cultivos celulares aplicados a la inmunologia

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ÍNDICE

CULTIVO CELULAR

1. Introducción. 1.1. Introducción histórica.

2. Conceptos actuales de cultivo celular. 2.1. Aplicaciones del cultivo celular. 2.2. Ventajas e inconvenientes de las técnicas de cultivo celular.

3. Tipos de cultivos de tejidos. 3.1. Cultivo de órganos. 3.2. Explantes primarios. 3.3. Cultivo celular.

4. Biología de la célula en cultivo. 4.1. Evolución de las líneas celulares.

ANTICUERPOS MONOCLONALES

1. Introducción. 2. Nociones básicas.

2.1. Consideraciones estructurales y funcionales. 2.2. Genética y repertorio de inmunoglobulinas.

3. Anticuerpos monoclonales de primera generación. 4. Anticuerpos monoclonales de segunda generación.

4.1. Anticuerpos quiméricos. 4.2. Anticuerpos humanizados. 4.3. Moléculas recombinantes derivadas de Ac. 4.4. Fragmentos de Ac. 4.5. Cadena Simple Fv (sc Fv). 4.6. Expresión de repertorios de Ac en fago λ . 4.7. Desplegamiento de repertorios de Ac en fagos filamentosos. 4.8. “Diabodies”, anticuerpos biespecíficos y “Triabodies”. 4.9. Minibodies. 4.10. Anticuerpos “Camélidos”. 4.11. Proteínas de fusión.

5. Consideraciones finales.

PRODUCCIÓN

1. Producción de cultivos de anticuerpos monoclonales. 1.1. Elementos técnicos de la producción de hibridomas y anticuerpos monoclonales.


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APLICACIONES

1. Aplicaciones de anticuerpos monoclonales.

BIOTECNOLOGÍA

1. Concepto actual de Biotecnología. 2. Ventajas y Problemas. 3. Ejemplo de planta industrial.

PUBLICACIONES

- Anticuerpo Monoclonal Humanizado h-R3.

- Tratamiento contra el cáncer de hígado.

- Inmunólogos españoles han obtenido AM humanos que reconocen células cancerosas.

- Los anticuerpos monoclonales en la caracterización de los virus de la rabia en América latina y el Caribe.

- Anticuerpos monoclonales disponibles en España.

- Los anticuerpos monoclonales, las enfermedades raras y los medicamentos.

- El uso de animales puede cambiar el futuro de la I+D farmacéutica.

BIBLIOGRAFÍA


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CULTIVO CELULAR

1. Introducción.

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las buenas instalaciones de asepsia, contenedores especiales, estos avances han hecho del cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad. Ha sido así mismo importante el desarrollo de un buen número de compañías comerciales de suministro de medios, sueros, equipo y líneas celulares.

Podemos dividir el cultivo de tejidos en dos grupos de técnicas :

• El cultivo de órganos: Se puede definir como el mantenimiento de pequeños fragmentos de tejido u órganos completos in vitro.

• El cultivo celular: Es la propagación de células dispersas tanto en suspensión como en monocapas sobre cristal o plástico.

1.1. Introducción histórica.

El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX como una continuación de las técnicas de la embriología. Wilhem Roux mantuvo en el año 1885 células de embrión de pollo en solución salina durante unos días. El zoólogo americano R.G. Harrison es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animales, en 1907.

Harrison fue el primer autor que empleó técnicas in vitro para el estudio de fenómenos in vivo, realizando cultivos de médula espinal embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableció que el axón se formaba por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusión de una cadena de células. El cultivo se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cámara sellada.

La primera limitación para el establecimiento de cultivos era lograr un medio nutritivo adecuado. Burrows (1910) empleó plasma de pollo para nutrir los explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio se reveló mucho mejor que los anteriormente probados, lo que le permitió observar el crecimiento del tejido nervioso, corazón y piel.

Burrows y Carrel realizaron los primeros intentos de establecer cultivos de células de mamífero, y consiguieron mantener explantes obtenidos a partir de perros, gatos y conejos de indias, así como en el crecimiento de tumores sólidos. Demostraron que la vida del cultivo se puede prolongar mediante subcultivo. Los medios empleados fueron plasma suplementado con extractos de embrión.


