores de tendencia central y rango de parámetros del hemograma y bioquímicos de los pacientes diagnosticados de LLC.
72
La determinación de CD38 en los linfocitos B monoclonales estuvo disponible en 147
casos; de estos fue positiva en 45 (30,6%) y negativa en 102 (69,3%). La determinación de
ZAP-70 fue positiva en 10% de los casos, aunque sólo estaba disponible en los pacientes
diagnosticados en los últimos años (n=32). Se determinó la β2-microglobulina en 250 casos,
y de estos presentaba un valor entre una y dos veces superior al valor normal el 32,8% y
más de dos veces superior al valor normal el 9,6% de los casos. Se produjo duplicación
linfocitaria en menos de 12 meses en 36 de los 221 pacientes evaluables para este
parámetro (16,3%).
1.4 Neoplasias asociadas
Se diagnosticó una segunda neoplasia asociada a la LLC en 67 pacientes (25,8%). En
algunos casos se realizó el diagnóstico de ambas enfermedades de manera simultánea y en
otros casos durante el periodo de seguimiento. Como se observa en la tabla 9, la localización
más frecuente de la segunda neoplasia fue la cutánea seguida del intestino grueso y tracto
urinario. En 6 casos se diagnosticó otro síndrome linfoproliferativo asociado a la LLC. No se
encontraron diferencias en la incidencia de neoplasias entre los pacientes que habían recibido
o no tratamiento para la LLC.
Frecuencia Porcentaje
Carcinoma de piel 14 20,8%
Tubo digestivo 13 19,4%
Vejiga incluidos papilomas 10 14,9%
Linfomas 6 8,9%
Respiratorio 4 5,9%
Otros 20 28,8%
Total 67 100
Tabla 9: Tipos de neoplasias asociadas en pacientes con LLC.
En resumen, en nuestra serie de pacientes encontramos una tasa de incidencia muy
elevada. La media de edad de nuestros pacientes es superior a los 70 años y el riesgo de
padecer la enfermedad aumenta con la edad. El diagnóstico en la mayoría de los casos se
realizó en fases precoces de la enfermedad, estando los pacientes asintomáticos. Las
alteraciones en el hemograma son poco llamativas salvo linfocitosis leve; sólo se detectó
anemia con cifras de hemoglobina inferiores 100 gr/L en el 19,6% y trombopenia con cifras
73
de plaquetas menores de 100x109/L en el 15,7% de los casos. La alteración bioquímica más
frecuente fue la hipogammaglobulinemia (cifra de gammaglobulinas inferior a 10,5 gr/L) que
se detectó en 158 casos (61%). Los pacientes presentaron una incidencia elevada de otras
neoplasias fundamentalmente de piel, tubo digestivo y vejiga.
2. Distribución por estadios de Rai, Binet, IP
MDACC e índice GIMEMA
El curso clínico de la LLC es muy variable, con algunos pacientes que mueren poco
tiempo después del diagnóstico y otros cuya supervivencia apenas se afecta por la
enfermedad. Por este motivo se realizan numerosos estudios encaminados a conocer
diferentes factores pronósticos que nos ayuden a detectar a aquellos pacientes que van a
evolucionar peor, precisan un seguimiento más estrecho y que tal vez podrían beneficiarse
de una intervención terapéutica más agresiva. Tradicionalmente existen diversos sistemas de
estadiaje como los sistemas clásicos de Rai y Binet que tratan de diferenciar a estos
pacientes, aunque se ha visto que presentan numerosas limitaciones para predecir la
supervivencia. Estas son debidas fundamentalmente a que en el momento del diagnóstico la
mayoría de los pacientes se encuentran en estadios iniciales (A de Binet o bajo riesgo de Rai)
y aunque la mayoría de estos pacientes permanecen estables sin precisar tratamiento y
presentan una supervivencia que apenas se ve afectada por esta enfermedad, algunos de
estos pacientes presentarán formas agresivas con progresión rápida a estadios avanzados y
una supervivencia de pocos meses. Los sistemas de estadios clásicos son incapaces de
identificar a estos pacientes.
Nuestro segundo objetivo consistió en validar en nuestra serie la utilidad de nuevos
sistemas pronósticos que nos ayuden a diferenciar mejor a pacientes con diferente
supervivencia, para ello comenzamos analizando la distribución de los 265 pacientes con LLC
según los estadios de Binet, Rai modificados, el grupo de riesgo IP MDACC y el Índice
GIMEMA para los pacientes en estadio A de Binet. Como se observa en la tabla 10, la
mayoría de los pacientes se diagnostican en estadios iniciales de Rai y de Binet, pero sin
embargo el grupo más numeroso según el IP MDACC fue el grupo de riesgo intermedio en
lugar del grupo de bajo riesgo. Un 76,8% de los pacientes se diagnosticaron en el estadio A
de Binet; si clasificamos a este subgrupo según el IP MDACC, el 40,2% se encontraban en el
grupo de bajo riesgo, el 59,8% en el de riesgo intermedio y ningún paciente en el de alto
riesgo.
74
Número Porcentaje
ECOG (264) 0 1 2 3
114 85 47 18
43,2 % 32,2 % 17,8 % 6,8 %
Estadios de Binet (263) Estadio A Estadio B Estadio C
202 39 22
76,8 % 14,8 % 8,4 %
Estadios de Rai modificados (263) Bajo riesgo
Riesgo Intermedio Riesgo alto
161 77 25
61,2 % 29,3 % 9,5 %
Grupo de riesgo IP MDACC (258) Bajo riesgo
Riesgo intermedio Riesgo alto
81
160 17
31,4 %
62 % 6,6 %
Índice GIMEMA (176) 0 Mujer 0 Varón
1-3 ambos sexos
58 66 52
33 %
37,5 % 29,5 %
Entre paréntesis el número de casos incluidos en cada análisis. Tabla 10: Distribución de los pacientes diagnosticados de LLC según los estadios de Binet, de Rai modificados, grupo de riesgo IP MDACC e Índice GIMEMA.
2.1 Supervivencia libre de tratamiento según los distintos
sistemas pronósticos
Nuestro siguiente objetivo fue analizar la capacidad de los sistemas de estadios
clásicos y de los índices pronósticos IP MDACC y GIMEMA para predecir la supervivencia
tanto libre de tratamiento (SLT) como la supervivencia global (SG), con el objetivo de valorar
cual de estos sistemas nos permite discriminar mejor la evolución de los pacientes
diagnosticados de LLC.
De los 258 pacientes evaluables (se perdió el seguimiento en 7 pacientes) y con una
mediana de seguimiento de 55,26 meses, sólo 67 pacientes (26,1%) han precisado
tratamiento. El principal motivo de inicio de tratamiento fue el fallo medular progresivo en 28
(41,8%), seguido de la aparición de síntomas sistémicos atribuibles a LLC en 16 (23,9%),
problemas compresivos o dolorosos debidos a las adenopatías en 14 (20,9%) y citopenia
inmune refractaria en 7 pacientes (10,4%).
La probabilidad de SLT de todos los pacientes fue de 71% (SE 0,03) a los 5 años y
de 61% (SE 0,04) a los 10 años. No se expresan las medianas de supervivencia pues no se
habían alcanzado en los grupos de menor riesgo.
75
(SLT: Supervivencia libre de tratamiento. SE: Error estándar)
Tabla 11: Probabilidad de supervivencia libre de tratamiento a los 5 y 10 años según estadios de Binet, Rai modificados, IP MDACC e Índice GIMEMA.
Como se observa en la tabla 11 y en la figura 12 que muestran la probabilidad de
SLT a los 5 y 10 años y las curvas de SLT según los estadios de Binet y Rai modificados,
grupos de riesgo del IP MDACC y del índice GIMEMA, todos los sistemas fueron útiles para
discriminar pacientes con diferente SLT (p<0,05) salvo los estadios de Binet pues entre los
estadios B y C no se detectan diferencias significativas (log rank p=0,19). Por otra parte, el
índice GIMEMA también fue útil para diferenciar tres subgrupos con diferente SLT dentro del
estadio A, que como ya habíamos comentado es el subgrupo más numeroso y heterogéneo
de pacientes en el momento del diagnóstico.
De los 67 pacientes que requirieron tratamiento sólo 61 pacientes fueron evaluables
para la eficacia, en 4 pacientes se alcanzó remisión completa (6,6%), en 41 pacientes
remisión parcial (67,2%) mientras que los restantes 16 pacientes se consideraron
refractarios al tratamiento (26,2%). Todos los pacientes que obtuvieron remisión completa
habían sido tratados con fludarabina.
Estadio Binet (p=0,63)
Número de
pacientes SLT 5 años (SE) SLT 10 años (SE)
Estadio A 202 0,86 (0,03) 0,76 (0,05) Estadio B 39 0,25 (0,08) 0,25 (0,08)
Estadio C 22 0,25 (0,1) 0,13 (0,1)
Rai modificado (p<0,05) Bajo riesgo 161 0,88 (0,03) 0,78 (0,05) Riesgo intermedio 77 0,5 (0,06) 0,45 (0,08)
Alto riesgo 25 0,27 (0,09) 0,14 (0,11)
IP MDACC (p<0,05) Bajo riesgo 81 0,93(0,03) 0,89 (0,05) Riesgo intermedio 160 0,64 (0,04) 0,54 (0,06)
Riesgo alto 17 0,13 (0,08) 0 (0)
Índice GIMEMA (p<0,05) 0 mujer 58 1 (0) 0,94(0,06) 0 varón 66 0,88 (0,05) 0,83(0,07)
1-3 ambos sexos 52 0,46 (0,05) 0,34 (0,08)
Total 265 0,71 (0,03) 0,61(0,04)
76
Log rank p<0,05 excepto entre estadio B y C de Binet p=0,19
Figura 12. Curvas de supervivencia libre de tratamiento según los diferentes sistemas. SLT según estadio de Binet. SLT según estadio de Rai modificado. SLT según índice pronóstico IP MDACC. SLT según índice GIMEMA para estadio A de Binet.
2.2 Supervivencia global según los distintos sistemas
Nuestro siguiente propósito fue valorar la supervivencia global (SG). Durante el
periodo de seguimiento de nuestro estudio fallecieron 76 pacientes con una la mediana de
tiempo desde el diagnóstico hasta el fallecimiento de 112,53 meses (IC 95%: 88,61-136,45).
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Mujeres 0 2/58
Varones 0: 7/66
Ambos sexos 1-3:17/5
1251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Mujeres 0 2/58
Varones 0: 7/66
Ambos sexos 1-3:17/5
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Estadio de Binet Estadio de Rai
IP MDACC
Índice GIMEMA
Su
pe
rviv
en
cia
acu
mu
lad
aS
up
erv
ive
nci
a a
cum
ula
da
Meses Meses
Meses Meses
Estadio A: 26/202
Estadio B: 25/39
Estadio C 16/22
Bajo riesgo 21/161
Riesgo intermedio 33/77
Bajo riesgo 6/81
Riesgo intermedio 51/160
Alto riesgo 17/25
Alto riesgo 15/17
5
77
En 46 casos (60,52%) la muerte estaba relacionada de forma directa o indirecta con la LLC,
y las principales causas fueron progresión de la enfermedad en 27,6%, infecciones en 17,1%
y anemia hemolítica en 1,3% de los pacientes. Por el contrario, en 21 pacientes (27,6%) se
consideró que la causa de la muerte no estaba relacionada con la LLC y en 9 pacientes la
causa fue desconocida. Sólo fallecieron 3 pacientes menores de 70 años y todos ellos a causa
de progresión de la leucemia.
En la tabla 12 se muestra la probabilidad de SG a los 5 y 10 años de los pacientes
según los estadios de Binet, Rai modificado, IP MDACC e índice GIMEMA. Como se observa,
en el caso del índice GIMEMA, aunque se observaban diferencias en la SLT entre los tres
grupos pronósticos estas no se traducen en diferencias en la SG; estos datos contradicen la
hipótesis planteada por el grupo italiano que describió este índice.
Estadio Binet (p<0,05)
Numero de pacientes
SG 5 años (SE) SG 10 años (SE)
Estadio A 202 0,83 (0,03) 0,62 (0,04)
Estadio B 39 0,61 (0,09) 0,40 (0,09)
Estadio C 22 0,4 (0,10) 0,21 (0,01)
Rai modificado (p<0,05) Bajo riesgo 161 0,84 (0,03) 0,61(0,05) Riesgo intermedio 77 0,71 (0,06) 0,51(0,07)
Alto riesgo 25 0,41 (0,09) 0,25(0,09)
IP MDACC (p<0,05) Bajo riesgo 81 0,87 (0,04) 0,73 (0,05) Riesgo intermedio 160 0,75 (0,04) 0,49 (0,05)
Riesgo alto 17 0,29 (0,12) 0,16 (0,10)
Índice GIMEMA (p=0,9) 0 mujer 58 0,79 (0,06) 0,64 (0,08)
0 varón 66 0,87 (0,05) 0,61 (0,07)
1-3 ambos sexos 52 0,7 (0,05) 0,61 (0,08)
Total 265 0,76 (0,03) 0,54 (0,04)
(SG: supervivencia global, SE error estándar).
Tabla 12: Probabilidad de supervivencia global a los 5 y 10 años según los estadios de Binet, Rai modificada, IP MDACC e Índice GIMEMA.
En la figura 13 se muestran las curvas de SG según las clasificaciones por estadios
de Binet, Rai modificado, IP MDACC e Índice GIMEMA. No se detectaron diferencias
significativas en la supervivencia global entre los grupos de riesgo bajo e intermedio de la
clasificación de Rai, ni entre ninguno de los subgrupos que diferencia el Índice GIMEMA.
78
Log rank p<0,05 excepto entre grupos de bajo riesgo e intermedio riesgo de Rai p=0,188 y entre los subgrupos del índice GIMEMA p=0,075, p=0,223, p=0,531.
Figura 13. Curvas de supervivencia global según los diferentes sistemas pronósticos. SG según estadio de Binet. SG según estadio de Rai modificado. SG según índice pronóstico IP MDACC. SG según índice GIMEMA para estadio A de Binet.
Como habíamos observado, de los pacientes que se diagnosticaron en el estadio A de
Binet: el 40,2% se clasificaban en el grupo de bajo riesgo y el 59,8% en el de riesgo
intermedio según el IP MDACC y entre ambos se detectan diferencias en la supervivencia,
por tanto el IP MDACC es útil para dos subgrupos de pacientes dentro del estadio A (Fig. 14).
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Estadio de Binet
Estadio A 45/202
Estadio B 16/39
Estadio C 15/22
Estadio de Rai
Bajo riesgo 38/161
Riesgo intermedio 22/77
Alto riesgo 16/25
IP MDACC
Bajo riesgo 12/81
Riesgo intermedio 51/160
Alto riesgo 12/17
Índice GIMEMA
Mujeres escore 0: 12/58Varones escore 0: 16/66Ambos sexos escore 1-3: 13/55
Su
pe
rviv
en
cia
acu
mu
lad
aS
up
erv
ive
nci
a a
cum
ula
da
Meses Meses
Meses Meses
79
Log rank p=0,003. Figura 14. Curvas de supervivencia global según el grupo de riesgo IP MDACC para pacientes en estadio A.
Para valorar la utilidad de los diferentes sistemas pronósticos como predictores de
mortalidad se calculó el área bajo la curva ROC que fue de 0,576 (IC 95%: 0,493-0,660)
para el índice GIMEMA, de 0,579 (IC95%:0,492-0,666) para los estadios de Rai, de 0,618
(IC 95%: 0,531-0,705) para los estadios de Binet y de 0,632 (IC 95%: 0,552-0,713) para el
IP MDACC. Siendo por tanto este último el sistema con mayor capacidad predictora de la
mortalidad de los que hemos analizado.
Con los datos expuestos, el mejor sistema pronóstico para discriminar la evolución
de pacientes diagnosticados de LLC es el IP MDACC, puesto que es el índice que mejor
discrimina pacientes con diferentes supervivencias tanto libre de tratamiento como global y
es el mejor predictor de mortalidad de los cuatro índices analizados. Los estadios de Binet no
fueron útiles para diferenciar la supervivencia libre de tratamiento y ni los estadios de Rai ni
el índice GIMEMA fueron útiles para discriminar subgrupos de pacientes con diferente
supervivencia global. Según el grupo de riesgo IP MDACC, el número de pacientes que se
clasifican en el estadio más precoz es menor que para los estadios de Rai y Binet, siendo el
grupo más numeroso el grupo de riesgo intermedio. Dentro del estadio A de Binet que es el
más heterogéneo y numeroso, utilizando el IP MDACC podemos distinguir dos subgrupos con
diferente supervivencia. El índice GIMEMA para pacientes en estadio A, aunque fue capaz de
predecir diferencias en la SLT, esto no se traduce en diferencias en la SG, contradiciendo la
hipótesis planteada por sus autores.
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Su
pe
rviv
en
cia
acu
mu
lad
a
Meses
Bajo riesgo 13/80
Riesgo intermedio 40/120
80
La probabilidad de supervivencia global a los 5 y 10 años según el IP MDACC es de
87 y 73% para los pacientes de bajo riesgo, 75 y 49% para los pacientes de riesgo
intermedio y de 2 9 y 15% para los pacientes de alto riesgo.
Además de ser capaces de predecir la evolución de esta enfermedad de curso tan
heterogéneo es preciso investigar diferentes factores pronósticos que nos permitan conocer y
explicar la evolución tan diferente de la enfermedad en unos y otros casos.
3. Cuantificación y valor pronóstico de los linfocitos T
CD4, CD8 y células NK en la leucemia linfática crónica
Hasta ahora los factores pronósticos que se emplean en la LLC tienen en cuenta
exclusivamente las características biológicas del componente monoclonal B y las
características clínicas de los pacientes, pero no tienen en cuenta otros factores como el
sistema inmunitario circundante. Recientemente se ha descrito en numerosos síndromes
linfoproliferativos que el presentar un número elevado de linfocitos T y NK se asocia a una
mejoría en la supervivencia global, sin embargo en la LLC esto no ha sido analizado. En este
objetivo pretendemos valorar si la presencia de un sistema inmunitario más competente se
asocia a una mejor supervivencia en la LLC, y por tanto, puede ser considerado un factor
pronóstico con utilidad clínica. Para este propósito analizamos el papel potencial del número
de linfocitos T CD4, T CD8 y de las células NK en el momento del diagnóstico en relación a la
supervivencia de los pacientes con LLC.
3.1 Las subpoblaciones T/NK al diagnóstico presentan una
distribución anormal
El número total de linfocitos de sangre periférica en los pacientes con LLC está
constituido fundamentalmente por el total de linfocitos B monoclonales, linfocitos B
normales, linfocitos T con sus subpoblaciones CD4 y CD8 y las células NK.
El número absoluto de las diferentes subpoblaciones de células T y NK en los
pacientes con LLC en el momento del diagnóstico, no sigue una distribución normal,
presentando una marcada tendencia hacia los valores elevados (fig. 15). Comparado con
valores de referencia en una población normal caucásica158, los pacientes con LLC presentan
81
cifras más elevadas de todas las subpoblaciones de linfocitos T y células NK, aunque los
linfocitos T citotóxicos CD8 y las células NK muestran un mayor aumento que los linfocitos T
CD4. De todos los casos analizados, 136 pacientes (51,1%) tenían un número aumentado de
linfocitos T (límite superior 1,787 x109/L), 95 pacientes (41,5%) tenían aumentados los
linfocitos T CD4 (límite superior 1,138 x109/L), 115 pacientes (50,2%) tenían aumentados
los linfocitos T CD8 (límite superior 0,823 x109/L) y 154 pacientes (63,9%) presentaban un
número aumentado de células NK (límite superior 0,427 x109/L). En 39,7% de los casos se
produjo una inversión del ratio CD4/CD8.
Figura 15. Distribución de linfocitos T con sus subpoblaciones CD4 y CD8 y de células NK en los pacientes diagnosticados de LLC. (Las barras rayadas representan valores normales en la población caucásica)158.
En la tabla 13 se muestra la distribución del número absoluto y relativo de células T y
NK con respecto al componente monoclonal según los estadios de Rai y otros factores
0
10
20
30
40
50
60
200-6001000
14001800
22002600
30003400
38004200
>4200
0
10
20
30
40
50
60
0-30
0600 90
0120
0150
01800
2100
2400
2700
3000
>3000
0
10
20
30
40
50
0-20
040
060
080
010
0012
0014
0016
0018
0020
00
>200
0
0
10
20
30
40
50
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
>200
0
Linfocitos T (x10 9/L)
Nª
de p
acie
ntes
Linfocitos T CD8 (x10 9/L)
Linfocitos T CD 4 (x10 9/l) Células NK (x10 9/L)
Nú
mer
o de
pac
ient
esN
ªde
pac
ient
es
Nª
de p
acie
ntes
82
pronósticos. No encontramos diferencias significativas en la distribución del valor absoluto de
las diferentes subpoblaciones linfocitarias según los estadios de Rai. Por otra parte, los
números absolutos más elevados de linfocitos T y NK los presentan los pacientes con peores
factores pronósticos: los pacientes con LLC CD38 positiva presentaron medianas de linfocitos
T más elevados (2,199x109 vs. 1,908 x109/L, p=0,007) y en particular T CD8 (0,984 x109/L
vs. 0,744 x109/L, p=0,005). Igualmente los pacientes con niveles más elevados de β2-
microglobulina tienen niveles más elevados de linfocitos T (2,144 x109/L vs. 1,856 x109/L,
p=0,03) y células NK (0,619 x109/L vs. 0,545 x109/L, p=0,02).
Factores pronósticos/ variables
Número absoluto de linfocitos T
Número absoluto de T CD4
Número absoluto de T CD8
Número absoluto de cel NK
p
Todos los pacientes (256)*
1,927 1,044 0,814 0,589
Estadio de Rai 0 (155)* I/II (77)* III/IV (22)*
1,878 2,040 1,977
1,014 1,128 1,023
0,797 0,846 0,815
0,583 0,613 0,511
ns
CD38 Positivo(>30%) (46)* Negativo(<30%) (100)*
2,199 1,908 (1)
1,256 1,004
0,984 0,744 (2)
0,649 0,532
(1) 0,007 (2) 0,005
β2-microglobulina Alta (>2,4 mg/L) (100)* Baja (≤2,4mg/L) (140)*
2,135 1,856 (3)
1,203 0,967
0,875 0,801
0,619 0,545 (4)
(3) 0,03 (4) 0,02
Factores pronósticos/ variables
Número relativo de linfocitos T
Número relativo
de T CD4
Número relativo de
T CD8
Número relativo de
cel NK
p
Todos los pacientes (256)*
0,258 0,142 0,105 0,075
Estadio de Rai 0 (145)* I/II (72)* III/IV (72)*
0,282 0,234 0,168 (1)
0,152 0,129 0,087 (2)
0,115 0,092 0,067 (3)
0,084 0,069 0,036 (4)
(1) 0,044 (2) 0,037 (3) 0,027 (4) 0,014
CD38 Positivo (>30%) (46)* Negativo(<30%) (100)*
0,201 0,220
0,112 0,131
0,092 0,086
0,060 0,061
ns
β2-microglobulina Alta( >2,4mg/L) (100)* Baja(≤2,4mg/L) (140)*
0,195 0,277
0,111 0,146
0,086 0,111
0,064 0,076
ns
* valores perdidos. ns: no significativo Tabla 13: Valores absolutos y relativos de linfocitos T, CD4 y CD8 y células NK. Distribución según estadio de Rai, positividad o no CD38 y valores elevados o no de β2- microglobulina.
