tesis doctoral “papel de la proteína adaptadora numb en la...

Consejo Superior de Universidad de Granada

Investigaciones Científicas

“Papel de la Proteína Adaptadora Numb en la

Modulación de la Señal

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

Dra.


TESIS DOCTORAL


Modulación de la Señalización por TCR”


PRESENTADO POR:

Dª Nadia María Martín Blanco

Lda. Biología

BAJO LA DIRECCIÓN DE:

Dra. Dª Matilde Cañelles López

Científico Titular del CSIC

Granada, 2010



por TCR”


Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Nadia María Martín BlancoD.L.: GR 1473-2010ISBN: 978-84-693-0734-2

Dra. MATILDE CAÑELLES LÓPEZ, Científico Titular del CSIC

CERTIFICA:

Que Dña. Nadia María Martín Blanco, Licenciada en Biología, por la Universidad de Granada,

ha realizado bajo su dirección en el departamento de Biología Celular e Inmunología del Instituto

de Parasitología y Biomedicina “López Neyra” del CSIC, la presente tesis titulada:


Modulación de la Señailización por TCR”

Para la obtención del Título de Doctor en Ciencias.

Y para que conste y surta sus efectos en el expediente correspondiente expido la presente

certificación en Granada, a 1 de Diciembre de 2009.

DIRECTORA DEL TRABAJO LA ASPIRANTE

Dra. Matilde Cañelles López Lda. Nadia Mª Martín Blanco

Esta Tesis Doctoral ha sido realiza en el Departamento de Biología Celular e Inmunología del

Instituto de Parasitología y Biomedicina “Lopéz Neyra” (CSIC) de Granada y ha podido ser

realizada gracias a un Contrato Asociado a Proyecto de la Junta de Andalucía (2007-2008).

Parte de los resultados de esta tesis han sido descritos y enviados para su publicación en la revista

científica: BLOOD, aceptado con revisión:

Aguado R., Martín-Blanco N., Canelles M. The endocytic adaptor Numb regulates

thymus size by modulating pre-TCR signaling during asymmetric division.

A M ercedes y R aúl.

…..Caminante, no hay camino,

se hace camino

Al andar se hace el camino,

y al volver la vista atrás

se ve la senda que nunca

se ha de volver a pisar…..

Antonio Machado.

A M ercedes y R aúl.

…..Caminante, no hay camino,

se hace camino al andar.

Al andar se hace el camino,

y al volver la vista atrás

se ve la senda que nunca

se ha de volver a pisar…..

Antonio Machado.

Agradecimientos:

Porque una persona es el resultado de todo lo que tiene alrededor, porque los buenos momentos

y los éxitos hay que compartirlos, y porque no todo el mundo ve esto como una competición, a lo

largo de cuatro años te encuentras con gente a la que estás obligado a agradecerle su ayuda,

porque realmente se lo merece.

Gracias a Matilde Cañelles por confiar en mi y darme esta oportunidad, espero no haberte

defraudado; y gracias no solo por ser la directora de mi tesis sino también por preocuparte por

mi futuro, por mi presente y por mi pasado. Por guiarme hacia el objetivo cuando yo pierdo el

punto de referencia.

Gracias Ignacio Molina por su ayuda para conseguir mi financiación, y por sus clases se

Inmunología durante la carrera.

Gracias a Balbino Alarcón por toda su ayuda científica, y por acogerme en su laboratorio, por su

trato tan cercano y amabilidad, gracias a todo su equipo que me hicieron sentir como en casa.

A Javier León, por su ayuda, porque hablar con él no es como hablar con un jefe, y a todo su

equipo por su trato, su amabilidad, por su acogida, por preocuparse por enseñarme Santander. A

Gabi, gracias especialmente por su ayuda, y porque es capaz de enseñar todo lo que sabe sin

guardarse nada para el, no pierdas eso nunca.

Gracias a mis compañeros de laboratorio, a Rocío por esa primera etapa de tesis en las que

fuimos cómplices y nos perdíamos juntas por estos pasillos del López, y por las discusiones

durante el café que nos hicieron comprender un poco mas nuestro proyecto. Y a Michael por

esta última etapa.

A Esther Zumaquero, gracias por ser mi puente de conexión con el López, por su sonrisa

contagiosa y por sus visitas al 210. Porque no tiene ningún reparo en enseñarte todo lo que sabe,

que es mucho aunque ella lo niegue. Siempre está dispuesta a ayudarte, es una gran compañera.

A Pili por su dulzura, por su sonrisa, por su ayuda, gracias. A Marién, por sus visitas cada vez

que pisa de nuevo el López. Y a Per y Nieves por su ayuda técnica, gracias. A Angélica y a

Virginia por esta última etapa, gracias.

Gracias en general a todos mis compañeros del López Neyra, bueno excepto a uno, que no se

quien es, y que me voto como ácido acético, jajajaja!!! Es broma, a este/a también. Gracias al

personal del López porque sin ellos tampoco hubiese sido posible, Paco, Clara, Ángeles, Mª José,

José Luis Rafa, Salva…. Gracias por hacer bien vuestro trabajo.

Y ahora que está finalizando esta etapa, me pongo a pensar como llegue hasta aquí, y me doy

cuenta que es producto de un gran número de coincidencias. Gracias a mi profesora de bilogía,

que hizo que me gustara esta profesión. Porque no escogí Inmunología en mi primera matrícula,

y alguien me convenció en el último momento, gracias Paco y Susana, porque yo quería trabajar

en Desarrollo y allí no me quisieron, también gracias; y por último, Gracias a Ramón Cañelles,

porque es el último eslabón de esta cascada de coincidencias, este trabajo también es gracias a

ti. Y a veces el destino también parecía enviar señales contradictorias, porque casi suspendo

biología en selectividad, porque no conseguí eliminar el primer examen de inmunología, pero

como naci cabezona, yo seguí en mis treces.

A mis amigos, que son pocos pero grandes. Gracias a Elena, Irene, Jordi, Antonio, Chico y

David, porque sois parte de una de las etapas más felices de mi vida, que recuerdo como aquellos

maravillosos años. Gracias a Miriam, porque al final llegue a entender tu letra mejor que la mía

propia, porque estuviste cuando te necesitaba, por levantarme y sostenerme en el momento

adecuado, gracias porque se que eres incondicional, gracias por todas las anécdotas comunes

que podemos contar, muchas horas de risas, de lágrimas, de chistes…. Que se yo!!. Por decirme

que yo valgo para esto. A Nuria, gracias por su sensatez, por su sabiduría, porque de las cuatro

representa la cordura, la fortaleza, las palabras justas, gracias por contagiarme de todo esto, por

tu cariño y por tus muestras de este. A Luismi, mi mejor amigo consorte, porque si estas tu en la

reunión seguro que acabo riéndome a carcajadas, por tu calidad humana, porque es increíble ese

aire de bondad infantil que trasmites, nunca pierdas esto último, gracias. A Nieves, gracias por

tu sonrisa, por tu humor, por tu espontaneidad, porque con tus cualidades consigues que cada

momento contigo este muy lejos del aburrimiento

A Javi, gracias, porque también formó parte de esto, por su ayuda y amor.

A mi Pablito, por su amor, su compañía, siempre dando ánimos, por convencerme de que mi

trabajo será recompensado, por llamarme “maquinón”, por decirme “no te preocupes por el

western ese, mañana te saldrá”. Por toda tu ayuda, disposición y amor sin razón, porque eres el

que estas todos los días, gracias.

Y a mi familia, a mi Madre, Mercedes, que se yo que puedo decir..!, porque me ha enseñado todo,

y porque estoy aquí por una de sus frases “estudia lo que te guste”. Por ser un ejemplo de

valentía, y como madre por su respeto, por la educación que me dio, por enseñarme el valor de

las cosas, y por su amor incondicional, gracias. A mi hermano Raúl, por ser mi ejemplo a seguir,

porque está lleno de bondad y porque es un ejemplo de superación, porque me decía “Tata tu

hasta el final”, porque se le nota orgulloso de mí, porque es mi hermano, gracias. A mi padre,

Raúl, por quererme y estar junto a mí, por decirme “que fuerza de voluntad tienes, hija”, porque

sin el aquí tampoco habría sido posible, por sus sabios consejos, por toda su ayuda gracias. A mi

hermano Issey, porque es la alegría que me lleva a casa todos los días, porque sigue siendo un

niño y con su sonrisa me hace feliz, gracias. A Merce, por cuidarme todos los días, por su

cariño, ayuda y comprensión, porque sin ti habría sido mucho más difícil, a la madrina gracias.

A Paula y Julia, por sus abrazos tan sinceros, nunca dejéis de abrazarme así. A Ana, porque

siempre sabe escuchar, porque siempre quise ser como tú. A Alexis por ser como un hermano. A

Justo, Ángel, Mª Sol, Eva, gracias por estar ahí. A Jose, por su cariño desde hace muchos años. A

Ramoncito, porque aún tenemos un gran proyecto juntos que cumplir. A María y Elena, porque

puedo ver en sus ojos su alegría al verme. A Gema por cuidarme, gracias. A todos mis tíos y

primos porque en la lejanía os siento cerca y orgullosos, Manolo, Pedro, Paco y Jesús, y a mi

padrino Ramón, gracias. A mi abuela, por cuidarnos con tanto amor, por toda su preocupación,

por sus rezos, por ser tan valiente y luchadora, gracias. Y para los que ya no lo podrán leer,

Manolo, gracias, para Mimi y Justo, ojala os llegue este agradecimiento, porque os llevo dentro

de mí, gracias.

Bueno, y acabo ya, porque casi tengo más agradecimientos que dar, que resultados que mostrar,

y ya lo último.

A TODOS, quiero que comprendáis, que me soy consciente de vuestra ayuda, de vuestra amistad

y de vuestro amor, porque soy quien soy, y se lo que se por vosotros, porque espero tener la

suerte de seguir teniendo que hacer agradecimientos durante muchos años…..

GRACIAS.

ÍNDICE

Índice

- RESUMEN………………………………………………………………………..19

- INTRODUCCIÓN………………………………………………………………..23

1. Desarrollo y maduración de linfocitos T en el timo……………….23

1.1 Etápas tempranas de desarrollo tímico………………………..23

1.2 Selección positiva y toma de linaje……………………………25

1.2.1 Modelos clásicos de selección positiva y toma de linaje..26

1.2.2 Modelo de “kinetic signaling”. ……………………….....27

1.3 Papel de Notch en el desarrollo de linfocitos T……………….30

2. Modulación de los niveles superficiales de TCR…………………..32

2.1 Mecanismos de modulación del TCR superficial……………..34

2.1.1 Diferencias en la dinámica………………………………34

2.1.2 Diferencias en el mecanismo…………………………...35

2.2 Mecanismo del ciclo Constitutivo del TCR…………………....37

2.3 Mecanismos de Modulación del TCR…………………………37

2.3.1 Modulacion del TCR independiente de ligando………...37

2.3.2 Modulación del TCR dependiente de ligando…………..38

2.3.3 Degradación del TCR……………………………………39

3. Proteína adaptadora Numb………………………………………..41

3.1 Estructura y regulación de Numb…………………………….41

3.2 Funciones de Numb…………………………………………...42

3.2.1 Proteína endocítica……………………………………...44

3.2.2 Modulador negativo de Notch…………………………..46

3.3 Numb en el sistema inmune…………………………………..47

- OBJETIVOS……………………………………………………………………53

- MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………57

- RESULTADOS…………………………………………………………………73

Nadia Mª Martín Blanco

1. El dominante negativo para Numb inhibe la función de Numb endógena………..73

2. Análisis fenotípico en timo de ratones TG dnNumb y TG Numb…………………76

2.1 Fenotipo de ratones TG dnNumb……………………………………………….76

2.2 Fenotipo de ratones TG Numb……………………………………………….....76

3. Marcadores de activación en timo………………………………………………….79

3.1 Alteración en marcadores de activación en células DP de ratones TG

dnNumb………………………………………………………………………….79

3.2 Secuestro en timo de células CD8SP en ratones TG dnNumb…………………81

4. Análisis fenotípico de nódulos linfáticos en ratones TG dnNumb y TG Numb……85

4.1 Expresión de proteínas transgénicas en nódulos de ratones TG

dnNumb y TG Numb, modulación de la actividad de Notch ………………….85

4.2 Alteración en la relación CD4/CD8 en nólulos en ratones TG dnNumb……..86

4.3 Alteración en la relación de células Virgenes /Efectoras-Memoria en

ratones TG dnNumb……………………………………………………………...87

5. Modulación de los niveles superficiales de TCR……………………………………90

5.1 Dinámica normal del ciclo constitutivo del TCR en ratones TG dnNumb…….90

5.2 Alterada lamodulación del TCR dependiente de ligando en ratones TG

dnNumb…………………………………………………………………………...92

5.3 Aumento en el número de vesículas de TCR en citoplasma…………………..94

5.4 El dominante negativo de Numb compite con Numb endógena por su

unión al complejo del TCR tras la estimulación de este……………………….96

5.5 Disminución en la colocalización entre Numb y TCR en ratones TG

dnNumb…………………………………………………………………………97

5.6 Numb coinmunoprecipita con CD3ε tras la activacion del TCR por

ligando, y el dominante negativo mantiene esta capacidad……………………99

5.7 Disminución en la tasa de colocalización entre TCR y Cbl en ratones

TG dnNumb……………………………………………………………………..101

5.8 El dominante negativo Numb no es capaz de unirse a la ubiquitin ligasa

Cbl……………………………………………………………………………….102

5.9 Los niveles endógenos de Numb aumentan ligeramente durante la

estimulación…………………………………………………………………….103

Índice

5.10 Normal modulación de los niveles superficiales de TCR en ratones

TG dnNumb………………………………………………………………104

5.11 Alteración en la polarización de Numb hacia la zona de sinapsis……..105

6. Segregación de Numb durante la división de linfocitos T CD4 maduros…...107

- DISCUSIÓN………………………………………………………………………113

- CONCLUSIONES………………………………………………………………....131

- BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………….135

- PUBLICACIONES……………………………………………………………….145

RESUMEN

Resumen

21

Los linfocitos T se generan a partir de precursores de medula ósea que viajan hasta el timo. Es en

este órgano donde pasarán por diferentes fases de desarrollo antes de convertirse en linfocitos T

maduros. Uno de los procesos que los timocitos deben superar durante su maduración es la

selección positiva, durante esta fase se decide el linaje que van a tomar las futuras células

maduras, linfocito T CD4 o linfocito T CD8. El proceso de selección positiva se encuentre regulado

por la unión del TCR con el MHC-I o MHC-II, de esta manera se generan células CD8 o CD4

respectivamente. Uno de los mecanismos que regula la elección de linaje es la señalización a

través de TCR, así las señales generadas por el TCR resultan ser cuantitativamente diferentes

según se haya activado a través de MHC-I o MHC-II. De esta manera, una fuerte señalización a

través de TCR genera células CD4 mientras que señales más débiles producen células CD8.

Uno de los mecanismos por los cuales se puede modular la señalización a través de

TCR es regulando la disponibilidad del receptor en membrana. Los niveles TCR en membrana

dependen de cuatro procesos, internalización, reciclaje, degradación y nueva síntesis. De esta

manera, la alteración en cualquiera de estos procesos puede llevar a una alteración en los niveles

de TCR y en la señalización por éste. Cuando el TCR es activado por la unión a su ligando, se

produce una disminución en los niveles de expresión en superficie que se lleva a cabo por un

aumento en el proceso de internalización y de degradación mediado por la ubiquitin ligasa c-Cbl,

así este mecanismo constituye una manera de extinguir la señal generada por TCR.

La proteína adaptadora Numb participa en procesos de endocitosis y de degradación de

receptores. Anteriormente se ha demostrado que Numb colocaliza con el TCR en la zona de

sinapsis y que es capaz de coinmunoprecipitar junto con c-Cbl. Es por esto que Numb parece ser

un buen candidato para regular la modulación de los niveles de TCR.

Mediante el estudio de ratones TG que expresan un dominante negativo para Numb (TG

dnNumb) hemos podido demostrar que la inhibición de Numb provoca un aumento en los niveles

de señalización por TCR en timocitos que están pasando por el proceso de selección positiva,

debido a esto aparece en ratones TG dnNumb un aumento en la eficiencia de producción de

células CD4 frente a una producción normal de células CD8. Mediante el estudio del mecanismo

de modulación del TCR hemos podido demostrar que en ratones TG dnNumb se encuentra

parcialmente inhibida la degradación del TCR tras activación. Asimismo, hemos descrito que Numb

es capaz de coinmunoprecipitar junto a CD3ε de manera dependiente de activación, y de reclutar


22

a c-Cbl hacia el complejo del TCR con el fin de facilitar su degradación y modular la señalización a

través del receptor.

Con los resultados descritos en este trabajo hemos podido establecer un modelo para la

degradación del TCR de manera dependiente de ligando, en el cual Numb actúa como una

proteína adaptadora en su degradación. Por tanto, Numb parece ser una proteína indispensable

para la correcta modulación de los niveles de señalización por TCR, y por tanto para el desarrollo

de células T

INTRODUCCIÓN

Introducción

25

1. DESARROLLO Y MADURACIÓN DE LINFOCITOS T EN EL TIMO.

1.1 Etapas tempranas de desarrollo tímico.

Los linfocitos, tanto B como T, se desarrollan a partir de precursores comunes que se

generan en la médula ósea. En el caso de los linfocitos T, los precursores migran por los vasos

sanguíneos desde la médula ósea hasta el timo, y es en este órgano donde se producirá la

maduración y desarrollo de los linfocitos T a partir de timocitos. Las diferentes etapas de

desarrollo por las que pasan los timocitos durante su desarrollo antes de convertirse en células

maduras se encuentran muy bien definidas [1, 2].

Cuando los precursores de médula ósea llegan hasta el timo se convierten en timocitos

dobles negativos (DN), que no expresan ni CD4 ni CD8 en su superficie, es en este estadio

cuando las células proliferan para dar lugar al número definitivo de timocitos que conformarán el

timo y que darán lugar a células maduras; dentro de este estadio de DN se pueden diferenciar

cuatro etapas de desarrollo que se distinguen entre si por la expresión de CD25 y de CD44 en

superficie, así se denominan células DN1 a timocitos CD44+ CD25¯ , DN2 a CD44+ CD25+, DN3 a

CD44¯ CD25+ y DN4 a timocitos CD44¯ CD25¯ . En el estadio de DN las células pueden

diferenciarse hacia célula T γδ o hacia célula T αβ [3]. Estas últimas comienzan en el estadio DN3

a expresar el receptor de membrana pre-TCR en su superficie, formado por una cadena pre-Tα

que no sufre reordenamiento somático, y por una cadena β que sí ha sufrido reordenamiento, y

que por tanto será la cadena β definitiva. En esta etapa es necesaria la activación de los genes

RAG 1 y RAG 2 que intervienen en el reordenamiento de las cadenas del TCR. En este estadio los

timocitos DN3 sufren lo que se denomina β-selección. Así, tanto fallos en el reordenamiento de la

cadena β, como fallos en la función de segundos mensajeros que intervienen en la señalización

por pre-TCR, llevan al aumento del número de DN3, debido a un bloqueo del desarrollo [2] . Otro

proceso importante que ocurre en los timocitos durante la selección β, y que es necesario para el

paso de DN a DP, es la modulación de la expresión del pre-TCR. Esta modulación, al contrario que

la que se da en el TCR en células maduras, es independiente de estimulación, se produce por

tanto de forma constitutiva [4, 5]. La degradación del pre-TCR provoca una disminución de su

expresión en superficie, mas tarde comienza el reordenamiento de la cadena α del TCR, y la

expresión en superficie del TCR definitivo; a su vez, los timocitos, comienzan a expresar CD4 y


26

CD8, pasando a un estadio de desarrollo denominado doble positivo (DP) y son estas células DP

las que constituyen la mayor población del timo tras el nacimiento del individuo.

Las células dobles positivas (DP) acabarán dando lugar a linfocitos T CD4 o CD8

maduros, que más tarde migrarán hacia órganos periféricos. Antes de que ocurra esto las células

DP deberán pasar por dos tipos de selección: la selección positiva y la selección negativa.(Fig 1).

Figura 1: Etapas de desarrollo de timocitos.

Diferentes etapas de desarrollo de células T en timo y

localización de cada una de ellas, en corteza hasta el

estadio de DP y en médula en el estadio de SP.

Introducción

27

1.2 Selección positiva y toma de linaje

En este estadio, solo las células DP cuyos TCRs presenten la avidez y afinidad correcta

por el complejo MHC sobrevivirán. Los timocitos que no tengan afinidad por el complejo MHC-

péptido morirán por falta de estimulación, en lo que se denomina muerte por negligencia; mientras

que los timocitos capaces de reconocer con baja afinidad al complejo MHC serán positivamente

seleccionados. De esta manera, si el TCR es capaz de reconocer a MHC de clase I, las células DP

se diferenciarán hacia célula CD8SP, mientras que las células cuyo TCR sea capaz de reconocer

a MHC de clase II se diferenciarán hacia células CD4SP. Más tarde los timocitos que superan la

selección positiva pasan por el proceso de selección negativa, en este caso los timocitos que

presentan una alta avidez por el complejo MHC-péptido propio sufrirán una fuerte estimulación lo

que les lleva a una muerte por apostosis. Este proceso evita que timocitos susceptibles de ser

autoreactivos maduren y pasen a órganos periféricos. Por tanto, solo los linfocitos que presentan

un grado de avidez y afinidad óptimo sobreviven y se diferencian hacia célula madura.

El proceso de selección positiva es crucial en el desarrollo intratímico de las células T, no

solo porque determina la especificidad de las células Tαβ en la periferia, sino porque también

controla la especialización de las células T, en CD4 T colaboradora y en CD8 T citotóxica,

dependiendo de si su TCR reconoce MHC de clase II o I respectivamente, además esta toma de

linaje entre CD4 y CD8 determina la relación entre células CD4/CD8. Dentro del estadio de DP,

las células pasan por diferentes fases de desarrollo. Tras la estimulación por TCR las células

comienzan a expresar altos niveles de CD69 [6] en superficie, en los estadios más tempranos las

células son CD4+ CD8+ TCRlow y CD69- . En una etapa posterior en la que aumenta la expresión

de TCR, las células pasan a ser CD4+, CD8+, CD69+ y TCRhi, simultáneamente también aparece

en esta fase la expresión de CD5 [7]. Tras este estadio irán poco a poco perdiendo la expresión de

CD69, así como de uno de los co-receptores CD4 o CD8, hasta llegar al estadio de simple positiva,

SP. Por tanto, la expresión de CD69 y de CD5 se considera como marcadores de células que

están dentro de la etapa de selección positiva.


28

1.2.1 Modelos clásicos de selección positiva y toma de linaje.

Clásicamente existen dos modelos que explican el proceso de toma de linaje de las

células DP hacia CD4 o CD8; estos son conocidos con el nombre de modelo Instructivo y modelo

Estocástico.

Modelo Estocástico: Defiende que el paso de células DP a SP se desarrolla en dos

etapas, una primera etapa en la que la activación del TCR lleva a la disminución de los niveles de

expresión de uno de los receptores de forma aleatoria, dando lugar a unos intermediarios

comunes, y un segundo paso en el que solamente las células que hayan disminuido los niveles

superficiales del co-receptor correcto sobrevivirán y pasarán a SP. Es decir, si la activación se ha

realizado mediante el MHC-II y la modulación afecta a CD4 esta modulación, aunque aleatoria, es

correcta, sin embargo las células que disminuyeron los niveles superficiales del co-receptor

incorrecto, en este caso CD8, morirán por falta de estimulación, y al contrario se producirá cuando

la estimulación se lleve a cabo por MHC-I. El modelo Estocástico se basa en el hecho de que

ratones β2m knockout (deficientes en MHC-I) contiene células CD8hiCD4medium, y defienden que

este estadio de desarrollo conforma los precursores inmediatos de CD8SP, apareciendo así

células que deben desarrollarse a partir de la unión TCR-MHC I; y que ratones deficientes para

MHC-II contienen células CD4highCD8medium, precursoras de CD4SP [8, 9], por tanto el linaje que

toman las células DP es independiente de la especificidad del TCR, según este modelo. Existen

dos importantes contradicciones en este modelo, en primer lugar, el modelo Estocástico predice

un 50% de eficiencia de la selección positiva, ya que existe el 50% de probabilidades de modular

el co-receptor adecuado, sin embargo, por trabajos posteriores se conoce que la eficiencia de la

selección positiva es de un 90% [10]. En segundo lugar más tarde se comprobó que las células

CD4highCD8medium, son precursores tanto de CD4 como de CD8 [6-8].

Modelo Instructivo: El modelo instructivo defiende que diferentes señales son

generadas por la activación de TCR+CD4 o por la activación de TCR+CD8, a partir de la unión con

clase II o clase I respectivamente. En este caso la visión más aceptada es la propuesta por Robey

Fowlkes, en la que se defiende que las señales generadas son cuantitativamente pero no

cualitativamente diferentes, así difieren en la intensidad de señal. De esta manera, la activación de

TCR+CD4 por MHC-II genera una fuerte intensidad de señal que llevaría al desarrollo de células

CD4, mientras que la activación de TCR+CD8 por MHC-I lleva a señales con intensidad más baja

Introducción

29

dando lugar a células CD8 [11-13]. Esta teoría se basa en el hecho de que el co-receptor CD4, a

diferencia del CD8 presenta un mayor número de motivos de unión de Lck [14], siendo Lck una

tirosinquinasa encargada de amplificar la cascada de señalización del TCR. La mayoría de los

trabajos realizados por Robey y colaboradores se basan en la manipulación de los dominios

intracelulares de los co-receptores CD4 y CD8, o bien en la alteración de los niveles superficiales

de estos [15-17].

No solo los experimentos realizados por Robey avalan este modelo, otros grupos han

demostrado que manipulaciones de la señalización por TCR alteran el linaje de las DP, por

ejemplo manipulaciones directas de la actividad de Lck [18, 19] , de MAPK [20], alteraciones en la

cadena ζ del TCR [21], o en CD5 [22]; estas alteraciones provocan que en ratones que expresan

TCRs específicos para MHC I o II se desarrollen células CD8 o CD4 respectivamente [19].

Como alternativa a estos modelos clásicos aparece otro modelo denominado “Kinetic

Signaling”[23], que se presenta como una modificación del modelo instructivo propuesto hasta

ahora.

1.2.2 Modelo de “Kinetic signaling”.

Los dos modelos anteriormente definidos se basan en las mismas presunciones. En

primer lugar se basan en que la selección positiva y la toma de linaje ocurren simultáneamente en

células DP que han sido estimuladas a través de su TCR, y en segundo lugar presuponen que la

toma de linaje termina cuando se produce el silenciamiento de uno de los co-receptores, siendo

este fenómeno irreversible. Sin embargo, el modelo de la señalización cinética de basa en

diferentes presunciones.