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Rous y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para disociar las células de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular. Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los cultivos celulares es la aparición de múltiples contaminaciones, por lo que desarrollaron numerosos métodos de manipulación en condiciones de asepsia que aún hoy día se utilizan.

En 1913 Carrel demostró la posibilidad de mantener en cultivo células extraídas de un animal, embrión de pollo, durante un periodo de tiempo superior al de la vida de éste. Mantuvo en cultivo células de pollo durante 34 años (Sharp, 1977). Gran parte del éxito en el mantenimiento de los cultivos se debió al desarrollo del denominado frasco de Carrel.

• Entre los años 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtención de cultivos y de mantenimiento de las condiciones estériles, pero sin grandes avances. A partir de los años 40, con el aislamiento de los primeros antibióticos, se desarrollaron numerosas aplicaciones de entre las que podemos destacar :

• 1948 Earle y col. (Sanford, Earle and Likely, 19848) aislaron células de la línea celular L y mostraron que eran capaces de formar clones en el cultivo de tejidos. Demostraron que para que una célula llegue a dividirse necesita ser alimentada con los nutrientes correctos.

• 1952. Gry y col. (Grey, Coffman y Kubicek, 1952) establecen la primera línea celular contínua, las actualmente bien conocidas células HeLa . El medio empleado era extremadamente complejo y poco definido : plasma de pollo, extracto de embrión bovino y suero de cordón umbilical humano.

• 1954 Rita Levi-montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones en tejidos en cultivo (Levi-Montalcini y Calissano, 1979). Este trabajo supuso el Premio Nobel para Levi-Montalcini en 1986.

• 1955 Eagle (Eagle, 1955) realiza la primera investigación sistemática de los requerimientos nutritivos de las células en cultivo. Describe que las necesidades del cultivo de soluciones corporales complejas (sueros,... ) pueden ser satisfechas por tan poco como el 1% de suero de caballo dializado en un medio definido de pequeñas moléculas (aminoácidos, azúcares, ...)

• 1961 Hayflick y Moorhead usaron por primera vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de fibroblastos. Pudieron mantener estos cultivos durante unos 12 pases, pero no consiguieron establecer líneas estables.


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• 1965 Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener algunas células de mamífero en cultivo indefinidamente (Ham, 1965).

• 1969 Augusti-Tocco y Sato establecen la primera línea celular estable de neuroblastoma aislando clones que establecían procesos nerviosos y que eran electricamente excitables (Augusti-Tocco y Sato, 1969). Se empiezan a establecer las primeras líneas celulares diferenciadas.

• 1975 Kohler y Milstein establecen la primera línea celular productora de anticuerpos monoclonales (Koehler y Milstein, 1975). El establecimiento de la tecnología de obtención de anticuerpos monoclonales les valió el Premio Nobel.

• 1976 Sato y col. publicaron sus trabajos en los que demuestran que las diferentes líneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y factores de crecimiento para crecer en medios libres de suero. (Sato y col., 1982).

En los últimos años la aplicación de la tecnología del cultivo celular ha permitido grandes avances en la comprensión de los mecanismos implicados en los procesos intracelulares e intercelulares con el establecimiento de co-cultivos,...

A pesar de que el primer animal del que se establecieron cultivos celulares era un anfibio, poiquilotermo, rápidamente el interés se centró en el cultivo de células de animales homeotermos, especialmente humanas, por su gran interés médico. Sin embargo en los últimos años, y especialmente debido a la problemática del control de plagas e infecciones en agricultura y piscicultura, se ha desarrollado notablemente el establecimiento de líneas celulares de poiquilotermos e invertebrados.

2. Conceptos actuales de cultivo celular.

Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células 'in vitro', manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido o del órgano de origen y de su duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos : de órganos, explantes, primarios o secundarios,...


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2.1. Aplicaciones del cultivo celular.

Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenómeno celular.

a. Actividad intracelular.

Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como por ejemplo la transcripción de DNA, síntesis de proteínas, metabolismo energético...

b. Flujo intracelular.