El significado funcional de las células T/NK en la LLC depende, no sólo del número
83
absoluto de células, sino también de su distribución en relación con el componente
monoclonal B (MBC)122. Por tanto, analizamos la distribución del número relativo de células
T y NK calculando el ratio entre el número de células T/NK y el componente monoclonal B
(ratio T/NK:CMB) como se muestra en la tabla 13. De manera significativa los pacientes con
estadios precoces de Rai presentan números relativos más elevados de linfocitos T CD4
(p=0,03), T CD8 (p=0,02) y células NK (p=0,01). Por el contrario, los números relativos de
células T y NK no presentaron diferencias significativas según los factores pronósticos
adversos analizados como son la positividad de CD38 o los niveles elevados de β2-
microglobulina.
3.2 Interés pronóstico del recuento relativo de linfocitos T
CD4 y CD8
Debido al conocido papel antitumoral de las células T/NK, analizamos el valor del
número absoluto y relativo de células T/NK como factores pronósticos respecto a la
supervivencia global usando el método de regresión de Cox. En el análisis univariante se
incluyeron otros factores pronósticos conocidos como el nivel de β2-microglobulina o el
estadio de alto riesgo de Rai. Analizando como variables continuas, el número relativo de
linfocitos T CD8 (p=0,01), número relativo de linfocitos T CD4 (p=0,036), la β2-
microglobulina (p<0,001) así como el estadio de alto riesgo de Rai (p=0,010) se
identificaron como factores pronósticos de la supervivencia global. Por otra parte, ni el
número relativo ni absoluto de células NK resultaron factores pronósticos de la supervivencia
global (p=0,178 y p=0,085), pese a que como hemos visto se trata del componente celular
más aumentado en la LLC.
En la tabla 14 se muestran las variables que mantuvieron la significación estadística
en el análisis multivariante: los números relativos de linfocitos T CD4 y de linfocitos T CD8 y
la cuantificación de β2-microglobulina. Ni el número absoluto de ninguna de las
subpoblaciones de células T (CD4 y CD8), ni el número absoluto de células NK, ni el
componente monoclonal B o el número relativo de células NK (NK/CMB) se asociaron con la
supervivencia global.
Como ya habíamos comprobado que el sistema pronóstico de grupos de riesgo IP
MDACC fue el sistema que mejor discrimina subgrupos con diferente supervivencia global;
decidimos incluir esta variable en el análisis multivariante e igualmente el recuento relativo
de linfocitos T CD8 continúa siendo un factor pronóstico independientes (tabla 14).
84
Supervivencia global HR HR 95% p
CD8/CMB * 1,464 1,070-1,994 0,006
CD4/CMB * 0,091 0,009-0,912 0,016
β2-microglobulina* 1,351 1,191-1,531 <0,001
Supervivencia global HR HR 95% p
IP MDACC **
Riesgo intermedio MDACC
Riesgo alto MDACC
3,412
27,85
1,653-7,041
9,182-84,528
0,001
<0,001
CD8/CMB * 1,711 1,257-2,329 0,001
*se analizaron como variables continuas. ** Riesgo bajo categoría de referencia.
Tabla 14: Análisis multivariante mediante regresión de Cox respecto a la supervivencia global. En la tabla inferior se incluye el grupo de riesgo IP MDACC.
3.3 Los valores relativos de linfocitos T CD8 y CD4 más
elevados se asociaron con mejor supervivencia global
La mediana de tiempo desde el diagnóstico hasta el fallecimiento fue de 112,53
meses (IC 95%: 88,61-136,45). En el momento en que se realizó el análisis habían muerto
76 pacientes y como ya hemos mostrado la probabilidad de supervivencia global a los 5 y 10
años de la serie global de pacientes fue de 76% y 54% respectivamente.
Para analizar mejor el valor pronóstico del número relativo de linfocitos T CD8 y CD4,
dicotomizamos ambas variables. Para ello elegimos como puntos de corte del número
relativo de CD8 el valor 0,074 y del número relativo de CD4 el valor 0,1 pues son los valores
entre los percentiles 25% y 75% que presentan mayores diferencias en la supervivencia
usando el log rank test. En la figura 16 se muestran las curvas de supervivencia global al
dicotomizar las variables según los puntos de corte. Aunque el recuento de células NK era el
parámetro que encontramos elevado en un mayor porcentaje de casos en el momento del
diagnóstico no encontramos ningún punto de corte que nos permita diferenciar pacientes con
distinta supervivencia de forma significativa. Este resultado es concordante con el análisis
previo según el cual ni el número absoluto ni relativo de células NK se asociaron con la
supervivencia global según el método de regresión de Cox.
85
Figura 16. Curvas de supervivencia global según el número relativo de las distintas subpoblaciones linfocitarias. A. Según el numero relativo CD8 (p=0,02). B. Según el número relativo CD4 (p=0,02).
En la figura 17 se muestra la curva de SG que obtenemos con la suma de dos
variables que se pueden obtener mediante el estudio de citometría de flujo en el momento
del diagnóstico: la positividad o no de CD38 y el recuento relativo de linfocitos T CD8.
p<0,001
Figura 17. Curva de supervivencia global según CD38 y CD8/CMB.
ese
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Su
pe
rviv
en
cia
acu
mu
lad
a
Meses Meses
T CD8/CMB>0,074: 40/138
T CD8/CMB≤0,074: 32/81
T CD4/CMB >0,1: 30/122
T CD4/CMB ≤0,1: 41/91
Superv
ivenci
a a
cum
ula
da
1751501251007550250
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Meses
CD38 negativo y CD8/CMB >0,074=2/51
CD38+ y/o CD8/CMB≤0,074: 25/78
86
Como se puede observar los pacientes con LLC CD38 negativa (signo de buen
pronóstico del clon tumoral) y con recuentos relativos elevados de linfocitos T CD8
representan un grupo de especial buen pronóstico que presenta una probabilidad de
supervivencia global del 95% a los 10 años.
Las características clínicas y biológicas de los pacientes según los recuentos relativos
bajos o altos de linfocitos T CD8 y CD4 se muestran en la tabla 15.
DP: duplicación de la cifra de linfocitos en menos de un año. Entre paréntesis número de casos Tabla 15: Características clínicas y biológicas según los recuentos relativos de T CD8 y CD4 bajos o altos.
Como se puede observar, los pacientes con recuentos relativos altos de ambos
parámetros se encontraban con más frecuencia en estadios iniciales, presentaban cifras más
CD8 CD4 ≤0,074
(81) >0,074 (138)
p ≤0,1 (91)
>0,1 (122)
p
Edad (años) 70,37 70,24 0,636 71,6 70,27
0,311
Sexo varón (%) 51(64,5%) 81(57,8%) 0,331 60 (66,7%) 59(55,6%) 0,105
Estadio de Rai 0 I/II III/IV
35(44,87%) 31(39,74%) 12(15,38%)
95(67,85%) 36(25,71%)
9 (6,42)
0,003*
44(49,4%) 34(38,2%) 11(12,4%)
84(67,7%) 31 (25%) 9 (7,3%)
0,026*
Hemoglobina (gr/L)
130,5 137,9 0,066 131,1
138,2
0,013*
Plaquetas (x109/L)
176 207 0,003* 184 205 0,013*
Gammaglobulinas (gr/L)
8,54 10,23 <0,001* 8,63 10,24 <0,001*
IgG (gr/L)
8,68 10,02
0,003* 8,80
10,13 0,005*
IgA (gr/L)
1,52 1,89 0,001* 1,53
1,90
0,001*
IgM (gr/L)
0,5 0,99 <0,001* 0,59
1,03
<0,001*
LDH (U/L)
358 339
0,781 354
336
0,200
β2-microglobulina (mg/L)
3,31
2,54
0,048* 3,11
2,53 0,185
CD38 positivo (>30%)
18 (33,3%) 23 (30,6%) 0,748 21(37,5%) 22(30,1%)
0,490
DP menor de 1 año 16 (23,5%) 20(15,3%) 0,158 21(26,92%) 16(13,7%) 0,036*
87
elevadas de plaquetas y de gammaglobulinas que los pacientes con recuentos bajos.
Además los pacientes con número relativo de linfocitos T CD8 elevado presentaban niveles
menores de β2-microglobulina y los pacientes con número relativo de linfocitos T CD4
descendido presentaban cifras de hemoglobina más bajas y duplicación linfocitaria menor de
un año con más frecuencia que los pacientes con recuentos relativos de T CD4 elevados.
Por otra parte tal y como se muestra en la tabla 16, los pacientes con recuentos
relativos de linfocitos T CD8 mayores de 0,074 presentan mayor probabilidad de
supervivencia global a los 5 y 10 años que los pacientes con valores menores (p=0,01) al
igual que los pacientes con recuentos relativos de linfocitos T CD4 mayores de 0,1 con
respecto a los que presentaban recuentos menores (p=0,01). Mediante el método de Cox,
utilizando las variables dicotómicas y los recuentos bajos como categoría de referencia, el
hazard rate fue para el recuento relativo de CD8 1,78 (p=0,041) y para el recuento relativo
de CD4 1,64 (p=0,039). La mediana de supervivencia en los casos con recuento relativo T
CD8 bajos fue de 82,06 meses (IC 95%: 38,64-125,48) frente a los casos con recuentos
altos que fue de 149,33 meses (IC 95%: 94,58-184,28).
CD8/CMB (p=0,01)
Numero de pacientes
SG 5 años (SE)
SG 10 años (SE)
≤0,074 81 0,64 (0,06) 0,43(0,08) >0,074 138 0,80 (0,04) 0,56(0,06)
CD4/CMB (p=0,01) ≤0,1 91 0,63(0,05) 0,41 (0,07) >0,1 122 0,83(0,04) 0,58 (0,06)
Total 265 0,76 (0,03) 0,54 (0,04)
SG supervivencia global. SE: error estándar Tabla 16: Probabilidad de supervivencia global en 5 y 10 años según el recuento relativo de CD8 ≤0,074 vs. >0,074 y de CD4 ≤0,1 vs. >0,1.
En resumen, en los pacientes con LLC nos encontramos un número aumentado de las
subpoblaciones linfocitarias T CD4 y CD8 y de células NK en el momento del diagnóstico
asociado en muchos casos a una inversión del ratio CD4:CD8. Además los pacientes con
recuentos relativos de linfocitos T CD4 y fundamentalmente de linfocitos T CD8 elevados, se
encuentran en estadios más precoces, presentan menos factores pronósticos adversos y
tienen mejor supervivencia que los pacientes con recuentos bajos. Todos estos datos nos
sugieren el posible papel antitumoral de estos linfocitos T que no forman parte del clon
maligno en la leucemia linfática crónica. Por último, pese a que las células NK son las células
inmunitarias que encontramos más aumentadas, su número no está asociado con el
pronóstico y evolución de estos pacientes.
88
4. Análisis del papel de la respuesta inmunitaria mediada por NKG2D frente a la leucemia linfática crónica
Como hemos visto en los resultados previos, en los pacientes con LLC pese a que las
células NK están muy aumentadas en comparación con los individuos normales, el presentar
un número más elevado no se asocia con mejor supervivencia. De manera concordante,
resultados obtenidos en nuestro laboratorio nos indican que las células leucémicas obtenidas
de pacientes de LLC son muy resistentes a la citotoxicidad mediada por células NK, en
particular por NKG2D (datos no mostrados). Estos resultados coinciden con diversas
publicaciones que indican que la LLC es muy resistente a la citotoxicidad por células NK,
tanto “in vitro” como “in vivo”127-129. Como hemos descrito en la introducción, la activación a
través del receptor NKG2D es uno de los principales responsables de la citotoxicidad mediada
por las células NK. Por ello nos hemos planteado como último objetivo analizar el papel de la
respuesta inmunitaria mediada por NKG2D en la LLC.
4.1 Características de los pacientes
Inicialmente estudiamos el papel de MICA, el ligando mejor conocido de NKG2D, en
la LLC. Para ello, se determinó la expresión MICA en la superficie de las células leucémicas
en 100 pacientes diagnosticados de LLC que acudieron a la consulta de Hematología entre
Enero y Junio de 2009 que no habían recibido tratamiento en los 6 meses previos a la
determinación. Se trataba de 51 varones y 49 mujeres con una edad media 73,93 años
(rango 45-90 años). En el momento de la determinación estaban asintomáticos el 48% de
los casos; los síntomas más frecuentes fueron astenia (34%) seguida de sudor nocturno
(8%). La enfermedad se consideró “estable” en el 61% de los casos y “progresiva” en el
39% en base a los criterios expuestos en material y métodos. Se produjo duplicación
linfocitaria en menos de 1 año en el 15% de los casos. El CD38 fue positivo en 31 casos
(33,7%). En las tablas 17 y 18 se muestran los datos clínicos, la distribución por estadios y
según el grupo de riesgo IP MDACC de esta serie de 100 pacientes y los principales
parámetros de hemograma y bioquímica realizados en el mismo momento de la
determinación de MICA. En la tabla 19 se muestran las diferentes características clínicas y
biológicas de los pacientes con enfermedad estable y progresiva. El número absoluto de
linfocitos T CD8 estaba más elevados en los pacientes con enfermedad estable que en los
pacientes con enfermedad progresiva (p=0,043). No se detectaron diferencias respecto a las
células NK.
89
Número Porcentaje ECOG
0 1 2 3
59 32 9 0
59% 32% 9% 0%
Numero de ganglios 0 1 2 3
50 20 12 18
50% 20% 12% 18%
Esplenomegalia Si
No
19 81
19% 81%
Estadios de Binet Estadio A Estadio B Estadio C
71 20 9
71% 20% 9%
Estadios de Rai modificados Bajo riesgo
Riesgo Intermedio Riesgo alto
47 42 11
47% 42% 11%
Grupo de riesgo IP MDACC Bajo riesgo
Riesgo intermedio Riesgo alto
12 69 19
12% 69% 19%
Tabla 17. Características de los pacientes a los que se determinó MICA.
Hemograma Mediana Media Rango
Leucocitos x109/L (0)*
28,5 42,3 3,4-399,8
Linfocitos x109/L (0)*
18,1 28,5 1,0-158,9
Hemoglobina gr/L(0)*
130 129 77-179
VCM fl (0)*
88,8 87,5 61,9-107,9
Plaquetas x109/L (0)*
179 194 57-421
Reticulocitos x109/L (61)*
66,7 70,3 6,6-157
Bioquímica Mediana Media Rango LDH U/L (9)*
306 316 179-593
Albúmina gr/L (10)*
41,4 41,3 25,6-48,1
Gammaglobulinas gr/L(6)*
7,9 8,1 1-19,1
IgG gr/L(11)*
8,7 9,2 1,5-22,1
IgA gr/L (11)*
1,28 1,5 0,5-6,2
IgM gr/L (11)*
0,4 0,6 0,1-7,8
ß2-microglobulina mg/L (17)*
3,04 3,4 1,4-11,6
*entre paréntesis: casos perdidos
Tabla 18. Parámetros del hemograma y bioquímicos de la serie de pacientes a los que se determinó MICA.
90
Características Total n=100
Estable n=61
Progresiva n=39
p
Edad al diagnóstico (años) 73,9 74,48 73,08 0,51 Sexo Varón Mujer
51% 49%
31(50,8%) 30(49,2%)
20(51,3%) 19(48,7%)
0,96
Estadio de Binet (%) Estadio A Estadio B Estadio C
71% 20% 9%
55(90,2%) 6(9,8%) 0(0%)
16(41%)
14(35,9%) 0(23,1%)
<0,001
Hemoglobina (gr/L) 129,7 134,3 122,6 0,001 Plaquetas (x109/L) 194 229 170 0,011 Leucocitos (x109/L) 38,32 31,51 51,53 0,094 Linfocitos (x109/L) 28,57 24,14 35,51 0,095 Linfocitos T(x109/L) 4,05 4,13 3,93 0,079 Linfocitos T CD4 (x109/L) 2,37 2,36 2,58 0,148 Linfocitos T CD8 (x109/L) 1,67 1,88 1,42 0,043 Células NK(x109/L) 1,54 1,17 2,14 0,818 CD38 (%) Positivo (>30%) Negativo (<30%)
31 (33,7%) 61 (66,3%)
11(19,6%) 45(80,4%)
20(55,6%) 16(44,4%)
0,001
β2-microglobulina (%) Normal ≤2,4 mg/L Alta>2,4 mg/L
28(28,6%) 70(71,4%)
23(39%) 36(61%)
5(12,8%) 34(87,2%)
0,01
ZAP-70 (positive >20%) 8(32%) 2(13,3%) 6(60%) 0,004 Gammaglobulinas (gr/L) 8,19 8,66 7,44 0,09 IgG (gr/L) 9,1 9,8 8,2 0,046 IgA (gr/L) 1,5 1,7 1,2 0,033 IgM (gr/L) 0,6 0,5 0,6 0,523 LDH (U/L) 316 293 352 0,001 Tiempo de duplicación linfocitaria menor de un año (%)
15(15%) 0(0%) 15(38,4%) <0,001
Tabla 19: Características clínicas y biológicas en pacientes con enfermedad estable y progresiva.
4.2 Expresión de MICA en los linfocitos B
Se estudió la expresión de MICA en la superficie de las células mononucleares de
pacientes con LLC y en controles mediante citometría de flujo empleando anticuerpos
marcados con diferentes fluorocromos para detectar linfocitos B (CD19), linfocitos típicos de
LLC (coexpresión de CD5 y CD19), linfocitos T (CD3) y con anticuerpos específicos de MICA.
Se observó que las células leucémicas expresaban MICA en su superficie, aunque se observó
una gran variabilidad en el rango de intensidad media de fluorescencia (MFI) con rangos de 0
a 39,9. Si consideramos positividad para la expresión de MICA como un incremento de la
expresión de dos veces respecto al background, el 44% de los pacientes expresaban niveles
significativos de MICA. Estos niveles de expresión de MICA son muy bajos si los comparamos
con diversas líneas tumorales epiteliales donde en las mismas condiciones se puede llegar a
91
detectar unas 100 veces más de fluorescencia media (datos no mostrados). Por otra parte,
estos niveles de expresión tan bajos concuerdan perfectamente con la alta resistencia de la
LLC a la citotoxicidad mediada por NKG2D. Se observó mayor expresión en pacientes (5,95;
IC 95%: 4,64-7,26) que en controles (2,91; IC 95%: 1,79-4,02) de forma significativa
(p=0,01) como se muestra en la figura 18, pero sin embargo no observamos diferencias en
la expresión de MICA entre los casos de LLC estable y progresiva (p=0,051), ni entre los
casos CD38 positivo y negativo (p=0,058).
Tabla 20. Expresión de MICA en controles y en leucemia linfática crónica.
MFI: intensidad de fluorescencia media Figura 18. Expresión de MICA en los linfocitos de controles y pacientes con LLC estable y progresiva. Entre controles y LLC estable p=0,061, entre controles y LLC progresiva p=0,02 y entre LLC estable y progresiva p=0,051.
En la tabla 21 se muestra la expresión de MICA en la membrana de los linfocitos
leucémicos según características clínicas de los pacientes como el estadio, el tipo de
enfermedad estable o progresiva, según otros factores pronósticos y según el recuento
relativo de linfocitos T CD4 y CD8. Como se observa, no encontramos diferencias en la
expresión de MICA según el estadio o grupo de riesgo, ni respecto a ninguno de los factores
pronósticos analizados. Únicamente encontramos valores más elevados de MICA en
pacientes con recuentos de linfocitos T CD8 más elevados, sin que encontremos diferencias
según el recuento de células NK.
Controles Enfermedad estable
Enfermedad progresiva
Mediana IC 95% Rango
2,91
1,79-4,02 0-9,17
4,76
3,68-5,83 0-23,5
7,82
4,92-10,72 0-39,9
92
MICA (mediana FI) MICA (rango FI) p Estadio Binet
Estadio A (71) Estadio B (20)
Estadio C (9)
4,30 6,74 2,30
0-39,9 0-16,8 0-32,1
0,091
Estadio Rai Bajo riesgo (47)
Riesgo moderado (42) Alto riesgo (11)
3,80 5,4 2,36
0-39,9 0-30,6 0-32,1
0,250
Grupo de riesgo IP MDACC Bajo riesgo (12)
Riesgo Moderado (69) Alto riesgo (19)
5,5 4,05 4,13
0,9-13,3 0,39,9
0,7-12,9
0,667
CD38 Positivo (31)
Negativo (61)
4,70 3,80
0-39,9 0-19
0,058
β2 microglobulina vn (30)
1-2 vn (46) >2 vn (20)
3,55 4,1 6,14
0-39,9 0-32,10 0,4-30,6
0,123
Tipo de enfermedad Estable (61)
Progresiva (39)
3,6 5,4
0-14
0,3-39,9 0,051
Neoplasia asociada Si (25)
No (75)
4,5 4,3
0-12,9 0-39,9
0,860
DP en menos de un año. Si (15)
No (85)
4,6 4,3
0-12,9 0-39,9
0,717
Recuento relativo CD4 ≤0,1 (40) >0,1 (51)
4,35 4,30
0,3-39,9 0-32,1
0,541
Recuento relativo CD8 ≤0,074 (38) >0,074 (53)
3,00 5,30
0-13,6 0-39,9
0,028*
Recuento relativo células NK ≤0,03 (43) >0,03 (54)
3,9 4,55
0-39,9 0-30,6
0,578
vn: valor normal. DP: duplicación de la cifra de linfocitos en menos de un año.
Tabla 21. Expresión de MICA según características clínicas de los pacientes, diferentes factores pronósticos y recuento relativo de linfocitos T CD4, CD8 y células NK.
4.3 Expresión de ERp5 y GRP78 en linfocitos B de donantes
sanos y pacientes con leucemia linfática crónica
La baja expresión de MICA que presentan las células leucémicas en la LLC podría ser
debida a que no se induce en este tipo de cáncer o de forma alternativa a efectos de la
inmunomodulación (“inmunoediting”) de las células leucémicas por el sistema inmunitario49.
