tecnología de cultivos celulares en investigación, producción de
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CULTIVO DE CÉLULAS EN LA PRODUCCION
DE BIOLOGICOS
M.V. ROQUE FERNANDEZ VERA
Introducción histórica.
• Hooke, Robert (1635-1703), 1º descubrimientos de las células vegetales.
• El cultivo de tejidos se desarrolló a finales del siglo XIX aplicado a técnicas de embriología.
• Roux : 1885 mantuvo células de embrión de pollo en solución salina durante unos días.
• Burrows y Carrel Utilizaron células de mamífero, perros, gatos , cobayos, y tumores sólidos.
• Rous y Jones (1916) emplearon extractos con tripsina disociar células y embriones , estableciendo el 1º
cultivo celular
• Grey y col.(1952) establecen la 1ª línea celular continua, bien conocidas las células HeLa .
• Eagle (1955) 1ª investigación sistemática requerimientos nutritivos de las células en cultivo
• Hayflick y Moorhead (1961)1ª vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de
fibroblastos
• Sato y col.(76-82) publicaron trabajos donde líneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y
factores de crecimiento en medios libres de suero.
• Los últimos años la aplicación de tecnologías en cultivo celular hay grandes avances para comprender
los mecanismos intracelulares e intercelulares estableciendo co-cultivos,...
• Actualmente ha revolucionado el manejo de cultivos celulares a través de la clonación, y los trabajos con
células madre:
Introducción histórica PERU.
• En Perú se realiza trabajos con tejidos de animales desde la década de los 50 donde se inocula
animales con virus como para la producción de vacuna antivariólica .
• Igualmente se trabaja vacuna antirrabica tipo FERMI inoculando corderos y tipo SEMPLE donde se
inocula conejos posteriormente se inocula ratones lactante vacuna antirrábica tipo FUENZALIDA Y
PALACIOS
• Entre los años 70 y 80 se trabaja con cultivos primarios la vacuna ANTIAFTOSA donde se usa epitelios
linguales de bovinos y adyuvada con Hidróxido de Aluminio.
• A finales de los 70 se construye el laboratorio de vacunas virales y un equipo de profesionales medicos
veterinarios se especializan en el centro de referencia de PANAFTOSA – BRASIL en la producción de
vacuna aftosa en cultivos celulares células BHK21
• En 1983 se inagura el LVV y se comienza con la producción de vacuna anti aftosa trivalente ( virus
O,A,C ) oleosa
• En1984 se propone la producción de vacuna antirrábica en CC (cel BHK) uso veterinario a partir 1986
se produce el primer lote de vacuna, y hasta la fecha se viene produciendo tratando de cubrir la
demanda nacional.
• En 1998 se trabaja lotes piloto de vacuna antirrábica en células VERO para humanos
CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS
Aplicaciones del cultivo celular. Los estudios Abarcan muchas disciplinas .
Actividad intracelular. trascripción de DNA, síntesis de proteínas, metabolismo energético.
Flujo intracelular. ej. ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA : núcleo-citoplasma, movimiento de proteínas,...
Ecología celular. estudia necesidades nutricionales, infecciones, transformación celular (inducidas por virus o agentes químicos), cinética de población celular,...
Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto o por adhesión, interacciones célula-célula.
CULTIVOS CELULARES
Áreas de Investigación
Virología :condiciones de cultivo, virus animales y plantas, producción vacunas antivirales.
Investigación del Cáncer
Inmunología. introducción de técnicas de fusión celular en producción de anticuerpos monoclonales, y el análisis genético de la célula somática.
Ingeniería de proteínas. producción de proteínas en líneas celulares : interferón, insulina, hormona de crecimiento,...
Estudios de interacción y señalización celular,. Comprende el estudio de los receptores y de las vias de translocación de la señal.
Aplicaciones diagnósticas. En medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células crecidas a partir de muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad,...
Aplicaciones médicas : mantenimiento y producción de tejidos para transplante.
Aplicaciones industriales y agronómicas : producción por reproducción "in vitro" de clones de plantas de interés comercial,...
y otras muchas.
Cultivo de Células en Producción de Biológicos
Equipos en el laborataorio de CC
Cabinas de flujo laminar (áreas de trabajo y de contención estéril).