Movimientos intracelulares de sustancias y señales asociadas a los diferentes procesos fisiológicos, como por ejemplo el ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA : núcleo-citoplasma, movimiento de proteínas,...

c. Ecología celular.

Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciación..., como por ejemplo el estudio de las necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la transformación celular (inducidas por virus o agentes químicos), cinética de la población celular,...

d. Interacciones celulares.

Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto o por adhesión, interacciones célula-célula.

Como ejemplo de áreas de investigación fuertemente dependientes de las técnicas de cultivo celular son :


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1. Virología : establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas antivirales,...

2. Investigación del Cáncer

3. Inmunología. Gracias especialmente a la introducción de las técnicas de fusión celular en la producción de anticuerpos monoclonales, así como en el análisis de la genética de la célula somática.

4. Ingeniería de proteínas. Por la producción de proteínas en líneas celulares : interferón, insulina, hormona de crecimiento,...

5. Estudios de interacción y señalización celular, en la diferenciación y en el desarrollo. Comprende el estudio de los receptores y de las vías de translocación de la señal.

6. Aplicaciones diagnósticas. Por ejemplo en medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células crecidas a partir de muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad,...

7. Aplicaciones médicas : mantenimiento y producción de tejidos para transplante.

8. Aplicaciones industriales y agronómicas : producción por reproducción "in vitro" de clones de plantas de interés comercial,...

y otras muchas.

2.2. Ventajas e inconvenientes de las técnicas de cultivo celular.

Estas técnicas tienen una serie de ventajas innegables, pero al mismo tiempo tienen unas desventajas que hay que tener en consideración.

Ventajas Inconvenientes Permiten un control preciso y fino

del medio ambiente. Técnica sensible.

Caracterización y homogeneidad de la muestra.

Cantidad y coste.

Economía. Inestabilidad.

Motivaciones éticas. Validez del modelo ‘in vitro’

Como ventajas podemos citar:


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a. Permiten un control preciso y fino del medio ambiente.

En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio : físico-químicos (pH, temperatura, presión osmótica, niveles de O2, CO2, tensión superficial...), y fisiológicos (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular,...). Esto es cierto completamente sólo para algunas líneas celulares para las que se han definido los denominados medios definidos. Un medio definido es aquel en el que se conocen todos y cada uno de los componentes que lo forman, y la concentración exacta en que se encuentran. Establecer un medio definido supone conocer con precisión las necesidades nutritivas de las células en cuestión. Sin embargo en muchas líneas no se han llegado a establecer medios definidos. En estos casos se trata de medios que se suplementan con soluciones complejas (suero, extractos de embrión, etc...) en los que se encuentran factores hormonales y nutritivos imprescindibles para el mantenimiento del cultivo pero cuya naturaleza se desconoce. Estas soluciones complejas están sujetas a variación de lote a lote.

b. Caracterización y homogeneidad de la muestra.

Las células en cultivo de una línea celular (cultivo primario propagado), o de una línea continua son homogéneas, con morfología y composición uniformes. Se pueden obtener con facilidad un número elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave problema de hetereogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de animales de experimentación.

c. Economía.

Suponen una economía en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al realizarse en volúmenes reducidos, y con un acceso directo de las células a la droga las concentraciones requeridas son mucho más bajas que en animal completo. Es diferente el coste de investigación de un nuevo fármaco para la empresa farmaceútica que está desarrollando moléculas si ha de sintetizar de cada una de las que ha de probar en cantidades del orden del gramo (para el estudio en animales) a que baste con pocos miligramos.

d. Motivaciones éticas.

La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles de animales de experimentación. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo' pero es una alternativa válida en muchas situaciones. Incluso un cultivo celular primario permite realizar experimentos que suponen el sacrificio de uno o pocos animales, pero con ellos se pueden ensayar un número de condiciones experimentales que pueden suponer si el estudio se hace con animales de experimentación el sacrificio de decenas o cientos.

En cuanto a las desventajas del cultivo celular :

a. Técnica sensible.

El crecimiento de las células animales es mucho más lento que el de los contaminantes más habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas,...) y además dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de


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una compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto supone la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido como del personal cualificado para su manipulación.

b. Cantidad y costo.

