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PRODUCCION DE METABOLITOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOS
TEMA 6. PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS
Producción de metabolitos primarios y secundarios
1) Son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce.2) Se producen como productos únicos3) Son producidos por todos los microorganismos (son universales).4) La producción no puede perderse fácilmente pormutación espontánea
Metabolitos primarios…son moléculas de bajo peso molecular que intervienen, bien como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anabólicas y catabólicas
aminoácidos, vitaminas, nucleotidos,alcoholes, ácidos orgánicos
Metabolitos secundarios….. se producen cuando la velocidadde crecimiento es baja, no tienen pues una función esencial en el crecimiento
antibióticos, toxinas, alcaloides,pigmentos
1) Generalmente se producen como mezclas de productosmuy relacionados químicamente entre sí.2) La producción puede perderse fácilmente por mutaciónespontánea3) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos
Producción de metabolitos primarios y secundarios
exponenciallatencia estacionaria muerte
Trofofase(metabolismo Primario)
Idiofase(metabolismo secundario). Solo observado en algunos microorganismos
Uso comercial de los aminoácidos
Producción de metabolitos primarios: AMINOÁCIDOS
…en medicina
…en la industria alimentaria …..60%1) Como aditivos de piensos y de alimentos2) Potenciadores del sabor2) Antioxidantes.3) Edulcorantes
…en la industria química 25%1) Manufactura de polímeros2) Manufactura de pieles sintéticas3) Fabricación de cosméticos4) En la fabricación de herbicidas
PRODUCCION DE AMINOACIDOS
Por producción microbiologica.1) Biotransformación directa. (L-glutámico, L-lisina)
2) Por conversión de un producto intermediario barato vía biosíntesis. Ej. La glicina es convertida en serina.
3) Enzimas o células inmovilizadas producidas por microorganismos; ejemplo: la amino acilasa específica de Aspegillus orizae para separar una mezcla de aa D, L que ha sido acetilada químicamente (met, ala, gly).
Por síntesis química. D, L-alanina, D, L-metionina, D, L-triptófano, D, L-glicina.
Extracción de aa de hidrolizados de proteínas, (L-cisteína, L-leucina, L-tirosina).
Glutamato Prolina( ) ( )
Enzima activa
Enzima inactiva
Regulación de la biosintesis de aminoácidos por retroalimentación (feedback)
Regulación de la biosíntesis de amino ácidos por represión
argC argB argH
RepresorargR
Inactivo
Activo
Promotor Genes estructurales
+ arginina
A
B
C
A A
P1 P2
()X X
REGULACION PORISOENZIMAS
B
C
A
F
P2
D GHE P3P1
REGULACIÓN ACUMULATIVA
A
B
C
A A
P2
X
REGULACIONCONCERTADA
P1
Metabolitos primarios…
I- ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION…
1) Alteración de la acumulación de productos finalesOrnitina, Lisina, Valina
Mutantes auxótrofos2) Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación
Lisina y Treonina, IsoleucinaMutantes resistentes análogos
II- ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD…L-glutámico
Producción de metabolitos primarios
I- ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION…
1) Alteración de la acumulación de productos finalesse acumula un producto intermediario
A B C D EEnzima a Enzima b Enzima c Enzima d
A B C D EEnzima a Enzima b Enzima c Enzima d
Producción de metabolitos primarios
I- ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION…
1) Alteración de la acumulación de productos finales
Superproducción de L-ornitina por Corynebacterium glutamicum.Mutante auxótrofo para Arginina
Glutámico N-Acetil-Glutamil-P N-Acetil Ornitina
N-Acetil Glutámico Semiladehido N-Acetil Glutámico ORNITINA
Mutación
Citrulina
ARGININA Arginosuccinato
MM+ ARGININA
MM+ARGININA
MM+ARGININA
Obtención de mutantes auxótrofos
Medio mínimo
Etilmetanosulfonato
+ARGININA
mutagénesis penicilina
-ARGININA
I- ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION…
1) Alteración de la acumulación de productos finalesse acumula otro producto final
A B
P1
P2
Superproducción
Producción de metabolitos primarios
I- ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION…
1) Alteración de la acumulación de productos finalesOrnitina, Lisina, Valina