Para intentar aclararlo decidimos analizar si la baja expresión de MICA en la superficie de las
células de LLC podía ser consecuencia de un mecanismo de evasión tumoral. Como se ha
descrito previamente uno de los mecanismos por el que los tumores evaden la respuesta
inmunitaria mediada por NKG2D es mediante la digestión proteolítica de MICA en la
93
superficie tumoral y su liberación en forma soluble. MICA soluble es una potente molécula
inmunosupresora69. Nuestro grupo en colaboración con el laboratorio del Dr. Spies, ha
demostrado que la producción de MICA soluble depende de la interacción de MICA en la
superficie celular con dos chaperonas del retículo endoplasmático denominadas ERp5 y
GRP7879. Se hipotetiza que ERp5 y GRP78 se traslocan a la superficie tumoral en respuesta
al estrés celular y esto permite la liberación de MICA soluble. Esta producción de MICA
soluble tiene un papel muy importante en la evasión de la respuesta inmunitaria en
numerosos tumores epiteliales73,159,160, pero en las células leucémicas ha sido menos
estudiado.
Para analizar si la producción de MICA soluble es responsable del bajo nivel de
expresión de MICA en la superficie de las células leucémicas estudiamos en primer lugar el
papel de ERp5 y GRP78 en este proceso. No existen datos hasta la fecha de la expresión de
estas moléculas en las células leucémicas o en los linfocitos B. Por ello se estudio la
expresión de ERp5 y GRP78 en la superficie tanto de las células leucémicas (CD19+CD5+)
como de los linfocitos B mediante citometría de flujo. Inicialmente analizamos la expresión
de ERp5 y GRP78 en las células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos
mediante doble marcaje con CD3 y CD19. Sorprendentemente se demostró que ERp5 y
GRP78 se expresan en la superficie de los linfocitos de individuos normales (MFI ERp5:
17,14; MFI GRP78: 16,66), aunque su expresión está restringida a los linfocitos B y no se
observó expresión en los linfocitos T (CD3+). Mediante microscopía confocal se confirmó que
GRP78 y ERp5 se expresan exclusivamente en la superficie de los linfocitos B, donde se
distribuye uniformemente si mostrar ningún tipo de polarización (figura 19). Por tanto, los
resultados obtenidos mediante citometría de flujo se confirman mediante microscopia
confocal y podemos concluir que ERp5 y GRP78 se expresan en la membrana de los linfocitos
B de donantes sanos en sangre periférica.
De forma paralela a los donantes sanos, se determinó también mediante citometría
de flujo ERp5 y GRP78 en los linfocitos B de 100 pacientes diagnosticados de LLC y se
observó una elevada expresión en las células leucémicas tanto de ERp5 (rango de 0 a 333,1)
como de GRP78 (rango de 0,4 a 369,6). El 92% de los pacientes presentaban niveles
elevados de ERp5 y el 96% de GRP78. La expresión de ERp5 y GRP78 fue significativamente
más elevada en los pacientes con LLC que en los linfocitos B de los controles (p<0,01) como
se muestra en la tabla 22. La expresión de ERp5 y GRP78 estaba mucho más elevada que la
expresión de MICA sobre la superficie celular y parece que, al menos en parte, es
independiente de MICA, pues ambas moléculas se detectaron en algunos pacientes en los
que la expresión de MICA fue negativa.
94
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CD
3-P
ercP
CD
19-P
E
ERp5- FITC GRP78- FITC
CD
3-F
ITC
CD
19-F
ITC
ERp5-Cy3 GRP78-Cy3
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CD
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E
CD
3-F
ITC
CD
19-F
ITC
Figura 19. Análisis mediante citometría de flujo y microscopía confocal de la expresión de ERp5, GRP78 en los linfocitos T y B de donantes sanos y pacientes con LLC. En la parte izquierda se muestran los resultados de la citometría de flujo de células marcadas con ERp5 o GRP78 (conjugados con fluoresceína) y CD3 (conjugado a PerCP) o CD19 (conjugado a ficoeritrina PE). En la parte derecha se muestran imágenes de microscopía confocal de células mononucleares de sangre periférica teñidas con CD3 (linfocitos T) o CD19 (linfocitos B) y anticuerpos específicos de ERp5 y GRP78. Las células CD19 positivas expresan ERp5 y GRP78 en pacientes y en controles, mientras las células CD3 positivas no expresan ninguna de estas moléculas en su superficie.
Mediante citometría de flujo y microscopia confocal también se observó que la
población CD19+ expresaba ERp5 y GRP78, mientras que la expresión de ambos en los
linfocitos CD3+ fue negativa (fig. 19). Adicionalmente se analizó la expresión de estas
moléculas (ERp5 y GRP78) en la superficie de linfocitos T clonales procedentes de 2
pacientes con leucemia prolinfocítica de células T (LP-T). Los resultados mostraron que los
linfocitos T clonales no expresaban ERp5 o GRP78 del mismo modo que tampoco lo hacían
los linfocitos T normales.
95
Tabla 22. Expresión de ERp5 y GRP 78 en controles y pacientes con LLC medida según su intensidad de fluorescencia media. Mediana e intervalo de confianza.
Además, se observó que la expresión de ERp5 y de GRP78 se correlacionaban con la
progresión tumoral ya que era significativamente mayor en las LLC progresivas frente a las
LLC estables (p<0,001 y p=0,005) y también era mayor en las LLC CD38 positivas respecto
a las CD38 negativas (p=0,04 y p=0,02) (tabla 23 y figura 20).
Tabla 23. Expresión de ERp5 y GRP78 en pacientes con LLC estable vs. LLC progresiva y CD38 positiva vs. CD38 negativa. Mediana e intervalo de confianza.
Para valorar que parámetro (ERp5, GRP78 o MICA) tenía mejor capacidad predictora
del curso clínico de la enfermedad (estable vs. progresiva) se calcularon las curvas ROC de
ERp5, GRP78 y MICA y como se observa en la tabla 24, es el ERp5 el parámetro que mejor
capacidad tiene para detectar LLC progresiva.
Parámetro Área bajo la curva IC 95% p
MFI ERp5 0,804 0,725-0,883 <0,001
MFI GRP78 0,746 0,660-0,833 <0,001
MFI MICA 0,623 0,512-0,735 0,030
Tabla 24. Área bajo la curva ROC e intervalo de confianza de los niveles de ERp5, GRP78 y MICA para detectar si la LLC es progresiva.
Número
ERp5 (p<0,01)
GRP78 (p<0,01)
Controles 21 17,14 (12,84-21,44)
16,66 (14,06-19,37)
Pacientes 100 82,71 (68,93-96,49)
98,89 (83,60-114,18)
ERp5-MFI GRP78-MFI
Enfermedad progresiva (n=39)
Enfermedad estable (n=61)
112,71(92,54-132,88)
63,53 (46,26-80,81)
118,24 (95,55-140,93)
86,84(66,54-107,13)
CD38+ (n=31)
CD38- (n=59)
116,9 (85,73-148,06)
69,35 (54,54-84,17)
136,18 (102,11-170,25)
85,80 (69,02-102,57)
96
Controles Estable Progresiva
100
200
300
400
MF
I ofE
Rp5
Controles estable Progresiva
100
200
300
400
MF
I ofG
RP
78
100
200
300
400
MF
I ofE
Rp5
CD38+ CD38-
100
200
300
400
MF
I ofG
RP
78
CD38+ CD38-
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Especificidad
Sen
sibi
lidad
MFI of ERp5MFI of GRP78MFI of MICA
p<0.01 p<0.01
p=0.04 p=0.02
Figura 20. A. Expresión ERp5, GRP78 en controles y pacientes con enfermedad estable y progresiva y en pacientes CD38 positivos y negativos. En ambos casos p<0,05. B. Curva ROC de la expresión de ERP5, GRP78 y MICA para detectar enfermedad progresiva.
97
4.4 Niveles de MICA y MICB soluble en leucemia linfática crónica
MICA se puede liberar en forma soluble desde la superficie de las células tumorales
epiteliales71 y de algunos tipos de leucemia58, aunque en la LLC apenas ha sido analizado.
Para analizar la producción de MICA soluble (MICAs) en la LLC se determinaron los niveles en
suero mediante ELISA en 100 pacientes diagnosticados de LLC y en 21 controles sanos; los
resultados se muestran en la tabla 25 expresados en pg/ml. En el suero de los donantes
sanos se detectaron muy pequeñas cantidades de MICAs en el límite de detección de la
técnica de Elisa con un rango de 0 a 22,73 pg/ml (mediana de 8,41 pg/ml). En los pacientes
con LLC los niveles fueron muy heterogéneos de 0 a 553,5 pg/ml y sólo el suero del 38% de
los pacientes con LLC presentaba niveles significativos de MICAs. Además los pacientes
presentaban valores medios de MICA superiores a los controles; y los pacientes con
enfermedad progresiva además presentaban niveles más elevados que los pacientes con
enfermedad estable, pero no alcanzaron significación estadística. En el caso de MICB, se
observaron valores superiores en controles que en pacientes, sin diferencias significativas.
Tampoco se observaron diferencias en la cuantificación de MICA y MICB soluble entre los
casos CD38 positivo y negativo (p=0,31) y (p=0,10) respectivamente. Se observó
correlación significativa entre los niveles en suero de MICA soluble y MICB soluble con un
coeficiente de correlación de 0,522 (p<0,001).
Tabla 25. Niveles de MICA soluble y MICB soluble en controles y en pacientes diagnosticados de LLC con enfermedad estable y progresiva. Mediana e intervalo de confianza del 95%.
Número MICAs (pg/ml)
p=0,032 MICBs (pg/ml)
p=0,124
Controles
21 8,41
(0-15,05) 606,39
223,60-989,18
Pacientes
100 27,72
(13,64-41,8) 315,34
207,90-422,79
Número MICAs (pg/ml) p=0,546
MICBs (pg/ml) p=0,069
Enfermedad
estable 61 33,27
(12,20-54,35) 327,77
(211,28-534,26)
Enfermedad
progresiva 39 20,56
(3,13-37,99)
207,33 (91,73-322,93)
98
4.5 Correlación entre la expresión de ERp5, GRP78 y MICA en
la superficie de las células leucémicas
Hemos descrito previamente que ERp5 y GRP78 interaccionan en la superficie de las
células tumorales de origen epitelial con MICA79. Para analizar la posible asociación de la
expresión en superficie de ERp5 y GRP78 con la liberación de MICA en los pacientes con LLC,
se analizó la colocalización sobre la superficie celular de los leucocitos leucémicos mediante
microscopia confocal usando anticuerpos frente a MICA, ERp5 y GRP78 unidos a
fluorocromos. Como se observa en la figura 21 mediante microscopía confocal se observa
colocalización de ERp5, GRP78 y MICA en la membrana de las células leucémicas sin mostrar
ningún tipo de polarización. MICA presenta un color verde sobre la superficie celular y este
cambia a amarillo cuando se tiñe simultáneamente con anticuerpos frente a ERp5 y GRP78.
No se observó colocalización con otras moléculas de la superficie de la célula leucémica como
CD19 (datos no mostrados). Conjuntamente estos datos sugieren que ERp5 y GRP78
interaccionan con MICA en la superficie de las células leucémica igual que hemos descrito
para otros tipos de tumores.
MICA-Cy2 ERp5-Cy3 mergeDAPI
MICA-Cy2 GRP78-Cy3 mergeDAPI
Figura 21. Colocalización de ERp5-MICA y GRP78-MICA en la superficie de células mononucleares de sangre periférica de un paciente con LLC mediante microscopía confocal. Fluorocromos utilizados: Cy2 (verde); Cy3 (rojo); DAPI (azul).
Para analizar la posible interacción de ERp5 y GRP78 con MICA en la superficie de las
células leucémicas estudiamos también la correlación de la expresión de estas moléculas
medida como fluorescencia media por citometría de flujo en los 100 pacientes analizados.
99
Como se muestra en la figura 22 se ha detectado correlación entre la expresión de GRP78,
ERp5 y MICA en la membrana de los linfocitos B de los pacientes con LLC. La correlación más
elevada se observa entre ERp5 y GRP78 (coeficiente de correlación=0,76; p<0,001), pero
también se ha observado correlación entre MICA y ERp5 (r=0,26; p=0,006) y GRP78
(r=0,21; p=0,031). Sin embargo en los linfocitos B de los controles no se observa
correlación significativa entre ERp5 y GRP78 (coeficiente de correlación=0,246; p=0,466).
Figura 22. Correlación entre la expresión de ERp5 y GRP78, ERp5 y MICA y GRP78 y MICA en la membrana de las células leucémicas en pacientes con LLC.
Se analizó si existía correlación entre la expresión de ERp5 y GRP78 con algún
parámetro clínico, de laboratorio o inmunológicos de los pacientes de LLC. No se observó
correlación entre ERp5 o GRP78 con la cuantificación de linfocitos T, subpoblaciones T CD4, T
CD8, células NK ni con la cuantificación de inmunoglobulinas. Pese a que los pacientes con
estadios de Rai más avanzados presentaban niveles superiores de ambos parámetros no se
detectaron diferencias estadísticamente significativas (tal vez debido al reducido número de
pacientes en los grupos de mayor riesgo).
4.6 Correlación entre MICA y MICB soluble y ERp5, GRP78 y
MICA en la membrana de los linfocitos.
Dado que se ha observado “in vitro” que ERp5, GRP78 y MICA interaccionan en la
superficie de las células y se ha implicado a ERp5 y GRP78 en la liberación en forma soluble
de MICA, hemos analizado la correlación existente entre estos parámetros.
De forma inesperada, observamos una correlación negativa entre los niveles MICAs y
ERp5 y GRP78 en la membrana de las células. (r=-0,338; p=0,001 y r=-0,362; p<0,001;
MF
I ofE
Rp
5
MIC
A
r=0.76p< 0.0001
r=0,316p= 0,001
100
200
300
400
MFI of GRP78
100 200 300 400
MFI of ERp5
100 200 300
MF
I ofM
ICA
10
20
30
40r=0.26p<0.01
MF
I ofM
ICA
10
20
30
40
MFI of GRP78
100 200 300
r=0.21 p=0.03
100
respectivamente), pero no se observó correlación entre la expresión de de MICA en la
superficie celular y MICA sérica. En los controles sólo se observa correlación negativa entre
GRP78 y MICAs, aunque esta es mucho más elevada que en los pacientes, como se muestra
en la tabla 26.
ERp5 GRP78 MICA
MICA soluble
Global
Controles
Pacientes
-0,306 (P=0,001)*
0,023 (p=0,946)
-0,338 (p=0,001)*
-0,333(p=0,001)*
-0,725 (p=0,012)*
-0,362 (p=0,000)*
-0,029 (p=0,767)
-0,090 (p=0,791)
-0,042(p=0,677)
MICB soluble
Global
Controles
Pacientes
-0,497 (p<0,001)*
0,036 (p=0,915)
-0,475 (p=0,000)*
-0,449(p<0,001)*
-0,346(p=0,297)
-0,395(p=0,000)*
-0,157(p=0,102)
0,146 (p=0,667)
-0,095 (p=0,348)
Tabla 26: Correlación de MICA soluble y MICB soluble con ERp5, GRP78 y MICA en pacientes y controles.
Por último encontramos correlación entre los niveles de MICAs y la cuantificación de
células NK (coeficiente de correlación: 0,275; p=0,007) y linfocitos T (r=0,25; p<0,001). La
correlación con los linfocitos T fue más elevada con los linfocitos T CD8 (r=0,29; p<0,001)
que los linfocitos T CD4 (r=0,22; p<0,05). No se observó correlación con otros parámetros
clínicos analizados.
En conjunto, nuestros resultados demuestran una baja expresión de MICA en la
superficie de las células de la LLC; en consonancia con esta baja expresión hemos observado
que sólo un pequeño grupo de pacientes expresa cantidades significativas de la forma
soluble de esta molécula en el suero. Sin embargo, a pesar de la baja expresión de MICA
soluble, ésta se correlaciona con las diferentes poblaciones de linfocitos T y NK lo que
sugiere que MICA soluble puede tener algún papel inmunomodulador como ha sido descrito
en otros tipos de tumores.
Adicionalmente, nuestro estudio sugiere que la evasión de la respuesta inmunitaria
mediada por NKG2D también puede ser importante en este tipo de neoplasia, aunque
probablemente deben existir otros mecanismos de evasión de la respuesta inmunitaria
mediada por NKG2D diferentes de la producción de MICA soluble. En consonancia con esta
hipótesis otros miembros de nuestro grupo han caracterizado recientemente que la represión
epigenética de MICA y las ULBPs puede ser un mecanismo importante en la evasión de la
respuesta inmunitaria mediada por NKG2D, recalcando la relevancia de este sistema en la
inmunovigilancia de la LLC.
101
Discusión
102
103
1. Elevada incidencia de la leucemia linfática crónica
en nuestra área sanitaria
Como ya hemos comentado, nuestro primer objetivo fue conocer las características y
repercusión de la LLC en nuestro medio, y uno de los hallazgos más llamativos en este
sentido fue la elevada incidencia que nos encontramos de esta enfermedad. A pesar de que
la LLC es el tipo más común de leucemia en Europa y Norte América no se conoce bien su
incidencia real y los datos más fiables proceden de los Estados Unidos. En España no se
conocen con exactitud las características epidemiológicas de esta enfermedad debido a la
ausencia de un sistema de vigilancia epidemiológico específico; los datos de incidencia
disponibles de los diferentes tipos de leucemias proceden de registros del cáncer, y
concretamente en nuestro país, de los datos publicados por la Asociación Internacional de
Registros del Cáncer (IARC), agencia de la OMS, que utiliza clasificaciones previas a la
clasificación OMS para las neoplasias linfoides.
En nuestro estudio, hemos encontrado una tasa bruta (TB) de 8,99/100.000
habitantes/año y una tasa ajustada (TA) de 3,63 /100.000 habitantes /año. La TA es mucho
menor que la TB pues nuestra población está mucho más envejecida que la “población
mundial estándar”. Revisando la literatura nos encontramos que estas tasas de incidencia
son más elevadas que las publicadas recientemente en los diferentes estudios
epidemiológicos. En nuestro país, en el estudio realizado por Marcos-Gragera y cols. sobre la
población incluida en el Registro del Cáncer Poblacional de Gerona (1994-2001) la TB fue de
4,7/100.000 habitantes/año y la TA de 2/100.000 habitantes/año161, siendo por tanto
inferiores a las tasas encontradas en nuestra población. Por otra parte, los datos recogidos
en “Cancer Incidence in Five Continents” Vol IX (1996-2000), que es una publicación de la
IARC que se utiliza de referencia para conocer la incidencia de cáncer en el mundo, agrupan
todas las leucemias linfoides sin distinguir formas agudas o crónicas, ni diferentes subtipos
de síndromes linfoproliferativos; según este registro mundial, en el Principado de Asturias, se
registra una TB de leucemias linfoides en varones de 7,2 y en mujeres de 4,8/100.000
habitantes/año y una TA en varones de 4 y en mujeres de 3,1/100.000 habitantes/año162.
Por tanto, pese que se incluyen todas las neoplasias linfoides, las tasas de incidencia también
son inferiores a las que hemos recogido para la LLC en nuestro estudio. Por último, en un
estudio del registro SEER de Estados Unidos sobre 21.058 pacientes con LLC (1987-2004)
que utiliza la clasificación OMS, la TA fue de 5,13/100.000 habitantes/año163. Esta
publicación no proporciona los datos de la tasa bruta y se refiere únicamente a la tasa
ajustada, pero para ajustar esta tasa usa como referencia la población “US 2000” en lugar de
utilizar la “población mundial estándar”. Por este motivo la tasa de incidencia que nos
104
comunican es más próxima y equiparable a la tasa bruta en esta población, y por tanto en
este estudio también refieren una tasa inferior a la que encontramos en nuestro medio.
Hemos intentado analizar y elaborar hipótesis sobre los diferentes motivos de esta
elevada incidencia:
• Puede ser que no se trate de una mayor incidencia real de esta enfermedad sino de
un mejor registro y clasificación de los casos diagnosticados de LLC en nuestro medio
donde realizamos un diagnóstico muy precoz de esta patología que puede pasar
fácilmente desapercibida al tener con frecuencia un comportamiento muy indolente.
• Por otra parte, puede ocurrir que en nuestra población exista realmente una mayor
incidencia de LLC que en otras poblaciones por el envejecimiento de la población de
nuestra área sanitaria o por motivos genéticos o ambientales.
1.1 Mejor recogida de los casos diagnosticados de leucemia
linfática crónica
De todas las neoplasias hematológicas, la LLC es la que presenta más problemas
desde el punto de vista epidemiológico pues en los Registros del Cáncer se analizan los datos
procedentes de los informes de las biopsias, de las citologías, los ingresos y altas
hospitalarias, las defunciones y los tratamientos tanto de la sanidad pública como privada.
En estos no están incluidos muchos de los casos con LLC pues los datos que se registran
derivan sobre todo de los pacientes hospitalizados que no representan a toda la población. El
diagnóstico de la LLC se diferencia del de otros cánceres en que se establece mediante un
análisis de sangre periférica que incluye un recuento linfocitario confirmado con estudio del
inmunofenotipo y no precisa, por tanto, de confirmación histológica mediante biopsia para su
diagnóstico. Además muchos pacientes están asintomáticos, tardan en precisar tratamiento o
nunca lo precisan y son generalmente controlados en régimen ambulatorio, por lo que son
pacientes cuya patología no está recogida en los registros hospitalarios, ni por tanto en los
registros poblacionales de cáncer. Por otra parte, los registros pasivos como son los registros
del cáncer que se basan en revisiones retrospectivas nunca son tan precisos como los
registros activos y específicos.
105
En algunos estudios recogidos en la literatura ya se había observado que la
incidencia real de esta enfermedad era muy superior a la que se había recogido en los
registros de tumores para esa misma población.
• Al comparar la incidencia de LLC recogida en la base de datos del Sistema de Salud
de Veteranos de Arkansas, atendidos por un único Servicio de Hematología y con un
laboratorio de diagnóstico centralizado se observó que la incidencia real era un
37,6% mas elevada que la que estaba recogida en los registros del cáncer para esta
misma población164.
• En Suecia, entre los años 1964-2003, se detecta una incidencia un 12% mas baja
para la LLC en los Registros del Cáncer comparada con los casos registrados en los
hospitales165. Este fenómeno se observa sobre todo en los pacientes de edad
avanzada y en estadios precoces de la enfermedad. Por tanto, también existe este
problema de registro en los países con asistencia sanitaria universal.
• En el año 2002, se publicaron los datos recogidos por el REL “Registro de Leucemias”
que se trataba de un registro activo, prospectivo y concurrente elaborado por el
Grupo Cooperativo Español de Leucemias (REL) con la colaboración de la Fundación
Leucemia y Linfoma. En este registro no se recogen de forma diferenciada los casos
de LLC, pero los datos que aporta sobre la incidencia de la leucemia en nuestro país
son muy superiores a las cifras de las que se disponía hasta ese momento, que eran
procedentes del registro International Agency for Research on Cancer (IARC) y de
otros registros poblacionales de cáncer. Según el REL las tasas de leucemia en
España son de 12 y 8,6/100.000 habitantes/año en varones y en mujeres
respectivamente, y según el IARC para el mismo periodo eran de 7,8 y
4,7/1000000/año respectivamente166, lo que demuestra que los datos del IARC están
claramente infraestimados. De este registro podemos deducir que la incidencia de
leucemia global está infraestimada, ya que no figuran de forma diferenciada los
datos de incidencia de la LLC pues se incluyen de forma conjunta todas las leucemias
linfoides.