El costo de producción de 1 g de tejido en cultivo es más de 10 veces superior al obtenido en el animal. Asimismo existe una limitación de producción, que es del orden de 10 g de células en un laboratorio normal, y que para ser superior a 100 g requiere instalaciones de tipo industrial.

c. Inestabilidad.

Muchas de las líneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la dotación cromosómica aneuploide. La población celular puede variar su composición si alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer con una tasa ligeramente superior, es decir podemos encontrar diferencias significativas en la línea celular de una generación a la siguiente. La única manera de evitarlo es emplear líneas estables que se resiembran a partir de un stock congelado cada determinado tiempo, o después de un determinado número de generaciones.

d. Validez del modelo 'in vitro'.

Cuando nos referimos a un cultivo celular nos estamos refiriendo exactamente a un disgregado celular de un tejido de origen y que se diferencia de éste en que :

• Se ha perdido la organización espacial tridimensional propia del tejido. • Se han perdido las interacciones heterotípicas, entre los distintos tipos celulares,

y entre las células y la matriz extracelular. Es de destacar que los avances más excitantes en la función celular proceden del reconocimiento de la importancia de las interacciones específicas de las células con otras células o con el sustrato.

• Carece de los componentes sistémicos de regulación, implicados en la regulación de la homeostasis 'in vivo', especialmente los sistemas nervioso y endocrino.

Cuando se establece el cultivo, las células se desdiferencian, y entre otras cosas se hacen móviles e inician su proliferación. Esta desdiferenciación puede, en algunos casos ser revertida por procedimientos de diferenciación inducida por hormonas, confluencia, inductores químicos (ésteres de forbol,...) pero no está claro si el estado rediferenciado es equivalente al estado de diferenciación 'in vivo'.

Por todo lo anterior hemos de ser precavidos en cuanto a la validez de los resultados obtenidos 'in vitro' respecto a lo que pueda observarse 'in vivo'. Sin embargo actualmente se están realizando gran cantidad de estudios de validación de modelos 'in vitro' dentro del desarrollo de los métodos alternativos a la experimentación animal, por ejemplo por ECVAM ('European Center for Validation of Alternative Methods'), ALTWEB (Colección de recursos para el desarrollo de métodos alternativos a la experimentación animal en web de la Universidad John Hopkins, USA), Invittox (Colección de protocolos 'in vitro'), Invitroderm (Alternativas a los ensayos de irritación dérmica en animales), etc..


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3. Tipos de cultivos de tejidos.

Se podría hablar de tres tipos de cultivos :

3.1. Cultivo de órganos.

Implica que la arquitectura característica del tejido 'in vivo' se mantiene al

menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. La imposibilidad de propagar obliga a partir en cada nuevo experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada heterogeneidad.

3.2. Explantes primarios.

Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las células de la periferia del explante.

3.3. Cultivo celular.

Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como


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característica negativa se pierde la heterogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento.

En la actualidad los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la posibilidad de propagación, así como por las ventajas en la cuantificación, caracterización y repetibilidad de las muestras. A fin de compensar la ausencia de interacciones heterotípicas se realizan desde hace unos años cultivos mixtos con importantes éxitos.

4. Biología de la célula en cultivo.

En el proceso de establecimiento de un cultivo celular se seleccionan las células que crecerán según numerosos criterios. Así solo formarán el cultivo aquellas células que sean por una parte capaces de superar el proceso de disgregación, y por otra capaces de adherirse al sustrato y proliferar en forma de monocapa o en suspensión.

El crecimiento en monocapa significa que las células se adherirán al sustrato y en esa forma inician la proliferación. Muchas líneas celulares son anclaje dependientes, es decir no inician la proliferación hasta que se han adherido al sustrato. Este es el modo normal de proliferación de la mayor parte de las células, con excepción de las células hematopoyéticas maduras. El crecimiento en suspensión es propio de aquellas células capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje, y es propio de las células hematopoyéticas, algunas líneas celulares transformadas y de células procedentes de tumores. Es de destacar que en todo tejido existe una fracción o tipo celular que es capaz de crecer en suspensión. A pesar de que su origen no está claro se cree que se trata de células cepa ("stem cells") indiferenciadas.