Este modelo defiende que la selección positiva y la toma de linaje son dos procesos

independientes que no se desarrollan simultáneamente sino consecutivamente, así la selección

positiva se desarrolla en el estadio de DP y este fenómeno si sería dependiente de la intensidad de

señal, mientras que la toma de linaje se decide en un estadio posterior de desarrollo denominado

CD4highCD8medium, por tanto en este estadio, las células a pesar de haber disminuido sus niveles

superficiales de CD8 aún son capaces de diferenciarse hacia los dos linajes, manteniendo su


30

capacidad de diferenciación [24-29]. De esta manera las células DP que han sido positivamente

seleccionadas tras la activación de su TCR+co-receptor con el MHC específico se convierten en

células CD4highCD8medium [29-31]. Si la señal por TCR persiste, estos intermediarios se

diferenciaran hacia CD4SP, produciéndose un silenciamiento definitivo del co-receptor CD8. Sin

embargo, si la señal por TCR cesa, se diferenciaran hacia células CD8, en este caso cesará la

expresión de CD4 y se reanudará la expresión de CD8 en un proceso denominado “coreceptor

reversal” convirtiéndose en células CD4medium CD8high[32] (Fig 2).

Figura 2: Diferentes etapas de desarrollo de timocitos según

la expresión de CD4 y CD8, los colores indican el posible

linaje con el que están comprometidos los timocitos, naranja

para CD4 y azul para CD8.

. Por tanto, según este modelo, el linaje hacia el cual se diferencian los precursores

depende de la duración de la señalización por TCR y no de la intensidad, como defiende el modelo

instructivo (Fig3), en este caso la intensidad de señal regula solamente la eficiencia de la selección

positiva tanto de células CD4 como de células CD8. Este hecho explicaría que la eficiencia de la

Introducción

31

selección positiva de CD4 sea más elevado que la de CD8 debido al aumento en el número de

sitios de unión a Lck que presenta el co-receptor CD4, hecho que se produce de forma natural

durante el desarrollo de linfocitos T.

Pero, ¿de qué depende que la señalización por TCR persista o cese?. Puesto que la

disminución de los niveles superficiales de CD8 se realiza independientemente del linaje a seguir,

en el caso en el que el TCR haya sido estimulado por MHC-I esta disminución en el CD8

superficial lleva a un cese en la señalización por TCR, puesto que en este caso el co-receptor CD8

estaba siendo estimulado y estaba participando en la señalización por TCR, en el caso opuesto,

cuando el TCR es activado por MHC-II la disminución de los niveles superficiales de CD8 no afecta

a la señalización por TCR, por tanto esta persiste.

La importancia de la señalización por TCR dentro de la selección positiva es un fenómeno

ampliamente aceptado, pero sigue existiendo controversia acerca de la diferencia entre el papel de

la intensidad de señalización y del tiempo que dura la señalización, en cualquier caso ambas

teorías se pueden englobar dentro del Modelo Instructivo de selección positiva

Pero evidentemente, se trate de uno u otro modelo, la conclusión que se puede sacar es

que la señalización por TCR juega un papel determinante en la selección positiva y en la toma de

linaje de los timocitos, por tanto cualquier alteración en la señalización puede causar alteraciones

en el linaje CD4/CD8 .


32

Figura 3: Esquema del modelo de la señalización cinética, en el que se defiende

que la toma de linaje depende de la duración de la señalización por TCR.

1.3 Papel de Notch en el desarrollo de linfocitos T.

Otro de los receptores, a parte del TCR, que se ha propuesto para intervenir en el

desarrollo de linfocitos T es el receptor de membrana Notch. Notch ha sido altamente estudiado

como un determinante del destino de desarrollo y diferenciación celular, no solo dentro del

desarrollo del sistema inmune, sino que también en el desarrollo de otros sistemas.

Numerosos trabajos han demostrado que la activación de Notch en los progenitores que

viajan desde médula produce el desarrollo de células T frente a B [33], y viceversa, la inactivación

de Notch provoca un aumento en la producción de células B [34, 35]. En el estadio de DN3 Notch

participa en el desarrollo de células Tαβ versus Tγδ, se ha demostrado que la activación de Notch

es necesaria para la expresión de pre-TCRα y para el reordenamiento Vβ-DJβ [36], por tanto la

activación de Notch es necesaria para el desarrollo de células Tαβ frente a Tγδ [37]. El punto que

ha generado más controversia en el papel de Notch dentro del desarrollo en el sistema inmune, es

su función en la diferenciación de células DP hacia CD4 o CD8, trabajos realizados por Robey y

colaboradores defienden que la activación de Notch es necesaria para el desarrollo de células

CD8, de esta manera demostraron que la sobreactivación de Noch mediante la sobreexpresión de

su dominio intracelular producía la diferenciación de células CD8 en ratones deficientes en MHC-I

[38, 39] , sin embargo otros trabajos han visto que la sobreactivación de Notch lleva a un aumento

en la maduración de células SP tanto CD4 como CD8, produciéndose un acúmulo de estas en el

timo, y que no participa en la toma de linaje CD4/CD8 [40], en relación a esto la inactivación de

Notch tampoco provoca alteraciones en el desarrollo de células CD4 o CD8 según el trabajo de

Wolfer y colaboradores [41] . Recientemente se ha visto que el papel de Notch dentro de la

diferenciación CD4/CD8 está relacionado con la señalización a través de TCR [42], así la

activación de Notch lleva a una disminución en los niveles de señalización por TCR, esta

disminución en la señalización por TCR produciría el desarrollo de células CD8 frente a CD4 según

el Modelo Instructivo de selección positiva.

Introducción

33

Figura 4: Papel del receptor Notch en el desarrollo de timocitos.

Es posible que la determinación del linaje hacia CD8 o hacia CD4 este determinada no

por uno de los receptores, TCR o Notch, sino por una actuación conjunta que tenga como fin un

equilibrio entre ambas señalizaciones que lleve a la elección correcta del linaje.


34

2. MODULACIÓN DE LOS NIVELES SUPERFICIALES DE TCR.

Los linfocitos T presentan en su superficie un receptor denominado TCR, el TCR se

encarga de reconocer los antígenos unidos a MHC en la superficie de células presentadoras de

antígenos. El TCR está constituido por una cadena α y otra β, que son las encargadas de unirse al

complejo péptido-MHC además el TCR se asocia con diferentes cadenas CD3 para formar el

complejo TCR/CD3, existen cuatro tipos de cadenas de CD3 denominadas ζ, ε, γ y δ. Las

cadenas del TCR se asocian con las cadenas CD3 que forman tres dímeros diferentes, ζζ, εγ y εδ.

Una vez que el TCR es estimulado por su unión al ligando la señal es transmitida hasta las

cadenas de CD3, esta estimulación lleva a la fosforilación de las secuencias ITAMs presentes en

los dominios citoplasmáticos de las cadenas CD3, por parte de la familia de tirosin quinasas Src

(Lck y Fyn); los ITAMs fosforilados constituyen un sitio de unión para proteínas con dominios SH2,

tales como ZAP-70, a partir de aquí se genera una cascada de transducción de señales generadas

por la activación del TCR.

El TCR que se expresa en la superficie celular de los linfocitos T está continuamente

siendo internalizado o endocitado hacia el interior celular para posteriormente reciclarse a la

membrana, este proceso se realiza de manera constitutiva sin necesidad de estímulo, además de

forma constitutiva también se pueden producir otros dos fenómenos que regulan los niveles de

TCR, como la degradación del TCR internalizado y el aporte de nuevo TCR sintetizado hacia la

membrana [43]. Por tanto, los niveles superficiales de TCR dependen de la tasa de internalización,

de las tasas de degradación, de reciclaje y de de síntesis de novo (Fig 5); pero de manera

constitutiva los niveles superficiales de TCR se mantienen constantes. Así, la mayoría del TCR

total en células en reposo se encuentra en la superficie celular, frente a una pequeña fracción

intracelular que puede estar en diferentes compartimentos, endosomas, lisosomas o vesículas de

nueva síntesis. Este proceso se denomina ciclo constitutivo del TCR.

Introducción

35

Figura 5: Ciclo del TCR. Diferentes

compartimentos en los que se puede encontrar

el TCR.

Cuando el TCR es activado por su unión a MHC-péptido, se produce una polarización

tanto del TCR como de otras proteínas hacia el punto de estímulo, este zona es conocida como

sinapsis inmunológica. Tras la formación de este complejo se produce una rápida disminución de

los niveles superficiales de TCR, este fenómeno es conocido como “down-modulation”, o

modulación del TCR, y su objetivo parece ser la modulación de los niveles de señalización por

TCR, participando así en una correcta activación de las células T tras la activación vía TCR. La

modulación del TCR puede llevarse a cabo de una manera dependiente o independiente de

ligando. En el primer caso se origina por su unión al complejo MHC-péptido, o bien por métodos in

vitro mediante la estimulación con anticuerpos frente a TCR o CD3, en el segundo caso la

modulación o disminución del TCR expresado en superficie se origina in vitro por la activación

celular mediante el empleo de ésteres de forbol, como el PMA (PMA + Ionomicina).

Si atendemos al esquema del ciclo del TCR anteriormente descrito, la disminución del

TCR superficial se puede producir por un incremento en la tasa de internalización y/o


36

degradación, o bien por una disminución de la tasa de reciclaje y/o síntesis de novo, o bien por

una conjunción de los cuatro fenómenos.

2.1 Mecanismos de modulación del TCR superficial.

El ciclo o tráfico celular del TCR es diferente en células no activadas y en células

activadas, estas diferencias son en cuanto a su dinámica y en cuanto a su mecanismo.

2.1.1 Diferencias en la dinámica.

En cuanto a su dinámica, en el caso del ciclo constitutivo del TCR existe un equilibrio

entre la cantidad de TCR retirado de la membrana y la cantidad de TCR aportado a esta, de tal

manera que la cantidad de TCR en membrana se mantiene constante con el tiempo, así mientras

que las células se encuentran en reposo, el 85% del TCR se encuentra en membrana y sólo un

15% aparece en compartimentos intracelulares [44]. En el caso del ciclo constitutivo, diferentes

grupos han determinado una tasa constante de degradación y de síntesis de novo del TCR en

0,0011min-1, frente a una tasa de internalización de 0,012min-1 y una de reciclaje de 0,055min-1,

estos indican que la tasa de degradación es muy baja en células sin activar [45]. El papel del ciclo

constitutivo del TCR no se conoce, pero podría representar un mecanismo por el cual se someta

al receptor a un “control de calidad”, de esta manera se ha visto que complejos con cadenas

CD3ζ defectuosas o ausentes sufren una internalización más rápida que cadenas en perfecto

estado [46], tal vez cuando la cadena ζ se encuentra en perfecto estado se reduce la accesibilidad

de la maquinaria de internalización. Otra posible función para el ciclo constitutivo del TCR sería

asegurarse la disponibilidad de un pool de TCR intracelular que pueda ser reexpresado en la zona

de estimulación en cualquier momento.

Sin embargo, cuando se produce la activación vía TCR, los niveles superficiales decrecen

drásticamente. La activación del TCR lleva a un aumento en la tasa de internalización y de

degradación respecto a células no estimuladas , así diferentes grupos han observado un aumento

de 3 a 4 veces en la tasa de internalización del TCR tras su activación [47], y un aumento en la

tasa de degradación de 3 veces [48, 49], aunque este aumento puede variar según se trate de

una u otra cadena del TCR, ya que diversos grupos defienden que la dinámica de degradación es

Introducción

37

diferente para cada cadena [50]. Otra posibilidad que también ha sido contemplada por otros

autores es que la tasa de internalización se mantenga constante y que sea solamente un aumento

en degradación y una disminución en reciclaje lo que produzca la modulación del TCR superficial

[51] , de cualquier modo la modulación del TCR dependiente de ligando debe de ser producida

por un aumento en la tasa de degradación del TCR. De esta manera, mientras que en células sin

activar la vida media del TCR es calculada en 10 horas, tras la activación la vida media del TCR

disminuye hasta 3,5 horas [49].

2.1.2 Diferencias en el mecanismo.

La internalización de receptores, en general, se encuentra mediada por la presencia de

diferentes motivos de internalización en los dominios citosólicos de los receptores. Estos motivos

pueden ser de dos tipos, motivos de tirosina del tipo YXXØ o NPXY y motivos de dileucina

(D/L)XXXL(L/I) . En el caso del TCR las cadenas CD3 γ, ζ, ε y δ presentan motivos de tirosina, y

las cadenas γ y δ contienes motivos de dileucina, cuando estos motivos se encuentran accesibles

van a ser los encargados de reclutar las proteínas necesarias para activar la maquinaria de

internalización.

Tradicionalmente se han descrito dos mecanismos diferentes para la modulación del

TCR. De esta manera el primer mecanismo lleva a la internalización y reciclaje de nuevo a la

membrana, mientras que el segundo mecanismo lleva a la internalización y degradación del TCR.

- Mecanismo de Internalización-Reciclaje: El mecanismo que lleva a la

internalización y reciclaje del TCR es dependiente de la proteín-kinasa C, así la PKC se encarga

de fosforilar la Serina 126 de la cadena CD3γ, esta fosforilación probablemente cause un cambio

conformacional en la cadena CD3γ que provocaría que el motivo de dileucina presente en esta

cadena [52] quede accesible para su unión al complejo AP-2 [53, 54], este complejo es capaz de

reclutar moléculas de clatrina que conformaran las vesículas de internalización. De esta manera,

la desfosforilación de la serina 126 por Serin/Treonin fosfatasas es necesaria para el reciclaje del

TCR de nuevo a la membrana [55]. Este mecanismo actúa durante el Ciclo Constitutivo del TCR

asi como durante la Modulacion del TCR dependiente e independiente de ligando.


38

- Mecanismo de Internalización y Degradación: Al contrario que el mecanismo

anterior, este mecanismo de Internalización y Degradación aparece tras la estimulación por

ligando de TCR. En líneas generales se considera dependiente de Lck, ZAP-70 y Cbl, así la

activación del TCR lleva a la fosforilación de las secuencias ITAM de sus dominios

citoplasmáticos por la actuación de Lck [56, 57], los ITAMs fosforilados constituyen el sitio de

unión de ZAP-70 [58]. El proceso de degradación de la cadena ζ se lleva a cabo por un proceso

de ubiquitinización mediado por la ubiquitin ligasa Cbl [48, 59], debido a que no se ha

demostrado una asociación directa entre la cadena ζ y Cbl, o entre otras cadenas del TCR y Cbl,

la asociación de Cbl al complejo del TCR se debe realizar mediante la actuación de una proteína

adaptadora que actúe como un puente de unión entre el complejo del TCR y Cbl, como proteína

adaptadora se ha propuesto a ZAP-70.

Figura 6: Mecanismos de modulación del TCR.

Por tanto se han descrito dos mecanismos diferentes para el tráfico del TCR, estos dos

mecanismos coexistan tanto durante el ciclo constitutivo del TCR como durante la modulación del

TCR ya sea esta dependiente de ligando o independiente de ligando. Según las condiciones

celulares será uno u otro mecanismo en que predomine.

Introducción

39

2.2 Mecanismo del Ciclo constitutivo del TCR.

La internalización constitutiva del TCR se lleva a cabo por el mecanismo de

Internalización y Reciclaje del TCR anteriormente descrito. En este caso, la internalización

constitutiva parece ser independiente de la actividad PKC y de la Serina 126, pero dependiente de

los motivos de diLeucina de la cadena CD3γ, estos datos indican que los motivos de diLeucina

de la cadena CD3γ deben estar parcialmente expuestos a su unión con AP-2 y clatrina en células

no estimuladas, para su posterior internalización [60].

Dentro del ciclo constitutivo del TCR, además de producirse la internalización y reciclaje

del receptor, también aparece una pequeña tasa de degradación. Puesto que el mecanismo

regulado por la cadena CD3γ no lleva a la degradación del receptor, en células no estimuladas

debe existir una cierta activación del mecanismo de degradación del TCR; es posible que esta

degradación se deba a una cierta actividad basal de Lck [49], o bien podría ser causada por una

conexión entre el ciclo de reciclaje y el ciclo de degradación en lisosomas. De esta manera, se ha

comprobado que TCRs cuyas cadenas ζ son defectuosas son degradados de manera constitutiva

más rápidamente, así se propone un modelo en el cual la proteólisis de la cadena ζ enmascara

los motivos de la cadena CD3γ, llevando al TCR desde el ciclo de reciclaje hasta el de

degradación [46, 49, 61].

2.3 Mecanismos de Modulación del TCR.

La modulación del TCR o disminución de los niveles superficiales se produce tras la

activación celular, esta activación puede ser producida farmacológicamente mediante la utilización

de ésteres de forbol como el PMA, o mediante la activación por ligando del TCR. De esta manera,

la modulación del TCR se puede producir de manera independiente o dependiente de ligando.

2.3.1 Modulación del TCR independiente de ligando.

La modulación del TCR independiente de ligando se lleva a cabo por el mecanismo de

Internalización- Reciclaje del TCR. Así, tras la activación celular con esteres de forbol se produce


40

un aumento en la actividad PKC que llevaría a la fosforilación de la Serina 126. Esta fosforilación

probablemente provoque un aumento en los niveles de accesibilidad del motivo de diLeucina,

aumentando así la tasa de internalización, en este caso la internalización si aparece para ser

dependiente de Serina 126 y del motivo de diLeucina. Así, la activación de PKC mediante el uso

de esteres de forbol, lleva a un acumulo del TCR internalizado en vesículas de reciclaje pero no

aumenta la tasa de degradación del TCR [62].

2.3.2 Modulación del TCR dependiente de ligando.

Un segundo mecanismo se produce tras la activación del TCR por ligando, este

mecanismo lleva a la internalización y degradación del receptor en lisosomas. En la

internalización del TCR tras su estimulación con ligando existe una gran controversia acerca de si

es dependiente o no de la actividad protein tirosin-quinasa PTK . La internalización del TCR tras

su activación por ligando necesita de un mecanismo aparentemente más complicado que en el

caso de la internalización constitutiva, de esta manera son necesarios diferentes motivos de

internalización localizados en distintas cadenas del TCR [62, 63]. Cuando se produce la activación

del TCR por ligando, no todos los complejos del TCR se encuentran directamente asociados con

su ligando, pero sí todos los complejos van a ser modulados, estén o no unidos directamente a su

ligando. Respecto a esto, algunos estudios indican que la modulación del TCR unido a ligando y

el no unido se desarrollan por mecanismos diferentes, así la modulación del TCR unido a ligando

sería independiente de la actividad PTK, sin embargo, la modulación del TCR no unido a ligando

sería dependiente de la actividad de PTK. De esta manera según la dosis de ligando utilizada

para la estimulación variará la cantidad de TCR unido directamente a ligando y con esto la

dependencia o independencia de PTK [64]. De esta manera, el TCR no unido directamente a

ligando presenta una modulación dependiente de PKC, del motivo de diLeucina presente en la

cadena CD3γ y de la fosforilación de la Serina 126 de la misma cadena, produciéndose una

internalización mediada por clatrina [65, 66]. De esta manera la estimulación del TCR por parte

del ligando provoca una activación de PTKs que activan PKC y desencadenan la modulación del

TCR no acoplado a ligando. Sin embargo, la modulación de los TCRs directamente acoplados al

ligando no se ve afectada cuando se produce la inhibición de PTKs, PKC o de endocitosis

dependiente de clatrina [64], por tanto es posible que la internalización con este tipo de ligandos

se lleve a cabo por un mecanismo independiente de clatrina. Este puede ser el motivo por el cual

Introducción

41

existe tanta controversia acerca de la dependencia de PTK o no de la modulación del TCR tras

estimulación con ligando, ya que diferentes dosis de anticuerpo a la hora de estimular las células

produce diferentes requerimientos de la actividad PTK, de esta manera una alta dosis de

anticuerpo disminuiría los requerimientos de actividad PTK, puesto que aumentaría el número de

receptores unidos directamente a ligando.

2.3.3. Degradación de TCR.

Para que se produzca la modulación del TCR tras la activación por ligando es necesario

que se vea aumentada la tasa de degradación del TCR. La degradación del TCR es mediada por

un proceso de ubiquinización llevado a cabo por la ubiquitin ligasa Cbl. ZAP-70 se ha a pesar de

ser una PTK, se ha propuesto como la encargada de reclutar Cbl al complejo del TCR, así

alteraciones que llevan a inhibición en la formación del complejo TCR-ZAP-70-Cbl, llevan a una

disminución en los niveles de ubiquitinización de la cadena ζ, y en la degradación de esta; sin

embargo esta disminución en los niveles de ubiquitinización y de degradación no es total, por

tanto otras proteínas adaptadoras podrían estar participando en este proceso [58, 67]. Por otro

lado, en células con baja actividad de Lck también se ha observado una disminución en la

degradación de la cadena ζ [56, 57] , aunque Cbl también es capaz de asociarse a Lck, y este a

los correceptores CD4 y CD8, probablemente la inhibición en la degradación de la cadena ζ

venga determinada por la actividad quinasa de Lck, ya que es esta la encargada de fosforilar los

motivos ITAMs de la cadena ζ, y esta fosforilación resulta indispensable para la unión de ZAP-70

a ζ, así ratones KO para Lck presentan altos niveles de TCR en la superficie de células DP [68].

Sin embargo alteraciones en ZAP-70 y en Lck no afectan a la modulación del TCR

superficial cuando se utilizan altas dosis de estimulación, efecto que coincide con el hecho de que

la modulación del TCR se lleva a cabo por dos mecanismos diferentes según este el receptor

asociado directamente a ligando o no; de esta manera células con baja actividad de Lck son

capaces de internalizar TCR, apareciendo el TCR retenido en endosomas citoplasmáticos, que no

son capaces de pasar a lisosomas para la degradación del complejo [69].

Otra proteína que ha sido implicada en este proceso es SLAP, que es capaz de

asociarse a la cadena ζ y a Cbl, de esta manera, ratones KO para SLAP presentan una aumento


42

de TCR superficial en células DP debido a la inhibición en la degradación de la cadena ζ, SLAP

es capaz de asociarse a la cadena ζ de manera dependiente de fosforilación, por tanto parce que

la actividad de SLAP es dependiente de Lck. En ratones KO para SLAP se observa una normal

internalización del complejo del TCR, sin embargo el TCR internalizado queda retenido en

vesículas de internalización que mas tardes son recicladas de nuevo a la membrana por falta de

degradación [70, 71]. En este caso despista el hecho de que SLAP participa en la degradación del

TCR de manera independiente de ligando, y especialmente en timocitos que se encuentran en

una fase de preselección positiva, y no en células SP de timo o en células maduras de periferia,

donde la expresión de SLAP es mucho más moderada, de esta manera en ratones KO SLAP no

se lleva a cabo la disminución de los niveles superficiales de TCR durante la transición de célula

DN a DP [72]. Debido a esto es posible que la actividad de SLAP dependa de la actividad basal

de Lck que se produce en células DP de timocitos [73].

Recientemente se publicaba un trabajo en el que se proponía un modelo para la

degradación del TCR durante la etapa de pre-selección positiva, según este trabajo, la

degradación constitutiva de la cadena ζ es dependiente de una secuencia rica en prolina (PRS)

de la cadena CD3ε, esta secuencia es capaz de reclutar a una proteína adaptadora denominada

Nck, en este trabajo trabajan con ratones en los que se ha sustituido la secuencia RPPPVPNP

(PRS) de la cadena CD3ε, en los que se observa un fenotipo similar a los ratones KO para SLAP;

proponen un modelo por en el cual la zona PRS recluta a la proteína Nck, que actúa como puente

de unión con Lck, necesaria para la fosforilación de la cadena ζ, unión de SLAP y para la

degradación de la cadena ζ [74]. Puesto que la degradación descrita se realiza de manera

constitutiva, este modelo implica que la región PRS se encuentra accesible de manera

constitutiva, hecho que contradice numerosos trabajos realizados anteriormente. A este respecto

anteriormente se había demostrado por diferentes procedimientos que Nck se une a CD3ε de

manera dependiente de activación por ligando, así la unión del TCR a ligando provoca un cambio

conformacional que lleva a la exposición de la zona PRS de CD3ε y a la unión de Nck [75-77]

Por tanto, durante la degradación del TCR dependiente de ligando ZAP-70 actúa

reclutando a Cbl hacia el complejo del TCR, pero los trabajos realizados, concluyen que otras

proteínas adaptadoras pueden estar implicadas en este proceso, ya que la inhibición de ZAP-70

no provoca la inhibición total de la degradación del TCR. En este caso no es SLAP la responsable

Introducción

43

de reclutar a Cbl puesto que SLAP participa en una degradación independiente de ligando, y

además no es expresada ni en timocitos SP ni en células de periferia.

4.PROTEÍNA ADAPTADORA NUMB.

4.1 Estructura y regulación de Numb.

Numb es una proteína adaptadora de localización intracelular, con potencial para unirse

a un gran número de proteínas por diferentes motivos presentes en su estructura. Así, en su

extremo amino-terminal posee un dominio de unión a fosfotirosina o PTB y en el extremo carboxi-

terminal una zona rica en prolina o PRR que es capaz de unirse a motivos SH3. Numb contiene

también en el extremo carboxi-terminal motivos altamente conservados como DPF (aspartate-

proline-phenylalanine) y NPF (asparagine-proline-phenylalanine), que le permiten interaccionar

con motivos EH. Tanto estos dos últimos motivos, como el PTB, se encuentran altamente

conservados en todas las isoformas de Numb en vertebrados, así como en su homólogo Numblike

[78].

Existen cuatro isoformas de Numb que se designan según su peso molecular [79]; p65,

p66, p71 y p72 (Fig 8); las cuatro informas se diferencian entre sí por:

- Ausencia o presencia de un inserto de 11 aminoácidos dentro del PTB, PTBi.

- Ausencia o presencia de un inserto de 49 aminoácidos dentro de PRR, PRRi.

Figura 8: Isoformas de Numb.


44

La presencia de PTBi confiere la capacidad de unirse a la membrana plasmática, por

tanto las isoformas p66 y p72 se encuentran en esta localización, mientras que las isoformas p65 y

p71 se encuentran en el citoplasma o en el núcleo. La localización de Numblike es también

citoplasmática. La expresión de las diferentes isoformas de Numb varía de un tejido a otro, así

dentro del timo las isoformas más expresadas son p66 y p65 [79], aunque funcionalmente las 4

isoformas son equivalentes en términos de división asimétrica.

Los dominios PTB aparecen en un gran número de proteínas, que actúan como

proteínas adaptadoras en diversos procesos, tales como desarrollo neuronal, inmunidad,

crecimiento celular o homeostasis de tejidos. Los PTBs se unen a proteínas por secuencias

NPXY, según la necesidad de que la tirosina esté fosforilados o no, los PTBs se pueden dividir en

dos subgrupos, PTBs dependientes de fosforilación o familia IRS-like, y PTBs independientes de

fosforilación o familia Dab-like. Dentro de esta familia se encuentra Numb, y se ha descrito que su

PTB presenta una gran versatilidad para unirse a diferentes secuencias tanto fosforiladas como

sin fosforirilar, de esta manera es capaz de asociarse a secuencias de tipo NPAY, AYIGPpYL y

GFSNMSFEDFP [80-82], algunas de las cuales difieren de la secuencia canónica de unión de los

PTB. Actualmente las proteínas que contienen PTB se pueden dividir en tres familias según su

estructura y función, las familias Shc e IRS que están principalmente implicadas en procesos de

transducción de señales desde RTKs (receptor tyrosine kinases) y receptores de citoquinas, y la

familia Dab que intervienen en procesos de endocitosis y exocitosis de receptores de membrana;

dentro de este último grupo se encuentran Numb, Numblike, Dab2 y ARH. De esta manera ARH

participa en la modulación del receptor LDLR (low density lipoprotein receptor), asociado a

mutaciones en el dominio PTB de ARH aparece el desarrollo de la enfermedad denominada

“Autosomal Recessive Hipercholesterolemia”, en pacientes con esta enfermedad se ha observado

que mutaciones en el dominio PTB de ARH llevan a una falta de internalización y degradación del

receptor LDLR, y la función del receptor pude ser restaurada mediante la expresión retroviral de

ARH1 [83-85]. El porcentaje de similitud del PTB de Numb con proteínas de su mismo grupo es

relativamente elevado, sin embargo, este porcentaje disminuye si se compara con proteínas del

tipo Shc. (Tabla 1) [86].