Mutantes auxótrofos2) Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación de rutas ramificadas
Lisina y Treonina, IsoleucinaMutantes resistentes análogos3) Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación de rutas no ramificadas
ProlinaMutantes resistentes análogos
ASPARTATO
ASPARTIL FOSFATO
SEMIALDEHIDO ASPARTICO
ACIDODIHIDRODIPICOLINICO HOMOSERINA
METIONINA ISOLEUCINA
ACIDO DIAMINOPIMELICO
LISINA
aspartokinasa12
3
Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación (rutas ramificadas)Biosíntesis de lisina en Escherichia coli
TREONINA
Biosíntesis de lisina en Escherichia coli
ASPARTATO
ASPARTIL FOSFATO
SEMIALDEHIDO ASPARTICO
ACIDODIHIDRODIPICOLINICO HOMOSERINA
TREONINA
METIONINA ISOLEUCINA
ACIDO DIAMINOPIMELICO
LISINA
aspartokinasa12
3
retroalimentaciónrepresión
Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación (rutas ramificadas)
Biosíntesis de lisina en Corynebacterium glutamicum
ASPARTATO
ASPARTIL FOSFATO
SEMIALDEHIDO ASPARTICO
ACIDODIHIDRODIPICOLINICO HOMOSERINA
TREONINA
METIONINA ISOLEUCINA
ACIDO DIAMINOPIMELICO
LISINA
aspartokinasaretroalimentaciónrepresión
Homoserinadeshidrogenasa
Mutantes resistentesa AEC
Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación (rutas ramificadas)
Biosíntesis de lisina en Corynebacterium glutamicum
Características de los microorganismos superproductores de lisina:1.Mutantes con un bloqueo en la homoserina deshidrogenasa (auxotrofos de treonina, metionina e isoleucina)2. Mutantes homoserina deshidrogensa hipersensible a la inhibición por treonina.3. Mutantes resistentes a AEC (s-β-aminoetil-L-cisteína).
NH2-(CH2)2-CH2-CH2-CHNH2-COOH Lisina
NH2-(CH2)2-S-CH2-CHNH2-COOH S-aminoetil cisteina AEC
Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación (rutas ramificadas)
Mutantes regulatorios,retrocruzamientocon la cepa parental para mejorar su crecimiento
(1) (2) (3)L-Glutámico ----------- B -------------------- C ---------- D -------------- Prolina
Glutamato kinasa
glutámico semialdehidodeshidrogenasa
pirrolina-S carboxilatoreductasa
No enzimatica
Biosíntesis de prolina en Serratia marcensens
Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación (rutas no ramificadas)
prolina 3,4-dehidroprolina
S
Acido 4-tiazolidin carboxilico
1) Se aislaron mutantes resistentes a 3,4-dehidroprolina.
2) Se inactivó el gen que codifica la enzima la prolina oxidasa.
Para superproducir prolina
3) Serratia marcensens se cultivo en medio con alta concentración de sales
4) Los genes que participan en la biosíntesis de prolina se clonaron a partir de la cepa superproductora, se insertaron en un plásmido multicopia y se reintrodujeron en Serratia marcensens en cepas defectivas en la degradación de prolina
Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación (rutas no ramificadas)
Metabolitos primarios…
II- ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD…L-glutámico
Uso: potenciador del saborMicroorganismo: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium, Microbacterium y Artrobacter
Características de los microorganismos superproductores de glutamato:1. Deficiencia en la α–cetoglutarato deshidrogenasa2. Incremento en la glutamato deshidrogenasa3. Requerimiento nutricional de biotina
glutamato
Metabolitos primarios…
II- ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD…L-glutámico
COOHCH2
HC-COOH
HC-OH
COOH
isocitrato
HC-NH2C=O
COOHCH2
COOH
CH2
α-cetoglutarato
COOHCH2
COOH
CH2
glutamato
IsocitratoDeshidrogenasa(descarboxilaciónoxidativa)
GlutamatoDeshidrogenasa(aminaciónreductiva)
NADP
NADPH2
CO2
NADPH2
NH3NADP
Glucosa
Pirúvico Acetil CoA
Oxalacetato
CO2
CO2
Citrato
MalatoAconitato
Succinato
Succinil CoA
FumaratoIsocitrato
α-cetoglutaratodeshidrogenasa
CO2
Glioxilato
Acetil CoAMalatosintasa
CO2
Enzimamálica
Piruvatocarboxilasa
Isocitrato liasa
IsocitratpdeshidrogenasaDescarbox.
NH4
α-cetoglutarato
Glutamato
Metabolitos primarios…L-glutámico
CICLOTCA
Biosíntesis de ácidos grasos
Concentración de Biotina:1-5 μg/ml: excreción de glutamato15 μg/ml: (no hay excreción de glutamato)
Metabolitos primarios…L-glutámico
Acetil-CoA carboxilasa
PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDO CON ENZIMAS…L-Aspártico
L-Aspártico Acido fumárico + NH3
Aspartasa
Keq =20mM1mM
2M ácido fumárico 2M NH3+L-AspárticoAspartasa