Cuando se mantiene el cultivo se establece una nueva selección : aumentan en número aquellas células que tienen una mayor tasa de crecimiento. En el momento en que se alcanza la confluencia las células, en general, detienen su crecimiento, aunque pueden existir tipos celulares, neoplásicos, que sigan duplicándose y que desplacen a los otros del cultivo.

Así pues se ha de entender el cultivo como un ente dinámico en el que las proporciones relativas de los diferentes elementos que lo forman varían en el tiempo en función de la presión selectiva a la que estén sometidos.

4.1. Evolución de las líneas celulares.

Una vez se alcanza la confluencia en el cultivo es cuando muchas líneas celulares expresan sus aspectos más característicos. Es en este estado cuando el parecido morfológico y fisiológico es mayor al modelo celular de origen. Es también el momento en el que se detiene el crecimiento y se hace necesario dividir, replaquear o propagar las células.


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Es una observación generalizada que después del tercer replaqueo el cultivo se estabiliza y homogeneiza : el tipo celular de mayor tasa de crecimiento ha ocupado completamente el cultivo desplazando a los otros tipos celulares. En general, si no se establecen condiciones selectivas las células del tejido conjuntivo, especialmente fibroblastos, serán las seleccionadas finalmente. Para evitar que las células más especializadas del cultivo se vean desplazadas de éste por los fibroblastos y otras células de rápido crecimiento se han establecido protocolos detallados de medios selectivos.

Evolución de una línea celular hipotética. Comportamiento a lo largo de las semanas.

Comparación del número de cromosomas por célula en una línea primaria glial y una línea estable de melanoma.

En el momento en que las células comienzan a dividirse en la placa su número se incrementa, hasta ocupar todo el espacio. En ese momento es necesario tomar algunas y resembrar en una nueva placa. En el caso de células en cultivo primario el factor de dilución de un pase al siguiente suele ser de 1/2 a 1/5 pero no superior. En el caso de líneas celulares establecidas la dilución puede ser tan elevada como 1/100 o 1/1000, siendo la habitual 1/10. El caso más extremo serían los procesos de clonaje en los que se siembran en pocillos (multiwell de 96 pocillos) 1 única célula.

El crecimiento de las células en cultivo primario prosigue a lo largo de una serie de generaciones o pases característicos de cada tipo celular y condiciones de cultivo. Así los hepatocitos de adultos no se establecen más que como cultivo primario mientras que las células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) permanecen en cultivo de 3 a 9 pases, y los fibroblastos dérmicos humanos pueden superar los 20 pases. Sin embargo al final todas ellas entran en una fase de senescencia, con acumulación de numerosas anormalidades, perdida de funciones especializadas, etc... que conducen a la muerte del cultivo.

Sólo ocasionalmente un cultivo primario se mantiene durante más generaciones de las esperadas. Es debido a la aparición en el cultivo de células inmortales. Estas células forman líneas estables o cultivos celulares permanentes. La razón de la inmortalización de estas células es en la mayor parte de los casos desconocida pero se incrementa la frecuencia de inmortalización mediante infecciones virales, tratamientos


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con mutágenos, etc... por lo que deben estar relacionadas con la pérdida, espontánea o inducida por el tratamiento, de las vías de control celular. Se hipotetiza que la capacidad de un cultivo celular primario para establecerse como línea estable está relacionado directamente con su variabilidad genética. Así líneas celulares que nunca se establecen como estables se mantienen euploides como es el caso de fibroblastos humanos (Hayflick y Moorhead, 1961), fibroblastos de pollo (Hay y Strehler, 1967), y la glia humana (Pontén y Westermarck, 1980) mientras que otras líneas frecuentemente se convierten en aneuploides y se transforman en líneas celulares continuas con mayor frecuencia, como es el caso de las células epidérmicas (Green y col., 1979; Thomas J., 1979).