Introducción

45

% similitud

Numblike 68,2%

Dab2 43,9%

ARH 41,2%

SHC 25,7%

Tabla1: Porcentaje de similitud del PTB de Numb con otros PTB.

La actividad de Numb es regulada por procesos de fosforilación y desfosforilación

mediada por quinasas dependientes de Ca2+/Calmodulina [87], así tres quinasas diferentes han

sido implicadas en la fosforilación de Numb. Nak o quinasa asociada a Numb, es una

Serin/Treonin quinasa que es capaz de unirse al PTB de Numb de forma muy específica, así Nak

es capaz de fosforilar a Numb, llevando esta fosforilación a una inhibición de Numb, ya que

aumentos en la expresión de Nak llevan a un aumento en la fosforilación de Numb y al desarrollo

de un fenotipo igual que el que se desarrolla con la inhibición de Numb durante el desarrollo de

los órganos sensoriales externos en Drosophila [80]. Además se ha demostrado que la

fosforilación de Numb lleva a una disminución en su interacción con AP-2 [88], de esta manera

otra quinasa denominada AAK1 se ha visto implicada en este proceso [89]. Por último, la quinasa

aPKC también se ha relacionado con procesos de fosforilación de Numb, en este caso parece

regular la localización asimétrica de Numb durante la división de precursores del sistema nervioso

de Drosophila [90, 91]

Los niveles de Numb se encuentran regulados mediante un mecanismo de degradación

dependiente de ubiquitinización que es mediado por las ubiquitin-ligasas de tipo E3 NLX y

Mdm2, en el caso de NLX se ha demostrado que es capaz de unirse al PTB de Numb de las

isoformas p72 y p66, que son las que contienen los insertos de 11 aminoácidos dentro del PTB

(PTBi) [92, 93]. Por otra parte, también se ha demostrado que Numb es capaz de unirse a la

ubiquitin ligasa Mdm2, y que esta es capaz de regular los niveles de Numb mediante su

degradación [94].


46

4.2 Funciones de Numb.

4.2.1 Proteína endocítica.

Uno de los mecanismos de internalización de receptores es el mediado por clatrina. En

este proceso participa una proteína adaptadora denominada AP-2, esta es un heterotetrámero

compuesto por dos subunidades grandes, α y β; una subunidad mediana µ 2 y una pequeña σ2.

AP-2 es capaz de unirse a la membrana plasmática, a moléculas de clatrina y a secuencias de

internalización presentes en los dominios intracelulares de receptores de membrana ( YXXΦ y

[DE]XXXL[LL] ), actuando así como una proteína adaptadora de todo el complejo de

internalización. Además AP-2 es capaz de unirse a otras proteínas necesarias para la

internalización. Otros receptores sufren una internalización, dependiente de clatrina, pero

independiente de AP-2, son receptores con secuencias de internalización de tipo FXNPXy, como

LDLR y EGFR. Diferentes trabajos han demostrado que la internalización de estos receptores no

se ve alterada cuando la actividad de AP-2 se encuentra comprometida. Así, en estos casos, son

otras proteínas, y no AP-2, las que actúan como adaptadoras para el complejo de internalización

[95].

Tanto Numb como ARH y Dab2 son capaces de actuar como proteínas adaptadoras

uniéndose a secuencias de internalización de tipo FXNPXY o NPXY y a membrana por sus

dominios PTBs, actuando así de forma semejante a como lo hace AP-2 [95, 96]. Santolini y

colaboradores describían en el 2000 [97], que Numb es capaz de unirse a la subunidad α-adaptina

de AP-2 mediante su dominio DPF. Puesto que Numb se ha visto asociado a la molecula AP-2, es

probable que Numb también participe en procesos de modulación de receptores mediados por AP-

2.

Además, Numb es capaz de interaccionar mediante sus dominios NPF con dominios EH

presentes en Eps15 , otra proteína que está implicada en procesos de endocitosis. Por otra parte,

se ha visto como Numb colocaliza con receptores, como EGFR y TfR, que están siendo

internalizados en orgánulos endocíticos, en este caso Numb parece competir con Eps15 por su

unión a vesículas de internalización, ya que no se ha detectado la presencia de las dos proteínas

simultáneamente en la misma vesícula, siendo la unión de Numb de menor afinidad que la de

Eps15. Sin embargo Numb y Eps15 si aparecen simultáneamente en endosomas que están

Introducción

47

transportando EGFR y TfR. Estos datos indican que Numb no sólo parece estar implicado en

procesos de internalización sino que probablemente actúe a diferentes niveles dentro de la ruta de

endocitosis de receptores. En este mismo trabajo vieron cómo fragmentos de Numb actúan como

inhibidores de la endocitosis; construcciones en las que se deleccionan los motivos DPF y NPF

actúan inhibiendo la endocitosis de EGFR y TfR [97].

En otro trabajo posterior, Smith y colaboradores [98], describían que Numb es capaz de

unirse a proteínas de la familia EHD/Rme1 que intervienen en procesos de endocitosis

dependientes e independientes de clatrina. Además, en este mismo trabajo describían que Numb

no solo está implicado en procesos de internalización sino también en reciclaje de receptores.

Por otro lado, parce que Numb no solo interviene en procesos de endocitosis de

receptores sino que también participa en su degradación, así se ha demostrado que es capaz de

asociarse a la ubiquitin ligasa de tipo E3 Itch y de degradar el dominio intracelular de Notch [99],

además se ha demostrado que coinmunoprecipita junto con otra ubiquitin ligasa de tipo E3, Cbl,

en timocitos [100].

Por tanto, parece que Numb es capaz de actuar en procesos de internalización

dependientes de clatrina, de manera dependiente o independiente de AP-2 y en procesos de

endocitosis independientes de clatrina. Además parece estar implicado en otros procesos que

ocurren dentro de la ruta de endocitosis tales como reciclaje [98], y degradación [99], actuando

como un regulador de los niveles de expresión superficial de estos, de esta manera puede

representar una proteína esencial para la modulación de los niveles de señalización de receptores.

En relación a esta función de Numb, también se ha demostrado que Numb es capaz de

unirse a las cadenas β3 y β5 que conforman las intergrinas, de esta manera Numb se une por su

PTB a secuencias NPXY presentes en los dominios citoplasmáticos de las cadenas β de

integrinas[101], participando así en su internalización.


48

4.2.2 Modulador negativo de Notch.

Numb ha sido altamente estudiada como un inhibidor del receptor transmembranal

Notch [102], el cual está implicado en la toma de decisiones de los precursores hacia diferentes

vías de desarrollo. En mamíferos existen cuatro isoformas de Notch, Notch 1 ,2 ,3 y 4; que pueden

interactuar con cinco ligandos diferentes Deltalike 1,3 y 4, y Jagged 1 y 2.

Notch está formado por dos dominios, un dominio extracelular o NEC y un dominio

intracelular o NIC. Esta proteína es activada por la unión con sus ligandos, que se localizan en la

membrana plasmática de células adyacentes. Tras la unión de Notch con su ligando se producen

dos cortes sucesivos en el receptor, un primer corte que afecta al dominio extracelular de Notch, y

hace que el dominio intracelular quede activado, este corte se lleva a cabo por una ADAM

metaloproteasa, y un segundo corte en el dominio NIC es llevado a cabo por la γ-secretasa, que

hace que NIC se desprenda de la membrana y que se dirija hacia el núcleo; una vez allí, se asocia

con el factor de transcripción CSL. En su estado normal, CSL se encuentra asociado con co-

represores, pero en presencia de NIC se desplazan los co-represores y se reclutan co-activadores,

que estabilizan la asociación entre CSL, NIC y el ADN, por tanto NIC actúa como activador de la

transcripción de genes diana de Notch como HES 1, HES 5 y pre-Tα.

La señalización a través de Notch es minuciosamente regulada por proteínas

extracelulares, citoplasmáticas y nucleares. Los reguladores citoplasmáticos de Notch incluyen a

Numb y Deltex.

Numb actúa inhibiendo la translocación de NIC al núcleo, el PTB de Numb se une al

dominio intracelular de Notch [103], y actúa como una proteína adaptadora reclutando a una

ubiquitin ligasa de tipo E3, Itch [99], y a otros componentes de la maquinaria de degradación , de

esta forma NIC es degradado antes de ser translocado al núcleo (Fig 9), reprimiendo de esta

manera la transcripción de genes dianas de Notch.

Introducción

49

Figura 9: Regulación de la degradación del dominio

intracelular de Notch por Numb, en el caso 1 se representa la

activación de Notch tras su unión a ligando, y en el caso 2 la

degradación de NIC por Numb.

Otro mecanismo por el cual Numb podría mediar la regulación de la actividad Notch es

la endocitosis de este, así la endocitosis de cualquier receptor representa un mecanismo por el

que se regulan los niveles superficiales del receptor en membrana, regulando así la disponibilidad

de éste para ser activado por la unión a su ligando. De esta manera, Numb parece participar

también en la internalización y en la degradación de Notch mediante un proceso independiente

del proteasoma [104, 105].

4.3 Numb en el sistema inmune.

La proteína Numb fue descrita por primera vez dentro del sistema nervioso de Drosophila

como un modulador negativo de Notch y como un determinante de división asimétrica dentro del

desarrollo del sistema nervioso [106], mas tarde fue descrito su homólogo en mamíferos, mNumb

[107] y desde que se demostró que Numb también era expresado en timo [79, 108] se ha


50

intentado determinar la función de Numb durante el desarrollo del sistema inmune. Puesto que

ratones deficientes en Numb mueren prematuramente durante el desarrollo, para el estudio de la

función de Numb dentro del sistema inmune se ha tenido que recurrir al uso de ratones con

delección condicional de Numb. E. Robey y colaboradores [100] veían como los ratones

condicionales para Numb no presentaban ninguna alteración en el desarrollo del sistema inmune,

apareciendo en estos ratones un fenotipo igual que el de ratones WT, probablemente debido a la

expresión de Numblike. En este mismo trabajo pudieron ver como Numb se polariza hacia la zona

de sinapsis en linfocitos periféricos tras su estimulación, y cómo Numb se encuentra unido al

complejo del TCR y co-inmunoprecipita junto con Cbl. Más tarde, en el laboratorio de Anne Wilson

[109] se analizaban ratones dobles condicionales para Numb y Numblike, apareciendo

aparentemente un leve secuestro en el desarrollo en el estadio de DN3, y no se conoce el

fenotipo que muestran estos ratones en periferia ya que estos datos no han sido publicados. En

cuanto a experimentos en los que se aumenta expresión de Numb solamente ha sido publicado

un trabajo por el laboratorio de C.J. MacGlade [110], en el que se sobreexpresa la isoforma p66

de Numb bajo el promotor de Lck, en este caso observaron una disminución en la función de

Notch, pero no vieron alteraciones en el desarrollo de timocitos. Por último, el trabajo más

recientemente publicado ha sido en el laboratorio de Steven Reiner, en el que demuestran que

los linfocitos T CD8 se dividen asimétricamente tras ser estimulados, siendo Numb heredada por

solamente una de las células hijas, además demostraron que esta división asimétrica derivaba en

la generación de dos células hijas con diferente fenotipo, por un lado se desarrollaba un fenotipo

efector en aquella célula que estaba heredando TCR y Numb, y por otro lado aparecía un

fenotipo memoria en la otra célula hija [111]. De esta manera, estos últimos datos publicados

abren una vía de investigación para determinar cuál es el papel de Numb dentro de la división

asimétrica de linfocitos T en periferia, y no solo en el desarrollo de células efectoras versus

células memoria, sino también dentro del desarrollo de una respuesta de tipo Th1 o Th2, ya que el

receptor Notch también ha sido implicado en este proceso, de esta manera la activación de Notch

parece desarrollar un fenotipo Th2 frente a Th1 debido a la activación del factor de transcripción

GATA-3 [112] , en este aspecto, la regulación que ejerce Numb sobre Notch, y la segregación

asimétrica de Numb en la división de linfocitos, podría estar implicada en el desarrollo de una

respuesta Th1 o Th2.

Con anterioridad en nuestro laboratorio hemos podido demostrar que Numb es segregado

asimétricamente durante la división de timocitos DN3, y que esta segregación asimétrica

Introducción

51

determina la vía de desarrollo que van a seguir estos timocitos, diferenciación o proliferación,

apareciendo así por primera vez el proceso de división asimétrica asociado al desarrollo del timo.

De esta manera, Numb determina el grado de proliferación de las células DNs y la celularidad

total del timo. En cuanto al mecanismo por el cual Numb media en este proceso, hemos podido

determinar que Numb participa en la modulación de la señal por pre-TCR, de esta manera

timocitos que expresan un dominante negativo para Numb presentan altos niveles de señalización

por pre-TCR, así la herencia o no de Numb por las células hijas repercute en la señalización por

pre-TCR.

Puesto que hasta el momento los intentos realizados para estudiar el papel de Numb

dentro del sistema inmune han sido infructuosos, debido probablemente a que los sistemas

propuestos hasta ahora para este estudio no parecen ser los adecuados, en este trabajo y en

otros realizados en el laboratorio pretendemos determinar la función de Numb dentro del sistema

inmune mediante el uso de ratones que expresan un dominante negativo para Numb,

constituyendo un sistema de inhibición de Numb que no había sido anteriormente utilizado.

JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

Justificación y Objetivos

55

La proteína adaptadora Numb es altamente expresada tanto en timocitos como en células

T maduras, pero poco se sabe a cerca del papel que desempeña dentro del desarrollo y función

de las células T. En otros sistemas Numb ha sido descrita como una proteína endócitica que

participa tanto en procesos de internalización como de degradación de diferentes receptores, así

como una proteína que participa en la decisión delinaje durante el desarrollo mediante un proceso

de división asimétrica. Debido a esto en el laboratorio hemos intentado estudiar el posible papel

de Numb en el desarrollo de linfocitos T, de esta manera los objetivos que persigue la presente

tesis son:

- Estudio del papel de Numb durante la Selección positiva y Migración de timocitos.

- Estudio del papel de Numb en la Modulacíon de la Señalización a través del TCR en

linfocitos maduros.

- Estudio del papel de Numb en División Asimétrica de linfocitos T maduros.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y Métodos

59

1. MATERIALES

1.1 Ratones transgénicos.

Para el desarrollo de este trabajo fueron empleadas dos líneas de ratones transgénicos,

una primera línea que expresa un dominante negativo para Numb, este dominante negativo está

constituido por el propio PTB de la isoforma p71 de Numb, y por la secuencia

c-myc tag humana, el transgen es expresado bajo el promotor de CD2 humano. La segunda línea

de ratones transgénicos sobreexpresa la isoforma p71 de Numb también bajo en promotor de CD2

humano, y unido a la proteína transgénica también aparece la secuencia de c-myc tag humana

(Fig 1). Los ratones utilizados para la producción de los transgénicos son C57BL/6. Los ratones

fueron creados por la Dra. Matilde Cañelles en el laboratorio de la Dra. B.J. Fowlkes en NIH y

fueron cedidos a nuestro laboratorio por la Dra. Fowlkes.

Dominante negativo de Numb: c-myc

PTB

Isoforma sobreexpresada de Numb: c-myc

PTB

1.2 Medios de cultivo.

RPMI Completo Medio RPMI 5% Suero bovino fetal inactivo 2 mM L-glutamina 50ug/ml y 50unit/ml Penicilina-Estreptomicina 50uM β-mercaptoetanol

Medio 199 Completo Medio 199 5% Suero bovino fetal inactivo 50ug/ml y 50unit/ml Penicilina-Estreptomicina


60

1.3 Reactivos para tipaje de ratones

Buffer digestión de muestra 0’2% SDS 100mM Tris HCl ph 8

100mM NaCl 10mM EDTA ph 8

Reactivos de PCR 0,15 µ l Enzima Taq Biotools 3µ l Buffer de Taq 4µ l Agua DEPC

0,6 µ l DNTPs, oligonucleótidos UP y DOWN 1,2µ l MgCl2

18,72µ l Agua DEPC Buffer de carga 0’25% Azul Bromofenol

0’25% Xilencianol 30% Glicerol

Gel de agarosa 1,2% 1,8gr de Agarosa + 150ml TAE1x

1.4 Reactivos para western-blotting

Buffer Lisis celular Buffer de lisis NP40. Biosource 1mM PMSF

100µ l/ml de Cocktail de inhibidores de proteasa. Sigma

Geles 4-12% Bis-Tris Comerciales Invitrogen Buffer de Electroforesis Comercial Invitrogen Buffer de Transferencia Comercial Invitrogen Buffer de lavado PBS+tween-20 Buffer de bloqueo PBS+tween-20+5% Leche en polvo Solución de Revelado (HRP) Bio Rad

1.5 Anticuerpos para western-blotting

Ratón Anti-Myc Clon 9.E10, Upstate Conejo Anti-Numb cedido por el Dr. Weimin Zhong Conejo Anti-TCR ζ cedido por el Dr. Balbino Alarcón Ratón Anti-GADPH SIGMA Cabra Anti-CD3 epsilon cedido por el Dr. Balbino Alarcón Ratón Anti- Cbl Clon A-9, Santa Cruz Conejo Anti- Cbl Clon C-15, Santa Cruz Anti- Ig G ratón HRP Santa Cruz Anti- Ig G conejo HRP Santa Cruz Anti- Ig G cabra HRP Santa Cruz


61

1.6 Anticuerpos para citometria

CD25 FITC Clon 7D4, Pharmingen CD44 CYC Clon IM7, Pharmingen, CD4 FITC, BIO y PE Clon RM4-5, Pharmingen, CD8 FITC,BIO, PE y PERC Clon 53-6.7, Pharmingen TCR β PE Clon H57-597, Pharmingen, CD5 FITC Clon 53-7.3, Pharmingen CD69 FITC Clon H1.2F3, Pharmingen CD62L BIO Clon MEL-14 BD, Pharmingen CD2 BIO Clon RM2-5, Pharmingen Estreptavidina APC Anti-Biotina ,eBioscience 7-AAD Sigma

1.7 Reactivos para congelación de tejidos.

Paraformaldheido Panreac Sucrosa Sigma Compuesto O.C.T Tissue Tek Criomolde Tissue Tek

1.8 Reactivos para microscopía confocal

Paraformaldehido Panreac. Poli-L-lisina Sigma Buffer bloqueo y permeabilización 5% Normal Goat Serum. Invitrogen

3% Albumin bovine. Sigma 0’2% Triton –X- 100. Sigma

Cloruro amónico Sigma Medio de montaje Molecular Probes

1.9 Anticuerpos para microscopia confocal

Anti- CD4 Alexa 647 y 555 Clon RM4-5, Pharmingen Anti- CD8 Alexa 647 y 555 Clon 53-6.7, Pharmingen Anti- TCR Alexa 647 y 555 Clon H57-597 , Pharmingen Anti- Myc Clon 9.E10, Upstate Anti- Cbl Clon A-9, Santa Cruz Anti- Numb Clon H-70, Santa cruz Anti- Citoqueratina FITC SIGMA Anti- Armenian Hamster IgG1 Cross-linking, eBioscience anti- Ig G conejo Alexa 488 Invitrogen anti- Ig G ratón Alexa 488 Invitrogen


62

Topro-3 iodide Molecular Probes

1.10 Reactivos para medida de apostosis

Anexina-V FITC Invitrogen Buffer de unión Invitrogen

2. MÉTODOS.

2.1 Ratones transgénicos.

Los cruces de ratones se realizaron entre un macho transgénico y una hembra WT con el

fin de obtener descendientes heterocigoticos, por esta razón es necesario el tipaje de todos los

ratones de cada camada nacida, ya que dentro de la misma camada puede haber ratones WT y

TG. Los cruces para la obtención de los ratones dobles transgénicos se realizaron entre un macho

TG dnNumb y una hembra TG Numb, en este caso el tipaje también era necesario ya que dentro

de la progenie podían aparecer ratones WT, TG dnNumb, TG Numb y dobles trangénicos, y fue

realizado mediante western-blot.

Todos los ratones utilizados en este trabajo fueron sacrificados con una edad

comprendida entre 4 y 12 semanas.

2.2 Tipaje de ratones.

Puesto que los cruces de ratones se realizaron entre un macho TG y una hembra WT

era necesario el tipaje de las camadas. Los tipajes se realizaron mediante la toma de muestras de

las orejas de los ratones, las muestras fueron digeridas durante dos horas con 47,5µ l de Buffer de

digestión mas 2,5µ l Proteinquinasa K a una temperatura de 55ºC y en movimiento a 1300rpm en

Termoblot, con el producto de la digestión se realizó una PCR con el fin de amplificar una

secuencia sólo presente en las proteínas transgénicas, para esto se utilizaron los siguientes

cebadores:


63

Forward: 5´ AACAAACTACGGCAAAGCTTCAGG 3´

Reverse: 5´ CTTCTCCCGCTTCTGTTTACGCTC 3´

El producto de la PCR fue cargado en un gel de agarosa al 1,8% y corrido durante 30

minutos, así en los ratones transgénicos podía visualizarse una banda amplificada correspondiente

a 600 pb (Fig 1).

Figura 2: Imagen de gel de agarosa en el que se han corrido

los productos de una PCR para determinar el tipaje de

ratones. Se observa una banda de 600pb en el ratón TG.

2.3 Tipaje de ratones dobles transgénicos.

Puesto que la PCR diseñada para el tipaje de ratones TG dnNumb y TG Numb no

permite diferenciar entre unos y otros ratones, el tipaje de ratones dobles trangénicos fue realizado

mediante un western blot frente a c-myc, de este modo en ratones dobles trangénicos aparecen

dos bandas de diferente peso molecular, una de menor peso molecular que corresponde al

dominante negativo de Numb, y otra de mayor peso molecular que corresponde a la isoforma p71

de Numb transgénica. Para esto, 10x106 timocitos fueron lisados en 100µ l de buffer de lisis

durante 30 minutos a 4ºC, tras esto el producto de la lisis fue centrifugado a 13000rpm durante 10

minutos, el sobrenadante producido tras la centrifugación fue recogido y reservado para la

electroforesis. 10µ l de muestra fue mezclado con 6,25µ l de buffer de carga 4X y completado el

volumen hasta 25µ l con H2O m.q., posteriormente 20µ l de cada muestra fueron cargados en un

gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris y corridas durante 1 hora aproximadamente, tras la electroforesis se

realizó una transferencia en membrana de nitrocelulosa durante 1 hora, la membrana fue

bloqueada durante 30 minutos en agitación con leche al 5%, tras el bloqueo la membrana fue

incubada con anti-myc en agitación toda la noche, posteriormente fue lavada con PBS-Tween e


64

incubada con el anticuerpo secundario durante 30 minutos en agitación, tras esto fue de nuevo

lavada con PBS-Tween, y revelada con el sustrato de la peroxidasa. (Fig2)

Figura 3: Imagen de wester blot frente a c-myc, en la que se diferencian

dos bandas de diferente peso molecular correspondientes a dnNumb y

p71 Numb. En el primer pocillo aparece una muestra de raton WT, en el

segundo TG dnNumb, en el tercero TG Numb y en el cuarto pocillo doble

TG.

2.4 Citometría de flujo para marcaje superficial e intracelular.

Una vez extraídos el timo o los nódulos estos fueron disgregados en medio Medium 199

y lavados con PBS. 1x106 células fueron teñidas durante 15 minutos a 4ºC con 10µ l de la

concentración adecuada de cada anticuerpo, tras la incubación las células fueron lavadas dos

veces con PBS y resuspendidas en 200µ l de PBS, las muestras fueron analizadas con un FACs

Calibur de Becton Dickinson (BD).

Para el caso de las tinciones intracelulares se realizaron primero las tinciones

superficiales, posteriormente se permeabilizó y fijó con el kit Cytofix/Cytoperm de BD, utilizándose

éste según las instrucciones del fabricante.

Todos los datos fueron analizados con el software FlowJo.

2.5 Medida de muerte celular por apoptosis con Anexina V.

Durante el proceso de apoptosis los fosfolípidos de membrana son translocados al

exterior de la membrana plasmática, la Anexina V es capaz de unirse a la fosfatildilserina, asi la


65

unión de la anexina V a membrana indica que la célula se encuentra en un estadio temprano de

apoptosis.

Una vez disgregados los órganos, timo o nódulos, las células fueron lavadas con PBS,

1x106 células fueron primero teñidas superficialmente y posteriormente se añadió 100µ l de

Binding Buffer 1X y 5µ l de Anexina V-FITC, las células se incubaron durante 5 minutos a Tª

ambiente, inmediatamente fueron analizadas con un FACs Calibur.

2.6 PCR-RT.

Extracción de ARN: Tras la disgregación de nódulos de animales WT, TG dnNumb y

TG Numb, 10x106 células de nódulos fueron empleadas para la extracción de ARN mediante el

uso de Rneasy Kit de Quiagen, el protocolo fue realizado según se indica por el fabricante.

Transformación de ARN a cDNA: Para la transformación se utilizo el kit Super

Script de Invitrogen y el protocolo fue realizado según las instrucciones del fabricante.

PCR-RT: Con el cDNA obtenido anteriormente se realizo una PCR semicuantitativa por

incorporación de SYBR Green a la doble cadena de ADN. Los datos obtenidos se analizaron

normalizando respecto al gen de referencia endógeno 18S y se realizaron las medias entre dos

replicas, los valores obtenidos para los animales transgénicos son relativos respecto al WT.

Los oligos empleados en la PCR fueron:

18S Forward: 5´ CGGCTACCACATCCAAGGAA 3´

18S Reverse: 5´ GCTGGAATTACCGCGGCT 3´

HES-1 Forward: 5´ GCCAGTGTCAACACGACACCGG 3´

HES-1 Reverse: 5´ TCACCTCGTTCATGCACTCG 3´


66

2.7 Microscopia confocal. Protocolos generales.

Congelación de Tejidos: Timos aislados de ratones WT y TG dnNumb fueron

lavados con PBS frio y posteriormente fijados con paraformaldehido 4% durante 15 minutos en frio,

tras esto fueron lavados dos veces con PBS y tratados con sucrosa al 20% durante 1 hora, de

nuevo fueron lavados en PBS y los timos fueron inmersos en medio OCT para su posterior

congelación. Las secciones de tejidos fueron realizadas mediante el empleo de un criostato.