Nuestro trabajo sugiere que el estudio de una población estable atendida por un
Servicio de Hematología centralizado donde se revisan y validan todos los hemogramas
procedentes del área sanitaria y se registran todas las neoplasias hematológicas, refleja de
manera más real la incidencia de esta hemopatía que los registros de cáncer. Todos los casos
de LLC de nuestra población son detectados al ser validados todos los hemogramas por un
hematólogo que confirma los casos sospechosos mediante estudios de inmunofenotipo con
106
citometría de flujo y los registra en la base de datos del Servicio de Hematología de nuestro
hospital. Por tanto, uno de los principales motivos de estas elevadas tasas de incidencia
puede ser debida al mejor registro de todos los casos diagnosticados de LLC en nuestra área
sanitaria, y por tanto, las tasas de nuestro estudio constituyen un reflejo más fiel de la
realidad de esta enfermedad que los datos procedentes de registros del cáncer.
1.2 Mejor clasificación de esta enfermedad
En la mayoría de los registros del cáncer no se utiliza la clasificación OMS aunque en
algunos casos se ha adoptado muy recientemente; sin embargo, para realizar un estudio
epidemiológico riguroso uno de los pasos más importantes es utilizar esta clasificación, pues
es reproductible y está reconocida internacionalmente167. En la clasificación OMS no sólo se
tienen en cuenta criterios morfológicos, sino también inmunofenotípicos, genéticos y clínicos
que no se tenían en las clasificaciones previas y que nos permiten una filiación más correcta
de todas las leucemias.
En el volumen IX de “Cancer Incidence in Five Continents” (1996-2000), publicado
en 2007, no se utiliza la clasificación OMS, sino que se utiliza la clasificación CIE-10 o sea la
“Clasificación Internacional de Enfermedades, décima revisión” que data del año 1992. Esta
clasificación agrupa a todas las leucemias linfoides sin distinguir formas agudas y crónicas
por lo que tiene una utilidad muy limitada en los estudios epidemiológicos de LLC; además
no incorpora información sobre el inmunofenotipo, ni genética, ni las características clínicas.
En la actualidad, en la mayoría de los registros de tumores hospitalarios se siguen los
criterios CIE-0-2 (apartado oncología, segunda edición) que se ajusta más a los criterios de
la clasificación OMS que otras utilizadas previamente, aunque continua considerando la
leucemia linfática crónica y el linfoma linfocítico bien diferenciado como dos entidades
diferentes. Por otra parte, en el “Registro Español de leucemias” (REL) se presentan
agrupados los datos de la leucemia linfática crónica B, leucemia prolinfocítica T, leucemia
prolinfocítica B, leucemia de células peludas y otras leucemias linfoides no especificadas
como si se tratase de una única entidad pese a que se trata de entidades claramente
diferenciadas según la clasificación OMS y la práctica clínica habitual.
Para la elaboración del presente trabajo he revisado e incluido en el análisis sólo
aquellos casos que cumplían los criterios actuales del IWCLL para el diagnóstico de la LLC5.
107
1.3 Aumento de la tasa de incidencia por un mayor número
de casos diagnosticados.
El incremento de la incidencia de LLC que observamos puede también ser debido a
que diagnosticamos más casos de leucemia linfática crónica, sobre todo en los estadios muy
iniciales de la enfermedad. Esto puede ser debido a varios motivos como son: diferentes
criterios diagnósticos, la realización de un mayor número de hemogramas a pacientes
asintomáticos y la validación en todos los casos por un especialista en Hematología, lo que
nos permite su detección en fases muy incipientes de la enfermedad.
Uno de los motivos que puede explicar las diferentes incidencias recogidas en los
estudios puede ser la utilización de distintos criterios diagnósticos, sobre todo en lo referente
a la cifra de linfocitos que se requiere para realizar el diagnóstico de la enfermedad. Nosotros
hemos utilizado como criterio la cifra de linfocitos superior a 5x109/L de acuerdo con los
criterios propuestos por el BCSH en 1996 y actualizados por el IWCLL y en la Clasificación
OMS en el año 20085,17. En algunas clasificaciones previas se requerían cifras de linfocitos
superiores a 10x109/L168, para poder garantizar el diagnóstico cuando no se disponía de los
estudios inmunofenotípicos, por lo que no incluían muchos casos de LLC con cifras entre
5x109/L y 10x109/L que se incluirían según los criterios actuales.
En segundo lugar, el aumento de casos diagnosticados puede ser debido a que se
detectan más casos de LLC al realizar un mayor número de hemogramas a nuestra población
y así podemos detectar esta enfermedad de forma casual en fases precoces y asintomáticas.
Nos hemos encontrado que en el 60,4% de los casos el diagnóstico se realizó de forma
casual al realizar un hemograma de rutina por otro motivo. Por tanto, la elevada incidencia
también puede reflejar el hecho de que cada vez se realizan en nuestro sistema sanitario un
mayor número de exámenes de salud y con mayor nivel de complejidad, sobre todo a los
pacientes de edad avanzada. Esto es debido a la mejoría de los programas de salud en este
grupo de edad y la accesibilidad existente en nuestro sistema sanitario con cobertura
universal.
Se ha observado una tendencia en los últimos años al diagnóstico más precoz de la
LLC, de forma que la mayor parte de los pacientes en el momento del diagnóstico se
encuentran en estadios iniciales. Rozman y colaboradores publicaron un estudio realizado
sobre dos cohortes históricas de pacientes: un grupo diagnosticado entre los años 1960-
1979 (grupo I) y un segundo grupo entre los años 1980-1989 (grupo II). Los pacientes del
grupo II presentaban mayor edad (65.8 vs. 61.3 años) y una mayor proporción de ellos se
108
encontraban en estadios A de Binet (65.7% vs. 42.6%)169. En otro estudio realizado por
Molica sobre tres grupos de pacientes clasificados según el año del diagnóstico: entre 1970-
1979 se diagnosticaban en estadio A un 26,3% de los pacientes, entre 1980-1989 un 50,3%
y en el grupo más reciente entre los años 1991-1998 un 72% de los casos diagnosticados
pertenecían a este estadio170. Esta tendencia a realizar el diagnóstico de la enfermedad en
fases cada vez más precoces se ha señalado también por la Sociedad Americana de Cáncer
al observar que en los últimos años el número de pacientes que requieren tratamiento en el
momento del diagnóstico es menor que en épocas anteriores15.
Por el contrario, en otro estudio epidemiológico publicado en el año 2007 sobre LLC
en la India, sólo un 14% de los pacientes eran menores de 55 años y sólo el 30%
pertenecían al estadio de bajo riesgo de Rai y la cifra media de linfocitos al diagnóstico es
mucho más elevada que en otros estudios actuales (70,6x109/L). Estos datos posiblemente
reflejan que el diagnóstico de LLC en la India se realiza en fases más avanzadas que en los
países occidentales por la menor accesibilidad al sistema sanitario en este país171.
En nuestra serie de pacientes la proporción de casos en estadios iniciales (A de
Binet) es del 76,8%, lo que sugiere que el diagnóstico se realiza en fases muy precoces y
asintomáticas de la enfermedad.
1.4 Aumento real de la incidencia de leucemia linfática
crónica en nuestra área
Por último, otro posible motivo que explicaría la mayor incidencia de LLC en nuestro
medio podría ser que, en nuestra población, la incidencia de LLC fuese realmente superior a
otras poblaciones. En el registro REL, la LLC supuso el 34,2% de todas las leucemias, pero el
Principado de Asturias fue la comunidad autónoma donde fue el porcentaje de LLC fue mas
elevado, alcanzando el 49,5%. Además las tasas de incidencia de los síndromes
linfoproliferativos crónicos en Asturias fueron de 6,2 y 3,7/100.000/año en hombres y
mujeres respectivamente, mientras que en el resto de España fueron de 4,8 y
3,4/100.000/año. Por tanto, podría ocurrir que en nuestra Área Sanitaria la incidencia de LLC
fuese realmente más elevada que en otras poblaciones debido a diferentes factores genéticos
y/o ambientales.
Según se constata en diferentes publicaciones, la LLC no afecta por igual a todas las
poblaciones. Se ha observado que la LLC es 20-30 veces más común en Europa, Australia y
109
blancos norteamericanos que en la India, China y Japón. Estas diferencias raciales son
consistentes y se han descrito igualmente en personas que migran a USA desde países
asiáticos y en sus descendientes. Por ejemplo, en el registro SEER en USA se ha observado
que la incidencia es inferior en la raza negra (25%) o asiática (77%) respecto a la raza
caucásica163. También existe una tendencia familiar en la LLC; se ha observado que en
familiares de primer grado de pacientes con LLC se presenta con mayor frecuencia que en la
población general y el diagnostico se realiza unos 10-20 años antes que en los casos
esporádicos. Parece, que al menos en una proporción de familias, puede existir una
anormalidad hereditaria que predispone a esta enfermedad172. Por tanto, parece demostrada
la existencia de una tendencia genética a padecer esta enfermedad y en este sentido pueden
existir poblaciones como la nuestra que presenten un mayor riesgo genético, aunque por el
momento esto debe ser demostrado.
También podrían influir en la elevada incidencia determinados factores ambientales
que desconocemos actualmente; en los últimos años existe un interés creciente por el
estudio de factores de riesgo de la LLC. Recientemente se han identificado algunos como son
la radiación en mineros de uranio de la República Checa o en trabajadores en centrales
nucleares173,174 y la exposición a benceno o butadieno en trabajadores de la industria del
caucho y del petróleo175. Para detectar los diferentes factores ambientales se deberían
realizar estudios epidemiológicos que valorasen en poblaciones amplias el riesgo de padecer
la enfermedad según diferentes exposiciones ambientales y/o profesionales.
Nuestra población está mucho más envejecida que la “población mundial” utilizada
para el ajuste de tasas; por ese motivo, observamos una tasa bruta tan elevada y que la
tasa ajustada es mucho menor que la tasa bruta. En todos los estudios publicados se
observa un aumento marcado en la incidencia de esta enfermedad al aumentar la edad. En el
registro SEER, se observa un aumento de la incidencia exponencial hasta los 65 años, con un
aumento más lento a partir de esta edad163; mientras en otros estudios al igual que en el
nuestro, se observa un aumento progresivo con la edad sin mostrar ningún “plateau”167. La
esperanza de vida de nuestra población fue de 80,5 años en el 2006 o sea es una de las más
elevadas del mundo, lo que también puede motivar la elevada tasa bruta que nos hemos
encontrado. Por último, la media de edad de los pacientes de nuestro estudio que fue 71,7
años es algo más elevada que en la mayoría de las series publicadas en los últimos años
(entre 65-70 años)163,167,176.
En conclusión, observamos una elevada incidencia de LLC en nuestra Área sanitaria
que puede ser debida a diferentes factores como son un registro más fiel de la realidad de
esta enfermedad y un aumento de los casos diagnosticados en estadios precoces junto con
110
un posible aumento en la incidencia real de esta enfermedad por la edad tan avanzada de
nuestra población; tal vez la elevada incidencia también sea debida a diferentes factores
genéticos y/o ambientales pero para su detección deberían diseñarse estudios específicos en
este sentido.
2. Supervivencia de los pacientes con leucemia
linfática crónica
En nuestro estudio hemos encontrado una probabilidad de supervivencia a los 5 y 10
años del 76% y 53%, que es superior a otros estudios recientes realizados en Estados
Unidos. Los datos procedentes del registro SEER estiman estas probabilidades en 60,2% y
34,8%177 y según la Base de datos Nacional del Cáncer de EEUU (NCDB) fue de 48,2% y
22,55% para estos mismos periodos167. Por otra parte, en el estudio EUROCARE II se
observa una mayor supervivencia a los 5 años en el oeste y norte que en el este de Europa.
La supervivencia a los 5 años en nuestro país según este estudio es del 68%, en Francia del
79%, en Holanda del 74% y en Alemania del 72%, siendo la media para 14 países Europeos
del 63%178. Por tanto, la supervivencia en nuestra serie es equiparable a la de países del
Norte de Europa como Suecia donde en pacientes diagnosticados entre los años 1994 y 2003
fue del 73 y 53% a los 5 y 10 años respectivamente176.
Como ya hemos descrito en nuestro estudio el porcentaje de casos en estadio A es
muy elevado debido a un diagnóstico muy precoz de la enfermedad. Como ya se ha descrito
esto puede ocasionar un aumento de la supervivencia sin que refleje necesariamente un
cambio en la historia natural de la enfermedad. No obstante, desde hace unos años se ha
venido observando una mejoría en la supervivencia de los pacientes diagnosticados de LLC,
aunque no todos los grupos coinciden ni en el motivo ni en los grupos de edad en los que se
produce esta mejoría. En el estudio EUROCARE II, la probabilidad de supervivencia a los 5
años ha ido aumentando desde 53% en los años 1978-1980 a 66% entre los años 1987-
1989178, aunque esta supervivencia sigue siendo inferior a la de la población general de la
misma edad y sexo25. Según EUROCARE II, la LLC acorta la esperanza de vida en todos los
grupos de edad independientemente de sus características clínicas al diagnóstico178.
En el estudio del NCI sobre el registro SEER al comparar la supervivencia de los
pacientes diagnosticados entre los años 2000-2004 y los diagnosticados entre los años 1980-
1984, se observa una mejoría en la supervivencia a los 5 años en todos los grupos de edad y
a los 10 años en todos los grupos salvo en los pacientes de edad más avanzada177. Los datos
de este estudio proceden de registros del cáncer por lo que presentan los problemas que ya
111
hemos descrito previamente y además no tiene en cuenta la mejoría en los cuidados de
salud en la población general. Por el contrario, en un estudio realizado en pacientes del
Hospital Clínico de Barcelona comparando dos periodos 1980-1994 y 1995-2004 donde se
tiene en cuenta la mejoría en la esperanza de vida en la población general en los últimos
años, se observa que la mejoría en la supervivencia se produce sobre todo en pacientes más
jóvenes (de edad menor de 70 años) y que presentan formas de enfermedad avanzada, que
son el subgrupo de pacientes que se tratan con las terapias más modernas, aunque sólo
constituyen un 20% de todos los pacientes con LLC. No observan, por el contrario, mejoría
en los pacientes de mayor edad o que presentan enfermedad de bajo riesgo, lo que sugiere
que los nuevos tratamientos realmente están mejorando el pronóstico de la enfermedad179.
La supervivencia a los 5 años en el estudio EUROCARE II disminuye al aumentar la
edad de los pacientes, desde el 88% en menores de 44 años hasta el 54% en mayores de 75
años178. En nuestro estudio, debido a la media de edad tan avanzada de los pacientes, se
observa un porcentaje de muertes por causas no relacionadas con la LLC superior a las
descritas en el estudio del MD Anderson Cancer Center donde la media de edad es de los
pacientes diagnosticados de LLC es de 58 años26, y como el parámetro que hemos analizado
es la supervivencia global en lugar de la supervivencia específica en relación con la
enfermedad esto puede suponer un impacto negativo debido a las muertes producidas por
otros motivos en pacientes de edad avanzada. Pero por otra parte, se ha visto que aunque
en pacientes diagnosticados de LLC la incidencia de comorbilidades suele ser muy elevada,
pero el mayor impacto negativo sobre la supervivencia es la propia LLC180.
Como ya hemos descrito, la probabilidad de supervivencia de nuestros pacientes a
los 5 y 10 años es de 76 y 53% respectivamente y la mediana de supervivencia global está
en torno a 10 años, pero el pronóstico individual es extraordinariamente variable y por este
motivo teniendo en cuenta las limitaciones para predecir la evolución que presentan los
sistemas de estadios clásicos se intentan diseñar nuevas clasificaciones que nos permitan
identificar grupos de pacientes con diferente pronóstico.
2.1 Análisis y validación de los diferentes sistemas
pronósticos en la leucemia linfática crónica
Los estadios clínicos de Rai y Binet son los sistemas vigentes desde hace muchos
años para clasificar a los pacientes con LLC. Se basan en la extensión de las adenopatías,
112
esplenomegalia y hepatomegalia medidas por palpación y la presencia de anemia y/o
trombopenia. Parte de su éxito se debe a que son simples, baratos y accesibles, pero no
permiten distinguir dentro de un mismo estadio los pacientes que tendrán una evolución más
agresiva de su enfermedad, sobre todo en los estadios precoces donde además se
encuentran la mayoría de los pacientes al diagnóstico, o sea utilizados de forma aislada los
estadios no son suficientes para predecir el riesgo individual de cada paciente, por lo que
debemos utilizar otros parámetros que nos ayuden a determinar el pronóstico.
En otras hemopatías, como en los Linfomas no Hodgkin (LNH) se han desarrollado
índices pronósticos internacionales como el IPI para los LNH agresivos181 o el FLIPI para los
LNH foliculares182, que se basan en determinaciones sencillas, y que permiten predecir el
pronóstico a largo plazo, identificar grupos de riesgo y adecuar el planteamiento terapéutico
para cada paciente. En la LLC está pendiente el desarrollo de un modelo pronóstico
semejante, tal vez debido a que su elaboración es muy difícil por la naturaleza crónica de
esta enfermedad y a que se precisan seguimientos muy largos. Los nuevos índices
pronósticos propuestos por el MDACC y por el grupo GIMEMA también tienen la ventaja de
que son accesibles a la práctica clínica diaria y de fácil aplicación26,27. El índice GIMEMA,
pretende distinguir subgrupos con diferentes supervivencias libres de progresión dentro del
estadio A de Binet, pues se considera que estas tendrán impacto en la SG27. Hemos
analizado este índice respecto a la SLT y observamos que en nuestra serie también distingue
tres grupos diferentes, pero sin embargo no hemos encontrado diferencias en estos
subgrupos respecto a la SG.
El IP MDACC ha sido útil para valorar diferencias tanto respecto a la SLT como la SG,
pese a que nuestra población de pacientes es muy diferente a la atendida en el MD Anderson
Cancer Center donde los pacientes presentan un posible sesgo de selección y tienen una
media de edad de 58 años. En nuestro estudio se analizaron e incluyeron todos los pacientes
diagnosticados de LLC del Área sanitaria; la media de edad es de 72 años, que es más
próxima a la descrita en la LLC en la mayoría de los estudios. En el subgrupo de pacientes en
estadio A de Binet que es el más numeroso (76,8% del total), el IP MDACC nos permite
diferenciar pacientes de bajo riesgo de otros de riesgo intermedio con supervivencias
diferentes, o sea también es útil en estadios precoces. Las principales ventajas del IP MDACC
son que las características que se valoran en cada paciente se pueden obtener rápidamente
en la clínica diaria, es útil en cualquier momento de evolución previo al inicio de tratamiento
y se puede usar de manera seriada en un paciente a lo largo del tiempo26. Puede ser útil
para aplicarlo en ensayos clínicos y para estudiar la correlación con otras variables biológicas
de interés pronóstico. Este índice también presenta algunas limitaciones como son el hecho
de que no todas las variables que incluye han demostrado ser factores pronósticos
113
independientes en muchas series recientes pues algunas están muy interrelacionadas y el
hecho de que clasifique a todos los pacientes varones mayores de 65 años en los grupos de
riesgo intermedio u alto, pues ambos parámetros son variables demográficas más que
características específicas de la enfermedad. Las diferencias en la supervivencia pueden ser
debidas a que los pacientes varones presentan más factores pronósticos adversos y a que,
tanto en el estudio original como en el nuestro, se analiza la supervivencia global donde
tiene mucha influencia la edad del paciente, en lugar de la supervivencia específica en
relación con la LLC. No obstante en los índices pronósticos que se aplican de forma universal
en otros linfomas como el IPI181 o el FLIPI182, el parámetro que se valora también es la
supervivencia global. Por otra parte, el IP MDACC detecta diferencias en la SLT por lo que
también es útil para predecir la evolución en relación con la propia enfermedad. Pese a que
hoy en día se van conociendo gran cantidad de características biológicas y moleculares en
pacientes con LLC que son predictores poderosos de la supervivencia, el IP MDACC
proporciona un avance en el manejo de los pacientes que no tienen acceso a estas técnicas
mediante la integración en un sistema pronóstico simple de características clínicas y
determinaciones de laboratorio básicas. Se ha demostrado que los índices pronósticos
basados en características clínicas y básicas de laboratorio son complementarios a la
utilización de factores pronósticos moleculares y proporcionan una mejor predicción
usándolos conjuntamente que mediante la utilización de una única estrategia181,183.
El sistema propuesto por Wierda y colaboradores es sencillo y nos ayuda a definir
mejor la supervivencia que los sistemas de estadios de Rai y Binet. Ha sido validado por dos
grupos independientes: en nuestros pacientes que presentan una características muy
diferentes al grupo de origen y en pacientes de la Clínica Mayo184,185. Además es útil cuando
se aplica a pacientes en estadios precoces y ayuda a predecir tanto la SG como la SLT y
según las curvas ROC es el sistema pronóstico que presenta la mejor capacidad predictora.
Para validar nuestros resultados, sería muy interesante su utilización y valoración de forma
prospectiva, aunque esto presenta la dificultad de la larga historia natural de la enfermedad.
3. Linfocitos T y células NK en la leucemia linfática
crónica
La progresión de la LLC se asocia a defectos cuantitativos y cualitativos del sistema
inmunitario del huésped. Estos defectos causan alteraciones de la respuesta inmunitaria
celular que afectan a la función de las diferentes subpoblaciones T, células NK y
dendríticas186. Estas alteraciones dañan la respuesta inmunitaria lo que provoca un
114
incremento de incidencia de enfermedades infecciosas y de segundas neoplasias187. También
es muy posible que la competencia del sistema inmunitario pueda afectar al mantenimiento
y/o progresión del clon leucémico. La identificación de factores pronósticos en la LLC
relacionados con el funcionamiento del sistema inmunitario nos puede ayudar a comprender
algunos mecanismos relacionados con la evolución de la enfermedad y además puede tener
implicaciones terapéuticas pues estos podrían ser modificados mediante tratamientos
inmunomoduladores. En este estudio he analizado el efecto de las alteraciones cuantitativas
del sistema inmunitario sobre la supervivencia de los pacientes con LLC.