Incubadores : baños termostatizados, incubadores de CO2, Incubadores 'roller', ...
Instrumentos ópticos de observación del cultivo : microscopio invertido de contraste de fases, de fluorescencia,...
Instalación de criogenia (tanques de N2 líquido) y congeladores
Equipo de esterilización : autoclave, equipos de filtración,...
Otros instrumentos : centrífugas, contadores electrónicos (Cell Counters), equipo de purificación de agua, balanzas, pH-metro, pipeteadores...
NORMAS DE SEGURIDAD
TECNICAS DE LABORATORIO ESTANDAR Y NORMAS DE HIGIENE PERSONAL:
BPM, BPL, BPA, desarrollo procedimientos, minimizar riesgos biológicos, químicos y físicos.
El lavado de manos inicio y fin jornada y el uso de indumentaria de protección es obligatorio para el manejo de cultivos y agentes biológicos.
Usar sustancias antimicrobianas, secar con toallas de papel o aire.
No comer, beber, fumar, aplicarse cosméticos ni guardar o almacenar alimentos y bebidas en el área de trabajo del laboratorio.
No pipetear con la boca.
El ingreso a las zonas restringidas deben efectuarse únicamente a través de las instalaciones de cambio de ropa y ducha.
Vacunarse..
CULTIVOS CELULARES
CLASES DE CULTIVOS CELULARES
CULTIVOS PRIMARIOS
CULTIVOS EN MONOCAPA
CULTIVOS EN SUSPENSION
CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS
Cultivo primario: células, tejidos u órganos tomados
directamente de un animal.
Cultivo de órganos, explantes: mantenimiento de
órganos o parte de órganos in vitro.
Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro.
Cultivo de células: mantenimiento de células dispersas.
Líneas celulares: células mantenidas por subcultivos
sucesivos comenzando por un cultivo primario.
Cultivos continuos: células que han logrado sobrevivir a
muchos subcultivos. Expectativa de
CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS
BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel) CHO: Epitelio de ovario de hamster chino VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino Etc., etc., etc.
CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS
Sigla Nombre u organismo
Ciudad, país Nº de cultivos
ATCC American Type Culture Collection
Minassas, USA 800
DSMZ Human and Animal Cell Cultures
Braunschweig, Alemania
500
ECACC European Collection of Cell Cultures
Salisbury, Wiltshire, UK
1000
GEIMM Istituto Giannina Gaslini
Genova, Italia 2300
CULTIVOS CELULARES INSTALACIONES
CULTIVOS CELULARES EQUIPOS
CRIOPRESERVACION
MEDIOS DE CULTIVO CELULAR
Agua
Sales
Glucosa
Ácidos grasos
Vitaminas
Suero
Péptidos
Micro y oligoelementos Aminoácidos esenciales Factores de crecimiento Otro regulador de pH Indicador de pH Antiespumante ¿Antibióticos?
COMPONENTES:
MEDIOS DE CULTIVO CELULAR
CONDICIONES DE UN MEDIO
CUALIDADES:
Específico para la célula a cultivar
Nutritivo
pH adecuado
Capacidad buffer
Isotónico
Estéril
MEDIOS DE CULTIVO CELULAR
Medio Basal de Eagle (BME). Medio con aminoácidos esenciales. Se suplementa con suero bovino fetal al 10 %.
Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). aminoácidos en mayor concentración que el BME. adición de suero (10 %).
R.P.M.I. 1640. crecimiento de linfoblasto y líneas celulares leucémicas en suspensión.
Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). 4 V AA y vit. selección de hibridomas .
Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina bovina, transferrina, selenito, et... linfocitos libre de suero.
McCoy 5A. L.C diploides tanto de rata como humanas.
Medio L-15 de Leibovitz. cultivo de virus.
Medio F-10 de Ham. L.C. humanas, se suplementan con proteínas, hormonas metales como Fe, Cu, Zn. Cé. amnióticas.
Medio F-12 de Ham. medio libre de suero.
Medio 199. usado para cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías.