Tinción de tejidos y de células: En el caso de cortes de tejidos estos ya se

encuentran adheridos a un soporte, pero en el caso de las células previamente hay que adherirlas

a un cristal con una base de poli-L-lisina, para esto se prepara poli-L-lisina a 50 µ g/ml y se

recubren los cristales dejándolos durante toda la noche a 4ºC. Tras esto las células se echaron

sobre los cristales en una concentración de 1x106 cel/50µ l formando una gota sobre estos y se

incuban durante 30 minutos a 37ºC para que se adhieran las células a la matriz. Tras esto se

procede al protocolo de tinción que se realiza igual en el caso de tejidos y de células.

Las muestras se fijan con paraformaldehido al 4% durante 15 minutos a Tª ambiente,

posteriormente se lavan con PBS y se incuban durante 10 minutos con 50mM de NH4Cl en PBS,

tras esto se someten de nuevo a lavado con PBS, posteriormente se realizaron primero las

tinciones superficiales, y posteriormente se incuban con una solución de bloqueo y

permeabilización durante 1 hora a temperatura ambiente, tras esto se procedió a realizar las

tinciones intracelulares. Las muestras fueron montadas con medio de montaje y visualizadas con

un microscopio confocal Leica SP5.

2.8 Internalización constitutiva del TCR .

Para el estudio de la internalización del TCR independiente de ligando, células de

nódulos de ratones WT y TG dnNumb fueron aisladas y 1x106 fueron incubadas en medio RPMI

mas10µ g/ml de Cicloheximida (inhibidor de la síntesis de novo) y 10ug/ml de Brefaldin (inhibidor

de procesos de exocitosis) durante 30minutos a 37ºC. Tras esto fueron cultivadas durante

diferentes tiempos en placas de 48 pocillos con medio RPMI completo. Para cada tiempo de cultivo

las células fueron teñidas con anti-CD4, anti-CD8 y anti-TCR y analizadas con FACS.


67

El % de TCR internalizado a cada tiempo fue calculado con las medias de expresión

superficial de TCR y aplicando la siguiente fórmula:

%TCR internalizado = 100 - MFI de células CD4 a tiempo t x 100

MFI de células CD4 a t=0

2.9 Modulación del TCR dependiente de ligando.

Modulación del TCR superficial: Para el estudio de la modulación de los niveles

superficiales de TCR dependiente de ligando, células de nódulos fueron aisladas y 1x106

células/ml fueron cultivadas a 37ºC en medio RPMI completo con 1µ g/ml de anti-CD28 durante

diferentes tiempos, el cultivo se realizó en placas de 48 pocillos a las que había sido unido

10µ g/ml de anti-CD3. Tras diferentes tiempos de estimulación, las células fueron teñidas con

anti-CD4, anti-CD8 y anti-TCR y analizadas con FACS.

El % de TCR modulado fue calculado utilizando las medias de la fluorescencia para el

TCR superficial, y según la siguiente fórmula:

% TCR modulado= 100x MFI de células CD4 no estimuladas a tiempo t- MFI de células CD4 estimuladas a tiempo t

MFI de células CD4 no estimuladas a tiempo 0

Degradación: Para el estudio de la dinámica de degradación del TCR, células de

nódulos de ratones WT y TG dnNumb fueron aisladas y 10x106 /10ml células fueron estimuladas

con 10µ g/ml de anti-CD3 unido a placa y 1µ g/ml de anti-CD28 en frascos de cultivo durante

diferentes tiempos con medio RPMI completo. A cada tiempo de estimulación las células fueron

lavadas y los pellets de células fueron lisados con 100ul de buffer de lisis durante 30minutos a 4ºC,

con el producto de la lisis se realizó un western utilizando el mismo protocolo anteriormente

descrito. La membrana resultante se reveló primero para anti-TCR ζ, tras esto la membrana fue

stripeada con PBS-Tween+Azida 10% durante 30 minutos en agitación, tras esto fue incubada y

revelada para el segundo anticuerpo o GAPDH.


68

Recuento de vesículas: Para el recuento de vesículas de TCR, células de nódulos

de ratones WT y TG dnNumb fueron aisladas y lavadas con PBS, 1x106 células fueron

resuspendidas en 50µ l de medio y puestas sobre un cristal cubierto de polilisina, los cristales

fueron incubados durante 30 minutos a 37ºC para favorecer la adhesión de las células a la matriz

de polilisina, tras la adhesión las células fueron teñidas superficialmente con anti-TCR Alexa647

durante 30 minutos en hielo, posteriormente fueron lavadas dos veces con PBS, y se las incubó

durante otros 30minutos con un anti- Armenian Hamster IgG con el fin de provocar el cross-linking

del TCR, tras esto fueron lavadas de nuevo e incubadas con 1ml de medio RPMI completo durante

1 hora a 37ºC, excepto en el caso de los controles sin estimular, que fueron mantenidos a 4ºC. La

tinción previa realizada con anti-TCR, nos permite visualizar la localización del TCR mediante

microscopía confocal y actúa como activador de la internalización del TCR. Tras la hora de

estimulación las células fueron lavadas y fijadas con paraformaldheido durante 15 minutos,

posteriormente se realizó la tinción superficial con anti-CD4 Alexa555 durante 30 minutos. Tras

esto las células fueron lavadas y preparadas para su visualización al microscopio confocal Leica

SP5. Las imágenes fueron tomadas con una resolución de 1024x1024 y con un objetivo de

inmersión de 63x.

El recuento de vesículas se realizó en los z-stacks de cada célula, y se calcularon las

medias para 50 células de WT y 69 células de TG dnNumb.

2.10 Cálculo del porcentaje de colocalización.

Para el cálculo del porcentaje de colocalización del TCR con Numb y c-Cbl se realizo la

misma estimulación y tinción anteriormente descrita en el Recuento de Vesículas, tras la tinción

superficial con anti-CD4 Alexa555, se procedió a realizar una tinción intracelular frente a Numb o c-

Cbl, para esto las células fueron permeabilizadas y bloqueadas durante una hora a temperatura

ambiente con el buffer anteriormente descrito en el apartado Materiales, tras el bloqueo fueron

teñidas con un anticuerpo primario frente a Numb o c-Cbl durante toda la noche a 4ºC,

posteriormente las células fueron lavadas y teñidas con anticuerpo secundario Alexa 488 durante 2

horas a temperatura ambiente, tras los lavados posteriores las células fueron preparadas para su

visulalización al microscopio. Las imágenes fueron tomadas con una resolución de 1024x1024 y

con un objetivo de inmersión de 63x.


69

Los píxeles de TCR que colocalizan con Numb o c-Cbl para cada célula fueron

analizados con el programa LAS-F, los umbrales de colocalización empleados fueron iguales para

las células de WT y de TG dnNumb, y el porcentaje de TCR que colocaliza con Numb o c-Cbl fue

calculado según la siguiente fórmula:

%TCR colocalizado= 100x Nº de píxeles de TCR que colocalizan

Nº de píxeles totales de TCR

Se calculó la tasa de colocalización para cada célula y posteriormente se halló la media

para 25 y 49 células de WT y TG dnNumb respectivamente en el caso de la colocalización con

Numb, y para 32 y 42 células de WT y TG dnNumb, respectivamente, en el caso de la

colocalización con c-Cbl.

2.11 Visualización de sinapsis inmunológica.

Para la visualización de la sinapsis inmunológica mediante microscopía confocal, las

células de nódulos de ratones WT y TG dnNumb fueron aisladas y 1x106 células fueron

estimuladas con 10µ g/ml de anti-CD3 unido a placa y 1µ g/ml de anti-CD28 en medio RPMI

completo durante una hora a 37ºC en placas de 48 pocillos, tras el tiempo de estimulación el

medio de cultivo fue retirado de los pocillos y las células fueron fijadas durante 15 minutos con

paraformaldehido 4% directamente sobre la placa, tras la fijación las células fueron lavadas con

PBS y despegadas de la placa, las células fueron resuspendidas en 50µ l de medio y depositadas

sobre cristales cubiertos de polilisina que se incubaron durante 2 horas a 37ºC, en este caso el

tiempo de incubación se prolongó debido a que las células fijadas se adhieren con mayor dificultad

a la matriz de polilisina. Tras este proceso las células se tiñeron con anti-TCR Alexa 647 y anti-

CD5 Alexa 555 superficialmente, e intracelularmente con anti-Numb Alexa 488 según el protocolo

anteriormente descrito. Tras la tinción las células fueron preparadas para su visualización con el

microscopio confocal. Esta técnica fue descrita anteriormente en el trabajo [113].


70

2.12 Cálculo del porcentaje de segregación asimétrica de Numb

Células de nódulos de ratones WT, TG dnNumb y TG Numb fueron estimuladas con

5µ g/ml de anti-CD3 unido a placa y 1µ g/ml de anti-CD28 durante 72 horas, tiempo suficiente para

provocar la división de las células, tras eso las células fueron adheridas a cristales con matriz de

polilisina y teñidas con Topro, anti-CD4 y anti-Numb, según el protocolo de tinción para

microscopía confocal anteriormente descrito.

Para calcular el porcentaje segregado de Numb por cada célula hija se realizaron z-stack

con el microscopio confocal de células que se encontraban dentro de mitosis, en cada plano de la

célula se cuantificaron los píxeles totales de Numb y se sumaron los píxeles de cada plano, dando

lugar a la cantidad total de Numb en la célula en división, por otro lado se cuantifico de la misma

manera la cantidad total de Numb que heredaba una de las células hijas, mediante la construcción

de una gate que englobaba la futura célula hija, con estas cantidades relativas de Numb se

calculó el porcentaje de Numb segregado por cada célula hija con la siguiente fórmula:

% Numb heredado por célula hija 1 = Numb total heredado por la célula hija 1 X 100

Total de Numb en célula por división

% Numb heredado por célula hija 2 = 100 - % Numb heredado por célula hija 1

2.13 Purificación de células CD4 de nódulos.

Del total de células extraídas de nódulos se purificaron células CD4 utilizando un proceso

de selección negativa mediante el empleo de un Kit de Miltenyi Biotec, el protocolo se desarrollo

según las instrucciones del fabricante, una vez obtenida una fracción pura de CD4, comprobamos

que la fracción tenía una pureza mayor del 90% (Fig 4).


71

2.14 Coinmunoprecipitación.

Células de nódulos o timo, previamente estimuladas o no, fueron lisadas durante 30

minutos con 700µ l de buffer de lisis que contenía 20mM Tris-HCl, 138mM NaCl, 2mM EDTA, 9,5%

glicerol, 1% NP-40, 1mM Sodium Ortovanadato , 10mM NaF y 100ul por ml de inhibidores de

proteasas (Sigma). Los lisados obtenidos fueron incubados con 1,5µ l de anti-myc o 3µ l de anti-

Numb durante 2 horas a 4ºC, tras esto los lisados fueron incubados durante 1 hora con Proteina

G-Microbeads a 4ºC. Los lisados fueron pasados por columnas magnéticas, recogiendo el eluido

que pertenece a la porción de No IP, la porción IP fue recogida de la columna mediante la

utilización de Laemmli previamente calentado a 100ºC. Posteriormente se realizó la separación de

las proteínas inmunoprecipitadas mediante una electroforesis SDS-PAGE.

RESULTADOS

Resultados

75

1 EL DOMINANTE NEGATIVO DE NUMB INHIBE LA FUNCIÓN

ENDÓGENA DE NUMB.

Para estudiar el papel de Numb en el sistema inmune, en el laboratorio hemos trabajado

con dos líneas de ratones trangénicos; los ratones TG dnNumb que expresan un dominante

negativo de Numb con el fin de inhibir la función de la proteína Numb endógena, este dominante

negativo está constituido por la región PTB de la isoforma p71 de Numb y por la secuencia c-myc

tag, este dominante negativo es expresado bajo el promotor de CD2 humano, que es expresado

en células B y T desde los primeros estadios de desarrollo. Por otro lado, los ratones TG Numb

sobrexpresan la isoforma p71 de Numb bajo el mismo promotor. Esto implica que en las dos líneas

de ratones transgénicos se conserva la expresión de la proteína Numb endógena, debido a esto la

asociación de la secuencia c-myc tag a las dos proteínas transgénicas nos permite identificarlas y

diferenciarlas de la proteína Numb endógena, mediante la utilización de un anticuerpo anti-myc

tag.

Para comprobar la expresión de las proteínas transgénicas en timo de ratones TG

realizamos un western blot frente a c-myc tag, de esta manera detectamos la presencia de las

proteínas trasngénicas tanto en ratones TG dnNumb como TG Numb, siendo estas diferenciadas

por su distinto peso molecular. (Fig 1 A). Mediante citometría medimos los niveles de expresión de

CD2 en las distintas etapas de desarrollo en timo, y pudimos comprobar que la expresión aumenta

durante el desarrollo, siendo más baja en células DP que en células SP, por tanto, puesto que las

proteínas transgénicas se expresan bajo el promotor de CD2, los niveles de expresión de estas

irán aumentando durante el desarrollo de los timocitos. (Fig 1 B)

El fenotipo de ratones TG dnNumb en el timo se caracteriza por una disminución en el

número total de células respecto a ratones WT, por el contrario en ratones TG Numb, el fenotipo

de caracteriza por un aumento en el número total de células en el timo. Puesto que durante el

desarrollo del timo son las células DN las responsables de proliferar hasta alcanzar el número

definitivo de timocitos, la variación en la celularidad total del timo puede ser ocasionada por una

alteración en este estadio de desarrollo, así en el laboratorio hemos podido comprobar

anteriormente que las células DN en ratones TG dnNumb presentan una alta tasa de muerte

celular por apoptosis así como una disminución en su tasa de proliferación (Aguado, R.).


76

Para descartar esta posibilidad de que además de Numb se esté inhibiendo a otras

proteínas, y poder asegurar que el fenotipo obtenido en estos ratones se debe a la inhibición de

Numb, cruzamos ratones que expresan el dominante negativo con ratones que sobreexpresan

Numb con el objetivo de restaurar el fenotipo en los ratones dobles transgénicos al aumentar la

cantidad de Numb funcional, los ratones dobles transgénicos fueron tipados mediante western blot

frente a c-myc tag, así en ratones que habían heredado las dos proteínas transgénicas se podía

detectar dos bandas de diferente peso molecular (Fig 1 A, cuarto panel). Como resultado de este

cruce obtuvimos que los ratones que expresaban las dos proteínas transgénicas eran capaces de

restaurar la celularidad total en timo, sin que aparecieran diferencias significativas con ratones WT,

de este modo podemos decir que la cantidad de Numb funcional correlaciona con la celularidad

total del timo. (Fig 1 C)

Por otro lado, Numb ha sido altamente estudiada como un inhibidor de Notch [99, 103],

de esta manera la inhibición de Numb produciría un aumento en la actividad de Notch y por tanto

un aumento en la transcripción de HES-1 (gen regulado por Notch) en timo. Con anterioridad en el

laboratorio hemos podido comprobar mediante PCR-RT, que en ratones TG dnNumb se

encuentran aumentados los niveles de HES-1, por tanto el dominante negativo de Numb produce

una inhibición de Numb endógena que lleva a un aumento en la función de Notch (Aguado, R.).

Debido a esto podemos decir que el dominante negativo de Numb empleado es capaz de

inhibir la función de Numb endógena, convirtiéndose en un buen sistema para el estudio del papel

de Numb dentro del sistema inmune.

Resultados

77

Figura 1: A. Expresión de proteínas trangénicas en timo de ratones WT,

dnNumb, Numb y dnNumbXNumb. B Niveles de expresión superficial de CD2

en ratones WT. C Celularidad total en timo de ratones WT, dnNumb, Numb y

dnNumb X Numb, los asteriscos muestran las diferencias significativas.


78

2 ANÁLISIS FENOTÍPICO DEL TIMO DE RATONES TG dnNUMB Y TG

NUMB.

2.1 Fenotipo de ratones TG dnNumb.

En ratones TG dnNumb se orservó que se encuentran reducidas las poblaciones de DP y

de CD8SP en ratones TG dnNumb respecto a WT , sin embargo el número absoluto de células

CD4SP no se encuentra alterado respecto a ratones WT, pero el % de células CD4SP se

encuentra aumentado en ratones TG dnNumb (Fig 2 A primer panel y 2 B). Utilizamos la relación

entre DP/CD4SP y DP/CD8SP, como un índice de tasa de producción de células SP, ya que las

células DP son los precursores inmediatos de las células SP, así pudimos comprobar que la tasa

de producción de células CD8SP no se encontraba alterada en ratones dnNumb, es decir el

número de células CD8SP producidas en ratones TG dnNumb es normal en relación con el

número de DP que aparecen en el timo, sin embargo la tasa de producción de células CD4SP se

encuentra aumentada tres veces en ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 2 C) . Este aumento

en la tasa de producción de células CD4SP se refleja también en un aumento en el porcentaje de

células TCRhigh en el timo de ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 2 D), estas células con altos

niveles de TCR son células maduras o SP. Además, mediante microscopía confocal hemos podido

visualizar este aumento en el número de células SP dentro del timo, de esta manera en ratones

TG dnNumb se observa un aumento de células SP localizadas dentro de las áreas de médula (Fig

2 E).

2.2 Fenotipo de ratones TG Numb.

El fenotipo de ratones TG Numb se caracteriza por un aumento significativo en la

celularidad total del timo así como en las diferentes subpoblaciones, DP y SP (Fig 2A, segundo

panel), pero no aparecen alterados sus porcentajes (Fig 2B), además no aparece ninguna

alteración en las relaciones DP/CD4SP y DP/CD8SP (Fig 2C) ni en los niveles de células TCRhigh

en ratones TG Numb respecto a WT (Fig. 2 D). Por tanto a nivel fenotípico el único fenómeno

observable es un aumento en la celularidad total del timo en ratones TG Numb (Fig 2A).

Resultados

79


80

Figura 2: Analisis fenotípico en timo de ratones TG dnNumb y TG Numb:

A. Números absolutos de células en timo de WT versus TG dnNumb en el

primer panel y de WT versus TG Numb en el segundo panel, WT en negro y

TG en gris. B. Citometria de flujo frente a CD4 y CD8 en células totales de

timo WT y TG dnNumb en el primer panel, en els egundo papel con una gate

para TCR high. C. Relación del número absoluto de células entre

DP/CD4SP y DP/CD8SP en ratones WT(negro), TG dnNumb (gris) y TG

Numb ( blanco). D. Niveles totales de TCR en timo, las barras indican el

porcentaje de células con niveles altos de TCR. Los asteriscos indican

diferencias significativas. E. Imágenes de secciones de timo visualizadas

con microscopia confocal, en las que se observa la zona de transición

cortico medular delimitada mediante tinción frente a citoqueratina.

Resultados

81

3 MARCADORES DE ACTIVACIÓN EN TIMO.

3.1 Alteración en marcadores de activación en células DP de ratones TG

dnNumb.

Puesto que el fenotipo observado en ratones TG dnNumb no corresponde con el fenotipo

que aparece en ratones en los que se aumenta la función de Notch, es decir aumento en la

selección positiva de células CD8SP [38], pensamos que Numb puede estar desarrollando, aparte

de su función como modulador negativo de Notch, otra función diferente a la regulación de Notch.

Para intentar dilucidar este asunto hicimos un estudio de las células DP, que son las precursoras

de las SP, para esto medimos mediante citometría de flujo la expresión de diferentes marcadores

de activación en las distintas subpoblaciones del timo, estos marcadores TCR, CD69 y CD5

aumentan sus niveles de expresión superficial en células que están dentro de la selección positiva,

siendo indicativos de la activación del TCR, así pudimos comprobar que en células DP, que son

células que aun no han entrado en selección positiva, los niveles de TCR, CD69 y CD5 no

presentan ninguna alteración en ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 4 B), sin embargo en un

estadio más avanzado de selección positiva, en células CD4high CD8medium, que son células cuyos

TCRs ya han sido activados [29], se observa un aumento en los niveles de expresión de TCR,

CD5 y CD69 en ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 4 B). En ratones TG Numb encontramos

unos niveles normales de TCR, CD5 y CD69 en células que están dentro de la selección positiva

en relación al WT (Fig 4 C). Puesto que la señalización por TCR es uno de los factores

fundamentales que intervienen en la selección positiva, este aumento en ratones TG dnNumb

podría ser indicativo de una alteración en la toma de linaje CD4 versus CD8, explicando el

aumento en la tasa de producción de células CD4SP en ratones TG dnNumb a 4 semanas de

edad. Sin embargo en ratones TG Numb la tasa de producción de células CD4 es normal, así

como los niveles de CD5, CD69 y TCR.

Por tanto, Numb no sólo interviene en la regulación de la actividad de Notch, sino que de

alguna manera contribuye a la modulación de la señalización por TCR en células que están

sufriendo selección positiva en el timo.


82

Figura 4: Alteración en marcadores de selección positiva en ratones

TG dnNumb A. Gates para células DP y CD4high CD8medium en ratones

Resultados

83

WT y TG dnNumb. B Niveles de expresión de TCR, CD5 y CD69 en

células DP y CD4high CD8medium de ratones WT (línea continua) versus

ratones TG dnNumb (línea discontinua). C. Niveles de expresión de

TCR, CD5 y CD69 en células DP y CD4high CD8medium de ratones WT

(línea continua) versus ratones TG Numb (línea discontinua).

3.2 Secuestro en el timo de células CD8SP en ratones TG dnNumb.

El análisis fenotípico de nódulos en ratones TG dnNumb revela una disminución drástica

en el porcentaje de células CD8 frente a un aumento en el porcentaje de células CD4 (Fig 9 A).

Diferentes causas podrían explicar esta alteración:

En primer lugar, se puede deber a un aumento de la muerte celular por apoptosis de las

células CD8SP en timo o en nódulos. Para analizar esta posibilidad medimos los niveles

superficiales de anexina V (Fig 5), la anexina es capaz de unirse a fosfolípidos que están

presentes en la cara externa de la membrana plasmática en células que están sufriendo

apoptosis, así pudimos comprobar que ni en células de timo ni de nódulos aparecían aumentados

los niveles de anexina, o de muerte celular por apoptosis en ratones TG dnNumb respecto a WT.

Figura 5: Niveles superficiales de anexina V. A. Niveles de anexina

V para células de timo, WT (línea continua) versus TG dnNumb (línea

discontinua). B. Niveles de anexina V para células de nódulos, WT

(línea continua) versus TG dnNumb (línea discontinua).


84

En segundo lugar, la ausencia de linfocitos T CD8 en nódulos podría ser causado por

una disminución en la producción de células CD8SP en timo, hipótesis también descartada, ya que

la relación DP/CD8SP en timo de ratones TG dnNumb es normal respecto a WT.

En tercer lugar, esta alteración podría ser causada simplemente por el hecho de los

números absolutos de células CD8SP producidas en timo sea menor, frente a un número normal

de células CD4SP, precursores inmediatos de células CD8 y CD4 maduras respectivamente, lo

que alteraría los porcentajes en periferia. En este caso la relación entre CD4SP/CD4 y

CD8SP/CD8 no se tendría que ver alterada. Para comprobar esto calculamos la relación entre las

células SP que se están produciendo en timo y las células maduras que aparecen en periferia, así

pudimos comprobar que para las células CD4 la relación era normal respecto al WT, sin embargo

la relación de células CD8 era mayor en ratones TG dnNumb respecto al WT, es decir en relación

al número de células CD8SP que se están produciendo en timo, el número de células CD8 en

periferia se encuentra disminuido (Fig 6).

Figura 6: Relación entre células SP/Maduras en periferia.

Relación CD4SP/CD4 en el panel de la derecha y CD8SP/CD8 en

el panel izquierdo en números absolutos de células en ratones de 4

semanas de edad WT (negro), TG dnNumb (gris) y TG Numb

(blanco).

La relación entre SP/Maduras podría considerase en este caso como una tasa de

migración desde el timo hacia nódulos, así el aumento de esta relación en el caso de células CD8

podría indicar una alteración en la tasa de migración hacia la periferia, lo que produciría un

acúmulo de células CD8SP en timo a lo largo del tiempo. Para comprobar esto, calculamos el

número absoluto de células CD8SP en el timo a diferentes edades, así pudimos ver que mientras

Resultados

85

que en ratones WT lo normal es una disminución en el número de células CD8SP por la propia

involución del timo, en ratones TG dnNumb se producía un aumento en el número absoluto de

células a 12 semanas de edad, indicando una acumulación de células CD8SP dentro del timo (Fig

7 A), sin embargo las células CD4SP presentan una dinámica de migración hacia la periferia

normal respecto a ratones WT.

Trabajos anteriores habían mostrado que en ratones que sobreexpresan CD69 durante

el desarrollo del timo se produce un secuestro de células SP en timo [114, 115], para comprobar si

en nuestro caso se producía el mismo fenómeno medimos los niveles superficiales de CD69 en

células SP maduras, pudimos comprobar que en células CD8SP de ratones TG dnNumb se

encontraban aumentadas los niveles superficiales de CD69 respecto a ratones WT, pudiendo ser

este el mecanismo por el cual las células quedan retenidas en timo (Fig 7 B). Por otro lado, las

células SP maduras cuando salen hacia la periferia expresan altos niveles de CD62L, aunque la

expresión de CD62L no es necesaria para la migración de los timocitos, si es imprescindible para

su entrada en órganos periféricos [116] , en ratones TG dnNumb hemos podido observar un

aumento en el número de células CD8SP que expresan niveles bajos de CD62L (Fig 7C).


86

Figura 7: Retención de CD8SP en timo de ratones TG dnNumb. A. Números

absolutos de células CD8SP y CD4SP en timo a diferentes edades de ratones

WT (negro) y TG dnNumb (gris).B. Niveles superficiales de TCR en células

CD4SP y CD8SP y niveles superficiales de CD69 en células con TCRhigh

(maduras) WT (línea continua) versus TG (dnNumb línea discontinua). C.

Niveles superficiales de CD62L en células CD4SP y CD8SP con TCRhigh de timo

WT (línea continua) versus TG (dnNumb línea discontinua).

Resultados

87

Por tanto, debido a la alteración de los números absolutos de células CD4SP y células

CD8SP en timo, se produce una alteración en la relación CD4SP/CD8SP, como es lógico esto

lleva a una alteración en el mismo sentido de la relación CD4/CD8 por ser las células SP sus

precursores, pero en nuestro caso a esta alteración lógica se le suma el hecho de que las células

CD8SP quedan retenidas en el timo lo que acentúa aun más la alteración en la relación CD4/CD8

en nódulos (Fig 9, página X)

4. ANÁLISIS FENOTÍPICO DE LOS NÓDULOS LINFÁTICOS EN

RATONES TG dnNUMB Y TG NUMB.

4.1 Expresión de proteínas transgénicas en nódulos de ratones TG dnNumb y

TG Numb, modulación de la actividad de Notch en nódulos de ratones TG .

De la misma manera que en timo, en nódulos hemos trabajado con dos líneas de ratones

transgénicos, TG dnNumb y TG Numb. Para comprobar la expresión de las proteínas

transgénicas, tanto la del dominante negativo como la de la isoforma p71 de Numb, realizamos un

western blot en células de nódulos frente a c-myc tag (Fig 8A), así pudimos comprobar que igual

que en timo, en nódulos también se produce la expresión de las proteínas transgénicas, además

pudimos ver que los niveles de expresión de estas eran parecidos a los que aparecen en células

SP de timo, ya que los niveles de CD2 son iguales entre células de la periferia y células SP de timo

(Fig 8 B). Por otro lado hemos podido comprobar que no existen diferencias en la expresion de

Numb entre linfocitos T CD4 y CD8 (Fig 2D).