Uno de los hallazgos más significativos de nuestro análisis es que el número de
células T/NK esta significativamente aumentado en el momento del diagnóstico de los
pacientes con LLC y que la distribución de las distintas subpoblaciones es anormal, con un
incremento más llamativo de los linfocitos T CD8 que los T CD4; de hecho aproximadamente
el 40% de los casos muestran niveles más elevados de linfocitos T CD8 que CD4. No hemos
analizado la actividad funcional de estas células, pero es bien conocido que los linfocitos T
CD8 y las células NK tienen una función efectora común en relación con su capacidad para
eliminar células cancerosas. Las linfocitos T citotóxicos CD8 y las células NK poseen una
proteína efectora, la perforina (pfp) que es una molécula crítica en la respuesta inmunitaria
primaria del huésped frente a los tumores. Se ha visto que ratones pfp-/- tienen entre dos y
tres veces aumentada la incidencia de tumores respecto a ratones tipo silvestre (wild
type)188-190 y el 50% de los ratones pfp-/- desarrollan linfomas espontáneos diseminados191, lo
que sugiere un papel crítico de las células CD8 y NK en la inmunovigilancia frente a los
tumores. En humanos, la presencia de linfocitos infiltrando tumores (TILs), principalmente
los linfocitos T CD8 y células NK, se asocian con un buen pronóstico en varios tipos de cáncer
incluidos colorrectal, ovárico, pancreático y esofágico98-100,192-195. Por otra parte un número
elevado de linfocitos en sangre periférica se ha asociado a un buen pronóstico en varios tipos
de hemopatías malignas101,103-105 ,196, 197.
Todos estos datos sugieren que el número elevado de linfocitos T CD8 y NK que
observamos en la LLC también pueden tener, al menos en parte, un papel antitumoral.
Podría ser que la expansión de linfocitos T CD8 en pacientes con LLC sea secundaria a la
infección por citomegalovirus (CMV)138. Aunque el estatus frente a CMV no esta disponible en
muchos de nuestros pacientes en el momento del diagnóstico, también hemos observado un
aumento de linfocitos T CD4 en los pacientes con LLC y esta subpoblación linfocitaria no está
alterada en pacientes con LLC infectados con CMV138. Estos datos asociados a la evolución
más favorable de los pacientes con mayor incremento relativo de linfocitos T CD8 sugieren
que el incremento de estas subpoblaciones puede ser debido al menos en parte a células
reactivas antitumorales.
115
Debido al potencial papel antitumoral de estas células T y NK cuantitativamente
alteradas, el siguiente análisis que realizamos fue valorar su interés pronóstico. Para ello
hemos tenido en cuenta que el significado de la cantidad de linfocitos T y células NK, tanto in
vitro como en la LLC, no depende sólo del número absoluto de estas subpoblaciones, sino
también del número relativo de estas células con respecto al número de células neoplásicas,
es decir respecto al componente monoclonal (T/NK:CMB)122. Hemos observado que el
número relativo de linfocitos T CD8 y CD4, pero no el tamaño del clon monoclonal B fueron
factores pronósticos independientes y que los pacientes que presentaban valores más
elevados del número relativo de linfocitos CD8 presentaron una mejor supervivencia. En este
sentido, nuestros resultados son concordantes con el estudio realizado por Palmer y
colaboradores que ha descrito relación del recuento relativo de linfocitos T respecto al
componente monoclonal con la supervivencia libre de tratamiento en pacientes con LLC122.
Sólo en algunas enfermedades malignas como la Enfermedad de Hodgkin, el carcinoma
nasofaríngeo o el carcinoma anal se ha visto que el infiltrado por linfocitos T CD8 es un factor
adverso198-200; aunque esto podría ser debido a que estas neoplasias tienen en común que se
asocian a infecciones por virus (EBV o HPV) y tal vez las proteínas virales expresadas en las
células tumorales las hacen más resistentes a la apoptosis o que la expresión de
neoantígenos virales en las células tumorales podría alterar la respuesta inmunitaria.
Todos los datos descritos previamente junto con nuestros resultados sugieren que la
inmunidad del huésped puede tener papel en la evolución de la LLC con las implicaciones
clínicas que conlleva. En primer lugar, nuestro análisis refleja la importancia del sistema
basal inmunitario en el pronóstico en la LLC. Aunque se conocen muchos factores pronósticos
en pacientes con LLC, la determinación de las subpoblaciones linfocitarias T en el momento
del diagnóstico está disponible en todos los pacientes con esta enfermedad pues al realizar el
estudio del inmunofenotipo de la población clonal se incluyen anticuerpos monoclonales que
nos permiten valorar de forma simultánea los compartimentos T CD4 y CD8 y NK. Por tanto,
se trata de una determinación accesible que no encarece los estudios que se realizan de
forma rutinaria en el momento del diagnóstico ni precisa de sofisticadas pruebas de
laboratorio. En segundo lugar, se trata de un factor pronóstico que valora el sistema
inmunitario del huésped mientras que la mayoría de los factores pronósticos descritos
previamente valoran la agresividad del clon celular B maligno. Tercero, nuestros resultados
sugieren que los tratamientos encaminados a mejorar el sistema inmunitario del huésped
como drogas inmunomoduladores o vacunas, podrían tener un importante papel en el
tratamiento de esta enfermedad. De hecho el sistema inmunitario del huésped juega un
papel importante en la eficacia del Rituximab en el tratamiento del linfoma folicular109 y en
pacientes con linfoma de célula B grande parece que la actividad del Rituximab está reducida
en pacientes con un recuento linfocitario bajo104. El mecanismo de acción del Rituximab no
116
está claro201, pero la hipótesis es que esta mediado por la citotoxicidad celular dependiente
de anticuerpo (ADCC), en la que intervienen las células NK y linfocitos T CD8, que
promueven la apoptosis de las células cancerosas. Por tanto, posiblemente pueda existir una
relación entre la respuesta al tratamiento de la LLC que incluya Rituximab y los niveles de
linfocitos T CD8 y células NK. También están en marcha numerosos estudios que demuestran
la efectividad de la Lenalidomida en el tratamiento de la LLC y que indican que no induce
apoptosis de forma directa sobre las células cancerígenas, sino que parece que actúa a
través de un efecto inmunoestimulador, en parte debido al aumento de la citotoxicidad
mediada por NK202,203. Por el contrario, muchos de los tratamientos que utilizados
actualmente en la LLC son inmunosupresores, por lo que además de aumentar la
susceptibilidad a infecciones puede contribuir a que las sucesivas recaídas sean más
precoces y agresivas.
En nuestro conocimiento este es el primer trabajo que demuestra que el estado
cuantitativo de linfocitos T CD4 y sobre todo CD8 en el momento del diagnóstico se asocia
con la supervivencia global en los pacientes con LLC, aunque si se había descrito una
respuesta inmunitaria especifica por linfocitos CD4 y CD8 autólogos frente a las células
tumorales B en pacientes con LLC204. No obstante, sería conveniente confirmar estos datos
en un estudio prospectivo que incluya un mayor número de pacientes sobre todo teniendo en
cuenta que desde fechas recientes el tratamiento combinado con Rituximab se incluye en la
primera línea de esta enfermedad. No hemos podido correlacionar estos datos con otras
características biológicas con interés pronóstico en esa enfermedad como son alteraciones
genéticas detectadas mediante FISH, el ZAP-70 o el estado mutacional de IgVH, pues la
mayoría de estos parámetros se han descubierto entre los años 1999 y 2002205 y por tanto
no están disponibles en la mayoría de los pacientes de nuestro estudio.
En cualquier caso el análisis del número de células NK/T aporta una información
limitada sobre la actividad funcional del sistema inmunitario. Por poner un ejemplo, la
función de las células NK depende de los numerosos receptores activadores o inhibidores que
expresan estas células y cuya expresión o actividad funcional puede determinar la actividad
antitumoral de estas células206,207. El estudio de las características funcionales de las
distintas subpoblaciones linfocitarias con un posible papel antitumoral en la LLC, como los
linfocitos T CD8 y las células NK, y los mecanismos de control que ejerce el sistema
inmunitario, sin duda nos podrían ayudar a conocer mejor la patogenia de esta enfermedad y
a un mejor manejo clínico y terapéutico de nuestros pacientes.
117
4. Mecanismos de control del sistema inmunitario
sobre la leucemia linfática crónica
Uno de los datos más llamativos que hemos obtenido en el estudio de las
subpoblaciones linfocitarias en el pronóstico de la LLC es que a pesar de que las células NK
son la población de células inmunitarias más expandida en esta enfermedad y a pesar de que
se ha demostrado ampliamente el papel antitumoral en otros tipos de tumores, el presentar
un mayor número de células NK no se asocia con una mejor supervivencia de los pacientes.
En concordancia con estos resultados se ha descrito que las células leucémicas en la LLC son
muy resistentes a la citotoxicidad provocada por las células NK127-129,208. Del mismo modo,
resultados obtenidos en nuestro laboratorio por otros miembros de nuestro grupo nos indican
que los linfocitos clonales de la LLC son muy resistentes a la citotoxicidad mediada por
NKG2D, que es uno de los principales mecanismos desencadenantes de citotoxicidad
mediada por las células NK (datos no mostrados). Como ya hemos descrito, el NKG2D es un
receptor activador expresado en células NK, linfocitos T CD8 αβ, linfocitos T γδ y también en
algunos linfocitos T CD4. Los ligandos de este receptor, MICA o las ULBP1-5, se expresan en
la superficie de las células tumorales y no se detectan en la superficie de las células
mononucleares en sangre periférica de donantes sanos. Por tanto, estos ligandos se inducen
durante la trasformación maligna y permiten el reconocimiento y la eliminación del tumor. La
elevada resistencia de la LLC a la citotoxicidad mediada por NKG2D sugiere que la expresión
de los ligandos de NKG2D no se induce durante la trasformación de las células leucémicas o
que las células leucémicas desarrollan diversos mecanismos para evadir la respuesta
inmunitaria mediada por NKG2D. En este trabajo, hemos analizado la validez de esta
segunda hipótesis, es decir que la LLC desarrolla mecanismos de evasión para escapar a este
tipo de respuesta.
Nuestro grupo ha descrito diversos mecanismos por el que los tumores epiteliales
evaden la respuesta inmunitaria mediada por NKG2D como es la liberación de ligandos
solubles de este receptor desde la superficie de la célula tumoral o la represión epigenética
de la expresión de estos ligandos (en particular mediante la acetilación de histonas asociadas
a los promotores de los ligandos de NKG2D)67,79. El primer mecanismo, la liberación de
formas solubles de estos ligandos como MICAs desde la superficie tumoral, dificulta el
reconocimiento de la célula cancerígena y puede alterar la función de las células NK y los
linfocitos T CD8 citotóxicos por provocar endocitosis y degradación del receptor NKG2D75,
además de activar linfocitos T CD4+NKG2D+ con características inmunosupresoras69. Se han
descrito la presencia de MICA soluble en el suero asociada con progresión en múltiples
tumores sólidos y hemopatías malignas como el mieloma múltiple y la LLC, aunque en este
118
último caso el número de enfermos es muy escaso124,125. En los tumores epiteliales la
producción de MICA soluble parece ser uno de los mecanismos más importantes en la
evasión de la respuesta inmunitaria mediada por NKG2D, sin embargo la importancia de este
mecanismo en las leucemias está por establecer. Por ello analizamos el posible papel de
MICA y de la liberación de MICA y MICB solubles desde la membrana de los linfocitos
leucémicos como mecanismo del escape a la acción del sistema inmunitario.
En este estudio pretendemos evaluar el mecanismo mediado por la liberación de
MICA soluble en la evasión de la leucemia al sistema inmunitario y la resistencia de los
linfocitos clonales de la LLC a la muerte provocada por células NK.
4.1 ERp5 y GRP78 se expresan en la superficie de las células
de la leucemia linfática crónica
Nuestro grupo en colaboración con el grupo del Dr. Spies ha descrito recientemente
el mecanismo por el que se libera MICA soluble de la superficie de las células tumorales.
Hemos demostrado que la liberación de MICA soluble está mediada por la interacción de
MICA en la superficie de la célula tumoral con dos chaperonas del retículo endoplasmático
denominadas ERp5 y GRP78 y esta interacción es necesaria para la liberación de MICA79. Se
hipotetizaba hasta la realización de este trabajo que estas chaperonas del retículo
endoplasmático se traslocaban a la superficie celular en las células tumorales en respuesta al
estrés celular, lo que sería imprescindible para la liberación de MICA soluble posiblemente
por procesamiento proteolítico.
Hemos estudiado la expresión de estas dos chaperonas en la superficie de las células
leucémicas en pacientes diagnosticados de LLC y hemos analizado su relación con la
evolución de la enfermedad. Dado que se desconocían completamente los patrones de
expresión de ERp5 y GRP78 en la superficie de las células leucémicas o células primarias
comenzamos analizando su expresión en la superficie de los linfocitos B, el origen celular de
este tipo de leucemia. El primer hallazgo llamativo, e inesperado, fue que ERp5 y GRP78 se
expresan en la superficie de las células de la LLC, pero también la superficie de los linfocitos
B (CD19+) de donantes sanos. La expresión parece específica de esta subpoblación pues no
la detectamos en la superficie de linfocitos T (CD3+) provenientes de los controles. Esto
sugiere que la expresión de estas moléculas es independiente del estrés celular o de la
trasformación tumoral como se había especulado previamente. Además ERp5 y GRP78 se
colocalizan con MICA en la superficie de la célula leucémica, observando una elevada
119
correlación entre la expresión de estas moléculas en la superficie celular sugiriendo que al
igual que hemos descrito in vitro79, MICA interacciona con ERp5 y GRP78 en la superficie de
estas células de la LLC. No obstante su expresión parece al menos en parte independiente de
MICA pues hemos observado altos niveles de expresión de ERp5 y GRP78 en células que no
expresan MICA. Estos datos sugieren que ERp5 y GRP78 posiblemente desempeñan un papel
fisiológico en los linfocitos B adicional a la regulación de la expresión de MICA.
ERp5 y GRP78 se expresan de una forma mas elevada en pacientes con LLC que en
los linfocitos B de donantes sanos, y además en las formas progresivas de LLC los niveles
son superiores a las estables, al igual que en la LLC CD38 positiva también son superiores a
la LLC CD38 negativa; o sea, los niveles más elevados se asocian a una mayor agresividad
de la enfermedad. Se ha descrito que en la LLC se produce un estrés oxidativo que causa
daño del DNA y de las estructuras lipídicas y puede estar en relación con la progresión de la
enfermedad209,210. Es posible que este estrés oxidativo o daño al DNA pueda contribuir a la
sobreexpresión de ambas chaperonas y su migración a la superficie celular en la LLC. La
chaperona ERp5, es una proteína “disulfide isomerasa” que provoca un cambio en el dominio
α3 de MICA y lo hace susceptible a la proteolisis en la superficie celular favoreciendo su
liberación79. Parece que la expresión de ERp5 puede ser crítica en la perdida del control
inmune como se había descrito en mieloma múltiple124. A pesar de que encontramos niveles
de ERp5 más elevados en pacientes con LLC agresiva, no ocurre lo mismo con los niveles de
MICA sobre la superficie de los linfocitos leucémicos. Esto mismo ocurre en el Mieloma
múltiple pues aunque los niveles de ERp5 en las células plasmáticas son superiores a los que
se detectan en la gammapatía monoclonal de significado indeterminado, no ocurre lo mismo
con los niveles de MICA sobre las células plasmáticas124.
Se ha descrito que otro mecanismo por el que las células cancerosas se adaptan al
estrés crónico que existe en el microambiente tumoral es induciendo la expresión de
GRP78/BiP, otra chaperona que tiene propiedades antiapoptóticas. Se ha demostrado que
promueve la proliferación celular, supervivencia, metástasis y resistencia a muchos
tratamientos y se ha descrito que su expresión se puede utilizar para predecir la evolución y
respuesta al tratamiento en tumores pues confiere resistencia a linfocitos citotóxicos211. La
mayoría de GRP78 esta localizada en la luz del RE, pero una fracción se localiza como una
proteína transmembrana212.
También en nuestro estudio hemos detectado GRP78 en la superficie de los linfocitos
B y de forma concordante con los datos conocidos previamente en otros tejidos, hemos
encontrado que la expresión de GRP78 está aumentada en los linfocitos leucémicos con
respecto a los controles normales. Se ha observado que la expresión de GRP78 es baja en
120
las células de diversos órganos como cerebro, pulmón y corazón pero que se inducía
fuertemente en tumores213. Además se ha descrito en numerosos estudios en diversos tipos
de cánceres que los niveles elevados de GRP78 se asocian a alto grado patológico,
recurrencia y peor supervivencia214-216. De forma concordante a estos datos, hemos
encontrado una mayor expresión en la LLC progresiva y asociado a otros factores de mal
pronóstico como la positividad de CD38. Parece que además la sobreexpresión de GRP78
puede conferir resistencia a citostáticos y en cáncer de mama se ha observado que los
niveles elevados de GRP78 identifican a pacientes con alto riesgo de recurrencia con
regímenes basados en adriamicina por lo que su detección nos podría ayudar a evitar la
exposición a determinados agentes que no serán beneficiosos para un paciente217.
No se había descrito previamente la expresión de ERp5 y/o GRP78 en pacientes
diagnosticados de LLC y al igual que en otros tumores, los niveles de expresión de ambas
chaperonas pueden ser útiles como marcadores del comportamiento de la LLC pues se
correlacionan con la agresividad de la enfermedad. Tal vez la utilización de tratamientos que
inhiban la expresión de ERp5 o GRP78 podría resultar una aproximación novedosa para
intentar erradicar las células leucémicas, pues al detectarse en niveles muy superiores a los
que nos encontramos en los linfocitos B normales las convierte en interesantes dianas
terapéuticas.
En conclusión, por primera vez se ha demostrado in vivo en un grupo numeroso de
pacientes la correlación y colocalización existente entre ERp5, GRP78 y MICA, que sugiere su
interacción funcional apoyando datos que previamente se habían obtenido in vitro en líneas
tumorales. Posiblemente ambas chaperonas actúen por mecanismos desconocidos
confiriendo mayor agresividad a la enfermedad, además de su contribución a la liberación de
MICA soluble.
4.2 La expresión de MICA es muy baja en la leucemia linfática
crónica
Los niveles de MICA que detectamos en la membrana de las células leucémicas y en
el suero de los pacientes con LLC son muy inferiores a los que nuestro grupo y otros grupos
han detectado en tumores epiteliales (datos no mostrados). La baja expresión de MICA en la
superficie de la célula leucémica está en consonancia con el bajo nivel de liberación de MICA
soluble que detectamos en el suero de muchos pacientes. Además se observa una gran
variabilidad en la expresión que puede estar al menos en parte en relación con su
121
polimorfismo genético; se han descrito más de 50 alelos de MICA, con diferencias en
aminoácidos en el dominio extracelular que pueden afectar a la unión al anticuerpo y lo que
es más importante, a la afinidad por NKG2D218. Por otra parte, hemos detectado niveles de
MICA sobre la superficie de los linfocitos leucémicos y niveles de MICA soluble en suero
mayores en los pacientes con LLC que en los linfocitos y suero de donantes sanos, pero no
encontramos diferencias entre pacientes con enfermedad estable o progresiva ni asociados a
otros parámetros de mal pronóstico y tampoco encontramos correlación entre la expresión
de estos dos parámetros. Revisando los datos publicados, sólo en un estudio se analizan los
niveles de MICA en membrana y de MICA soluble en diversos tipos de leucemias, pero en
este sólo se incluyeron dos casos con LLC y concretamente en estos no se analizaron los
factores solubles58. En los otros tipos de leucemias analizados no encontraron correlación
entre los niveles de MICA y MICB soluble y MICA en la superficie celular, ni siquiera cuando
se ajustaban según el número de células leucémicas58. Nosotros tampoco hemos encontrado
correlación en los pacientes con LLC. Como ya hemos descrito, pese a que hemos encontrado
mayores niveles de ERp5 y GRP78 en formas progresivas, no parece que la mayor liberación
de MICA soluble por este mecanismo pueda explicar la mayor agresividad de la enfermedad
y al menos en la mayoría de casos de LLC tampoco parece que la liberación de MICA soluble
sea un mecanismo que utilicen los leucocitos leucémicos para “escapar” al sistema
inmunitario.
Este mecanismo podría producirse en un grupo de pacientes en los que nos
encontramos niveles de MICA muy elevados en suero lo que sugiere la posibilidad de que en
estos pacientes pueda desempeñar un papel importante en la patogenia de la enfermedad,
mientras que en el resto posiblemente existan otros mecanismos de evasión de la respuesta
inmunitaria mediada por NKG2D diferentes a la producción de MICA soluble. Un mecanismo
alternativo de evasión de la respuesta inmunitaria mediada por NKG2D que ha descrito
nuestro grupo es la represión de la expresión de MICA y otros ligandos NKG2D por
mecanismos epigenéticos. En particular hemos descrito que la acetilasa de histonas 3
(HDAC3) se une a promotores de diversos ligandos de NKG2D modificando la estructura de
la cromatina en la proximidad de dichos promotores e inhibiendo la trascripción de estos
genes67. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio indican que este mecanismo es más
importante en la expresión de MICA y ULBP1-3 en la LLC que la producción de MICA soluble
(datos no mostrados).
En conjunto nuestros datos sugieren que la respuesta inmunitaria mediada por
NKG2D tiene un papel importante en la inmunovigilancia de la LLC, y que las células
leucémicas desarrollan diversos mecanismos para evadir esta respuesta. Aunque en los
tumores epiteliales la producción de MICA soluble parece ser un mecanismo muy relevante,
122
en la LLC es probable que otros mecanismos como la represión transcripcional de la
expresión de los ligandos NKG2D sean más importantes.
Las diferencias en el mecanismo de evasión de la respuesta inmunitaria al NKG2D
entre los tumores epiteliales y las leucemicas pueden ser debidas a las diferencias
histológicas que existen entre estos tipos de neoplasias. En la LLC las células neoplásicas
están en contacto continuo y desde el inicio de su aparición con las células NK y linfocitos
citotóxicos del sistema inmunitario a diferencia de los tumores epiteliales y los mecanismos
que desarrollen para evadirse de estos sean posiblemente muy diferentes en ambos tipos de
neoplasias. Si la expresión de MICA u otros ligandos de NKG2D fuese muy elevada en la
superficie de las células leucémicas, el sistema inmunitario al estar en contacto permanente
sería capaz de erradicar el clon leucémico cuando este fuese poco numeroso, se trataría de
una enfermedad muy infrecuente y los casos que consiguiesen “evadirse” del sistema
inmunitario presentarían un comportamiento mucho más agresiva que la mayoría de los
casos de LLC que diagnosticamos en la práctica clínica que permanecen estables durante
años. Sin embargo, en los tumores epiteliales la expresión de MICA de membrana esta
polarizada en la luz epitelial, sólo cuando las células tumorales abandonan el epitelio e
invaden el mesénquima, MICA pierde esta polaridad en la célula y toma contacto con el
sistema inmunitario y las células NK, de modo que en células tumorales que han desarrollado
sistemas para liberar MICA de la membrana son las que serán capaces de evadir el sistema
inmunitario y provocar metástasis, en fases avanzadas de la enfermedad.