MEDIO ESENCIAL MINIMO MEM
Composición Química:
L-arginina. HCL 126.00 mg/l Colina cloruro 1.00 mg/l
L-cistina. 2HCL 32.40 mg/l Acido fólico 1.00 mg/l
L-glutamina. 294.00 mg/l Inositol 2.00 mg/l D- glucosa 2000.00 mg/l Niacinamida 1.00 mg/l
L-histidina. 31.00 mg/l Bicarbonato de sodio al 7.5% 30.00 ml/l
L-isoleusina. 52.00 mg/l Piridoxal. HCL 1.00 mg/l
L-leucina 52.00 mg/l Riboflavina 0.10 mg/l
L-lisina 58.00 mg/l Tiamina HCL 1.00 mg/l
L-metionina 15.00 mg/l D- Calcio pantotenato 1.00 mg/l
L-fenilalanina. 32.00 mg/l Glutamina al 3% 10.00 ml/l
Sulfato de magnesio. 6H2O 200.00 mg/l
L-treonina 48.00 mg/l Cloruro de potasio 400.00 mg/l
L-triptófano 10.00 mg/l Cloruro de sodio 6500.00 mg/l
L-tirosina 2Na.2H2O 54.52 mg/l Fosfato dibasico de sodio 1327.00 mg/l
L-valina 46.00 mg/l Penicilina 1000.00 UI Rojo de fenol . 10.00 mg/l. Estreptomicina 100.00 mg/l
CULTIVOS CELULARES
SISTEMA DE CULTIVOS CELULARES
CULTIVOS ESTACIONARIOS
CULTIVOS ROTATIVOS
CULTIVOS EN SUSPENSION
ESTACIONARIO
ROTATIVO
PRODUCCION DE BIOLOGICOS
ROTATIVO
ROTATIVO
ROTATIVO Y SUSPENCION
PRODUCCION DE BIOLOGICOS MICROPORTADORES
RECUENTOCELULAR
CELULAS MDCK CELULAS BHK
CULTIVO DE TEJIDOS
RFV
CULTIVOS CELULARES
PRODUCCION DE BIOLOGICOS
VACUNA ANTIVARIOLICA
VACUNA ENCEFALITIS EQUINA
VACUNA ANTIAFTOSA (FRENKEL)
VACUNA ANTIAFTOSA (OLEOSA)
VACUNA HEPATITIS
VACUNA INFLUENZA
VACUNA ANTIRRABICA
OTRAS VACUNAS
PRODUCCION DE VACUNA ANTIRRABICA
VACUNA EN CULTIVOS CELULARES
INACTIVACION DE ANTIGENO
CLARIFICACION DE ANTIGENO
ANTIGENO RABICO PARA FORMULACION
ENVASE DE LA VACUNA
TAPONADO Y PRECINTADO
CONTROL DE VACUNAS
Hay factores importantes en la fabricación de Vacunas Antirrábicas, para el
control se emplean ratones adultos de (11- 14 gr.) y lactantes los cuales deben
provenir de criaderos garantizados, debiendo tener buenas condiciones de
manejo, alimentación y salud.
Los controles son decisivos, para poder usar un biológico, entre ellos tenemos
ESTERILIDAD
SEGURIDAD GENERAL
INOCUIDAD
POTENCIA (NIH)
ESTABILIDAD
VACUNA DE USO VETERINARIO
Vacuna Antirrábica en CC
RFV
Vacunación Antirrábica
138.945
224.182
126.064
73.901
129.060
59.239
112.443
238.380
128.496
224.920
0.000
50.000
100.000
150.000
200.000
250.000
300.000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CA
NT
IDA
D E
N F
RA
SC
OS
ENTREGAS REGISTRADAS DE LA VACUNA
ANTIRRÁBICA 2004-2013
CANTIDAD
1,389,450
2,241,820
1,260,640
739,010
1,290,600
592,390
1,123,260
2,383,800
1,284,960
2,249,200
0
500,000
1,000,000
1,500,000
2,000,000
2,500,000
3,000,000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CA
NT
IDA
D E
N D
OS
IS
ENTREGAS REGISTRADAS DE LA VACUNA ANTIRRÁBICA 2004-2013
CANTIDAD
«EL TRABAJO INDIVIDUAL GANA UNOS PASOS
PERO EL TRABAJO EN EQUIPO LOGRA LAS METAS
PRODUCIMOS PARA PROTEGER LA SALUD »
LVV
GRACIAS…