Puesto que con anterioridad en el laboratorio habíamos comprobado que la inhibición de

Numb en los ratones TG dnNumb provocaba un aumento en los niveles de HES-1 en el timo,

quisimos comprobar que en nódulos ocurría el mismo fenómeno, así mediante PCR-RT

cuantificamos la cantidad de HES-1 en ratones WT, TG dnNumb y TG Numb, así igual que ocurre

en el timo se produce un aumento de HES-1 en ratones TG dnNumb, y en ratones TG Numb se

produce el fenómeno contrario, una disminución de los niveles de expresión de HES-1 debido a

que la sobreexpresión de Numb inhibe la actividad de Notch (Fig 8 C).


88

Figura 8: A. Expresión de las proteinas transgénicas dnNumb y Numb

p71. B. Niveles de expresión superficiales de CD2 en células CD4 y CD8

de ratones WT. C. Niveles relativos de ARN-m de HES-1 en ratones WT,

TG dnNumb y TG Numb. D.Niveles de expresion de Numb en células CD4

y CD8 purificadas de nódulos de ratones WT.

4.2 Alteración en la relación CD4/CD8 en nólulos en ratones TGdnNumb.

La retención de células CD8SP en el timo produce, como es lógico, un disminución

drástica en el porcentage de células CD8 frente a un aumento en el porcentaje de CD4, sin

embargo este aumento en el porcentaje de células CD4 se debe a la reducción en el número de

CD8 ya que los números absolutos de CD4 no se ven alterados en ratones TG dnNumb. Esta

alteracion en los porcentajes y en los números absolutos provoca una alteración en la relación

CD4/CD8 (Fig 9 A y B). Esta alteración no se obsrva en ratones TG Numb.

Resultados

89

Figura 9: Análisis fenotípico en nódulos. A Citometría de flujo en células

extraídas de nódulos frente a CD4 y CD8. B. Relación en números

absolutos entre CD4/CD8 en nódulos para ratones WT, TG dnNumb y TG

Numb.

4.3 Alteración en la relación de células Virgenes/Efectoras-Memoria en ratones

TG dnNumb

Lo siguiente que quisimos estudiar fue el fenotipo que presentan las células T en

periferia, en ratones WT se mantiene una relación entre el número de células T vírgenes y en

número de células T con fenotipo efector-memoria dirigida por el fenómeno conocido como

homeostasis [117]. De esta manera en animales jóvenes en los que aparece un timo muy

desarrollado las células de la periferia son predominantemente células T vírgenes, por el contrario

en animales de más edad cuando el timo involuciona, el pool de células T en periferia está

constituido por una gran proporción de células memoria. Es conocido que este fenómeno se

agrava cuando se produce en periferia una disminución de células T, algunos autores denominan a


90

este proceso proliferación inducida por linfopenia o LIP. Para analizar el fenotipo de las células T

en nódulos aislamos células de nódulos de ratones de cuatro semanas de edad e hicimos una

citometría de flujo frente a CD44 y CD62L, de esta manera se pueden diferenciar las células con

fenotipo virgen; CD44low CD62Lhi, de células con fenotipo efector-memoria; CD44hi CD62Llow [118].

Así pudimos observar que en ratones TG dnNumb se produce un aumento en el porcentaje de

células CD4 con fenotipo virgen frente a un aumento en células CD8 con fenotipo efector-memoria

respecto a WT, alterando la relación entre Naive/Efectora-Memoria. (Fig 10 A y B).

Puesto que las células CD44hi CD62Llow, pueden ser células efectoras o bien un tipo de

células memoria denominados TEM, para poder comprobar si este aumento en células CD8 con

fenotipo efector-memoria se debía a un aumento en el número de células efectoras o bien a un

aumento en el número de células memoria, hicimos una citometría de flujo frente a CD44 y CD25,

de esta manera podemos diferenciar entre los tres fenotipos posibles, siendo las células T

vírgenes CD44low CD25low, las células efectoras CD44hi CD25hi, y las células memoria CD44hi

CD25low [118]. Así, pudimos comprobar que este aumento de células CD8 con fenotipo efector-

memoria se debía a un aumento en el número de células memoria (Fig 11).

Por tanto, la mayoría de las células CD8 de ratones TG dnNumb que aparecen en

periferia presentan un fenotipo memoria, mientras que las células CD4 son mayoritariamente

células T vírgenes.

En cuanto a ratones TG Numb no hemos observado ninguna alteración significativa en el

fenotipo adoptado por las células T en periferia.

Resultados

91

Figura 10: Fenotipo de células T en nódulos. A. Citometría de flujo frente a

CD44 y CD62L de células CD4 y CD8 en ratones WT, TG dnNumb y TG Numb

de cuatro semanas de edad, los números representan el tanto por ciento de

células CD44lowCD62hi y de células CD44hiCD62Llow. B Relación entre

porcentajes de células con fenotipo virgen/efector-memoria.


92

Figura 11: Aumento en el porcentaje de células CD8 memoria en

ratones TG dnNumb. Citometría de flujo para células CD8 de

nódulos de ratones WT y TG dnNumb frente a CD25 y CD44, los

números indican el porcentaje de células contenido en cada gate.

5. MODULACIÓN DE LOS NIVELES SUPERFICIALES DE TCR.

Puesto que Numb ha sido descrita con anterioridad como una proteína adaptadora que

interviene en procesos de endocitosis y de degradación de receptores de membrana como EGFR

y Tfr [97], y puesto que anteriormente hemos descrito una alteración de los niveles de TCR en

timocitos que están sufriendo selección positiva, pensamos que Numb podría estar implicada en la

modulación de los niveles superficiales de TCR. El TCR que se expresa en la superficie está

continuamente siendo internalizado de manera constitutiva, este TCR internalizado puede de

nuevo ser reciclado hacia la membrana o puede dirigirse hacia lisosomas donde es degradado,

manteniéndose así constantes los niveles de TCR superficiales, sin embargo tras la estimulación

del TCR se produce una drástica disminución de los niveles superficiales de TCR, producida por

un aumento en la tasa de internalización y/o en la tasa de degradación.

5.1 Dinámica normal del ciclo constitutivo del TCR en ratones TG dnNumb.

En primer lugar pudimos comprobar que los niveles de TCR superficial en células CD4

de nódulos no se encuentran alterados en ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 12 B), siendo

esto un indicativo de que la tasa de internalización constitutiva del TCR no se encuentra alterada,

Resultados

93

para comprobar esta hipótesis medimos la tasa de internalización del TCR a diferentes tiempos,

para ello células de nódulos fueron cultivadas a 37ºC en presencia de cicloheximida y brefeldin A

con el objetivo de inhibir la síntesis de novo y el reciclaje de vesículas hacia la membrana, a cada

tiempo de estimulación se midieron los niveles superficiales de TCR mediante citometría de flujo

(Fig 12 B), así pudimos comprobar que esta no se encuentra afectada en ratones TG dnNumb.

Estos datos explicarían que los niveles de TCR en células CD4 de nódulos no se encuentren

alterados, así como que los niveles de TCR en células DP de ratones TG dnNumb sean también

normales, ya que en este estadio de desarrollo las células DP aún no han sido estimuladas a

través del TCR.

Figura 12: Internalización constitutiva del TCR. A Niveles superficiales

de TCR en células CD4 de nódulos, WT (línea continua) versus TG (línea

discontinua). B. Dinámica de la internalización del TCR a diferentes

tiempos de cultivo, WT (línea continua) versus TG (línea discontinua).


94

5.2 Alteración de la modulación del TCR dependiente de ligando en ratones TG

dnNumb.

Puesto que en la modulación de los niveles superficiales de TCR dependiente de ligando

participa un segundo mecanismo diferente al mecanismo que participa en el del ciclo constitutivo

del TCR [64], era lógico pensar que Numb podría afectar a la modulación dependiente de ligando,

aunque no fuese así con el ciclo constitutivo. Además, anteriormente habíamos observado una

alteración en los niveles de TCR en células DP de timo que están dentro de la selección positiva o

que han sido activadas por TCR. Para estudiar este punto, estimulamos células extraídas de

nódulos con 10 µ g/ml de anti-CD3 unido a placa y con 1 µ g/ml de anti-CD28 a diferentes tiempos,

tras los diferentes tiempos de estimulación medimos por citometría de flujo los niveles superficiales

de TCR, y calculamos el porcentaje de TCR modulado según se explica en el apartado de

métodos, de esta manera pudimos comprobar que la modulación del TCR se producía de manera

más rápida en ratones TG dnNumb respecto a WT durante tiempos cortos de estimulación (Fig 13

C), sin embargo cuando el tiempo de estimulación se ampliaba hasta 12 horas, se observaba un

aumento de los niveles de TCR superficial en ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 13 A).

Además este aumento del TCR también se observó cuando se midieron los niveles totales de TCR

tras 12 horas de estimulación mediante el empleo de tinción intracelular y superficial

simultáneamente (Fig 13 B).

Resultados

95

Figura 13: Modulación del TCR dependiente de ligando. A. Niveles

superficiales de TCR en células CD4 de nódulos tras 12 horas de

estimulación en ratones WT (línea continua) versus ratones TG dnNumb

(línea discontinua). B. Niveles totales de TCR en células CD4 de nódulos

tras 12 horas de estimulación en ratones WT (línea continua) versus ratones

TG dnNumb (línea discontinua). C. Representación grafica de la dinámica

de modulación del TCR en células CD4 de nódulos a diferentes tiempos de

estimulación en ratones WT (línea continua) versus ratones TG dnNumb

(línea discontinua).

El aumento tanto de TCR superficial como del TCR total tras 12 de horas de

estimulación, puede ser explicado mediante dos hipótesis, en primer lugar, puede ser producido

por una falta de internalización del TCR hacia el citoplasma, y en segundo lugar, por una inhibición

en la degradación del TCR, puesto que la primera hipótesis queda descartada por el hecho de que


96

a tiempos cortos de estimulación la modulación del TCR se produce de manera más rápida en

ratones TG dnNumb respecto a WT, lo que indica que no existe una falta de internalización,

quisimos comprobar la segunda hipótesis. Para esto estimulamos a diferentes tiempos células

extraídas de nódulos con anti-CD3 unido a placa y anti-CD28, tras la estimulación se realizó un

western blot frente a la cadena ζ del TCR, así pudimos comprobar que la degradación de la

cadena ζ del TCR se encontraba parcialmente inhibida en ratones TG dnNumb respecto a WT

(Fig 14).

Figura 14: Degradación del TCR. Dinámica de degradación de la

cadena ζ del TCR en células de nódulos estimuladas a diferentes

tiempos.

Por tanto, aunque el ciclo constitutivo del TCR no aparece afectado en ratones TG

dnNumb, sí se produce una alteración en la modulación del TCR dependiente de ligando debido a

una inhibición en la degradación del TCR.

5.3 Aumento en el número de vesículas de TCR en el citoplasma

La inhibición parcial de la degradación del TCR explica el aumento de los niveles de TCR

superficial y total, pero no aclara el hecho de que a tiempos cortos de estimulación se produzca

una modulación más rápida del TCR en ratones TG dnNumb, por esto pensamos que la inhibición

en la degradación del TCR podría alterar la tasa de reciclaje a la membrana, quedando retenidas

las vesículas de TCR en citoplasma, para comprobar esta hipótesis utilizamos la microscopía

Resultados

97

confocal con el fin de analizar el número de vesículas citoplasmáticas de TCR tras estimulación.

Para esto, células de nódulos fueron aisladas e incubadas con anti-TCR Alexa 647, tras el cross-

linking del TCR las células fueros cultivadas a 37ºC durante una hora, la tinción con TCR y su

posterior cross-linking nos sirve no sólo para poder visualizar el TCR sino de activación de la

internalización del TCR, por tanto las vesículas de TCR observadas representan el TCR

internalizado tras su unión a ligando, así pudimos observar que tras una hora de estimulación se

producía un aumento significativo de vesículas citoplasmáticas de TCR en células CD4 de ratones

TG dnNumb respecto a ratones WT(Fig 15).

Figura 15: Aumento en el número de vesículas retenidas en

citoplasma en ratones TG dnNumb. A Imágenes de microscopia

confocal de células CD4 de nódulos de ratones WT y TG dnNumb,

células no estimuladas en el primer panel y estimuladas en el segundo

panel, en rojo el TCR y en verde CD4. B. Recuento del número total de

vesículas de TCR por célula en linfocitos T CD4 de ratones WT y TG

dnNumb.


98

5.4 El dominante negativo de Numb compite con Numb endógena por su unión

al complejo del TCR tras la estimulación de éste.

Por tanto Numb parece tener un papel directo en la modulación de los niveles superficiales

de TCR tras estimulación con ligando, para comprobar esto utilizamos microscopia confocal con

el fin de intentar visualizar una colocalización entre Numb y el complejo del TCR tras la activación.

Con este fin células de nódulos WT fueron teñidas con anti-TCR Alexa 647 y cultivadas durante

una hora a 37ºC tras el cross-linking, posteriormente fueron permeabilizadas y teñidas frente a

Numb , de esta manera pudimos observar una colocalización entre Numb y el complejo del TCR

en ratones WT (Fig 16).

Figura 16: Asociación de Numb al complejo del TCR tras activación. Imágenes

de microscopia confocal de células CD4 de nódulos en las que se observa la

colocalización entre vesículas de TCR y Numb en ratones WT. Las flechas

indican los puntos de colocalización de Numb con vesículas de TCR.

Mediante la misma técnica empleada anteriormente pudimos comprobar la localización del

dominante negativo de Numb en ratones TG dnNumb, en este caso utilizamos un anticuerpo frente

a c-myc tag humana para detectar la presencia del dominante negativo de Numb, así pudimos

observar que el dominante negativo se localizaba en el complejo del TCR tras la activación del

mismo. Estos datos podrían indicar que el dominante negativo de Numb compite con la proteína

Numb endógena por su unión al complejo del TCR (Fig 17). Además probablemente Numb se une

al complejo del TCR a través de su dominio PTB, ya que el dominante negativo mantiene su

capacidad para colocalizar con el complejo del TCR.

Resultados

99

Figura 17: Localización del Numb dominante negativo. Imágenes de

microscopia confocal de células CD4 purificadas y estimuladas

durante una hora en las que se observa la colocalización entre

vesículas del TCR y dnNumb. En el panel superior se muestran células

WT como control negativo de la tinción frente al dominante negativo.

5.5 Disminución en la colocalización entre Numb y TCR en ratones TG

dnNumb.

Esta competencia entre Numb y su dominante negativo por unirse al complejo del TCR,

produciría una disminución en la asociación entre la proteína Numb endógena y el complejo del

TCR en ratones TG dnNumb, para comprobar esto, medimos el porcentaje de colocalización del

TCR con la proteína Numb endógena en células activadas durante una hora de ratones WT y de

ratones TG dnNumb utilizando la misma técnica anteriormente descrita, en este caso utilizamos un

anticuerpo frente a Numb que reconoce la región carboxi-terminal de Numb, por tanto el anticuerpo

no reconoce al dominante negativo de Numb, sino que solo se une a la proteína Numb endógena,

de esta manera pudimos comprobar que en ratones TG dnNumb se reducía el porcentaje de TCR

que colocalizaba con Numb en células CD4 estimuladas (Fig 18 A y B).


100

Figura 18: Tasa de colocalización entre TCR y Numb: A. Imágenes de

microscopía confocal de células CD4 tras una hora de estimulación en las

que se observa la colocalización de TCR y Numb. B. Cuantificación del %

TCR que colocaliza con Numb en células CD4 de ratones WT y TG dnNumb

calculado según se describe en Materiales y Métodos.

Por tanto Numb colocaliza con el complejo del TCR tras la estimulación por ligando, siendo

necesario para esta localización el dominio PTB, puesto que el dominante negativo empleado está

constituido por el propio PTB de Numb y este sigue manteniendo su capacidad para colocalizar

con el complejo del TCR, de esta manera Numb y su dominante negativo compiten por la unión al

complejo, disminuyendo la cantidad de Numb endógena que es capaz de unirse al complejo del

TCR.

Resultados

101

5.6 Numb y su dominante negativo coinmunoprecipita con CD3ε tras la

activación del TCR por ligando.

El PTB de Numb tiene la capacidad de unirse a secuencias de internalización NPXY

presentes en los dominios intracitoplasmáticos de diferentes receptores [81]. Puesto que

anteriormente habíamos demostrado que tanto Numb como el dominante negativo colocalizan con

el complejo del TCR, quisimos estudiar a qué cadena de éste son capaces de asociarse. Puesto

que la cadena CD3ε s la única cadena que presenta un dominio canónico de unión al PTB, NPXY

(Human protein reference database), fue el primer candidato para estudiar su asociación con Numb y

con el dominante negativo, para ello células totales de timo de ratones WT fueron lisadas y se

realizó una inmunoprecipitación para Numb mediante la cual pudimos comprobar que una pequeña

fracción de Numb se encuentra asociada a CD3ε (Fig 19 A). Puesto que dentro de la población

total del timo solo una pequeña porción de células se encuentra activada, pensamos que la

asociación de Numb a CD3ε podría ser dependiente de estimulación, así quisimos comprobar si la

estimulación con ligando aumentaba la fracción de Numb unida a CD3ε, para esto células de

nódulos de ratones WT y TG dnNumb fueron estimuladas con anti-CD3 unido a placa durante 4

horas. Tras el tiempo de estimulación las células fueron lisadas y se realizó una

inmunoprecipitacion de Numb, de esta manera pudimos comprobar que en células sin estimular

Numb no aparece asociado a CD3ε, sin embargo tras la estimulación por ligando CD3ε es capaz

de inmunoprecipitar junto con Numb (Fig19 B). Puesto que anteriormente habíamos comprobado

por microscopia confocal que el dominante negativo mantiene su capacidad para colocalizar con el

complejo del TCR, quisimos realizar el mismo experimento para el dominante negativo, para esto

células de nódulos de ratones WT y TG dnNumb fueron estimuladas con anti-CD3 unido a placa

durante 4 horas, tras el tiempo de estimulación las células fueron lisadas y se realizó una

inmunoprecipitación del dominante negativo mediante la utilización de un anti-myc, así pudimos

observar que el dominante negativo actúa de la misma manera que Numb endógeno, es decir es

capaz de coinmunoprecipitar con CD3ε tan solo en células estimuladas (Fig 19 C). Por tanto, estos

datos indican que la coinmuoprecipitación de CD3ε con Numb es dependiente de la estimulación

del TCR por ligando, y del dominio PTB de Numb.


102

Figura 19: Numb y dnNumb coinmunoprecipitan con CD3ε

dependientemente de activación por ligando: A. Células totales de timo WT

en las que fue inmunoprecipitado Numb. El producto de la

inmunoprecipitación fue separado por western blot y revelado frente a

CD3ε y Numb. B. Células de Nódulos de ratones WT estimuladas durante 4

horas y sin estimular, en las que fue inmunoprecipitado Numb, el producto

de la inmunoprecipitación fue separado por western blot y revelado frente a

CD3ε y Numb. C .Células de nódulos WT y TG dnNumb estimuladas y sin

estimular en las que fue inmunoprecipitado el dominante negativo con anti

c-myc, el producto de la inmunoprecipitación fue separado por western blot

y revelado frente a CD3ε y c-myc.

Resultados

103

5.7 Disminución en la tasa de colocalización entre TCR y Cbl en ratones TG

dnNumb.

En condiciones normales la proteína Numb endógena se uniría al complejo del TCR

mediante su PTB y actuaría como una proteína adaptadora reclutando mediante su dominio

carboxi-terminal a otras proteínas necesarias para la correcta modulación del TCR. Este modo de

actuación ha sido descrito con anterioridad para la modulación de Notch, en este caso Numb se

une por su dominio PTB al dominio IC de Notch y mediante su dominio carboxi-terminal es capaz

de reclutar a la ubiquitin ligasa Itch [103], en el caso del TCR la ubiquin ligasa encargada de su

degradación es Cbl, y debido a que anteriormente habíamos descrito que en ratones TG dnNumb

se encuentra alterada parcialmente la degradación del TCR, quisimos abordar el estudio de este

posible mecanismo de actuación de Numb en la modulación del TCR .


104

Figura 20: Tasa de colocalización entre TCR y Cbl: A. Imágenes de

microscopía confocal de células CD4 incubadas durante una hora tras el

cross-linking del TCR en las que se observa la colocalización de TCR y Cbl. B.

Cuantificación del % TCR que colocaliza con Cbl en células CD4 de ratones

WT y TG dnNumb tras una hora de estimulación, el % de colocalización fue

calculado según se describe en Materiales y Metodos.

Para abordar esta cuestión utilizamos microscopía confocal con el fin de cuantificar el

porcentaje de asociación entre el TCR y Cbl en células que habían sido estimuladas durante una

hora tras el cross-linking del TCR, de esta manera pudimos ver que en ratones TG dnNumb

disminuía el porcentaje de TCR que colocalizaba con Cbl. Esta disminución en la tasa de

reclutamiento de Cbl hacia el complejo del TCR explica la parcial inhibición en la degradación de la

cadena ζ observada con anterioridad, puesto que es Cbl la ubiquitin ligasa encargada de la

degradación del TCR. (Fig 20 A y B).

5.8 El dominante negativo de Numb no es capaz de unirse a la ubiquitin ligasa

Cbl.

Anteriormente se había demostrado que Numb coinmunoprecipita junto con Cbl en

timocitos [100], de esta manera nosotros hemos sido capaces de reproducir estos datos en nuestro

laboratorio (Fig 21 A), sin embargo, hemos podido demostrar mediante el empleo de la misma

técnica que el dominante negativo de Numb pierde la capacidad de unirse a Cbl, indicando que Cbl

se une a Numb mediante el dominio carboxi terminal de éste. Puesto que este dominio no se

encuentra presente en el dominante negativo, éste pierde la capacidad de coinmunoprecipitar con

Cbl (Fig 21 B). De esta manera Numb actúa en la degradación del TCR del mismo modo que

opera en la degradación del dominio intracelular de Notch.

Resultados

105

Figura 21: El dominante negativo no es capaz de unirse a Cbl. A.

Inmunoprecipitación de Numb en timocitos de ratones WT, western blot para

Cbl y Numb B. Inmunoprecipitación del dominante negativo en timocitos de

ratones WT y TG dnNumb, western blot para Cbl y el dominante negativo.

5.9 Los niveles endógenos de Numb aumentan ligeramente durante la

estimulación de linfocitos T.

Con los experimentos expuestos anteriormente hemos demostrado que Numb participa

en la degradación del TCR tras la estimulación por ligando de linfocitos. Para comprobar como se

comporten los niveles endógenos de Numb durante la estimulación de linfocitos T, células de

nódulos fueron extraídas y estimuladas durante 4 y 6 horas con anti-CD3 unido a placa y anti-

CD28, tras los diferentes tiempos de estimulación las células fueron lisadas y se analizó la

cantidad total de Numb en cada tiempo mediante western blot (Fig 22). Los resultados obtenidos

indican que durante la estimulación de linfocitos T, los niveles de Numb endógeno aumentan

ligeramente.


106

Figura 22: Los niveles de Numb no varían durante la estimulación de

linfocitos T. Células de nódulos totales de ratones WT estimuladas

durante 4 y 6 horas. Western frente a Numb, Cadena ζ y GAPDH.

5.10 Normal modulación de los niveles superficiales de TCR en ratones que

sobrexpresan Numb.

Para comprobar si la sobreexpresión de Numb afecta a la modulación de TCR

dependiente de ligando, células de nódulos extraídas de ratones TG Numb y WT fueron

estimuladas durante 12 horas con anti-CD3 unido a placa y anti-CD28, tras este tiempo de

estimulación se midieron por citometría los niveles superficiales y totales de TCR en células CD4

(Fig. 23 A y B), así pudimos comprobar que en relación al WT la modulación del TCR dependiente

de ligando no se encontraba alterada en ratones que sobreexpresan Numb. Además de presentar

una modulación normal respecto a WT, también comprobamos que la degradación de la cadena

CD3ζ era normal en ratones TG Numb, para esto células de nódulos fueron estimuladas durante 4

y 6 horas con anti-CD3 unido a placa y anti-CD28, tras la estimulación los niveles de CD3ζ fueron

analizados mediante western blot (Fig. 23 C).

Resultados

107

Figura 23: Modulación del TCR en ratones TG Numb: A. Niveles superficiales

de TCR en células CD4 de nódulos tras 12 horas de estimulación (WT línea

continua y TG línea discontinua). B. Niveles totales de TCR en células CD4 de

nódulos tras 12 horas de estimulación (WT línea continua y TG línea

discontinua). C. Dinámica de degradación de la cadena CD3ζ en células totales

de nódulos a diferentes tiempos de estimulación.

5.11 Alteración en la polarización de Numb hacia la zona de sinapsis.

Puesto que hemos podido comprobar con anterioridad que el dominante negativo de

Numb compite con Numb endógena por unirse al complejo del TCR, pensamos que este fenómeno

podría estar alterando la polarización de Numb hacia la zona de sinapsis, hecho que anteriormente

ha sido demostrado en otros trabajos [100, 111]. Para comprobar esta hipótesis inducimos en

células CD4 de nódulos la polarización del TCR mediante una estimulación con anti-CD3 unido a

placa, mediante este sistema de estimulación conseguimos que el TCR se una a ligando

solamente en la zona de contacto entre la células y la placa, provocando la polarización del TCR

hacia esta zona de activación [113]. Tras la activación celular pudimos observar mediante

microscopia confocal que en ratones WT se producía una migración de Numb hacia la zona de

polarización del TCR, por el contrario en ratones TG dnNumb no se observaba esta polarización y

Numb quedaba simétricamente localizada en toda la membrana plasmática (Fig 24).


108

Figura 24: Polarización de Numb durante la sinapsis inmunológica:

Imágenes de microscopía confocal que muestran células CD4 de nódulos

durante la sinapsis inmunológica, en las que se observa la polarización o

no de Numb hacia la zona de sinapsis.

Pudimos comprobar que las sinapsis observadas eran sinapsis maduras analizando por

microscopia confocal la polarización de la tubulina, otra de las proteínas que se polarizan durante

la sinapsis inmunológica.

Figura 25: Polarización de tubulina hacia la zona de sinapsis.

Células CD4 de ratones WT en las que se observan sinapsis

maduras.

Resultados

109

6. SEGREGACIÓN DE NUMB DURANTE LA DIVISIÓN DE

LINFOCITOS T CD4 MADUROS.

La proteína Numb ha sido descrita anteriormente en numerosos trabajos como una

proteína que se segrega asimétricamente durante la división celular en el desarrollo del sistema

nervioso, y que influye de esta manera sobre la diferenciación de las células hijas [119],

participando así en procesos de división asimétrica. Pero no solo se ha visto implicada en el

desarrollo del sistema nervioso, en cuanto al sistema inmune, Numb migra hacia la zona de

sinapsis inmunológica colocalizando con TCR y Notch [100], y se ha descrito con anterioridad que

Numb se segrega asimétricamente durante la división de células CD8 [111].