Por tanto, el mecanismo de escape que supone la baja expresión de MICA sobre la
superficie de las células leucémicas posiblemente esté regulado por represión epigenética. El
remodelado de la cromatina a través de la acetilación de histonas es uno de los principales
mecanismos de control transcripcional de genes219 y está implicado en el silenciamiento de
antioncogenes que son capaces de frenar el crecimiento celular, inducir diferenciación y
apoptosis de células tumorales. Como ya hemos descrito, se ha demostrado la existencia de
control transcripcional de algunos genes que codifican ligandos NKG2D220. También se ha
comprobado que mediante el tratamiento de líneas tumorales de leucemias con inhibidores
de las desacetilasas de histonas como tricostatina A (TsA), aumenta la expresión de MICA y
MICB y la susceptibilidad a la citotoxicidad por células NKG2D129. Por tanto parece que la
expresión de ligandos NKG2D en leucemias puede estar regulada fundamentalmente por
acetilación de histonas y que mediante “inhibidores de desacetilasas de histonas” se induce
expresión de MICA y MICB en células tumorales. Esto no ocurre en las células normales que
se ha observado que son resistentes a la acción citotóxica de estos agentes129,220.
123
4.3 MICA soluble en la regulación de la respuesta inmunitaria
Se ha implicado a los ligandos de NKG2D en la inhibición y proliferación de
linfocitos T in vitro. De forma concordante en nuestro estudio hemos encontrado una
correlación entre MICA soluble con las diversas subpoblaciónes linfocitarias, tanto linfocitos T
CD4 como CD8 y células NK que nos apoya su papel en la modulación de la respuesta
inmunitaria. Esta observación es concordante con la expansión que hemos encontrado de
todas las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con LLC con respecto a la población
normal. Se precisa más investigación para conocer el papel potencial de MICA soluble sobre
esta expansión de las células del sistema inmunitario y sus características funcionales.
Figura 23. Modulación de las diferentes subpoblaciones linfocitarias por MICA soluble. En la figura se muestran las correlaciones estadísticas encontradas entre la expresión de estas moléculas o células inmunológicas.
4.4 MICB soluble en la leucemia linfática crónica
El papel de MICB es aún menos conocido; al igual que MICA, se ha descrito que MICB
se libera desde las células epiteliales y hematopoyéticas por la actividad de metaloproteasas
y se ha postulado que la liberación proteolítica de MICB disminuye la inmunogenicidad del
tumor al disminuir la densidad de los ligandos NKG2D sobre las células malignas58.
GRP78
ERp5
MICA
sMICA
r=0,76
r=0,26
r=-0,34
r=-0,36r=0,25
r=0,22LLC
GRP78
ERp5
MICA
NK
CD4
CD8r=0,29
NKG2D
NKG2D
¿NKG2D?
Interacción ERp5-GRP78-MICA
sMICA
MICA soluble Modulación linfocitos
124
El mecanismo de funcionamiento de MICB parece ser independiente de MICA y
aunque hemos detectado niveles de MICBs en algunos pacientes con LLC no encontramos
correlación con la expresión de ERp5, GRP78 o MICA.
Tampoco hemos encontrado diferencias en la detección de MICBs entre los controles
con LLC ni entre pacientes con enfermedad estable o progresiva. Estos datos son
concordantes con otros descritos en la literatura, pues aunque en diversos tipos de tumores
sólidos los niveles más elevados de MICB se correlacionan con la presencia de metástasis, no
se encontró correlación con otros parámetros de agresividad del tumor como son el tamaño,
la diferenciación tumoral ni la afectación ganglionar221. Además en este estudio realizado por
Holdenrieder y colaboradores no se han encontrado diferencias entre los niveles de MICB
soluble entre donantes sanos, pacientes con patologías benignas o pacientes con neoplasias.
La sensibilidad de este parámetro para detectar pacientes con cáncer fue solo del 18,6% y
un 69% de los pacientes con cáncer son negativos para MICB221. Muchas personas sanas o
con patologías benignas tienen niveles de MICB equiparables a los detectados en pacientes
con cáncer. En nuestro estudio tampoco los niveles de MICB soluble fueron diferentes en
pacientes con leucemia respecto a los controles ni fueron útiles para predecir el
comportamiento de la LLC.
Esto nos lleva a pensar que MICB tal vez tenga otro papel en la regulación del
sistema inmunitario y últimamente se le ha atribuido un papel regulador sobre el receptor
NKG2D. Parece que es sistema inmunitario es sensible a los cambios en la expresión de
ligandos NKG2D, pero no solo en las células infectadas o tumorales sino también en linfocitos
T. No se sabe bien el papel que juegan los linfocitos T CD4 NKG2D, y tal vez el receptor
NKG2D que podría actuar como una “molécula puente” en la regulación de estos distintas
subpoblaciones linfocitarias. En cultivos celulares de linfocitos de donantes sanos, se ha visto
se pueden liberar desde linfocitos T activados varios ligandos NKG2D solubles como son
MICA, MICB, ULBP1 y ULBP2, pero MICB es el ligando que se libera a mas altos títulos
cuando los linfocitos T CD4 están presentes, y parece que este MICB puede ser el principal
responsable de esta disminución de la expresión del receptor NKG2D sobre linfocitos T
CD8222. Se ha visto que MICB se libera desde los linfocitos TCD4 en todos los controles
estudiados, por lo que parece que puede jugar un papel fundamental en disminuir la
expresión del receptor NKGD2 mediada por los linfocitos T CD8+ y es posible que MICBs sea
la molécula responsable en mantener unos niveles bajos de receptores NKG2D en controles
sanos222; esto explicaría el hecho de que en la mayoría de pacientes con LLC o con otros
cánceres no se detecten mayores niveles de expresión de MICB soluble que en las personas
que no presentan la enfermedad.
125
En resumen, en este trabajo hemos descrito que la LLC presenta una elevada
incidencia en nuestro medio, mucho mayor de la que había sido descrita previamente.
Hemos analizado diversos sistemas pronósticos que nos pueden permitir una mejor
clasificación y manejo clínico de los pacientes y hemos observado que la competencia del
sistema inmunitario del huésped puede ser un factor pronóstico adicional asociado con la
supervivencia de los pacientes de LLC. A pesar de que nuestro estudio sugiere la relevancia
del sistema inmunitario en esta enfermedad, parece que las células leucémicas podrían tener
numerosos mecanismos para evadir la respuesta inmunitaria y que probablemente aquellos
tratamientos encaminados a incrementar la competencia inmunitaria de los pacientes tienen
un gran potencial en el tratamiento de esta enfermedad.
126
127
Conclusiones
128
129
2. La supervivencia de nuestros pacientes de leucemia linfática crónica es superior a la
recogida en muchos estudios sobre la enfermedad y semejante a la de los países del
norte de Europa, pese a la avanzada edad de nuestra serie.
3. El índice IP MDACC discrimina mejor el pronóstico de los pacientes que los estadiajes
clásicos de Rai y Binet y es útil tanto para predecir la supervivencia libre de
tratamiento como la supervivencia global en nuestros pacientes.
4. El índice pronóstico GIMEMA es capaz de distinguir tres subgrupos con diferente
supervivencia libre de tratamiento, pero sin embargo esto no se traduce en
diferencias en la supervivencia global en nuestra serie de pacientes.
5. El número absoluto de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T y células NK no
sigue una distribución normal en los pacientes de leucemia linfática crónica,
presentado una expansión del número de linfocitos T CD4 y CD8 y células NK. Este
aumento es superior en pacientes que presentan malos factores pronósticos como
CD38 positivo o altos niveles de β2-microglobulina.
6. Los valores relativos elevados de los linfocitos T CD4 y CD8 respecto al componente
monoclonal B, pero no de las células NK, se asociaron con una mejor supervivencia
global de los pacientes de leucemia linfática crónica a los 5 y 10 años.
7. Los pacientes con leucemia linfática crónica CD38 negativa y con recuentos relativos
elevados de linfocitos T CD8 representan un grupo de especial buen pronóstico que
presenta una probabilidad de supervivencia global del 95% a los 10 años.
8. Los pacientes con leucemia linfática crónica no expresan o expresan bajas cantidades
de MICA en la superficie de las células leucémica, sin embargo presentan niveles de
MICA soluble en suero significativamente mayores que los donantes sanos.
1. La incidencia de la leucemia linfática crónica en el Área Sanitaria V del Principado de
Asturias, con una tasa bruta de 8,99/100.000 habitantes/año y una tasa ajustada de
3,47/100.000 habitantes año, es más elevada que en la mayoría de estudios
epidemiológicos de esta enfermedad.
130
9. ERp5 y GRP78 se expresan en la superficie de los linfocitos B y los linfocitos
monoclonales de la leucemia linfática crónica. La expresión es superior en las formas
progresivas de la enfermedad. En la superficie de las células leucémicas, ERp5 y
GRP78 se colocalizan con MICA y su expresión se correlaciona con los niveles de
MICA soluble en el suero de los pacientes.
10. La cantidad de MICA soluble en el suero de los pacientes de leucemia linfática crónica
se correlaciona con el número de células NK y de linfocitos T CD4 y CD8.
131
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155
Anexos
156
157
Anexo 1: Hoja de recogida de datos pacientes con LLC.
Anexo 2: Consentimiento informado para recogida de muestra de material
biológico.
Anexo 3: Hoja de recogida de datos de pacientes a los que se determina
MICA.
158
159
Nombre…………………………………………………………………………………… Numero de historia……………… Edad…………………………….. Sexo : Fecha de nacimiento: Fecha del diagnóstico Periodo de seguimiento Síntomas: ECOG Ganglios Esplenomegalia Hepatomegal Hemograma Leucocitos linfocitos segm Hb VCM
Plaquetas
Reticulocitos Morfología Inmunofenotipo Linfos T
CD4
CD 8 Coombs dire duplicación
Muestra inmunofenotipo Bioquímica: Urea
Creatinina GOT GPT Fosfatasa alcalina
LDH Na K úrico bilirrubina
Albumina
gammaglobulina Pico M IgG IgA IgM
B 2 microg xvn
Pruebas de imagen: Aspirado y Biopsia Patrón de infiltración Estadio Binet RAI I pronostico Grupo riesgo Otros factores pronósticos: CD 38 ZAP 70 FISH Cariotipo Enfermedades autoinmunes Virus TRATAMIENTO Estadio Tratamiento Fecha: Motivo Duración Régimen
Anexo 1. Hoja de recogida de datos de pacientes con Leucemia linfática crónica
160
Evaluación tras tratamiento: Tratamiento segunda linea: Tratamiento Fecha: Motivo Duración Régimen
Evaluación tras tratamiento: Más líneas SUPERVIVENCIA: Estado actual Causa éxitus Fecha exitus: Trasformación Neoplasias asociadas Fecha Tipo Comentarios
161
PRESE�TACIÓ� DEL PROYECTO
La Universidad de Oviedo participa en un proyecto liderado por el Centro de Investigaciones Biológicas del Consejo Superior de Investigaciones Científicas y financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación, con el título “Respuesta inmune mediada por NKG2D en la transición epitelio-mesenquimal y la progresión tumoral “ (expediente PS 09/00420) y que tiene como objetivo profundizar en el conocimiento de los mecanismos del sistema inmune para evitar la progresión de tumores y la evasión de los mismos a la vigilancia inmunológica. Uno de los investigadores responsables del proyecto es la Dra. Ana Pilar González Rodríguez, facultativo especialista en Hematología-Hemoterapia, que esta realizando un estudio para su tesis doctoral en referencia a la respuesta inmune en leucemia linfática crónica y con quien puede establecerse contacto en el Servicio de Hematología-Hemoterapia del Hospital de Cabueñes teléfono 985185000, extensión 279.
Las muestras biológicas necesarias para el desarrollo de esta investigación incluirán tanto a personas enfermas como sanas, prevaleciendo el uso clínico de las muestras obtenidas, y siendo desestimado posteriormente con fines de investigación el material que no hubiera sido necesario. El manejo de dichas muestras estará sometido a la regulación de la confidencialidad y secreto a que la ley obliga para todas las actuaciones llevadas a cabo con las mismas, tanto asistenciales como investigadoras.
SOLICITUD:
Por parte del equipo investigador se me han explicado los pormenores del desarrollo del estudio, y como tal accedo a donar mis muestras biológicas para ser estudiadas en la Universidad de Oviedo, con los fines declarados en los objetivos del proyecto de investigación
He tenido oportunidad de consultar todas mis dudas, habiéndose explicado convenientemente los detalles del estudio por mí requeridos, así como el hecho de que la participación es esta investigación es completamente voluntaria, y puedo retirarme en cualquier momento sin necesidad de realizar por mi parte ningún tipo de justificación, y sin que ello suponga en ningún caso menoscabo o alteración de la atención clínica que en mi caso fuera necesaria
En Gijón, a ............... de ....................................... de ....................... Firma del MÉDICO que informa Firma del PACIENTE Fdo.: Dr/Dra ..................................... Fdo,:D/Dª .................................................................. (nombre y dos apellidos) Colegiado Nº ................................... D.N.I.......................................................................... REVOCACIÓN DEL CONSENTIMIENTO ANTERIORMENTE PRESTADO:
Asimismo, he sido informado de que de conformidad con la Ley 41/2002, de 14 de Noviembre, reguladora de la Autonomía del paciente de derechos y obligaciones en materia de información y documentación clínica, el presente consentimiento, puede ser revocado en cualquier momento.
En Gijón, a ............... de ....................................... de .......................
Firma del PACIENTE
Fdo,: D/Dª ......................................................................
(nombre y dos apellidos) D.N.I. .............................................................................
Anexo 2. Consentimiento Informado. Donación de material biológico para investigación.
162
163
Nombre…………………………………………………………………………………… Numero de historia……………… Edad…………………………….. Sexo : Fecha de nacimiento: FECHA DE DIAGNOSTICO LLC estadio al diagnostico Rai Binet IPI ENFERMEDAD ESTABLE O PROGRESIVA TRATAMIENTO FECHA EXITUS FECHA Síntomas: ECOG Ganglios Esplenomegalia Hepatomeg Hemograma Leucocitos linfocitos segm Hb VCM
Plaquetas
Reticulocitos Morfología Linfos T CD 4 CD8
Linfos NK
Coombs directo Positivo Negativo ND Bioquímica: Urea
Creatinina GOT GPT Fosfatasa alcalina
LDH Na K úrico Bilirrubina
Albúmina
gammaglobulina Pico M IgG IgA IgM
B 2 microg Xvn
Binet RAI
Otros factores pronósticos: CD 38 IPI doblado leucocitario zap 70
RESULTADOS
• MICA • ERp5 • GRP78 • MICAs • MICBs
Anexo 3. Hoja de recogida de datos de los pacientes a los que se determinó MICA
164
165
Anexo de publicaciones:
166
167
• Estudio epidemiológico y comparación de los índices pronósticos del MD
Anderson Cancer Center y el índice del Gruppo Italiano Malattie
Ematologiche dell´Adulto en pacientes con leucemia linfática crónica de
células B. González Rodríguez AP, González García E, Fernández Alvarez C,
González Huerta AJ y González Rodríguez S. Med Clin (Bar). 2009:133
(5):161-166.
• Prognosis significance of CD8 and CD4 T cells in chronic lymphocytic
leukemia. Gonzalez Rodriguez AP, Contesti J, Huergo-Zapico L, Lopez-Soto
A, Gonzalez García E, Fernandez Alvarez A, Gonzalez S. Manuscrito enviado
a European Journal Hematology.
• Mechanisms of resistance to NKG2D-mediated cytotoxicity in chronic
lymphocytic leukemia. Huergo-zapico L, Gonzalez-Rodriguez, Contesti,
López-Soto A, Lopez-Larrea C, González García E, Gonzalez S. Manuscrito en
elaboración.
168
169
Original
Estudio epidemiologico y comparacion de los ındices pronosticos del MDAnderson Cancer Center y el ındice del Gruppo Italiano MalattieEmatologiche Maligne dell0 Adulto en pacientes con leucemia linfaticacronica de celulas B
Ana Pilar Gonzalez Rodrıguez a,�, Esther Gonzalez Garcıa a, Carmen Fernandez Alvarez a,Ana Julia Gonzalez Huerta a y Segundo Gonzalez Rodrıguez b
a Servicio de Hematologıa, Hospital Cabuenes, Gijon, Asturias, Espanab Area de Inmunologıa, Departamento de Biologıa Funcional, IUOPA, Universidad de Oviedo, Oviedo, Asturias, Espana
I N F O R M A C I O N D E L A R T I C U L O
Historia del artıculo:
Recibido el 2 de junio de 2008
Aceptado el 16 de octubre de 2008
Palabras clave:
Epidemiologıa
Pronostico
Leucemia linfatica cronica de celulas B
R E S U M E N
Fundamento y objetivo: El curso clınico de los pacientes con leucemia linfatica cronica de celulas B (LLCB)es extremadamente heterogeneo y no hay ındices pronosticos (IP) que permitan clasificar bien a estospacientes. En este estudio se han analizado 2 nuevos IP propuestos por el MDACC (MD Anderson CancerCenter) y por el grupo GIMEMA (Gruppo Italiano Malattie Ematologiche Maligne dell0 Adulto).
Pacientes y metodo: Se ha realizado un estudio de seguimiento de una cohorte de pacientes diagnosticadosde LLCB (265 casos) en el area sanitaria de Gijon durante 10 anos (de 1997 a 2007), y de la supervivencia delos pacientes segun los sistemas de estadificacion clasica (Rai y Binet) y los nuevos IP.
Resultados: Las tasas bruta y ajustada fueron de 8,99 y de 3,47 cada 100.000 habitantes por ano,respectivamente. El ındice GIMEMA no fue util para predecir la supervivencia global. La distribucion segunel IP MDACC fue la siguiente: el 31,4% de bajo riesgo, el 62% de riesgo intermedio y el 6,6% de alto riesgo. Laprobabilidad de supervivencia a los 5 y 10 anos fue del 87 y el 73% para el bajo riesgo, del 75 y el 49% para elriesgo intermedio, y del 29 y el 16% para el de alto riesgo.
Conclusiones: Las tasas de incidencia de LLCB son superiores a las descritas hasta ahora, posiblementedebido a una mejor recogida de datos y a un diagnostico mas precoz. En este estudio se demuestra porprimera vez en una poblacion no seleccionada de pacientes que el IP MDCAA predice mejor lasupervivencia que los sistemas de estadificacion clasica. Dada su simplicidad, este modelo pronosticopuede ser muy util para el manejo de los pacientes en la practica clınica.
& 2008 Elsevier Espana, S.L. Todos los derechos reservados.
B-chronic lymphocytic leukemia: epidemiological study and comparison ofMDACC and GIMENA pronostic indexes
Keywords:
Epidemiology
Prognosis
B-Chronic limphocytic leukemia
A B S T R A C T
Background and objective: The clinical course of B-chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) patients ishighly heterogeneous and the prognosis of these patients is difficult to predict. In this study, we analysedtwo new prognostic indexes proposed by the MDACC and GIMEMA group in a random population ofB-CCL patients.
Patients and methods: A follow up study of a cohort of patients was carried out. 265 B-CLL patientsdiagnosed in the Area Sanitaria de Gijon during 10 years (1997–2007) were analysed in this study. Theoverall survival of the patients was analysed by the Rai and Binet staging systems and the prognosticindexes proposed by the MDACC and GIMEMA group.
Results: The crude rate was 8.99 per 100.000 populations for year and the adjusted-age rate was 3.47 per100.000 populations for year. The distribution of patients based on the MDACC index was: 31.4% had lowrisk, 62% had intermediate risk and 6.6% had high risk. The percentage of 5- and 10-years survivalprobabilities were 87% and 73% for low risk, 75% and 49% for intermediate risk and 29% and 16% of highrisk. The GIMEMA index was unable to predict the overall survival in our patients.
Conclusions: The rates of B-CLL are higher in our population than previously described, which is probablycaused by an earlier diagnosis. Our results indicate that the MDACC prognostic index predicted the overall
www.elsevier.es/medicinaclinica
0025-7753/$ - see front matter & 2008 Elsevier Espana, S.L. Todos los derechos reservados.
doi:10.1016/j.medcli.2008.09.046
� Autor para correspondencia.
Correo electronico: [email protected] (A.P. Gonzalez Rodrıguez).
Med Clin (Barc). 2009;133(5):161–166
170
survival and the prognosis of a random population of patients better than the classical staging systems. Thesimplicity and utility of this prognostic index may help clinicians in clinical decision and therapeuticalmanagement.
& 2008 Elsevier Espana, S.L. All rights reserved.
Introduccion
La leucemia linfatica cronica de celulas B (LLCB) se conocecomo entidad clınica diferenciada desde hace casi 100 anos. En laclasificacion de la Organizacion Mundial de la Salud (OMS) estaincluida dentro de las neoplasias linfoides de celulas B maduras yrepresenta aproximadamente el 30% de estas (registro Survei-llance Epidemiology and End Results [SEER]-9)1. Segun estaclasificacion, se consideran conjuntamente la LLCB, donde laafectacion es fundamentalmente leucemica, y el linfoma linfocı-tico de celulas pequenas (LLCP), donde la afectacion es nodal osolida2. La LLCB se caracteriza por un incremento progresivo decelulas monoclonales B con un inmunofenotipo caracterıstico(positividad para CD5, CD19, CD20 y CD23; expresion debil deinmunoglobulinas de superficie, CD20 y CD79b, y negatividadpara CD10 y ciclina D1) en tejidos linfoides, medula osea ysangre periferica3,4.
El curso clınico de las LLCB es muy variable, hay pacientes quefallecen precozmente y otros con esperanza de vida normal; lamediana de supervivencia se situa en torno a los 10 anos. Losestadios de Rai5,6 y Binet7 identifican grupos de riesgo basandoseen caracterısticas clınicas y de laboratorio, y reflejan fundamen-talmente el volumen de masa tumoral. Aunque se correlacionande forma global con la supervivencia, no identifican correctamen-te a muchos pacientes diagnosticados en estadios precoces, queprogresaran rapidamente y presentaran una supervivencia muyinferior a la esperada8.
En los ultimos anos se han establecido nuevos parametros demal pronostico, como los valores elevados de beta-2-microglobu-lina9, la delecion 17p o la delecion 11q10, mutaciones de los genesde la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IgVH)11 o laexpresion de ZAP 7012 y de CD 3813. Por separado, su valorpronostico es limitado y algunos de ellos no son accesibles en lapractica clınica diaria.
Wierda et al han propuesto un nomograma e ındice pronostico(IP) de la supervivencia global a los 5 y 10 anos (IP del MDACC[MD Anderson Cancer Center])14 basado en 6 parametros: edad,beta-2-microglobulina, cifra de linfocitos, sexo, estadio de Rai ynumero de areas nodales afectadas (tabla 1).
Por otra parte, el grupo GIMEMA (Gruppo Italiano MalattieEmatologiche Maligne dell0 Adulto) ha propuesto otro sistemapronostico para predecir el riesgo de progresion de la enfermedaden los pacientes en estadios iniciales (A de Binet)15 basado en el
tiempo de duplicacion linfocitaria, el estadio Rai, la cifra delinfocitos y el sexo.
En el presente estudio se analizan la incidencia, la epidemio-logıa y la supervivencia de los pacientes diagnosticados de LLCBsegun las clasificaciones por estadios de Binet, Rai modificado, IPMDACC e ındice GIMEMA con el fin de analizar la validez de estos2 ultimos sistemas pronosticos.