Previamente en otros trabajos realizados ya se había descrito que Numb se segrega

asimétricamente durante la división de linfocitos T CD8 [111], por esto quisimos comprobar si esta

distribución asimétrica de Numb también se producía durante la división de linfocitos T CD4. Para

comprobar esto, estimulamos células aisladas de nódulos con anti-CD3 unido a placa y anti-CD28

durante 72 horas, tras este tiempo las células se prepararon para su visualización mediante

microscopía confocal , de esta manera utilizando TOPRO como marcador de ADN pudimos

diferenciar entre células que se encuentran en mitosis y células que se encuentran en estado pre-

mitótico. Como resultado pudimos observar que en células CD4 de ratones WT que se encuentran

en anafase se produce una polarización de Numb hacia uno de los polos celulares (Fig 26 A primer

panel). Mediante la cuantificación de la cantidad de Numb localizada en cada polo o futura célula

hija pudimos comprobar que la polarización de Numb no era total, es decir, se produce una

segregación asimétrica de Numb, heredando de media una de las células hijas el 63% de Numb

total frente a un 36% de Numb heredado por la segunda célula hija , por tanto no se trata de un

sistema en el que se hereda “ todo o nada”.

Lo siguiente que quisimos comprobar es cómo afecta a la segregación de Numb durante

la mitosis tanto la expresión del dominante negativo de Numb como la sobreexpresión de la

isoforma de Numb p71, para esto realizamos el mismo experimento anterior con células aisladas

de ratones TG dnNumb y TG Numb. Sorprendentemente pudimos ver que el efecto en los dos

ratones era el mismo, se producía una segregación de Numb mas simétrica que en el caso de

células CD4 de WT. Para ratones TG dnNumb encontramos que la media de segregación de

Numb era de un 46% de Numb total para la célula que hereda la menor cantidad y de un 53% la


110

que hereda más cantidad, y para ratones TG Numb las medias eran de un 44% y un 55% (Fig 26

A, segundo y tercer panel).

Por tanto, tanto el dominante negativo para Numb como la sobreexpresión de Numb

producen una pérdida en la segregación asimétrica de Numb durante la división celular, sin

embargo el hecho del que en ratones TG dnNumb las dos células hijas hereden Numb, no implica

el mismo comportamiento que en ratones TG Numb, ya que a pesar de heredar Numb esta

preoteína se encuentra inhibida en ratones TG dnNumb debido a la expresión del dominante

negativo.

Figura 26: Segregación de Numb durante la división celular. A. Imágenes

de microscopía confocal que muestran células CD4 durante la etapa de

Resultados

111

anafase de la mitosis en las que se observa la polarización o no

polarización de Numb, los números indican las medias del porcentaje de

Numb heredado por cada célula hija. B. Representación gráfica de la

cuantificación del porcentaje de Numb heredado por cada célula hija, la

célula que hereda mayor cantidad se representa en la columna izquierda y

la que hereda menor cantidad en la columna derecha de cada ratón WT, TG

dnNumb o TG Numb.

En la siguiente tabla aparece el % de Numb heredado por cada célula hija que se

ha cuantificado para células CD4 de nódulos de ratones WT, TG dnNumb y TG Numb. En la

primera columna de cada ratón se muestra el % de Numb segregado hacia las células que

hereda mayor cantidad, y en la segunda columna de cada ratón el porcentaje de la célula que

hereda la menor cantidad de Numb, en la última fila se muestran las medias. Las diferencias

entre el % de Numb heredado por cada célula hija son significativamente diferentes tanto en

ratones WT como en los dos tipos de ratones TG, pero se observa una disminución de la

segregación asimétrica de Numb en ratones TG dnNumb y TG Numb respecto a WT.

WT TG dnNumb TG Numb

DC#1 DC#2 DC#1 DC#2 DC#1 DC#2

75 25 58,1 41,9 59,01 40,98

65,72 34,28 56,78 43,23 57,87 42,12

65,1 34,9 53,07 46,93 57,20 42,79

64,23 35,77 52,95 47,05 57,03 42,98

62,99 37,01 51,53 48,47 54,77 45,22

61,25 38,75 51,07 48,03 52,48 47,51

59 41 50,94 49,06 52,05 47,94

55,36 44,64 50,28 49,72 52,04 47,95

63,58 36,41 53,09 46,79 55,30 44,68

DISCUSIÓN

Discusión

115

DISCUSIÓN GENERAL

Mediante el empleo de ratones que expresan un dominante negativo para Numb hemos

podido estudiar el papel de Numb en la modulación del TCR. El empleo de dominantes negativos

para la inhibición de la función de una proteína puede potencialmente acarrear la inhibición de

otras proteínas que presenten un alto grado de homología en la región utilizada como dominante

negativo. En nuestro caso, puesto que el dominante negativo utilizado en nuestros ratones se

encuentra constituido por la región PTB de Numb, las proteínas homólogas a Numb podrían ser

Dab-2 y ARH, cuyos PTBs presentan un alto grado de similaridad con el PTB de Numb [86]. Esta

posibilidad queda descartada por el hecho de que ratones dobles transgénicos para dnNumb y

Numb restauran el fenotipo totalmente en timo, recobrando unos números absolutos normales. Los

ratones que expresan Numb dominante negativo se caracterizan por una disminución en la

cantidad de Numb endógena funcional, por el contrario los ratones que sobreexpresan Numb van a

presentar un aumento en la cantidad de Numb funcional, de esta manera en los ratones dobles

transgénicos se consiguen restaurar los niveles funcionales de Numb y con esto un fenotipo

normal en timo. Puesto que los ratones TG dnNumb se caracterizan por una disminución en la

celularidad total del timo, y los ratones TG Numb por un aumento, podemos decir que los niveles

funcionales de Numb regulan la celularidad total del timo. Puesto que los ratones con delección

condicional de Numb no muestran ninguna alteración en el desarrollo del timo [100],

probablemente debido a la presencia de su homólogo funcional Numblike [78, 120], dada la alta

homología entre los PTBs de Numb y Numblike el dominante negativo de Numb empleado en este

trabajo debe estar inhibiendo tanto a Numb como a Numblike de forma simultánea.

Numb ha sido anteriormente descrito como un modulador negativo del receptor Notch

[99, 103], en concordancia con ello hemos podido comprobar que la inhibición de Numb mediante

el dominante negativo provoca una sobreactivación de Notch en timo (Aguado, R.) y en nódulos de

ratones TG dnNumb, mientras que la sobreexpresión de Numb produce una disminución en la

actividad de Notch en nódulos de ratones TG Numb. La sobreactivación de Notch se ha

demostrado con anterioridad que lleva a una disminución del linaje B versus T [33], y a una

disminución del linaje Tγδ versus Tαβ [37], en ratones que expresan el dominante negativo, y por

tanto presentan una sobreactivación de Notch, se observa el mismo fenotipo (datos no

publicados), sin embargo, la sobreexpresión de Notch está relacionada con el aumento en la

selección positiva de células CD8SP [38] en nuestro caso, ratones que expresan el dominante


116

negativo no presentan aparentemente un aumento en selección de células CD8SP, puesto que la

relación DP/CD8SP es normal, fenotipo que no encaja con la sobreactivación de Notch. Es por

esto que cabe la posibilidad de que Numb no solo actúe como modulador de Notch sino que

además desarrolle otra función durante el desarrollo del timo.

El aumento o disminución de la celularidad total en timo en ratones TG Numb y TG

dnNumb respectivamente, ha sido aestudiado anteriormente en nuestro laboratorio (Aguado,R.).

Este fenotipo se debe a una alteración en la segregación de Numb durante la división asimétrica

de timocitos DN3 durante el desarrollo del timo. El aumento en la celularidad total del timo que se

observa en ratones TG Numb va acompañado de un aumento en todas las poblaciones que

conforman el timo, sin embargo en ratones TG dnNumb se observa una alteración en los

porcentajes de estas subpoblaciones, de esta manera, la disminución en la celularidad total de

células DP es consecuencia de alteraciones en la división de células DN que constituyen sus

precursores inmediatos, consecuentemente observamos también una disminución en el número

total de células CD8 SP derivado de la disminución en el número de precursores DP. Estas

disminuciones en los números absolutos de células DP y CD8SP son derivadas de la disminución

en el número de sus precursores, ya que no existe en ratones TG dnNumb ningún aumento en la

muerte celular por apoptosis dentro de estas subpoblaciones, además la relación entre células

DP/CD8SP es normal para ratones TG dnNumb a 4 semanas de edad, indicando que la

producción de células CD8SP es normal. Sin embargo, el número total de células CD4SP es

normal en ratones TG dnNumb respecto a WT, esto produce un aumento en la relación entre

células DP/CD4SP. Esto es un indicativo de un aumento en la tasa de producción de células

CD4SP frente a una tasa de producción de células CD8SP normal. Esta alteración no sería

consecuencia de la sobreactivación de Notch, sino que sería consecuencia de otra función de

Numb, ya que la sobreactivación de Notch está relacionada con un aumento de la selección de

CD8SP [38].

La toma de linaje CD4 versus CD8 viene determinada por la unión del complejo del TCR

a clase II o a clase I respectivamente, que se una a uno o a otro provoca una señalización por TCR

cuantitativamente diferente que desemboca en la diferenciación de células DP hacia células CD4 o

CD8. Según la teoría de “strenght of signaling” [11] las señales generadas por la activación del

TCR difieren entre sí en su intensidad, así señales generadas por la unión de clase II a TCR-CD4

son de alta intensidad y generan células CD4, mientras que señales generadas por la unión de

Discusión

117

clase I a TCR-CD8 son de menor intensidad y resultan en el desarrollo de células CD8SP. Según

esta teoría, la intensidad de la señal determina la toma de linaje, lo que implica que un aumento en

la intensidad de señalización es capaz de producir células CD4SP en ratones con un TCR

específico para clase I, siendo capaz de revertir la diferenciación de las células DP, y al contrario

en el caso de la selcción de las CD8SP[19]. Por el contrario, la teoría de “Kinetic signaling” [24]

defiende que las señales difieren en la duración, siendo las señales generadas por clase II más

prolongadas en el tiempo que las generadas por clase I. Según esta teoría, el aumento en la

intensidad de la señal lleva a un aumento en la eficacia o en la tasa de producción tanto de células

CD4 como CD8, es decir, ratones que expresan un TCR especifico para clase II con un aumento

de intensidad serían capaces de aumentar la tasa de producción de CD4SP, pero un aumento de

la intensidad en ratones con TCR especifico para clase I no produciría células CD4, sin embargo

un aumento en la duración si seria capaz de revertir el fenotipo en este caso. Debido a que la

señalización por TCR está implicada en la toma de linaje quisimos comprobar los niveles de

activación de células que están sufriendo selección positiva, CD4highCD8medium [29], de esta

manera hemos comprobado que en ratones TG dnNumb se producía un aumento en el número de

células que expresan altos niveles superficiales de marcadores de activación, tales como CD5 y

CD69, así como de TCR, en comparación con WT. Estos datos indican que se esta produciendo

un aumento en la señalización por TCR durante la selección positiva, pero no nos permiten

diferenciar entre un aumento en la intensidad o en la duración de la señal, y por tanto no somos

capaces de diferenciar si se esta produciendo un aumento de la eficiencia de la selección positiva

de CD4 o bien si se trata de un cambio en la toma de linaje.

Según esto, es probable que la regulación de la señalización por TCR dentro de la

selección positiva esté regulada por una actuación conjunta entre Notch [42] y Numb. En ratones

TG dnNumb, aunque se produce una sobreactivación de Notch que llevaría a una disminución en

la señalización por TCR [42], y a la generación de células CD8SP, la inhibición de Numb podría

provocar también un aumento en el tiempo de la señalización por TCR, siendo este fenómeno

probablemente predominante sobre la sobreactivación de Notch. Por otra parte, previos estudios

han demostrado que GATA-3 es un regulador de la diferenciación de DP hacia SP, de esta manera

la expresión de GATA-3 parece favorecer el desarrollo de células CD4SP, además los niveles de

expresión de GATA-3 correlacionan con la intensidad de la señalización por TCR [121],

posiblemente sea este uno de los mecanismos que actúan tras la señalización por TCR y que

determinan el linaje de las células DP según la modulación de la señalización por TCR.


118

Sin embargo, la sobreexpresión de Numb no produce ninguna alteración en la relaciones

DP/CD8SP y DP/CD4SP, indicando una selección positiva normal, además en ratones TG Numb

no encontramos alteraciones en los niveles superficiales de TCR, CD5 o CD69 en células que

están dentro de la selección positiva, este mismo fenómeno aparece en ratones que

sobreexpresan la isoforma p66 de Numb [110]. En estos ratones de la misma manera que ocurre

en los ratones que hemos empleado en este trabajo, el aumento en la expresión de Numb provoca

una disminución en la actividad de Notch, sin embargo no aparecen alteraciones en la producción

de células CD4 y CD8SP. Es posible que se precise una mayor sobreactivación de Numb que la

obtenida en nuestros ratones TG para observar un efecto. Además en otros trabajos realizados

anteriormente se observaba como la inhibición de Notch no produce alteraciones en la toma de

linaje CD4/CD8 [41].

Para explicar estos resultados quisimos estudiar el mecanismo por el cual Numb podría

regular la señalización por TCR. La señalización mediada por receptores puede ser regulada a dos

niveles, una forma de regulación es mediante la disponibilidad de segundos mensajeros que

participen en la cascada de señalización generada por la activación del receptor, en cuanto a esto

muchos son los trabajos anteriores en los que se ha demostrado que la alteración de la

señalización por TCR lleva a una alteración en la selección positiva, así cuando se produce una

reducción en la actividad Lck timocitos con TCR especifico de MHC-II se desarrollan hacia CD8 y

viceversa, cuando se produce un aumento en la actividad Lck, timocitos con TCRs específicos

para MHC-I se diferencian hacia CD4 [19]. Por otro lado ERK actúa de la misma manera, el

aumento en su actividad lleva a favorecer el linaje CD4 y su disminución favorece al linaje CD8

[20]. Un segundo mecanismo es regulando la disponibilidad del receptor para ser activado por su

ligando, este fenómeno puede ser regulado mediante la modulación de los niveles de expresión

del receptor en membrana, proceso que se lleva a cabo mediante endocitosis, reciclaje y

degradación del receptor. En cuanto a este mecanismo, tanto los KO de Cbl [122] como los KO de

SLAP [72], muestran un aumento en los niveles superficiales de TCR en células DP, que llevan a

un aumento en la señalización y en el desarrollo de células CD4SP. Puesto que Numb había sido

anteriormente relacionado con procesos de modulación de receptores [97] quisimos estudiar la

posibilidad de que Numb regula la modulación de los niveles superficiales del TCR.

El ciclo del TCR se lleva a cabo por dos mecanismos diferentes según se produzca de

manera constitutiva o tras estimulación por ligando [57-59]. Hemos podido demostrar en este

Discusión

119

trabajo que en ratones TG dnNumb no se encuentra afectado el ciclo constitutivo, puesto que los

niveles de TCR superficiales en células CD4 de nódulos no se encuentran alterados. Estos datos

coinciden con lo observado en células DP de timo, así las células DP, que son células que aún no

han sido estimuladas, es decir que no están sufriendo modulación de TCR dependiente de ligando,

no muestran alterados los niveles de TCR superficiales en ratones TG dnNumb respecto a WT, por

tanto podemos decir que Numb no participa en el ciclo constitutivo del TCR . Este mismo

fenómeno se observa en ratones KO para c-Cbl y Cbl-b [59], apareciendo intacto el ciclo

constitutivo del TCR. Anteriormente se había descrito que el ciclo constitutivo es independiente de

Cbl, y parece ser también independiente de Numb.

Puesto que la modulación dependiente de ligando se lleva a cabo por un mecanismo

diferente [60, 64, 123], quisimos estudiar este segundo mecanismo, así pudimos observar una

inhibición en degradación de la cadena ζ del TCR que lleva a un aumento en los niveles

superficiales de TCR tras 12 horas de estimulación. Este fenómeno está aparejado con a un

aumento en el número de vesículas de TCR internalizado en el citoplasma, probablemente

acumuladas por la falta de degradación.

Sin embargo, el hecho de que a tiempos cortos de estimulación la modulación del TCR

superficial sea más rápida en ratones TG dnNumb que en WT es un fenómeno menos claro. El

que la modulación sea más rápida puede ser explicado o bien por un aumento en la tasa de

internalización o bien por una disminución en la tasa de reciclaje hacia la membrana. Puesto que

un aumento en la tasa de internalización sería más propio de la sobreexpresión de Numb y no de

su inhibición, pensamos que el hecho de que las vesículas de TCR internalizado se acumulen en

el citoplasma podría estar alterando la tasa de reciclaje del TCR hacia la superficie celular. Esta

alteración de la tasa de reciclaje explicaría el hecho de que a tiempos cortos de estimulación los

niveles superficiales de TCR sean menores en ratones TG dnNumb respecto a WT. El defecto en

la degradación lleva a un acúmulo de vesículas de TCR internalizado en ratones TG dnNumb, que

tras quedar retenidas en el citoplasma vuelven a la membrana citoplasmática, este mismo

fenómeno fue descrito en ratones KO para SLAP [70], en los que se observa un aumento en el

pool de reciclaje del TCR debido a una inhibición en la degradación de la cadena ζ, siendo este

TCR de nuevo expresado en la membrana. Este mecanismo implica una conexión entre el ciclo de

internalización/reciclaje del TCR y el ciclo de internalización/degradación. De esta manera, está

descrito que para el reciclaje del TCR es necesario la desfosforilación de la Ser 126 presente en


120

CD3γ por parte de serin/treonin fosfatasas [52]. Tal vez el TCR retenido en el citoplasma por una

falta de degradación acabe siendo reciclado de nuevo a membrana por falta de fosforilación de la

Ser 126.

El aumento de los niveles de TCR superficiales tras 12 horas de estimulación coincide

con el hecho de que en células que están sufriendo selección positiva dentro del timo de observen

igualmente altos niveles de TCR superficial. Por tanto, Numb participa en la modulación de los

niveles superficiales del TCR tras estimulación por ligando. De esta manera, se produce un

aumento del tiempo de residencia en superficie del TCR que llevaría probablemente a la

prolongación en el tiempo de la señalización mediada por TCR, lo que hemos podido observar en

células que están sufriendo selección positiva mediante el aumento en los niveles superficiales de

marcadores de activación, alargando así el tiempo de señalización. Este fenómeno también

aparece en ratones KO para Cbl [59, 122], en el caso de los KO para Cbl se observa un aumento

en los tiempos de señalización por TCR que lleva a una prolongación del tiempo de fosforilación de

ERK tanto a nivel de timocitos como en células de periferia.

La modulación dependiente de ligando del TCR engloba dos fenómenos: la

internalización del TCR y su degradación. En cuanto a su degradación hemos demostrado que se

encuentra alterada en ratones TG dnNumb, y en cuanto a la internalización pesamos que el

dominante negativo no inhibe este proceso, primero debido a que la modulación es más rápida en

ratones TG dnNumb; y en segundo lugar hemos podido observar un aumento en vesículas de TCR

internalizado tras estimulación con ligando en ratones TG dnNumb. Además, ratones KO para c-

Cbl y Cbl-b son capaces de internalizar TCR de manera dependiente de ligando, lo que indica que

este proceso de internalización no es dependiente ni de Cbl ni de Numb [59]. Además en otro

trabajos realizados en los que se encuentra alterada la degradación de ζ, por inhibición de ZAP-70

o Lck [67, 69], no se encontraba alterada la tasa de internalización, por tanto parecen ser dos

mecanismos independientes.

En este trabajo hemos podido demostrar mediante microscopía confocal que Numb

colocaliza con vesículas de TCR tras la estimulación de células CD4 en nódulos, anteriormente en

otros trabajos se había demostrado que Numb colocaliza en vesículas que transportan diferentes

receptores, tales como Tfr y EGFR [97]. Del mismo modo proteínas con estructura homóloga a

Numb, como ARH, se han visto también implicadas en procesos de modulación de receptores, en

Discusión

121

este caso en internalización del receptor LDL [84]. Mediante microscopia confocal hemos podido

observar que Numb dominante negativo mantiene la capacidad de unión a las vesículas de TCR,

este hecho indica que Numb es capaz de colocalizar con vesículas del TCR dependientemente de

su dominio PTB. Además, dentro de este trabajo hemos demostrado que Numb es capaz de

coinmunoprecipitar junto a la cadena CD3ε mediante su dominio PTB, puesto que el dominante

negativo sigue manteniendo esta capacidad. Probablemente esta unión se lleve a cabo a través

del motivo canónico NPXY de unión del PTB de Numb que se encuentra presente junto a uno de

los motivos ITAM de la cadena CD3ε. Además, hemos podido comprobar que esta

coinmunoprecipitación es dependiente de activación, lo que explica que no se encuentre alterado

el ciclo del TCR constitutivo en ratones TG dnNumb. Por tanto Numb parece solo actuar en la

modulación del TCR dependiente de ligando. Si tanto Numb como el dominante negativo de Numb

son capaces de unirse al complejo del TCR, es lógico pensar que estos compiten entre sí, esta

situación es la causa de que disminuya la tasa de colocalización entre Numb y TCR en linfocitos

activados de ratones TG dnNumb. Por otra parte, anteriormente se había demostrado que Numb

coinmunoprecipita con la ubiquitin ligasa Cbl en timocitos [100]. En nuestro laboratorio hemos

podido reproducir estos datos, así mediante inmunoprecipitacion hemos podido observar que Cbl

coinmunoprecipita junto a Numb en timocitos de ratones WT, según estos datos es una pequeña

fracción de Numb la que se une a Cbl, probablemente debido a que los pellets celulares utilizados

en el experimento eran de timocitos totales, y dentro de los timocitos totales solamente una

pequeña fracción de ellos son timocitos activados. Por tanto, probablemente la asociación entre

Numb y Cbl se produce tras la activación celular, con el fin de facilitar la degradación del TCR, de

esta manera pensamos que la tasa de unión aumentaría si se realizara el experimento con

timocitos activados. Mediante la misma técnica hemos podido demostrar que el dominante

negativo de Numb no posee la capacidad de coinmonoprecipitar junto a Cbl, y por tanto de reclutar

a este hacia el complejo del TCR, esto demuestra que Numb coinmunoprecipita junto a Cbl

mediante su dominio carboxi-terminal, el cual en el caso del dominante negativo se encuentra

ausente.

En resumen, nuestros datos indican que Numb actúa como una proteína adaptadora

capaz de asociarse al complejo del TCR tras su activación por ligando, de esta manera Numb

actúa reclutando a Cbl hacia la vesícula del TCR, lo que lleva al paso a lisosomas y a su posterior

degradación. Nuestros experimentos indican, que el dominante negativo para Numb sigue

manteniendo su capacidad para unirse al complejo del TCR, desplazando de esta manera a Numb


122

endógena, ya que los niveles de colocalizacion entre Numb y TCR se encuentran disminuidos en

células activadas de ratones TG dnNumb, sin embargo el dominante negativo de Numb pierde la

capacidad para reclutar a Cbl hacia este complejo, este hecho provoca que células activadas del

TG dnNumb muestren una disminución en los niveles de colocalización entre Cbl y TCR. Estos

datos indican que Numb es capaz de unirse al complejo del TCR por su dominio PTB y reclutar a

Cbl mediante su unión a la región carboxi-terminal, que en el caso del dominate negativo se

encuentra ausente. La disminución en los niveles de colocalizacion entre Cbl y TCR podría llevar a

una disminución en los niveles de ubiquitinización de las cadenas del complejo CD3-TCR, y puesto

que los niveles de ubiquitinización están relacionados con el paso de endosomas a lisosomas

[124], este fenómeno podría provocar una inhibición del paso del TCR a lisosomas y de su

degradación, este mismo efecto aparece en ratones dobles KO para c-Cbl y Cbl-b en los que el

TCR queda retenido en endosomas sin aparecer dentro de lisosomas [59]. Este modelo de

actuación de Numb encaja con lo descrito acerca del papel de Numb en la degradación del

dominio intracelular de Notch, en este caso Numb es capaz de unirse por su región carboxi-

terminal a la ubiquitin ligasa Itch y a NIC por su PTB [99].

Discusión

123

Modelo propuesto para el papel de Numb en la modulación de los

niveles superficiales de TCR. La ruta 1 explica el papel de Numb en

condiciones normales, y la ruta 2 explica el efecto del dominante

negativo.

Otra proteína adaptadora implicada en la modulación de los niveles superficiales de TCR

es SLAP, en este caso SLAP tiene la capacidad de asociarse a la cadena ζ [70], y de actuar como

proteína adaptadora reclutando a Cbl hacia el complejo del TCR [71].

Es posible que Numb y SLAP desarrollen un papel parecido en cuanto a la modulación de los

niveles superficiales de TCR, pero tal vez actúen durante fases del desarrollo diferentes, en

nuestro caso, Numb solo participa en la modulación del TCR tras la activación de este por ligando,

proceso que ocurre durante la selección positiva y durante la activación de linfocitos en periferia,

debido a esto encontramos en células DP niveles normales de TCR, y la alteración en los niveles

superficiales de TCR solo aparecen tras la unión del TCR con su ligando, tanto en células de timo

que ya han entrado en selección positiva como en linfocitos T maduros de nódulos. Sin embargo,

durante el desarrollo de las células DP, existe una fase de pre-selección positiva en la que se

produce una modulación de los niveles de TCR de manera independiente a la unión MHC-TCR,

este mecanismo garantiza que la célula entre en selección positiva con la cantidad de TCR

superficial idónea. En ratones SLAP deficientes, las células DP que aún no han entrado en

selección positiva presentan altos niveles de TCR, es probable que sea en este proceso en el que

participa SLAP, este fenómeno constituye un mecanismo de degradación del TCR independiente

de ligando, dependiente de Lck y de clatrina [72] [70]. De esta manera en ratones KO para Cbl,

ocurre el mismo fenómeno, un aumento de TCR en células DP, en este caso Cbl participaría tanto

en la degradación del TCR en la etapa de pre-selección positiva como en la degradación del TCR

durante la selección positiva.

Por tanto, tanto en el caso de Cbl como de SLAP, los ratones KO muestran elevados

niveles de TCR superficial en células DP, lo que provoca que las células entren en selección

positiva con niveles superficiales de TCR alterados, sin embargo en ratones TG dnNumb las

células DP presentan niveles normales de TCR superficial, y esta alteración se produce tras la

estimulación de la células DP por parte de MHC. Aunque tanto en unos como en otros ratones la

alteración fenotípica es la misma, un aumento en selección positiva de CD4 producida por una

alteración en la modulación de los niveles superficiales de TCR, sin embargo esta alteración se

produce en diferentes etapas de desarrollo de los timocitos, antes de la selección o durante la

selección positiva. Por tanto, parece que SLAP y Numb participan en dos mecanismos diferentes


124

de la degradación del TCR, uno en la etapa de pre-selección positiva y otro tras la estimulación por

ligando. También es posible que Numb y SLAP actúen sobre la degradación de cadenas

diferentes, CD3ε y CD3ζ respectivamente, las cuales pueden ser accesibles a unión de estos

adaptadores en momentos distintos durante el desarrollo de timocitos.