Pacientes y metodo
Se ha realizado un estudio epidemiologico observacional,retrospectivo y de corte transversal sobre las caracterısticasclınicas, epidemiologicas y la evolucion clınica de los pacientesdiagnosticados de LLCB en el Hospital de Cabuenes (centro dereferencia para una poblacion de 300.000 habitantes) durante unperıodo de 10 anos (de 1997 a 2007). Los datos se han obtenido delServicio de Codificacion del hospital segun la ClasificacionInternacional de las Enfermedades (CIE)-0-9 y de la base de datosdel Servicio de Hematologıa. Solo se han incluido los casos con unincremento de mas de 5�109/l linfocitos con morfologıa einmunofenotipo de LLCB16 y con Royal Mardsen Scoring Systemmayor de 317, y los casos de LLCP confirmados por biopsiaganglionar. Los criterios de inclusion se basaron en los datosiniciales del momento del diagnostico.
Todos los pacientes se clasificaron en el momento deldiagnostico de acuerdo con los estadios de Rai y Binet, el IPMDACC y, ademas, los pacientes con estadio A se clasificaronsegun el ındice GIMEMA.
Se consideraron los criterios para iniciar el tratamientoestablecidos por el NCIWG (National Cancer Institute-sponsoredWorking Group)18. En caso de fallecimiento, se recogio la fecha yla causa atribuible a LLC o causas no relacionadas.
Analisis estadıstico
La tasa de incidencia bruta (TB) anual se calculo dividiendo elnumero de casos incidentes de LLCB entre el total de la poblacionen un ano. Las tasas especıficas por edad (TEE) se calcularondividiendo el numero de casos incidentes de LLCB en cada grupode edad determinado, en un perıodo de tiempo, entre la poblaciontotal de este grupo de edad a mitad del perıodo. Para conocer lapoblacion y su distribucion por grupos de edad se utilizaron datos
Tabla 1Indices pronosticos del MD Anderson Cancer Center (MDACC) y del Gruppo Italiano Malattie Ematologiche Maligne dell0 Adulto (GIMEMA)
Indice pronostico MDACCa Indice pronostico GIMEMAb
Edad o50 anos 1 Tiempo de duplicacion linfocitaria inferior a 12 m 1
50–65 anos 2 Conteo de linfocitos superior a 30 � 109/l 1
465 anos 3 Subestadio de Rai I–II 1
Beta-2-microglobulina 1–2 VN 1 Segun sexo
42 VN 2
Linfocitos � 109/l 20–50 1
450 2
Sexo varon 1
Rai III–IV 1
Numero de zonas nodales X3 1
VN: valor normal.a Bajo riesgo: 1 a 3; riesgo intermedio: 4 a 7; riesgo alto : superior a 7.b Grupos de riesgo: mujeres: puntuacion 0; varones: puntuacion 0; ambos sexos: puntuacion 1 a 3.
A.P. Gonzalez Rodrıguez et al / Med Clin (Barc). 2009;133(5):161–166162
171
de los censos de poblacion del Principado de Asturias del ano 2001y los padrones municipales de los anos 1998 y 2007.
El calculo de las tasas ajustadas (TA) por edad se realizo segunel metodo directo, con respecto a la poblacion mundial estandarutilizada en los estudios comparativos internacionales19.
Se considero supervivencia libre de tratamiento (SLT) como eltiempo trascurrido desde el diagnostico hasta la fecha de inicio deltratamiento. Para estimar la supervivencia global (SG) se consi-dero la fecha de diagnostico y la fecha de la defuncion porcualquier causa o la fecha final del estudio. Para el estudio de lasupervivencia (tabla 1) segun el IP MDACC se calculo el tamanomuestral para detectar diferencias de un 50% en la SG a 10 anos, ysegun el ındice GIMEMA para detectar diferencias de un 30% en laSLT a los 10 anos entre los grupos de mayor y menor riesgo, con unerror alfa del 5% y una potencia del 80% (tamano muestral de 14 y42 pacientes en cada grupo, respectivamente). La SLT y la SG seestimaron por el metodo de Kaplan Meier, y para comparar gruposse utilizo el log rank test. Para conocer la probabilidad de SG a los 5y 10 anos se utilizaron las tablas de mortalidad y, paracompararlas, el test de Wilconson (Gehan). No se expreso lamediana de supervivencia pues no se habıa alcanzado en losgrupos de menor riesgo. Se estimo el cociente de riesgo medianteel metodo de regresion univariante de Cox. Se determinaron lascurvas ROC (receiver operating characteristics ‘curva de eficaciadiagnostica’) y se calcularon las areas bajo la curva para losdiferentes sistemas pronosticos.
Se calcularon intervalos de confianza (IC) del 95% para lasvariables significativas. Para el analisis estadıstico se utilizo elprograma SPSS 12.0.
Resultados
Incidencia y caracterısticas de los pacientes diagnosticados de
leucemia linfatica cronica
Un total de 265 pacientes se diagnosticaron de LLCB en elperıodo de 10 anos. La incidencia fue superior en varones (155casos) que en mujeres (110 casos), con una razon de sexo de 1,3:1.La media de edad en el diagnostico fue de 71,7 anos (extremos de42 a 94); en varones fue de 70,8 anos y en mujeres fue de 72,7anos. La TB fue de 8,99 cada 100.000 habitantes por ano (en
varones fue de 11,04 y en mujeres fue de 7,11). La TA fue de 3,47cada 100.000 habitantes (en varones fue de 3,99 y en mujeres fuede 2,95). Las TEE se muestran en la figura 1.En el momento deldiagnostico, la mayorıa de los pacientes tenıan un estado general(medido por la escala ECOG [Eastern Cooperative OncologicGroup]) de 0 (en un 43%) o de 1 (en un 32%), y estabanasintomaticos (en un 60,4%). Los sıntomas mas frecuentes fueronastenia (22,6%), seguida de perdida de peso (11,3%) y sudornocturno (6,4%). El 67% no presentaba adenopatıas; se palpabanadenopatıas en un territorio ganglionar en el 9,8%, en 2 territoriosen el 6,4% y en 3 territorios o mas en el 15,8%, y esplenomegalia enun 18,6% del total de los casos.
La distribucion por estadios de Binet, Rai modificados, IPMDACC e ındice GIMEMA se muestra en la tabla 2. El 76,8% de lospacientes estaba incluido en el estadio A de Binet; de estos, el40,2% presentaba bajo riesgo, el 59,8% presentaba riesgo interme-dio y ningun paciente presentaba alto riesgo segun el IP MDACC.
Supervivencia libre de tratamiento
De los 257 pacientes evaluables (se perdio el seguimiento en 8pacientes), solo 67 pacientes (26,1%) han precisado tratamiento. Elprincipal motivo de tratamiento fue el fallo medular progresivo en28 pacientes (41,8%), seguido de sıntomas sistemicos en 16pacientes (23,9%), problemas en relacion con adenopatıas en 14pacientes (20,9%) y citopenias inmunes refractarias en 7 pacientes(10,4%). Las curvas y probabilidad de SLT a los 5 y los 10 anossegun el IP MDACC y el ındice GIMEMA se muestran en la figura 2y en la tabla 3.
Supervivencia global
Un total de 76 pacientes fallecieron durante el perıodo deseguimiento (28,6%). Las principales causas de muerte fueron
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Varones
Mujeres
Total
De 0 a
4
De 10 a
14
De 20 a
24
De 30 a
34
De 40 a
44
De 50 a
54
De 60 a
64
De 70 a
74
De 80 a
84
De 90 o
mas
Edad
TEE
Figura 1.
Tabla 2Caracterısticas y distribucion de los pacientes diagnosticados de leucemia linfatica
cronica de las celulas B
Caracterısticas de los pacientes (n) Numero Porcentaje
Sexo (265)
Varon 155 58,5
Mujer 110 41,5
ECOG (264)
0 114 43,2
1 85 32,2
2 47 17,8
3 18 6,8
Estadios de Binet (263)
Estadio A 202 76,8
Estadio B 39 14,8
Estadio C 22 8,4
Estadios de Rai modificados (263)
Bajo riesgo 161 61,2
Riesgo intermedio 77 29,3
Riesgo alto 25 9,5
Grupo de riesgo IP MDACC (258)
Bajo riesgo 81 31,4
Riesgo intermedio 160 62
Riesgo alto 17 6,6
Indice GIMEMA (176)
0 Mujer 58 33
0 Varon 66 37,5
1�3 ambos sexos 52 29,5
n ¼ 265.
ECOG: Eastern Cooperative Oncologic Group; GIMEMA: Gruppo Italiano Malattie
Ematologiche Maligne dell0 Adulto; MDACC: MD Anderson Cancer Center.
A.P. Gonzalez Rodrıguez et al / Med Clin (Barc). 2009;133(5):161–166 163
172
progresion de la LLCB en el 27,6%, infecciones en el 17,1% y anemiahemolıtica en el 1,3% de los pacientes. En 21 pacientes (27,6%) seconsidero que la causa de la muerte no estaba relacionada con laLLCB.
En la figura 3 se muestran las curvas de SG, en la tabla 4 semuestra la probabilidad de supervivencia a los 5 y los 10 anos y enla tabla 5 el cociente de riesgo para la SG segun los 4 sistemas declasificacion. Para valorar la utilidad de los diferentes sistemaspronosticos como predictores de mortalidad, se calculo el areabajo la curva ROC, que fue de 0,576 (IC del 95%: 0,493 a 0,660)para el ındice GIMEMA; de 0,579 (IC del 95%: 0,492 a 0,666) paralos estadios de Rai; de 0,618 (IC del 95%: 0,531 a 0,705) para losestadios de Binet, y de 0,632 (IC del 95%: de 0,552 a 0,713) para elIP MDACC.
Discusion
A pesar de que la LLCB es el tipo mas comun de leucemia enEuropa y Norteamerica, no se conoce bien su incidencia real. Losdatos de incidencia proceden de registros publicados por laAsociacion Internacional de Registros del Cancer (IARC), queutilizan clasificaciones previas a la de la OMS. Por ejemplo, losdatos recogidos para el Principado de Asturias en CancerIncidence in Five Continents Vol IX (de 1996 a 2000) agrupan de
forma global todas las leucemias linfoides, con unas TB de 7,2 y de4,8 cada 100.000 habitantes por ano y unas TA de 4 y 3,1 cada100.000 habitantes por ano en varones y mujeres, respectiva-mente20. Por otra parte, en los registros del cancer se analizan losinformes de las biopsias, citologıas, ingresos y altas hospitalarias,defunciones y tratamientos, y los datos derivan, sobre todo,de pacientes hospitalizados. El diagnostico de la LLCB seestablece mediante un analisis de sangre periferica con inmuno-fenotipo y no precisa de confirmacion histologica. Muchospacientes estan asintomaticos, tardan o nunca precisan trata-miento, y se los controla en regimen ambulatorio, por lo que noestan recogidos en los registros hospitalarios ni en registrospoblacionales del cancer.
De acuerdo con la clasificacion de la OMS, en un analisis delregistro SEER de EE. UU. sobre 21.058 pacientes con LLCB (de 1987a 2004), la TA fue de 5,13 casos cada 100.000 habitantes por ano21;en este estudio, para ajustar la tasa se uso como referencia lapoblacion ‘‘US 2000’’ en lugar de la ‘‘poblacion mundial estandar’’,por lo que son datos mas proximos a la TB de incidencia.
La TB y la TA recogidas para esta enfermedad en el Registro delCancer Poblacional de Gerona (1994 a 2001) fueron de 4,7 y de 2cada 100.000 habitantes por ano, respectivamente22.
En el presente estudio se han encontrado tasas de incidenciasuperiores a las de otros estudios, con una TB y una TA de 8,99 y3,63 cada 100.000 habitantes por ano. El motivo podrıa ser unamejor recogida de casos por parte de un servicio de hematologıaunico, donde se revisan y validan todos los hemogramasprocedentes de un area sanitaria, por lo que posiblemente esteestudio refleje de manera mas real la incidencia de esta hemopatıaque la incidencia recogida en los registros de cancer. Estaincidencia real superior a la recogida en los registros de tumoresya se habıa descrito previamente23.
Se ha encontrado una probabilidad de supervivencia a los 5 y10 anos superior a otros estudios recientes, con datos procedentesdel registro SEER, donde se estiman en 60,2 y un 34,8% para estosperıodos24. Uno de los motivos puede ser que muchos casos deLLCB asintomaticos no se recogen en los registros de cancer. En elpresente estudio, un elevado porcentaje de casos estan diagnosti-cados en estadios precoces; este hecho puede ocasionar unaumento de la supervivencia sin que refleje necesariamente uncambio en la historia natural de la enfermedad25.
Score 1-3 ambos sexos: 17/52
Mujeres 0: 2/28
Varones score 0: 7/66
IP riesgo intermedio: 47/160
IP riesgo alto: 15/117
IP riesgo bajo: 5/81
0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 120 140Tiempo (meses) Tiempo (meses)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Figura 2.
Tabla 3Probabilidad de supervivencia libre de tratamiento (SLT) a los 5 y 10 anos segun el
ındice pronostico (IP) del MD Anderson Cancer Center (MDACC) y el ındice del
Gruppo Italiano Malattie Ematologiche Maligne dell0 Adulto (GIMEMA)
IP MDACC (po0,05) Numero de
pacientes
SLT 5 anos (EE) SLT 10 anos
(EE)
Bajo riesgo 81 0,93 (0,03) 0,89 (0,05)
Riesgo intermedio 160 0,64 (0,04) 0,54 (0,06)
Riesgo alto 17 0,13 (0,08) 0 (0)
Indice GIMEMA (po0,05)
0 mujer 58 1 (0) 0,94 (0,06)
0 varon 66 0,88 (0,05) 0,83 (0,07)
1–3 ambos sexos 52 0,46 (0,06) 0,34(0,07)
EE: error estandar.
A.P. Gonzalez Rodrıguez et al / Med Clin (Barc). 2009;133(5):161–166164
173
Debido a la media de edad avanzada de estos pacientes, seobserva un mayor porcentaje de muertes por causas no relacio-nadas con la LLCB que en el estudio del MDACC, con el posibleimpacto negativo sobre la SG. No obstante, se ha descrito que enlos pacientes con LLCB la incidencia de comorbilidades suele sermuy elevada, pero el mayor impacto negativo sobre la supervi-vencia es la propia LLCB26.
Los estadios clınicos de Rai y Binet son los sistemas vigentesdesde hace muchos anos para clasificar a los pacientes con LLCB.Parte de su exito se debe a que son simples y de facil aplicacion,pero no permiten distinguir dentro de un mismo estadio quepacientes tendran una evolucion mas agresiva de su enfermedad,sobre todo en los estadios precoces en el momento deldiagnostico6. En otras hemopatıas, como en los linfomas nohodgkinianos, se han desarrollado IP, como el IP internacional(IPI)27 o el IP del linfoma folicular (FLIPI)28, basados endeterminaciones sencillas y que permiten predecir la evoluciona largo plazo, identificar grupos de riesgo y adecuar el plantea-miento terapeutico para cada paciente. En la LLCB esta pendienteel desarrollo de un modelo pronostico semejante, tal vez debido a
la dificultad de su elaboracion por la naturaleza cronica de estaenfermedad y a la larga duracion del seguimiento.
El ındice GIMEMA pretende distinguir subgrupos con diferen-tes supervivencias libres de progresion dentro del estadio A, puesse considera que tendra impacto en la SG. En la poblacion de esteestudio permite diferenciar 3 subgrupos con diferentes SLT, perono permite detectar diferencias en la SG.
El IP MDACC ha sido util para valorar diferencias tanto respectoa la SLT como a la SG, pese a que la presente poblacion depacientes es diferente a la atendida en el MDACC, donde lospacientes tienen una media de edad de 58 anos y presentan unposible sesgo de seleccion. Los autores del presente estudio hananalizado a todos los pacientes diagnosticados de LLCB del areasanitaria, y la media de edad es de 72 anos, mas proxima a lamedia de edad recogida en la mayorıa de los estudios. En elsubgrupo de pacientes en estadio A de Binet, que es el masnumeroso (76,8%), el IP MDACC ha permitido diferenciar pacientesde bajo riesgo de otros de riesgo intermedio, con supervivenciasdiferentes. Mediante las curvas ROC se ha observado que es elmejor sistema pronostico predictor de la mortalidad.
0 20 40 60 80 100 120 140Tiempo (meses)
0 20 40 60 80 100 120 140Tiempo (meses)
0 20 40 60 80 100 120 140Tiempo (meses)
0 20 40 60 80 100 120 140Tiempo (meses)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
IP riesgo intermedio: 51/61
IP riesgo alto: 12/17
IP riesgo bajo: 12/81
Pro
babi
lidad
de
supe
rviv
enci
a gl
obal
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Pro
babi
lidad
de
supe
rviv
enci
a gl
obal
A de Binet: 45/202
B de Binet: 16/39
C de Binet: 15/22
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Pro
babi
lidad
de
supe
rviv
enci
a gl
obal
Bajo riesgo Rai: 38/161
Riesgo intermedioRai: 22/77
Alto riesgoRai: 22/77
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Pro
babi
lidad
de
supe
rviv
enci
a gl
obal
1
32
1: Mujeres score 0: 12/582: Varones score 0: 16/663: ambos sexos score 1-3: 13/52
Figura 3.
A.P. Gonzalez Rodrıguez et al / Med Clin (Barc). 2009;133(5):161–166 165
174
Otras ventajas del IP MDACC, ademas de su sencillez deaplicacion en la practica clınica diaria, son que es util en cualquiermomento de la evolucion previo al tratamiento y que se puedeusar de manera seriada en un paciente a lo largo del tiempo14.Ademas, puede ser util para aplicarlo en ensayos clınicos y paraestudiar la correlacion con otras variables biologicas de interespronostico. En conclusion, segun los resultados del presenteestudio, el ındice IP MDACC discrimina mejor subgrupos depacientes que los sistemas de estadificacion clasicos y es util parapredecir tanto la SLT como la SG. Serıa muy interesante valorarlode forma prospectiva pese a la dificultad que conlleva, inherente ala larga historia natural de la enfermedad.
Financiacion
El Fondo de Investigaciones Sanitarias ha financiado parcial-mente este trabajo a traves del proyecto de investigacion FIS06/0841.
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Tabla 4Probabilidad de supervivencia global (SG) en 5 y 10 anos segun estadio de Binet,
estadio de Rai modificado, ındice pronostico (IP) del MD Anderson Cancer Center
(MDACC) e ındice del Gruppo Italiano Malattie Ematologiche Maligne dell0 Adulto
(GIMEMA)
Estadio Binet (po0,05) Numero de
pacientes
SG 5 anos (EE) SG 10 anos (EE)
Estadio A 202 0,83 (0,03) 0,62 (0,04)
Estadio B 39 0,61 (0,09) 0,40 (0,09)
Estadio C 17 0,4 (0,10) 0,21 (0,01)
Rai modificado (po0,05)
Bajo riesgo 161 0,84 (0,03) 0,61 (0,05)
Riesgo intermedio 77 0,71 (0,06) 0,51 (0,07)
Alto riesgo 25 0,41 (0,09) 0,25 (0,09)
IP MDACC (po0,05)
Bajo riesgo 81 0,87 (0,04) 0,73 (0,05)
Riesgo intermedio 160 0,75 (0,04) 0,49 (0,05)
Riesgo alto 17 0,29 (0,12) 0,16 (0,10)
Indice GIMEMA (p ¼ 0,9)
0 mujer 58 0,79 (0,06) 0,64 (0,08)
0 varon 66 0,87 (0,05) 0,61 (0,07)
1–3 ambos sexos 52 0,7 (0,05) 0,61 (0,08)
Total 265 0,76 (0,03) 0.54 (0.04)
EE: error estandar.
Tabla 5Cociente de riesgo para supervivencia global segun estadio de Binet, estadio de Rai
modificado, ındice pronostico (IP) del MD Anderson Cancer Center (MDACC) e
ındice del Gruppo Italiano Malattie Ematologiche Maligne dell0 Adulto (GIMEMA)
Cociente de riesgo IC del 95% p
Estadio Binet 2,21 1,65–2,95 o0,001
Rai modificado 2,07 1,5–2,83 o0,001
IP MDACC 3,34 2,15–5,19 o0,001
Indice GIMEMA 1,38 1,05–1,81 0,019
IC: intervalo de confianza.
A.P. Gonzalez Rodrıguez et al / Med Clin (Barc). 2009;133(5):161–166166
175
Title: Prognostic significance of CD8 and CD4 T cells in chronic lymphocytic
leukemia
Running Title: T cells in chronic lymphocytic leukemia
Authors:
Ana P Gonzalez-Rodriguez,1 Juan Contesti,1 Leticia Huergo-Zapico,2 Alejandro
Lopez-Soto,2 Ana J Gonzalez-Huerta,1 Esther Gonzalez,1 Carmen Fernandez-Alvarez,1
Segundo Gonzalez2.
Affiliations:
1 Hematology Department. Hospital Cabueñes. Cabueñes sn, Gijón, Spain.
2 Functional Biology Department. Instituto Universitario Oncologico del
Principado de Asturias (IUOPA). University of Oviedo, Oviedo, Spain.
Correspondence:
Segundo González
Universidad de Oviedo
Facultad de Medicina, 4 ª planta, despacho D02
Julián Clavería sn, 33006, Oviedo, Spain
Phone: 34 985102715
Email: [email protected]
176
Summary
Objectives: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by a highly variable
clinical course. An important search for prognostic factors that identify patients who
may benefit from an early and more aggressive therapeutic intervention is ongoing. This
study is planned to establish the prognostic significance of the number of T cells and
NK cells at diagnosis in CLL.
Methods: NK and T cells were quantified at diagnosis in a cohort of 256 CLL patients
diagnosed between 1997 and 2007.
Results: Leukaemia patients showed elevated NK cells, CD4 and CD8 T cell
populations and CD4/CD8 ratio was inverted in 39.7% cases. Prognostic significance of
lymphocytes was analysed as a ratio of relative number of T cells to the size of the
malignant monoclonal B-cell pool (T/NK cells:Malignant monoclonal B-cells ratio).
Patients showed higher relative number of CD4 (p=0.03), CD8 (p=0.02) and NK cells
(p=0.01) in early Rai stage of disease. The multivariate Cox analysis identified the
relative number of CD8 (Hazard Ratio=1.464; p=<0.006) and CD4 T cells (Hazard
Ratio=0.091; p=<0.01) as independent predictors for survival. Additionally, patients
with relative CD8 count>0.074 or CD4 count>0.1 had higher 10 year overall survival
than patients with CD8 count<0.074 or CD4 count<0.1 (p=0.002). Higher CD8 count
was associated with significantly higher median time of survival of patients (149.33 vs.
82.06 months).
Conclusions: This study shows that quantitative characteristics of the immune system
of patients may modify the progression of CLL.
Key words: Chronic lymphocytic leukemia, T cells, CD4, CD8, NK cells.
177
Introduction
B-cell chronic lymphocytic leukaemia (CLL) is the most common adult leukaemia
in Western countries. The clinical course of CLL is highly variable: some patients have
a short survival time after diagnosis, whereas the survival of other patients is only
slightly affected by the disease (1). Consequently, an important search for prognostic
factors that identify patients who may benefit from an early and more aggressive
therapeutic intervention is ongoing. Poor prognostic factors (including CD38, ZAP-70,
β2-microglobulin, IgVH mutation status and deletions of 11q23 or 17p53) may help to
identify patients at early CLL stages with a high risk of rapid disease progression (2-6).
However, current prognostic factors focus only on the characteristics of malignant B
cell clone and do not examine the immune response of the patients.
Interest in the study of the immune response against cancer has re-emerged in the
last ten years. The analysis of tumour growth in immunodeficient murine models
demonstrated that the immune system plays a key role in the susceptibility to several
types of tumours and haematological malignancies (7) and immunosuppressed patients
have an increased risk of cancer development. Conversely, activation of the immune
system has been associated with spontaneous tumour regression and the presence of
tumour infiltrating cytotoxic CD8 T cells, NK cells, and NKT cells has been associated
with an improved prognosis in many different cancer types (7-13). In haematological
malignancies, a higher number of T cells and NK cells has been described as a good
prognostic factor for survival in lymphoma and myeloma and they have been associated
with the time to treatment in CLL patients (14-21). Although the subset distribution and
functional activity of the immune system in these haematological malignancies were not
monitored, these data suggest that the non-malignant immune system may play an
important role in the pathogenesis and progression of these malignancies.
In this study, we hypothesized that the presence of a competent immune system
would translate into a longer survival time of CLL patients. Here, we analyzed the
potential effect of the numbers of CD8 T cells, CD4 T cells and NK cells at diagnosis to
the overall survival of CLL patients.
178
Methods
Patient population
Two hundred fifty six consecutive Caucasians who were diagnosed with CLL in
the Hospital Cabueñes de Gijón of Spain between 1997 and 2007 were enrolled in this
study. Clinical data was updated in July of 2009. The diagnosis of CLL was confirmed
in each patient by flow cytometry analysis using fluorochrome-conjugated antibodies
specific for CD5, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, FMC7, CD79b, CD103 and
immunoglobulin light chains (κ or λ). Clinical characteristics of patients, including age,
sex, Rai stage, treatment history, time for diagnosis to first treatment, haemoglobin
concentration, platelet count, serum activities of lactate dehydrogenase, concentration of
β2-microglobulin and immunoglobulins were obtained at diagnosis. CD38 and ZAP-70
expression on CLL cells was determined by flow cytometry (6,22). CD38 and ZAP-70
concentrations were monitored only after they were identified as prognostic factors.
This study is in accordance with the Helsinki Declaration of 1975 and it was approved
by the Ethics Committee of our Institution.
Assessment of T cell and �K cells counts
Absolute counts of the main peripheral blood mononuclear cell subsets including
CD4 and CD8 T cells, B cells, NK cells and monocytes were carried out by flow
cytometry upon diagnosis. The populations of cells were defined as follows: CD4 T
cells were defined as CD3+CD4+, CD8 T cells were defined as CD3+CD8+, B cells
were defined as CD19+, NK cells were defined as CD3-CD16+ and CD56+ and
monocytes were defined as CD14+. All samples were evaluated using an ADVIA
Hematology Analyzer (Bayer Diagnostica, Tarrytown, NJ, USA). The absolute counts
of these cells were derived from the flow cytometry. The relative number of T/NK cells
was determined as the distribution of these populations in relation to the size of CLL
monoclonal B-cells clone (MBC) (T/NK cells:MBC ratio).
179
Statistical analysis
Overall survival was analyzed using the approach of Kaplan and Meier (23).
Differences between survival curves were analyzed for statistical significance using the
two-tailed log-rank test. The relative numbers of CD4 and CD8 T cells were subjected
to dichotomized testing using different cut-off points between the 25% and 75%
percentile. The cut off point of the relative number of CD8 and the relative number of
CD4 yielded the greatest difference in survival based on chi-square test analyzed at
different cut off points, between the 25% and 75% quartiles, from the log-rank test.
Potential new prognostic factors for overall survival were identified by univariate and
multivariate Cox regression analyzes. Gaussian distribution of values was tested by
Kolmogorov-Smirnov test. Relationship between continuous variables and categorical
prognostic variables was evaluated by Mann Whitney and Kruskal Wallis tests. P-
values<0.05 were considered significant.
Results
Patient characteristics
A cohort of 256 CLL patients was analyzed in this study (Table 1). The patients
were diagnosed between 1997 and 2007 and the median length of follow up was 55.2
months. This population was typical of newly diagnosed CLL patients, with a median
age at diagnosis of 71.6 years old, male (58.8%) and a predominance of low risk of Rai
(61.2%). The percentage of patients which presented adverse prognostic factors at
diagnosis was: 31.2% of patients were positive for CD38 (limit>30%), 58.1% presented
high β2-microglobulin (limit >2.4mg/L) and 29% were positive for ZAP-70.
Lymphocyte subsets were quantitatively abnormal at diagnosis
The number of total T/NK cells at diagnosis among patients was not distributed in
a Gaussian distribution. Instead, patients showed a higher frequency of elevated T and
NK levels (Table 2, Figure 1). Compared to reference ranges in a normal Caucasian
population (24), CLL patients showed a marked increase of all T/NK populations.
180
Higher concentrations of cytotoxic CD8 T cells and NK cells were observed. Likewise,
51.1% of the patients showed an elevated T cell number (upper limit of normal
>1.787x109/L), 41.5% in helper CD4 T cells (upper limit >1.138x109/L), 50.2% in
cytotoxic CD8 T cells (upper limit >0.823x109/L) and 63.9% of the patients had a high
number of NK cells (upper limit> 0.427x109/L). In agreement with a higher number of
CD8 T cells in CLL patients, 39.7% of the cases showed an inversion in the CD4/CD8
ratio, showing higher levels of cytotoxic CD8 T cells than helper CD4 T cells.
Significantly, higher absolute numbers of T/NK cells were observed in patients with
poor prognostic factors. CD38 positive patients presented higher average number of T
cells (2.19x109/L vs. 1.9x109/L, p=0.007), mainly of CD8 T cells (0.98x109/L vs.
0.74x109/L, p=0.005). Patients with a higher β2-microglobulin levels presented
elevated T cells (2.13x109/L vs. 1.85x109/L, p=0.03) and NK cells (0.61x109/L vs.
0.54x109/L, p=0.02) (Table 2).
The distribution of the absolute number of T/NK cells within different Rai
categories was analyzed. The absolute number of different lymphocyte subsets was
similar among patients with different Rai stages (Table 2). Nevertheless, the functional
activity of T/NK cells in CLL depends, not only on the absolute number of cells, but it
is also related to the size of CLL monoclonal B cells clone (MBC) (21). Consequently,
we also analyzed the distribution of the relative number of T cells and NK cells by
calculating the ratio between the numbers of T/NK cells and MBC (T/NK cells:MBC
ratio) (Table 2). Patients with early Rai stage disease showed a higher relative number
of CD4 T cells (p=0.03), CD8 T cells (p=0.02) and NK cells (p=0.01). The relative
numbers of T and NK cells were not significantly different in patients stratified by the
association with the poor prognostic factors, CD38 or β2-microglobulin.
Prognostic significance of relative CD4 and CD8 count
We next analyzed whether the absolute and relative numbers of T/NK cells may
be potential prognostic factors for overall survival of CLL patients using the Cox
regression model. In the univariate analysis, other known prognostic factors, such as
high β2-microglobulin, high risk of Rai and the size of the monoclonal B cell pool, were
181
included. As continuous variables, the relative number of CD8 (Hazard Ratio
(HR)=1.474; p=0.01), the relative number of CD4 (HR=0.082; p=0.036), high levels of
β2-microglobulin (HR=1.526; p=<0.001) and high risk Rai stage (HR=2.827; p=0.010)
were identified as independent predictors for survival in the univariate analysis. These
variables, CD8 T cells (HR=1.464; p=<0.006) and CD4 T cells (HR=0.091; p=<0.01),
high levels of β2-microglobulin (HR=1.351; p=<0.001) and high risk Rai stage
(HR=2.974; p=<0.08), retained the statistical significance in the multivariate Cox
analysis (Table 3). The absolute number of T/NK cells, the monoclonal B-cell
compartment, and the relative number of NK cells (NK:MBC ratio) were not associated
with survival in this hazard model (data not shown).
Higher relative numbers of CD8 and CD4 T cells were associated with better
survival of chronic lymphocytic leukaemia patients
The median survival time of the patients was 112 months. When this analysis was
completed, 56 patients had died. The overall survival probability at 5 and 10 years was
76% and 54%, respectively. To further analyze the prognosis significance of the relative
numbers of CD8 and CD4 T cells, we grouped the patients using the cut off point of the
relative number of CD8 at 0.074 and the relative number of CD4 at 0.1. The clinical and
biological characteristics of the patients are shown in Table 4A. Patients with the higher
relative CD8 and CD4 count experienced a better survival probability at 5 and 10 years
(Table 4B and Figure 2). Patients with relative CD8 count>0.074 showed higher 10
years overall survival than patients with CD8 count<0.074 (0.56 vs. 0.43, p=0.02).
Concordantly, the median of survival time of patients with higher relative CD8 count
was significantly higher than those patients with lower relative number of CD8 cells
(149.33 months; 95% confidence interval (95 CI): 94.58-184.28 vs. 82.06 months, 95
CI: 38.64-125.48). Patients with the relative CD4 count>0.1 also showed higher 10
years overall survival than patients with CD4 count<0.1 (0.58 vs. 0.41, p=0.002).
182
Discussion
The progression of CLL is associated with quantitative and qualitative changes in
the host’s immune system. These defects, which include alterations in T cells and NK
cells, impair the cellular immune response of CLL patients (25-28). These alterations
may increase the susceptibility to infectious diseases and other malignancies (29,30).
Likewise, it is also plausible that the competence of the immune system may also affect
the progression of CLL itself. In this study, we analyzed whether the number of T cells
and NK cells at diagnosis correlated with the survival of CLL patients.
We initially observed that the amounts of T/NK cells were significantly elevated
in CLL patients. Furthermore, the distribution of T cell subsets was abnormal since
there was a greater increase of cytotoxic CD8 than CD4 T cells. Nearly 40% of the
cases showed higher levels of cytotoxic CD8 than helper CD4 T cells. Although
elevated CD8 T cells have been documented in CLL for decades, the significance of the
increase of immune cells in CLL is still unknown. One possibility was immune cells
had expanded due to CMV infection since the expansion of CD8 T cells has been
reported in CMV-infected CLL patients (31). Nevertheless, although the CMV status
was not available at the time of diagnosis in many patients, a significant increase of
CD4 T cells, which are not expanded in CMV-infected CLL patients, was also
observed. Thus, it is unlikely that CMV infection was responsible for the increase of
immune cells in CLL patients. The increase of immune cells may be also due, at least in
part, to the expansion of anti-tumour reactive immune cells. The expansion of anti-
tumour T cells has been described in several types of cancer. The expansion of tumour
infiltrating lymphocytes (TILs), mainly cytotoxic CD8 T cells and NK cells, is
associated with good prognosis in several types of cancer (7-13). A good clinical
outcome has also been observed in patients of several haematological malignancies with
higher counts of immune cells (14-20). In CLL, a significant increase of anti-tumour γδ
T cells, which are associated with the prognostic of the disease, has been reported (32).
This subset of T cells expressed the receptor NKG2D (33,34), which can mediate lysis
183
of certain tumour cells, and it is involved in the recognition of CLL. These data suggest
a potential role of the immune system in the pathogenesis of these diseases. In
agreement, several studies in immunodeficient patients and immunodeficient murine
models have highlighted the relevance of T cells and NK cells in the surveillance of
cancer (35-38).
To initially analyze whether the competence of the immune system may have an
impact on the survival of CLL patients, we assessed whether the absolute and relative
numbers of T/NK cells may be potential prognostic factors for overall survival of CLL
patients. Significantly, we did not observe a prognostic impact of crude T cell numbers
in CLL patients. However, the effector activity of T and NK cell in vitro depends not
only on the absolute number of immune cells, but it depends on the ratio between the
effector and target cells. In vivo, it has also been described that the ratio between T/NK
cells and MBC, but not with the absolute number of T/NK cells, is associated with the
time to treatment in CLL patients (21). For this reason, we also analyzed the impact of
the relative number of T/NK cells on the survival of CLL patients. We observed that the
CD8:MBC and CD4:MBC ratios, but not the NK:MBC ratio or the size of monoclonal
B cells clone, were independent prognostic factors in CLL. Higher CD8:MBC and
CD4:MBC ratios were associated with better survival of CLL patients. The favourable
clinical outcome of CLL patients with higher increase of T cells suggests that the host
immunity impacts the disease course of CLL patients. These expanded cells may be, at
least in part, activated anti-tumour cells. However, the analysis of the number of
different subsets of T cells should be taken with caution since the functionality of these
subsets may be diverse. For instance, regulatory T cells, a type of CD4 T cells, may
prevent apoptosis of cancer cells. Consequently, further studies should be done
analyzing the activity of each particular T cell subset to extend the knowledge of the
role of immune cells in the pathogenesis of CLL.
In addition to the fact that our study and others highlight the potential relevance of
the immune system in the progression of CLL, our work also has important clinical
implications. First, our analysis reflects the importance of the baseline immune system
as a prognostic factor in CLL. Although many prognostic factors are available for CLL
184
patients, the determination of T/NK cells is a routine laboratory analysis that is
performed for diagnostic purposes in all CLL patients. Second, this prognostic factor
focuses on the immune system, whereas all previous prognostic factors focus on the
malignant B cell clone. Third, these data suggest that therapies that enhance the host
immune response have a strong potential future in the treatment of this disease.
To our knowledge, this is the first report demonstrating that the quantitative status
of CD4 and CD8 T cells at diagnosis is associated with the overall survival of CLL
patients. Our work highlights the relevance of the immune system in the progression of
this disease and provides further insights that support the use of therapies that enhance
the host immune response in these patients.
Acknowledgement
This work was supported by the Spanish grants of Fondo de Investigaciones
Sanitarias PI06/0841 and PS09/00420. AL holds a predoctoral fellowship from FYCIT
of Asturias (BP06-99). The authors reported no potential conflicts of interest
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189
Table 1. Patient characteristics.
Table 2. Absolute and relative number of T cells, CD4+ T cells, CD8+ T cells and NK
cells at diagnosis.
Table 3. Multivariate analysis for survival.
Table 4. A) Clinical characteristics of the patients grouped by the relative number of
CD8 T cells (cut off 0.74) and the relative number of CD4 T cells (cut off 0.1). B)
Overall survival probability of CLL patients stratified by the relative number of CD8 T
cells (cut off 0.74) or the relative number of CD4 T cells (cut off 0.1).
Figure 1. Peripheral T cells, CD4 T cells, CD8 T cells and NK cells upon diagnosis.
Distribution of the patients according to the count of CD4 T cells (CD3+CD4+), CD8 T
cells (CD3+CD8+) and NK cells (CD3-CD16+ and CD56+). Striped bars represent
reference values of T cells (536-1787 cells x109/L), CD4 T cells (309-1139 cells
x109/L), CD8 T cells (137-823 cells x109/L) and NK cells (77-427 cells x109/L), in a
Caucasian population (24).
Figure 2. The relative number of CD8 and CD4 T cells was associated with overall
survival in CLL patients. CLL patients were stratified by the relative number of CD8 T
cells (cut off 0.74) or the relative number of CD4 T cells (cut off 0.1).
190
Table 1.
Characteristic n=256 Age at diagnosis (years) 71.6
Gender Male Female
151 (58%) 104 (42%)
Rai stage at diagnosis (%) 0/I II/III IV/V
156 (61%) 77 (30%) 22 (8%)
Hemoglobin at diagnosis (gr/L) 135.1
Platelets (x109/L) 197
Leukocyte (x109/L) 24.2
CD38 (%) Positive (>30%) Negative (<30%)
46 (31%) 101 (68%)
β2-microglobulin (%) High >2.4 mg/L Low ≤2.4 mg/L
140 (58%) 101 (41%)
ZAP-70 (positive >20%) 18 (29%)
Gammaglobulins (gr/L) 9.7
IgG (gr/L) 9.5
IgA (gr/L) 1.8
IgM (gr/L) 1.1
LDH (U/L) 344
MBC duplication in less than 1 year (%) 42 (17%)
MBC: monoclonal B-cells clone
191
Table 2.
Prognostic factors/variable
�umber of patients
Median of T cells
(x109/L)
Median of CD4 T cells
(x109/L)
Median of CD8 T cells
(x109/L)
Median of �K cells (x109/L)
p
All patients 256 1.92 1.04 0.81 0.58 Rai stage at diagnosis 0 I/II III/IV
155 77 22
1.87 2.04 1.97
1.01 1.12 1.02
0.79 0.84 0.81
0.58 0.61 0.51
ns
CD38 Positive (>30%) Negative (<30%)
46
100
2.19 1.90 (1)
1.25
1
0.98 0.74 (2)
0.64 0.53
(1) 0.007 (2) 0.005
β2-microglobulin High >2.4mg/L Low ≤2.4/L
100 140
2.13 1.85 (3)
1.2
0.96
0.87 0.80
0.61 0.54 (4)
(3) 0.03 (4) 0.02
Prognostic factors/variable
�umber of patients
Median of T:MBC
ratio (x109/L)
Median of CD4:MBC
ratio (x109/L)
Median of CD8:MBC
ratio (x109/L)
Median of �K:MBC
ratio (x109/L)
p
All patients 256 0.25 0.14 0.1 0.07 Rai stage at diagnosis 0 I/II III/IV
145 72 22
0.28 0.23 0.16 (1)
0.15 0.12 0.08 (2)
0.11 0.09 0.06 (3)
0.08 0.06 0.03 (4)
(1) 0.04 (2) 0.03 (3) 0.02 (4) 0.01
CD38 Positive (>30%) Negative (<30%)
46
100
0.2
0.22
0.11 0.13
0.09 0.08
0.06 0.06
ns
β2-microglobulin High >2.4mg/L Low ≤2.4/L
100 140
0.19 0.27
0.11 0.14
0.08 0.11
0.06 0.07
ns
ns: non significant; MBC: monoclonal B-cells clone
192
Table 3.
HR HR 95% p CD8/MBC 1.464 1.074-1.994 0.006 CD4/MBC 0.091 0.009-0.912 0.016 β2-microglobulin >2.4mg/L 1.351 1.191-1.531 <0.001 High risk of Rai 2.974 1.337-3.316 0.08
MBC: monoclonal B-cells clone
193
Table 4. A)
CD8:MBC ratio CD4:MBC ratio ≤0.074 >0.074 p ≤0.1 >0.1 p Number 79 140 90 124 Age at diagnosis (years) 70.3
70.2
0.636 71.6
70.2 0.311
Male (%) 51 (64%) 81 (57%) 0.331 60 (66%) 59 (55%) 0.105 Rai stage 0 I/II III/IV
35 (44%) 31 (39%) 12 (15%)
95 (67%) 36 (25%) 9 (6%)
0.003
44 (49%) 34 (38%) 11(12%)
84 (67%) 31 (25%) 9 (7%)
0.026
Hemoglobin (gr/L) 130.5
137.9
0.066 131.1
138.2
0.013
Platelets (x109/L) 176 207 0.003 184 205 0.013 Gammaglobulins (gr/L) 8.54
10.23
0.000 8.63
10.24
0.000
IgG (gr/L) 8.68 10.02 0.003 8.80 10.13 0.005 IgA (gr/L) 1.52 1.89 0.001 1.53 1.90 0.001 IgM (gr/L) 0.58 0.99 0.000 0.59 1.03 0.000 LDH (U/L) 358 339 0.781 354 336 0.200 β2-microglobulin (mg/L) 3.31
2.54
0.048 3.11
2.53
0.185
CD38 positive (>30%) 18 (33%) 23 (30%) 0.748 21 (37%) 22 (30%) 0.490 MBC duplication in less than 1 year
16 (23%) 20 (15%) 0.158 21 (26%) 16 (13%) 0.036
MBC: monoclonal B-cells clone
B) CD8:MBC ratio p=0.01
�umber of patients
5 years overall survival probability*
10 years overall survival probability*
≤0.074 81 0.64 (0.06) 0.43 (0.08)
>0.074 138 0.80 (0.04) 0.56 (0.06)
CD4:MBC ratio p=0.001 ≤0.1 91 0.63 (0.05) 0.41 (0.07)
>0.1 122 0.83 (0.04) 0.58 (0.06)
Total 265 0.76 (0.03) 0.54 (0.04) *percentage (standard deviation); MBC: monoclonal B-cells clone
194
Figure 1.
0
10
20
30
40
50
60
200-6
0010
001400
1800
22002600
300034
003800
4200
>4200
0
10
20
30
40
50
60
0-30
060
090
012
0015
0018
0021
0024
0027
0030
00
>300
0
0
10
20
30
40
50
0-20
040
060
080
010
0012
0014
0016
0018
0020
00
>200
0
0
10
20
30
40
50
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
>200
0
T cells (x10 9/l)
Num
ber
ofpa
tient
s
CD8 T cells (x10 9/l)
CD 4 T cells (x10 9/l) NK cells (x10 9/l)
Num
ber
ofpa
tient
sN
umbe
rof
patie
nts
Num
ber
ofpa
tient
s
0
10
20
30
40
50
60
200-6
0010
001400
1800
22002600
300034
003800
4200
>4200
0
10
20
30
40
50
60
0-30
060
090
012
0015
0018
0021
0024
0027
0030
00
>300
0
0
10
20
30
40
50
0-20
040
060
080
010
0012
0014
0016
0018
0020
00
>200
0
0
10
20
30
40
50
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
>200
0
T cells (x10 9/l)
Num
ber
ofpa
tient
s
CD8 T cells (x10 9/l)
CD 4 T cells (x10 9/l) NK cells (x10 9/l)
Num
ber
ofpa
tient
sN
umbe
rof
patie
nts
Num
ber
ofpa
tient
s
195
Figure 2.
months200,00150,00100,0050,000,00
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Log Rank p=0.028
CD8/MBC>0.074 (40/138)
CD8/MBC≤0.074 (32/81)
months200,00150,00100,0050,000,00
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Log Rank p=0.028
CD8/MBC>0.074 (40/138)
CD8/MBC≤0.074 (32/81)
months200,00150,00100,0050,000,00
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
CD4/CMB>0.1 (30/122)
CD4/MBC≤0.1 (41/91)
Log Rank p=0.002
months200,00150,00100,0050,000,00
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
CD4/CMB>0.1 (30/122)
CD4/MBC≤0.1 (41/91)
Log Rank p=0.002