Tras la activación del TCR por ligando se produce un cambio conformacional de la

cadena CD3ε [75], este cambio conformacional es anterior a la fosforilación de tirosinas, y conduce

a la asociación de una proteína adaptadora denominada Nck, tras esta unión se produce la

fosforilación de los ITAMs, debido a esto se ha propuesto un mecanismo por el cual esta unión

podría ser la responsable de la asociación de Lck a TCR, pero esto está sin demostrar. Nck se

asocia a una zona rica en prolina presente en la cadena CD3ε, RPPPVPNP, dentro de esta

secuencia se encuentra parte del motivo NPXY (RPPPVPNPXY) que nosotros mostramos como

candidato para su unión al PTB de Numb, esto indica que probablemente el cambio

conformacional que se produce tras la activación de TCR sea necesario para que el PTB de Numb

sea capaz de unirse al motivo NPXY, de esta manera la unión de Numb con CD3ε sólo se

produciría tras la activación del TCR. Este mecanismo constituye una forma muy elegante para

limitar la participación de Numb en la degradación del TCR sólo tras activación. Pero aún queda

por estudiar si la unión del PTB de Numb a CD3ε es dependiente o independiente de la

fosforilación de tirosinas, ya que el PTB de Numb tiene capacidad para asociarse tanto a motivos

fosforilados como sin fosforilar. Según uno u otro caso, Numb se asociaría antes o después de la

unión de Nck a CD3ε, o tal vez compitan por esta unión. En contraste, no se conoce un

mecanismo similar de cambio conformacional para CD3ζ, por tanto SLAP se uniría

constitutivamente a ésta cadena.

Nuestro modelo entra en contraposición con el trabajo de Malissen anteriormente

descrito en la introducción, en el que describían que la región PRS de CD3ε se encuentra

constitutivamente accesible a Nck. Si esto fuese así, puesto que la secuencia que nosotros

postulamos para que Numb se una CD3ε se encuentra parcialmente dentro de la región PRS,

Numb tendría la capacidad de asociarse a CD3ε sin necesidad de activación. Los datos que

hemos obtenido demuestran que Numb no es capaz de inmunoprecipitar con CD3ε en células sin

estimular, y en segundo lugar el trabajo de Malissen se basa en la observación de una asociación

de Nck a CD3ε en lisados de timocitos totales, algo que no sería incomplatible con la teoría del

cambio conformacional ya que dentro del total de timocitos, una pequeña fracción se encuentra

activada por la unión MHC-TCR. Por otro lado, numerosos trabajos demuestran que la unión de

Discusión

125

Nck a CD3ε es dependiente de la activación por ligando, así en ratones OT-1 β2mg -/- Rag-/- en los

cuales no es posible la activación de TCR por ligando durante la selección positiva no se observa

la unión de Nck a la cadena CD3ε [76].Otro punto en contra de las conclusiones de Malissen, es

que ellos describen un modelo por el cual CD3ε es necesario para la degradación de la cadena ζ

por parte de SLAP. Pues bien, anteriormente se demostraba mediante la expresión de una

quimera constituida por el dominio intracelular de la cadena ζ y el dominio extracelular de CD8,

que solamente la expresión del dominio intracelular de ζ era necesario para una correcta

degradación mediada por SLAP, es decir la función de SLAP se muestra para ser independiente

de cualquier otra cadena del TCR [71]. Hay que tener en cuenta que la delección de la zona PRS

de CD3ε utilizada en el trabajo de Malissen afecta a los dos primeros aminoácidos de la secuencia

NPXY que nosotros proponemos como sitio de unión para Numb, de esta manera la alteración de

la secuencia PRS no solo podría repercutir en la asociación de Nck, sino también de Numb. A

este respecto, los ratones utilizados en este trabajo presentan dos características fenotípicas que

coinciden con los ratones TG dnNumb, tales como una disminución en la celularidad total del timo

y una disminución en el estadio DN4. Probablemente, el fenotipo de estos ratones sea ocasionado

por una suma de diferetes alteraciones, entre ellas la falta de unión de Numb a CD3ε.

Por otra parte, hemos comprobado que los niveles de Numb aumentan ligeramente

durante la activación de linfocitos T, probablemente Numb sea degradado junto con el TCR en

lisosomas tras la activación, de la misma manera que sucede con otros componentes de la

maquinaria de degradación, pero en el caso de Numb es posibles que se mantenga su síntesis de

novo con el fin de mantener los niveles de Numb endógeno constantes o incluso aumentarlos. Este

sería el motivo por el cual encontramos que en ratones TG que sobreexpresan Numb no se

encuentra alterada la modulación del TCR dependiente de ligando, apareciendo así una relación

normal entre DP/CD4SP y DP/CD8SP, indicativo de una selección positiva normal, siendo este

fenotipo el mismo que aparece en ratones que sobreexpresan Numb p66 y en ratones en los que

disminuye la actividad de Notch [110].

Anteriormente se había demostrado que Numb migra hacia la zona de sinapsis

inmunológica colocalizando con el complejo del TCR [100, 111]. Nosotros hemos podido observar

el mismo fenómeno en células CD4 de nódulos de ratones WT, en este caso la expresión del

dominante negativo provoca en ratones TG que Numb endógena no sea capaz de polarizar hacia

la zona de sinapsis, quedando repartida homogéneamente por la membrana celular. Este


126

fenómeno podría ser debido a la competencia que se establece entre Numb endógena y el

dominante negativo, de esta manera el dominante negativo sí sería capaz de migrar hacia la zona

de sinapsis desplazando así de esta localización a Numb endógena. Probablemente en ratones

que sobreexpresan Numb, Numb endógena mantiene su capacidad de migrar hacia la zona de

sinapsis y modular los niveles de TCR tras la estimulación ya que no expresa ningún dominante

negativo que altere esta función. La función que desarrolla Numb dentro de la sinapsis era hasta

ahora desconocida, pero con los resultados obtenidos en este trabajo se puede deducir que Numb

migra hacia la zona de sinapsis con el objetivo de regular los niveles superficiales de TCR y

consecuentemente la señalización por este, de esta manera mientras que en las células que se

encuentran en reposo Numb se distribuye homogéneamente por la membrana celular, sin

participar en procesos de endocitosis de TCR, tras la activación de la célula y la formación de la

sinapsis, Numb se polariza en esta zona para regular la modulación del TCR. Probablemente, la

polarización de Numb hacia la zona de sinapsis se lleve a cabo de la misma manera que se

produce la polarización de Numb durante la división de precursores del sistema nervioso, en este

caso, un complejo formado por diferentes proteínas Par y una protein-quinasa atípica o aPKC,

parecen ser responsables de la fosforilación de Numb y de la polarización de esta hacia un polo de

la células [90, 91]; además este mismo mecanismo se ha descrito para la polarización de Numb

durante procesos de migración en los que interviene regulando la endocitosis de integrinas de

superficie [125]; y por último este mismo sistema participa en la polarización de receptores de

quimioquinas en linfocitos [126]. También es posible que Numb migre junto al TCR sin necesidad

de mecanismos alternativos.

En base a los datos descritos, se puede contruir un mecnaismo en el cual Numb es el

adaptador endocítico responsable de la degradación de CD3ε tras la activación del TCR, jugando

un importante papel en la modulación de la señalización a través del TCR, tanto en timocitos como

en linfocitos T maduros.

Discusión

127

PERSPECTIVAS

Papel de Numb en división asimétrica de linfocitos T.

Una de las funciones más estudiadas de Numb es su participación en el proceso de

división asimétrica durante el desarrollo del sistema nervioso, posteriormente también se ha

demostrado que participa en el desarrollo de muchos otros sitemas. Numb se segrega

asimétricamente durante la división de los progenitores, el hecho de que la célula herede Numb o

no influye en los niveles de activación de Notch, y mediante este mecanismo se regula la

capacidad de las células hijas para diferenciarse o bien para seguir manteniéndose como

progenitoras y seguir proliferando. Recientemente se publicaba que células CD8 naive de nódulos

sufrían tras su primera estimulación una división asimétrica que llevaba a la aparición de un

fenotipo diferente en cada célula hija, de esta manera aparecía una célula de fenotipo efector y

otra de fenotipo memoria, pero este trabajo era puramente descriptivo, y aunque veían una

segregación asimétrica de Numb este hecho no se relacionaba con la adquisición de uno u otro

fenotipo [111]. En este trabajo hemos podido observar que Numb se segrega asimétricamente

durante la división de células CD4 en ratones WT, así cuando se produce la sinapsis inmunológica

Numb migra hacia esta zona, quedando polarizada durante la división celular, puesto que la zona

de sinapsis marca el plano de división de la células, tras la finalización de la mitosis una de las

células hereda mayor cantidad de Numb que la otra. Sin embargo hemos podido observar que el

dominante negativo altera la migración de Numb hacia la zona de sinapsis quedando distribuida

por toda la membrana, de esta manera la segregación de Numb tras la división resulta más

simétrica en ratones TG dnNumb que en WT. En ratones que sobreexpresan Numb encontramos

de igual modo que Numb se hereda de forma más simétrica, probablemente debido a que la

sobreexpresión de Numb hace que no sea posible la polarización del total de la proteína. En este

trabajo no hemos estudiado el papel de Numb en la división asimétrica de linfocitos maduros, pero

puesto que hemos observado una alteración en la segregación de Numb durante la división de

células T CD4 en ratones TG dnNumb y TG Numb, este parece ser un buen modelo para el

estudio de la implicación de Numb en la división asimétrica de linfocitos maduros, y no solo en el

estudio de la adquisición de un fenotipo memoria o efector, sino que en muchos trabajos se ha

demostrado que la activación de Notch es necesaria para el desarrollo de células Th2 [112, 127], a

este respecto es posible que la herencia o no de Numb regule los niveles de activación de Notch y

esto regule, junto con otros factores, el desarrollo de células Th2.


128

Migración de células CD8SP.

Por otra parte, el fenotipo en nódulos de ratones TG dnNumb se caracteriza por una

drástica disminución en el porcentaje de células CD8 y un aumento en el porcentaje de células

CD4. Puesto que en ratones TG dnNumb se podría estar produciendo un aumento en la

producción de células CD4 frente a una producción normal de células CD8, este fenómeno

explicaría la alteración en el fenotipo de nódulos. Sin embargo, la relación entre CD8SP/CD8 en

ratones TG dnNumb es cuatro veces mayor respecto al WT, lo que nos indica que para el número

de células CD8SP que se están produciendo en timo, aparecen demasiado pocas en periferia.

Puesto que no existe un aumento en la muerte celular por apostosis en células CD8SP que

pudiera reducir el número de células en periferia, pensamos que la falta de CD8 en periferia podría

estar causado por una falta de migración de células CD8SP hacia la periferia. En cuanto a esto

hemos observado que en ratones de 8 y 12 semanas de edad se produce un aumento en el

número de células CD8SP, mientras que lo esperado sería una disminución debido a la propia

involución del timo, de esta manera estos datos indican que se produce un secuestro de células

CD8SP dentro del timo, impidiendo su salida a periferia y disminuyendo drásticamente el

porcentaje de CD8 en periferia. Este fenómeno podría estar causado o bien por un secuestro de

células CD8SP maduras dentro del timo, o bien por una falta de maduración de células CD8SP

que quedarían secuestradas en un estadio de desarrollo semi-maduro y por tanto no habrían

alcanzado aún la capacidad de migración hacia la periferia. Este estadio de semi-madurez,

engloba a células que una vez superada la selección positiva pasan a la médula, manteniéndose

como semi-madura con el fin de prolongar su estancia en el timo y permitir durante este tiempo la

eliminación de células autorreactivas. En este estadio se caracterizan por tener una expresión de

CD69high y de CD62Llow , sin embargo al madurar adquieren un fenotipo CD69low y de CD62Lhigh,

de esta manera la expresión de CD62L no parece ser necesaria para la salida del timo pero si para

el ingreso de las células en nódulos, sin embargo sí que es necesario para la migración de células

tímicas que expresen niveles bajos de CD69 [114, 115]. En ratones que sobreexpresan CD69 se

produce un acúmulo de células SP maduras en timo, este efecto parece ser debido a que la

expresión de CD69 modula los niveles de expresión del receptor S1P1 necesario para que las

células salgan del timo [128], de esta manera durante la fase de maduración de las células SP los

niveles de CD69 y de S1P1 se antagonizan mutuamente, así ratones S1P1-/- presentan una

población de células SP con fenotipo maduro pero con un aumento en los niveles de CD69

superficial, lo que imposibilita la migración de las células SP hacia la periferia. Por otro lado,

Discusión

129

parece que los niveles de expresión tanto de CD62L como S1P1, dos proteínas necesarias para

una correcta migración, se encuentran reguladas por el mismo factor de transcripción [116]. En

nuestro caso las células CD8SP presentan un fenotipo de células semi-madura, ya que presenta

altos niveles de CD69 y bajos de CD62L, sin embargo, es posible que los altos niveles de CD69

vengan producidos por la alteración en la modulación de los niveles superficiales de TCR, que

produciría una prolongación en los tiempos de estimulación y por tanto un aumento en los niveles

superficiales de CD69 ya que este es un marcador de activación; en este caso, el aumento de

CD69 impediría la expresión de S1P1 y de CD62L, ya que CD69 y S1P1 se antagonizan

mutuamente. Lo interesante de este fenómeno es que se produce de forma exclusiva en células

CD8SP, lo que indica que podría existir un mecanismo diferencial entre la migración de células

CD4SP y CD8SP.

Alternativamente, la alteración en la migración de células CD8SP podría estar

relacionada con procesos de endocitosis de integrinas, ya que anteriormente se ha descrito que

Numb participa en estos procesos, mediante su unión a cadenas β de integrinas [101]. De esta

manera se ha descrito que Numb participa en procesos de migración mediante su polarización

hacia uno de los polos de la célula y su participación en la modulación de los niveles superficiales

de integrinas [125]. Algunas de las integrinas expresadas en la superficie de los timocitos son

LFA-1, VLA3, 4, 5 y 6, estar integrinas son capaces de asociarse con componentes de la matriz

extracelular tales como, fibronectina, laminina y colágeno. Aparentemente la expresión de

integrinas en la superficie de timocitos puede afectar a la migración de timocitos, así la

disminución en la expresión de VLA-5 lleva a una alteración en la migración de timocitos [129]. Tal

vez exista un mecanismo de expresión diferencial de integrinas dentro de células CD4SP y

CD8SP, el cual podría estar afectado por la expresión del dominante negativo para Numb.

CONCLUSIONES

Conclusiones

133

1. Los niveles de Numb functional determinan la celularidad total del timo. Así, se observa

una gradación en la celularidad total del timo con bajos niveles d funcionales de Numb

(TGdnNumb), seguidos por ratones con niveles normales de Numb (TGdnNumb x

TGNumb), y finalmente elevada celuridad en ratones TG Numb.

2. La inhibición funcional de Numb aumenta la eficiencia de la selección postiva de timocitos

CD4SP en timo (DP/CD4SP), manteniéndose sin diferencias significativas la eficiencia de

la selección positiva de timocitos CD8SP.

3. La inhibición funcional de Numb provoca una disminución en la tasa de migración de

células CD8SP hacia la periferia.

4. La proteína adpatadora Numb facilita la degradación del receptor TCR de manera

dependiente de activación, tanto en timocitos dobles positivos como en linfocitos maduros,

contribuyendo de esta manera a la modulación de la señalización por TCR.

5. Numb es segregado asimetricamente durante la división de linfocitos T CD4 que son

activados in vitro con anti-CD3 y anti-CD28. Tanto la inhibición de Numb como la

sobreexpresión de Numb lleva a una segregación símetrica endógeno durante la división

de lifocitos T.

REFERENCIAS

Referencias

137

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PUBLICACIONES

Title

The endocytic adaptor Numb regulates thymus size by modulating pre-TCR signaling

during asymmetric division.

AUTHORS: Aguado R.1, Martin-Blanco N.1, Canelles M.1,�

Affiliations

1 Instituto de Parasitologia y Biomedicina, CSIC, P. T. Ciencias de la Salud, 18100

Granada, Spain.

Contact Information

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Matilde Canelles

[email protected]

Tel: 34-958-181660

Fax: 34-958-181632

Running Title

Numb and pre-TCR in asymmetric division.

Word counts:

Abstract: 148

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Figure legends: 965

References: 1048 (45 references)

Abstract

Stem cells must proliferate and differentiate to generate the lineages that

shape mature organs; understanding these two processes and their interaction is one

of the central themes in current biomedicine. An intriguing aspect is asymmetric

division, by which two daughter cells with different fates are generated. Several cell

fate determinants participate in asymmetric division, with the endocytic adaptor

Numb as the best known example. Here we have explored the role of asymmetric

division in thymocyte development, visualizing the differential segregation of Numb

and pre-TCR in thymic precursors. Analysis of mice where Numb had been inhibited

by expressing a dominant negative revealed enhanced pre-TCR signaling and a

smaller thymus. Conversely, Numb over-expression resulted in loss of asymmetric

division and a larger thymus. The conclusion is that Numb determines the levels of

pre-TCR signaling in dividing thymocytes and, ultimately, the size of the pool from

which mature T lymphocytes are selected.

Introduction

The mammalian thymus contains different cell types originated from initially

equivalent precursors that undergo several rounds of division. To ensure correct

numbers of mature lineage specific cells in adult organs precursors divide

asymmetrically, generating two sister cells with different fates [130, 131]. One of the

“cell fate determinants” asymmetrically segregated is Numb, a plasma membrane-

associated protein that contains a phosphotyrosine binding (PTB) domain and

antagonizes Notch signaling. Numb function was first described in Drosophila sensory

organ precursor cells [132], where loss of Numb resulted in both daughter cells

adopting the fate of the cell that normally inherits Notch, while the opposite result

was caused by Numb over-expression [102, 103, 106]. In mammalians, asymmetric

division has been studied most extensively during neurogenesis [107]. Deletion of

Numb and its homologue Numblike resulted in loss of neural progenitors and block of

neurogenesis [78], as a result of progenitor over-differentiation and death of young

neurons in mice. In other systems, Numb binds to integrins [101] and Src family

kinases [108], mediates receptor internalization [97, 105] and participates in clathrin

dependent endosomal association [95]. Thus, Numb plays multiple and important

roles in development and signaling, however little is known about its role in the

thymus.

T lymphocytes develop from precursors that undergo a series of cell fate

decisions resulting in differentiation into single positive (SP) thymocytes, the

immediate precursors of fully functional CD4 and CD8 T lymphocytes [2, 133]. The

initial CD4-CD8- double negative (DN) stages are influenced by signals from the pre-

TCR [134-136] and Notch [137],[138]. Only DN thymocytes receiving proper pre-TCR

and Notch signals are able to evolve into the CD4+CD8+ double positive (DP) αβ

lineage stage. Pre-TCR internalization and degradation is very important for correct

signaling [139-141]. As a consequence of pre-TCR signaling, DN thymocytes

proliferate, enabling normal numbers of DP thymocytes in the adult thymus [142-

144].

Both Numb and its homologue Numblike are expressed in hemopoietic stem

cells [109] and lymphoid tissues [79, 108, 110], also Numb co-localizes with the TCR

complex in mature T cells [100] and segregates asymmetrically in hemopoietic stem

cells [145] and mature T lymphocytes [111]. Moreover, Numb over-expression in

thymocytes results in reduction of Notch activity [110]. These data strongly suggest

that Numb may play a role during the DN stage in the thymus.

Here we have shown that double negative thymocytes asymmetrically

segregate Numb, but not the pre-TCR, during cell division. Our analysis of thymic

development in transgenic mice over-expressing dominant negative or full length

Numb has shown that Numb inhibition enhanced the pre-TCR pathway and resulted in

a smaller thymus, while Numb over-expression resulted in less signaling, loss of

asymmetric division and a larger thymus. These results show that Numb helps

modulate pre-TCR signaling in double negative thymocytes in order to direct cell fate

and regulate thymus cellularity.

Methods

Mice, embryos and cell lines. 15d embryos or 4-week-old mice were used for

experiments with fetal and adult thymus, respectively. All experimental procedures

involving mice were performed in agreement with the CSIC Ethical Committee

directives.

Antibodies. The following antibodies were obtained from BD Pharmigen: FITC anti-

CD25 (7D4), CD4 (L3T4), CD8 (53-6.7), CD5 (53-7.3), AnnexinV; PE anti-TCRβ (H57-

597), Lin [CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), CD3 (145-2C11), CD11b (M1/70), NK1.1

(PK136), TCRβ (H57-597), TCRγδ (GL3), B220 (RA3-6B2)]; CyC anti-CD44 (IM7);

Biotinylated anti-CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), pre-Tα (2F5), Fc Block (2.4G2), IgG1

(A85-1). Biotinylated Myc (9E10, Upstate). Biotinylated antibodies were revealed with

Streptavidin-APC (eBioscience). FITC anti-cytokeratin was obtained from Sigma.

Western blotting. 1x107 thymocytes were lysed in 100 µl NP40 cell lysis buffer

(Sigma) supplemented with protease inhibitor cocktail (Sigma) and 1mM PMSF for 30

min on ice. The lysates run on a NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) and

transferred to nitrocellulose. Subsequently, membrane was blotted with primary

antibodies, washed, incubated in secondary antibodies coupled to HRP (Santa Cruz)

and detected with enhanced chemiluminescence (Bio-Rad).

Flow cytometry. Thymocytes were washed twice with PBS and stained for 15

minutes at 4ºC with antibodies. For intracellular staining, cells were incubated with

Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience) and stained with antibodies. Analysis was

performed on a FACs Calibur (Becton Dickinson). Files were analyzed with software

(FlowJo; Tree Star, Inc.).

OP9/OP9DL co-cultures. Fetal thymocytes were cultured onto OP9/OP9DL

monolayers for 6 days at 37ºC and 5% CO2, in the presence of 5ng/ml IL-7 (RD

System). All co-cultures were maintained in complete α-MEM (Gibco) medium

supplemented with 10% FBS (Gibco) and antibiotics (Gibco).

Immunofluorescence and Confocal Microscopy. Thymii were fixed with a 4%

paraformaldehyde solution in PBS, washed with PBS, treated with a 20% sucrose

solution in PBS, immersed in O.C.T. (Tissue Tek) and frozen using a mixture of 2-

methylbutane (Sigma) and dry ice. 10 µm sections were fixed with 4%

paraformaldehyde in PBS, permeabilized with Triton-X100 and stained with antibodies

in a solution containing 5% normal goat serum and 3% bovine serum albumin.

Sections were mounted with ProLong Antifade (Molecular Probes). The following

primary antibodies were used for immunofluorescence: anti-Numb (Santa Cruz

Biotechnology Inc.), anti-c-Cbl (Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-CD25 (BD

Pharmingen), rabbit anti-Ubiquitin (Sigma), TOPRO-3 iodide (Molecular Probes). The

secondary antibodies were anti-rabbit Alexa-647, anti-rabbit Alexa-488, anti-mouse

Alexa-488, anti-mouse Alexa-555 (Molecular Probes). Using a Leica TCS SP5 confocal

microscope, images were collected at 8-bit depth, with a resolution of 1024 x 1024

pixels.

Quantification of fluorescence staining in z-stacks of dividing cells. The

software LAS AF (Leica Microsystem) was used to analyze fluorescent images.

Inside each picture, one gate for each daughter cell was drawn, using CD25 as a

marker, and threshold intensities of total pixels were determined for Numb. The

positively staining pixels on each daughter cell were expressed as a percentage of

the total pixels in the sum of the two gates, for each picture. This was performed

for all pictures of each z-stack. As a result, each daughter cell was associated with a

percent of positive pixels (which corresponds to the percent of inherited Numb

protein).

RNA Analysis. Total RNA was extracted with RNasy Kit (Quiagen). RT-PCR was

carried out with an I Script cDNA Synthesis Kit (Biorad). The resulting cDNA pool was

amplified by 40 cycles of PCR. The RT-PCR primers were mouse 18S (5' sense,

CGGCTACCACATCCAAGGAA; 3' antisense, GCTGGAATTACCGCGGCT ), Hes1 (5' sense

GCCAGTGTCAACACGACACCGG; 3' antisense, TCACCTCGTTCATGCACTCG). Fold

differences were calculated after normalizing cDNA levels of 18S transcripts.

Statistical Analysis. Statistical comparisons were made using the Student t-test.

Differences were considered statistically significant if p <0.05.

Results

Double negative thymocytes segregate asymmetrically Numb, but not

the pre-TCR, during cell division.

In order to explore asymmetric division in thymocytes, we focused on fetal

day-15 thymus, where most cells are at the DN stage, as evidenced by flow

cytometry (Fig. 1A) and immunofluorescence (high frequency of CD25+ cells, Fig.

1B). CD25 was used to detect dividing cells because it is only expressed on DN2 and

DN3 thymocytes and it is not polarized or asymmetrically segregated during signaling

and cell division (our own observations). We analyzed frozen sections of day 15 fetal

thymii by immunofluorescence, using TOPRO (to detect DNA), CD25 and Numb. We

were able to localize high numbers of CD25+ dividing cells at all stages of mitosis

(Fig. 1C). Since DN2 thymocytes do not divide and DN4 thymocytes do not express

CD25, these cells were at the DN3 stage. We observed Numb polarization in 43% of

CD25+ pre-mitotic DN3 cells. In dividing DN3 thymocytes, Numb was polarized in

most cells at the prophase and metaphase stages of mitosis (Fig. 1C, higher panels).

At the anaphase stage Numb did not polarize (Fig. 1C, middle panel), while at the

telophase stage, it was inherited exclusively by one of the daughter cells in 30% of

the cases, and equally segregated into both daughter cells in the rest of the cases

(Fig. 1C, lower panels). The fact that Numb looked homogeneously distributed at

anaphase was surprising. We hypothesized that some degree of asymmetry could

exist at anaphase that would not be detected by simple visual examination. To study

this possibility, we quantified Numb in the two daughter cells of dividing fetal

thymocytes at anaphase (see Methods). For each telophase, “dividing cell #1”

(DC#1) was the daughter cell with more Numb, and “dividing cell #2” (DC#2) the

daughter cell with less Numb. If Numb were always distributed homogeneously

between the two daughter cells at anaphase, the values for Numb intensity on DC#1

and DC#2 would always be similar. However, this was not the case (Fig. 1D).

Although some pairs of cells showed equal Numb inheritance at the anaphase stage,

there was a significant difference in 3 of the 10 analyzed Z stacks (Table 1, see

column marked DC#1/DC#2). These cells were probably destined to segregate Numb

asymmetrically at the telophase stage. Therefore, as expected, the percentage of

cells that presented asymmetric Numb segregation was similar at the anaphase and

telophase stages, but the degree of asymmetry seemed greater at telophase. Taking

into account that Numb is a marker of asymmetric division, these data show that a

subset of developing thymocytes divides asymmetrically.

Numb is co-localized with the TCR machinery in mature lymphocytes [100]-

[111], therefore we wanted to investigate how Numb localizes relative to the pre-TCR

in DN thymocytes. We analyzed by confocal microscopy pre-TCR localization in

dividing fetal thymocytes, and we did not find asymmetric pre-TCR segregation: all

the telophases showed uniform membrane (including the nascent membrane) and

cytoplasmic pre-TCR localization (Fig. 2A). In order to exclude the possibility that the

observed pre-TCR staining on sections might be unspecific, we stained fetal thymus

sections using an isotype control and observed no unspecific staining caused by the

secondary antibody (data not shown). We also stained adult thymus sections using

anti-preTα, CD4 and cytokeratin (expressed on thymic stromal cells, see [146]). If

the anti-preTα antibody is specific, there should be no staining on thymocytes located

either in the adult cortex (DPs) or medulla (SPs). Indeed, we could not detect pre-

TCR staining on CD4+ thymocytes (Sup. Fig. 1A, B); there was some degree of

staining, but it always correlated with cytokeratin (Sup. Fig. 1A, B). Since cytokeratin

staining in d15 fetal thymus is absent (our own observations), the observed pre-TCR

staining on fetal thymus sections must be specific.

To study pre-TCR localization during the cell cycle, we analyzed dividing fetal

thymocytes at the prophase stage, and could observe that the pre-TCR is always

polarized at the prophase and metaphase stages, similar to Numb (Fig. 2B). This

indicates that probably Numb polarization during the prophase in thymocytes is

related to signaling. If this is the case, thymocytes not receiving pre-TCR signals

would not polarize Numb during the prophase. To address this question, we analyzed

Numb localization in dividing Rag-/- thymocytes and, accordingly with our hypothesis

that Numb localization in dividing thymocytes is related to pre-TCR signaling, we

found that Numb is neither polarized or asymmetrically segregated in dividing Rag -/-

thymocytes (Fig. 2C). Together, these data indicate that Numb may be needed for

pre-TCR signaling and asymmetric division at the DN stage.

Functional Numb levels in thymocytes determine adult thymus size.

In order to further investigate the role of Numb in thymocyte development, we

used mice that expressed either a dominant negative Numb (dnNb TG mice) or full

length Numb (Numb TG mice) under the human CD2 promoter. DnNb TG mice

express the Numb PTB domain, while Numb TG mice over-express the full length p71

Numb isoform. A truncated protein similar to dnNb has a dominant negative effect in

neural cells [108].

Both the dnNb and the Numb construct contained the human Myc tag,

therefore we used an anti-hMyc tag antibody to detect by western blotting transgenic

proteins in thymocytes of the transgenic mice. We found that, while there was no

detectable hMyc epitope in WT mice, both Numb and dnNb TG thymocytes expressed

large amounts of transgenic protein, and these could be distinguished by their size,

since dnNb is a truncated product (Fig. 3A). Taking advantage of the size difference,

we verified that dnNb x Numb TG mice expressed both transgenic proteins (Fig. 3A).

Additionally, we performed western blotting to detect dnNb protein in DN thymocytes

of dnNb TG mice, and could confirm the expression of high quantities of the

transgenic protein in this cell subset (Fig. 3B).

We observed in Numb TG mice, compared with WT mice, an increase in

cellularity of both the DN and the DP compartments (Fig. 3C). Conversely, dnNb TG

mice showed a marked decrease in absolute numbers of these two thymic

subpopulations (Fig. 3D). The same results were obtained for two independent lines

of either dnNb or Numb TG mice (Supplemental Fig. 2, and our own observations).

Since DP thymocytes do not divide, differences in DP cellularity are originated at the

DN stage, therefore we analyzed by flow citometry the different DN thymocyte

subpopulations in transgenic mice. We observed a block at the DN3 stage in dnNb TG

mice, as compared with WT mice, with a 2-fold increase in the percentage of DN3 and

a 2-fold reduction in the percentage of DN4 thymocytes (Fig. 3E). This block was

absent in Numb TG, and was reverted by Numb over-expression in dnNb x Numb TG

mice, (Fig. 3E). The fact that sole over-expression of Numb is able to revert the dnNb

TG phenotype indicates that the dnNb protein is exclusively inhibiting Numb.

Interestingly, we observed a gradation in thymus cell numbers as functional levels of

Numb increased, starting with dnNb TG mice to reach a maximum in Numb TG mice

(Fig. 3F).

Impaired proliferation in the thymus of dnNb TG mice.

The results described above suggest that inhibiting Numb interferes seriously

with thymic development. Since both proliferation and pre-TCR signaling start during

the DN3 stage, we wanted to study the effect of Numb inhibition on these processes.

To study thymocyte proliferation, we used the OP9 system [147], which consists on

two cell lines, OP9 and OP9-DL1, the later expressing a Notch ligand that enhances

Notch signaling and differentiation into the DP stage. We labeled d15 fetal WT or

dnNb TG thymocytes with CFSE and co-incubated them with OP-9 or OP9-DL1 cells

for 6 days. While few thymocytes expressing CD4 and/or CD8 developed on OP9 cells

after a 6-day incubation, the number increased considerably in both WT and dnNb TG

mice when fetal thymocytes were incubated with OP9-DL1 cells (Fig. 4A). As

expected, very few DN3 and DN4 cells developed on OP9 cells, but these numbers

were higher when incubated on OP9-DL1 cells, and the observed DN3 block in dnNb

TG thymocytes was still observed (Fig. 4B). Analysis of CFSE binding on the

recovered thymocytes showed that dnNb thymocytes had proliferated to a lesser

extent than WT thymocytes (Fig 4C). Thus, Numb inhibition results in decreased

proliferative potential of DN thymocytes.

We suspected that dnNb inhibited Numb by competing for endogenous Numb

binding sites. Obviously, dnNb would not be able to exert normal Numb function at

those sites because of lacking the C-terminus. Therefore, we analyzed Numb and

dnNb localization on CD25+ fetal thymocytes by confocal microscopy. The Numb

antibody used in our studies is raised against the Numb C-terminus, which is absent

from the dnNb protein, therefore it only recognizes endogenous Numb, while dnNb

can be detected using an anti-Myc antibody. We observed that, as we hypothesized,

dnNb is localized at the cell membrane, and polarizes together with endogenous

Numb in CD25+ thymocytes (Fig. 4D). This is consistent with competence between

Numb and dnNb for binding sites: probably, dnNb partially blocks Numb access to its

physiological sites.

Increased Notch signaling and abnormal pre-TCR expression in dnNb

TG DN thymocytes.

We hypothesized that Numb inhibition would result in increased Notch

signaling, evidenced by augmented Hes-1 mRNA levels in thymocytes. This was,

indeed, the result obtained by analyzing Hes-1 expression in WT and dnNb

thymocytes by RT-PCR (Fig. 5A). Taking into account the observed parallelism in

asymmetric protein segregation between Notch and the pre-TCR, and the fact that

Numb co-localizes with the pre-TCR, the question arose of whether Numb inhibition

would enhance pre-TCR signaling, in a similar way to its described effect on Notch.

We looked first at pre-TCR surface levels by flow cytometry using an antibody

against the pTα chain, and observed that dnNb TG DN thymocytes expressed higher

pTα surface levels than WT DN thymocytes (Fig 5B). Increased pre-TCR levels on the

surface of developing thymocytes would result in enhanced pre-TCR signaling,

therefore we analyzed CD5 expression on DN thymocytes of WT and dnNb TG mice.

CD5 expression was increased at both the DN3 and DN4 stages in dnNb TG

thymocytes, as compared with WT thymocytes (Fig. 5B). Conversely, DN thymocytes

of Numb TG mice expressed lower CD5 levels, as compared to the WT (data not

shown).

If DN thymocytes of dnNb TG mice express higher surface pre-TCR levels and

present increased CD5 expression as a consequence of enhanced pre-TCR signals,

this may result in either death or premature differentiation [148]. In order to assess

whether a higher fraction of DN thymocytes is undergoing cell death in dnNb TG

compared to WT mice we performed Annexin-V staining and observed that indeed,

there is more cell death in DN thymocytes of dnNb TG mice (Fig. 5B). However, the

thymus of dnNb TG mice contained DP and SP thymocytes, indicating that not all the

DN thymocytes die; we therefore wanted to investigate how excessive pre-TCR levels

affect those DN thymocytes that end up developing into SP cells. In mice deficient for

Numb and Numblike, neural progenitors differentiate prematurely, before expanding

[78]. We hypothesized that DN thymocytes receiving enhanced pre-TCR signaling

would bypass the proliferation burst associated with the DN-DP transition,

differentiating prematurely into DP thymocytes, which would be the cause of the

observed decrease in thymus size. DN thymocytes must down-regulate both CD25

and pre-TCR levels previous to transitioning to the DP stage, therefore an indicator of

premature differentiation would be high surface CD25 and/or pre-TCR expression at

the DP stage. We observed increased surface levels of these two proteins in DP

thymocytes of dnNb mice, as compared with WT mice (Fig. 5C). In addition, CD5

levels were also increased in DP thymocytes of dnNb TG mice (Fig. 5C). Using TOPRO,

we observed an increase of apoptotic nuclei, with the characteristic DNA

fragmentation, in dnNb TG fetal thymii, as compared with WT thymii (Fig. 5D and E).

Together, these results indicate that excessive pre-TCR signaling induces cell death in

a fraction of DN thymocytes and a premature DN3-DP transition in another subset of

DN thymocytes in dnNb TG mice.

Such changes in proliferation may affect the number of thymocytes undergoing

each stage of the cell cycle, therefore we counted the number of metaphases and

telophases on fetal thymic sections of WT, dnNb TG or Numb TG mice, stained with

TOPRO. We found more metaphases and less telophases in dnNb TG than in WT fetal

thymii, conversely there were less metaphases and more telophases in Numb TG than

in WT fetal thymii (Fig. 5F). This may indicate that thymocytes progress faster

through the cell cycle in Numb TG mice than in either WT or dnNb mice, while the

opposite effect is caused by Numb inhibition in dnNb TG mice.

Defect in c-Cbl endosomal localization in dnNb TG DN thymocytes.

In view of the data presented above, we hypothesized that the dnNb protein

must be interacting (perhaps even more efficiently than endogenous Numb) with

proteins implicated in pre-TCR signaling in thymocytes. If this happened, endogenous

Numb would be excluded from sites where its function is needed for normal

development. In this aspect it is interesting that the ubiquitin ligase c-Cbl, an

essential player in pre-TCR signaling and early thymocyte development [149], co-

immunoprecipitates with Numb [100]. Moreover, there is a remarkable parallelism

between the phenotypes of c-Cbl/Cbl-b double knockout and dnNb TG mice, both of

which show reduced thymus size and abnormal pre-TCR surface expression on both

DN and DP thymocytes. In order to assess whether dnNb expression affected c-Cbl

function, we stained 15-day WT and dnNb TG fetal thymic sections using antibodies

against Numb and c-Cbl. C-Cbl was expressed at high levels in both WT and dnNb TG

thymii. However, while c-Cbl was localized in vesicles in fetal WT thymocytes, it was

mostly on the membranes of dnNb TG fetal thymocytes (Fig. 6A). Interestingly, Numb

expression pattern was largely conserved in dnNb TG mice (Fig. 6A). When both

proteins were observed on the same image (Fig. 6A, Merge), there was an evident

loss of “yellow dots” (c-Cbl+ Numb+ vesicles) in dnNb TG thymii, as compared with

the WT. Detailed quantification of vesicles containing Numb, c-Cbl, or both in CD25+

fetal thymocytes showed that, while the average number of Numb containing vesicles

per cell did not change in dnNb TG mice with respect to WT mice, there was an

important decrease in the average number of both c-Cbl+ and double positive

Numb+/c-Cbl+ vesicles per cell in dnNb TG mice, as compared with WT mice (Fig.

6B).

We wanted to investigate whether the observed vesicles corresponded to

endosomes, therefore we stained fetal thymic sections with an antibody against

ubiquitin, together with either Numb or c-Cbl. We found that both Numb and c-Cbl

containing vesicles also contained ubiquitin (Sup. Fig. 3A, B). The fact that c-Cbl

access to endosomes is blocked in dnNb TG mice suggests that dnNb must be able to

access sites normally occupied by endogenous Numb, displacing endogenous Numb

from those sites. Numb is probably a mediator of c-Cbl access to endosomes,

therefore expressing a truncated Numb protein blocks this process, interfering with

pre-TCR degradation. This would result in more pre-TCR bound to ubiquitin on the

surface of dnNb TG CD25+ thymocytes as compared to WT thymocytes. We observed

this effect by visualizing pre-TCR together with ubiquitin on fetal thymic sections (Fig.

6C). Also, changes in TCRβ localization would be expected in dnNb TG thymocytes.

We analyzed TCRβ expression on CD25+ fetal thymocytes and could observe high

TCRβ expression on the membrane of dnNb TG DN thymocytes (Sup. Fig. 3, C). This

is in agreement with the observed excessive pre-TCR signaling in dnNb TG

thymocytes.

Symmetric Numb segregation in Numb TG mice.

It is known that little Numb is necessary to guarantee normal asymmetric

division [150], however it is not known how excessive Numb levels affect this

process. Visualization of Numb expression in cycling Numb TG CD25+ DN thymocytes

on fetal sections revealed homogeneous, high Numb expression on both daughter

cells at all stages of cell division (Fig. 7A, higher panels). Interestingly, similar results

were obtained by analyzing dnNb TG mice (Fig. 7A, lower panels). Numb signal on Z-

stacks corresponding to dividing DN3 thymic cells at the telophase stage of WT, Numb

TG and dnNb TG mice was quantitated (see Methods). Our analysis showed that,

while there was a high degree of asymmetry in WT mice at telophase (higher than at

the anaphase stage, see Fig. 7B and Table 2), both Numb TG and dnNb TG

thymocytes segregated Numb in a more symmetric fashion (Fig. 7B and Table 2). The

fact that dnNb TG mice show a more symmetric Numb segregation in thymocytes is

irrelevant in terms of asymmetric division, given that endogenous Numb function is

blocked by dominant negative Numb. It rather adds to the notion that Numb

degradation is inhibited by dominant negative Numb. These data show that, during

asymmetric division in the thymus, it is not the quantity of Numb inherited by each

cell, but its functionality as an internalization adaptor, what determines the different

daughter cell fates.

Discussion

Although asymmetric division is associated with precursor differentiation in an

increasing number of developing organs, the question of whether this also applies to

thymocyte development has remained elusive. We have explored this matter by

visualizing dividing thymocytes on fetal thymic frozen sections. Our finding that Numb

asymmetrically segregates in a subset of dividing fetal thymocytes is in good

agreement with the observed pattern of Numb segregation during mouse cortical

neurogenesis [107, 151]. On the other hand, both Numb and the pre-TCR polarize

early during the cell cycle, indicating a possible role for Numb in pre-TCR signaling.

Localization of the pre-TCR on lipid rafts [152] and its polarization associated with

signaling [153] had been observed before. Therefore, despite its capacity to signal in

a ligand-independent fashion, the pre-TCR is probably able to signal more efficiently

when the TCR signaling machinery is polarized. Moreover, Numb seems to be

associated with this machinery in DN thymocytes. Membrane pre-TCR localization

through the cell cycle indicated that, although pre-TCR synthesis is stopped early

[144], its expression and signaling must continue through the cell cycle. Based on our

data showing that Numb, but not the pre-TCR is asymmetrically segregated, it can be

speculated that when the division is asymmetric, the cell inheriting both Numb and

pre-TCR continues proliferating, while the cell inheriting pre-TCR but not Numb

differentiates further. This is a simple model, based on data from other systems

where symmetric division has been studied in detail [102, 103, 106]. In this regard,

our observation that, in fetal thymus, just 30% of the precursors divide

asymmetrically seems logical, since at this stage of development proliferation must

be promoted at the expense of differentiation to ensure correct numbers of

thymocytes in the adult organ. Possibly, at later stages of development (e.g. adult

thymus) differentiation may be promoted at the expense of proliferation, by changing

the symmetric/asymmetric division rate.

In this context, the mild block at the DN3 stage observed in mice where Numb

and Numblike had been conditionally deleted (see Fig. 4C in [109]) and the down-

modulation of Notch target genes in thymocytes of mice over-expressing p61 Numb

[110] both support the idea that Numb may modulate important signaling events at

early stages of development. The mentioned knockout study must be interpreted with

caution, in the light of data showing that as little as 5% of normal levels of Numb or

Numblike is enough to guarantee normal asymmetric division and development in

mammalians [150]. It is possible that, in the work by Wilson and colleagues,

remnants of Numb and Numblike in precursors were enough to allow thymocyte

development, resulting in the observed mild defect. We have used a dominant

negative approach to avoid these and other problems related to knockout models

[154]. A dominant negative protein binds to the same ligand than the endogenous

protein, but is functionally defective. In dnNb TG mice, the dnNb protein should bind

to endogenous Numb PTB ligands, but proteins that are normally associated to the

Numb C-terminus would be excluded from the complexes. In the case of c-Cbl, it is

associated to endogenous Numb in endosomes of WT, but not dnNb TG DN

thymocytes. Therefore, dnNb does probably bind to Numb ligands within the TCR

complex but is unable to bind to c-Cbl and help it translocate into the endosomes

because of lacking the C- terminus, necessary for this function [95, 97]. The

similarity between c-Cbl/Cbl-b knockout [149] and dnNb TG thymic phenotypes does

also favor this notion. Thus, our data indicate a role for Numb in facilitating c-Cbl

access to endosomes. Obviously, this affects pre-TCR degradation and signaling, since

c-Cbl is directly involved in this function [149]. It is important to note that protein

degradation plays an essential role during development [155] and asymmetric

division [156, 157], therefore a link between Numb and pre-TCR degradation seems a

reasonable developmental mechanism to regulate thymic development.

Another indication of the mechanism by which dnNb blocks Numb function

comes form visualization of endogenous Numb in dnNb TG DN thymocytes. The fact

that endogenous Numb is not polarized in premitotic thymocytes of dnNb TG mice

indicates that dnNb associates with pre-TCR complexes on the membrane. However,

without the C-terminus dnNb does not allow pre-TCR translocation into the

endosomes. This results in the observed pre-TCR accumulation on the cell surface and

endogenous Numb cytoplasmic distribution in dnNb TG thymocytes. We have

excluded the possibility that dominant negative Numb may inhibit other PTB-

containing proteins other than Numb by showing that Numb over-expression reverts

the dominant negative phenotype. Additionally, the observed opposite effects on

thymus size by either inhibiting or over-expressing Numb, and the lack of asymmetric

Numb segregation in Numb TG thymocytes indicate that Numb and asymmetric

division play a key role in regulating thymus size.

Together, the data support a model for thymocyte asymmetric division where

Numb presence in daughter cells mitigates pre-TCR signaling and allows further

proliferation. On the other hand, dividing thymocytes that do not inherit Numb

receive more pre-TCR signals and differentiate (Fig 7C). It seems, thus, clear that

Numb directs thymocyte decisions between differentiation and division. This is in

agreement with the proposed general role of asymmetric division as a way to

diversify cell progeny [158]. Future studies in the thymus and other organs will,

hopefully, clarify what cues above Numb dictate at a certain developmental stage the

rate of precursor differentiation versus proliferation.

Acknowledgments

We thank Drs. Weimin Zhong (Yale University, New Haven, U.S.) for

discussion and support, M.L. Toribio (CBMSO, Madrid, Spain), B.J. Fowlkes

(NIADID, NIH, U.S.) and S. Hilfiker (IPBLN, Granada, Spain) for discussion, B.J.

Fowlkes for providing Numb and dnNb transgenic mice, Juan Carlos Zuniga-Pflucker

for providing OP9 and OP9-DL1 cells, Francisco Ferrer and Maria Isabel Gutierrez for

expert technical mouse work, Jose Luis Luque for expert technical help with

microscopy. The work was funded by grants BFU2004-01771 and BFU2007-67476

from the Spanish Science and Education Ministry, a Special Intramural CSIC

(Spanish Science Council) grant and the Excellence Grant P06-CTS-02112 from the

Department of Science and Innovation of the Regional Government of Andalucia,

Spain. R.A. was supported by an I3P CSIC scholarship co-financed by the European

Social Fund.

Authorship

R.A. and N.M. planned, designed and performed the experiments.

M.C. planned, designed, performed the experiments and wrote the paper.

Conflict-of-interest disclosure: The authors declare no competing

financial interests.

References

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Tables

Table I. Percentages of Numb in each daughter cell at anaphase

DC# 1

DC# 2

DC#1/DC#2

60,69

39,00

1,56

55,44

44,56

1,24

54,00

46,00

1,17

53,00

47,00

1,13

52,86

47,14

1,12

52,75

47,25

1,12

51,56

48,44

1,06

51,30

48,70

1,05

51,00

49,00

1,04

50,72 49,27

1,03

Table II. Percentages of Numb inherited by each daughter cell at telophase

WT

Numb TG

dnNb TG

DC#1

DC#2

DC#1

DC#2

DC#1

DC#2

71,36

28,64

58,77

41,23

59,50

40,50

65,14

34,86

56,90

43,00

59,32

40,68

60,00

40,00

56,00

44,00

54,00

46,00

58,49

41,51

56,00

44,00

52,91

47,09

58,00

42,00

54,52

45,48

52,72

47,28

57,00

43,00

53,32

46,68

52,00

48,00

53,60

46,39

53,00

47,00

53,44

46,56

52,40

47,60

53,24

46,76

52,20

47,80

51,96

48,04

50,34

49,66

Figure Legends

Figure 1- Asymmetric Numb segregation in dividing thymocytes. (A) CD4

and CD8 expression in fetal thymocytes of WT mice, analyzed by flow cytometry.

(B) Confocal image of a 15d fetal frozen WT thymus stained with CD25 in red. (C)

Confocal images of mitotic WT fetal thymocytes stained with antibodies against

Numb (green), CD25 (red) and treated with TOPRO-3 iodide (blue). The images are

representative of at least three independent experiments. (D) Percentage of Numb

protein contained in each daughter cell at the anaphase stage. Quantification of

Numb signal was performed as indicated in Methods. DC #1 and #2 represent the

daughter cells that inherited more and less Numb on each z-stack, respectively. A

total of ten anaphases were analyzed.

Figure 2- Symmetric pre-TCR segregation in dividing thymocytes (A)

Confocal images of WT fetal mitotic thymocytes at the telophase stage stained with

antibodies against CD25 (red), pre-TCR (green) and treated with TOPRO-3 iodide

(blue). (B) Confocal images of WT fetal mitotic thymocytes at the prophase (upper

panels) and metaphase (lower panels) stages stained with antibodies against pre-

TCR (red), Numb (green) and treated with TOPRO-3 iodide (blue). (C) Confocal

images of mitotic Rag2-/- thymocytes in prophase, metaphase, anaphase and

telophase stages stained with antibodies against CD25 (red), Numb (green), and

treated with TOPRO-3 iodide (blue). The images are representative of at least three

independent experiments.

Figure 3- Levels of functional Numb correlate with thymus cellularity. (A)

Western-blot analysis, using an anti-Myc tag antibody, of dnNb and p71 Numb

expression in thymus of WT, Numb TG, dnNb TG and dnNb x Numb TG mice. (B)

Western-blot analysis, using an anti-Myc tag antibody, of dnNb expression in DN

thymocytes of WT and dnNb TG mice. (C) Absolute numbers of DN and DP cell

subsets in thymus of WT (black) and Numb TG (grey) mice. (D) Absolute numbers

of DN and DP cell subsets in thymus of WT (black) and dnNb TG (grey) mice. (E)

CD25 and CD44 expression in Lin- thymocytes of 4-week old WT, Numb TG, dnNb

TG and dnNb x Numb TG mice. (F) Total cell numbers in dnNb TG (grey), dnNb x

Numb TG (white), WT (black) and Numb TG (light grey) adult thymii. Means ± SD of

at least three independent experiments are plotted.

Figure 4- Proliferation block in DN thymocytes of dnNb TG mice.

(A) Maturation of WT and dnNb TG fetal (15d) thymocytes to the DP stage after 6

days of co-culture with OP9 or OP9-Deltalike cells. The DP stage was monitored by

expression of CD4 and CD8. (B) Differentiation of WT and dnNb TG fetal DN

thymocytes after 6 days of co-culture with OP9 or OP9-Deltalike. Lin- thymocytes

were stained with CD44 and CD25. (C) CFSE expression in fetal thymocytes of WT

(solid line) or dnNb TG (broken line) mice cultured for 6 days over OP9-Deltalike

cells. (D) Confocal images of fetal thymocytes of WT (upper panels) and dnNb TG

(lower panels) mice stained with Numb (green), dnNb (anti-Myc, red) and CD25

(blue). Data are representative of at least three independent experiments.

Figure 5- Increased surface pre-TCR levels, apoptosis and premature

differentiation in dnNb TG thymocytes. (A) HES-1 gene expression levels,

measured by RT-PCR, in WT (black) and dnNb TG (grey) thymocytes. (B) Pre-TCR

(upper panel), CD5 (middle panel) and Annexin V (bottom panel) flow cytometry

measurement of DN3, DN4 or total DN WT or dnNb TG thymocytes. WT-solid line;

dnNb TG- broken line. (C) Pre-TCR (upper panel), CD5 (middle panel) and CD25

(lower panel) flow cytometry measurement in WT or dnNb TG DP thymocytes. WT-

solid line; dnNb TG- broken line. (D) Confocal images of fetal thymic frozen

sections treated with TOPRO-3 to detect DNA. Apoptotic nuclei are marked with red

arrows. (E) High magnification images of the nuclei marked with red arrows in (D).

(F) Average number of metaphases (left panel) and telophases (right panel) per

fetal thymic section of WT (black), dnNb TG (dark grey) or Numb TG (light grey)

mice. All data are representative of at least three independent experiments.

Figure 6- Less endosomal Numb and more ubiquitylated membrane pre-TCR

in fetal dnNb TG thymocytes. (A) Confocal images of fetal thymic frozen sections

stained with antibodies against Numb (red), c-Cbl (green) and CD25 (blue). (B)

Average number of CD25+ cells containing from zero to four c-Cbl+, Numb+ and c-

Cbl+Numb+ vesicles. Four independent images for each line (WT and dnNb TG)

were processed. For co-localization, analysis masks for c-Cbl (green colour) and for

Numb (red colour) were made with Photoshop 7.0. Numbers of vesicles per CD25+

cell in each mask were counted. The same analysis was performed in masks

containing Numb and c-Cbl together (yellow colour). An average of 34 and 45

CD25+ cells per image were counted for WT (black bars) and dnNb TG (grey bars),

respectively. (C) Confocal images of fetal thymic frozen sections of WT (left panel)

and dnNb TG (right panel) mice, stained with antibodies against ubiquitin (red),

pre-TCR (green) and CD25 (blue). White arrows point to cells with intracellular

ubiquitin+/pre-TCR+ vesicles (left panel) or membrane ubiquitin+/pre-TCR+

accumulations (right panel). All data are representative of at least three

independent experiments.

Figure 7- Symmetric Numb segregation in Numb and dnNb TG DN

thymocytes. (A) Confocal images of mitotic Numb TG (upper panels) or dnNb TG

(lower panels) fetal thymocytes at metaphase, anaphase and telophase stages

stained with antibodies against CD25 (red), Numb (green) and treated with TOPRO-

3 iodide (blue). The images are representative of at least three independent

experiments. (B) Percentage of Numb inherited by each daughter cell at the

telophase stage in WT (♦), Numb TG (•) and dnNb TG (�) mice. A total of 10 (WT

and Numb TG mice) and 6 (dnNb TG mice) Z-stacks were analyzed. (C) A model of

Numb influence on thymocyte decisions.

tesis doctoral “papel de la proteína adaptadora numb en la...

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