El cultivo de las células no presenta las mismas dificultades independientemente del tipo de célula de que se trate. Hay grandes diferencias que se relacionan fundamentalmente con el grado de diferenciación del tipo celular. Así pues en general se puede establecer como norma que una línea celular será tanto más fácil de establecer o cultivar cuanto más indiferenciada sea, con las excepciones de las líneas tumorales de células diferenciadas.

Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles porque las células pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, entre ellas la característica incapacidad de dividirse, y se convierten en células que mantienen tan solo algunas de las propiedades que las caracterizaban. Esta pérdida de propiedades puede ser debida a desdiferenciación o desadaptación. La primera implica una pérdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular ( por ejemplo un hepatocito en cultivo pierde sus enzimas característicos (arginasa, aminotransferasas,...) no puede almacenar glucógeno ni sintetizar las proteínas del suero...), mientras que la segunda implica que la característica especializada perdida no es irreversible sino consecuencia de la pérdida de la señal (por ejemplo externa, hormonal, nerviosa, ...) y que basta con recuperarla para que se reexprese (por ejemplo Michalopoulos y col. (Michalopoulos y Pitot, 1975; Sattler y col., 1978) han demostrado que los hepatocitos de rata pueden reexpresar tiroxina aminotransferasa en presencia de ciertas hormonas (insulina e hidrocortisona) cuando crecen sobre una matriz de colágeno).


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ANTICUERPOS MONOCLONALES

1. Introducción.

Desde su descubrimiento, hacia finales del siglo pasado, los anticuerpos han cautivado la atenc ión de médicos, bioquímicos y científicos en el área de las biociencias y la historia recoge testimonios de ello. Por ejemplo, el primer premio Nobel, otorgado en el área de Fisiología o Medicina, lo recibió Emil von Behring, precisamente, gracias al trabajo en el cual reportó el descubrimiento de los anticuerpos. Desde entonces y hasta el presente, quince premios Nóbel han sido otorgados a individuos que han hecho aportes significativos en el ámbito de la inmunología. Siete de éstos fueron entregados a personas cuyo trabajo estuvo directamente relacionado con anticuerpos. Sin duda, este interés surgió de la inmensa potencialidad que, desde un inicio, les fue reconocida a estas moléculas para ser usadas en aplicaciones diagnósticas y terapéutico-profilácticas.

Los anticuerpos policlonales, o antisueros, fueron los protagonistas en la época de la serología y la seroterapia. Los anticuerpos monoclonales, de primera generación, aparecieron a mediados de los años setenta para convertirse en las herramientas principales de poderosas técnicas analíticas como los radioinmunoensayos, los ensayos inmunoenzimáticos y la citometría de flujo. Más recientemente, avances importantes en el área de la biología molecular y el desarrollo de técnicas de ADN recombinante han hecho posible la creación de anticuerpos recombinantes, también llamados anticuerpos monoclonales de segunda generación.

2. Nociones básicas.

En el ámbito de la respuesta inmune específica de los organismos vertebrados, las inmunoglobulinas (Ig) o anticuerpos (Ac) juegan un papel central. Estas moléculas tienen la habilidad de reconocer específicamente y mediar la eliminación de sustancias y organismos extraños, tales como toxinas bacterianas y virus. Ello lo logran gracias a que, luego de ligar el antígeno (Ag), los Ac interactúan con receptores presentes en ciertas poblaciones celulares y con moléculas del sistema de complemento (Figura 1), conduciendo a la activación de mecanismos efectores, los cuales finalmente, son los responsables de la mencionada eliminación.


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2.1. Consideraciones estructurales y funcionales.

Los Ac son glicoproteínas solubles, sintetizadas y secretadas de manera exclusiva por un tipo particular de glóbulo blanco denominado linfocito B. Moléculas de Ac han sido encontradas, virtualmente, en todos los fluidos y cavidades corporales. En mamíferos se han descrito cinco clases de Ig a saber Ig M, G, A, D y E. Cada una de ellas posee, además de un metabolismo y fisiología característicos, rasgos estructurales y funcionales particulares. Sin embargo, todas comparten una estructura básica común que bien puede ser ejemplificada por la molécula IgG (Figura 2).

Básicamente, la molécula de Ac consta de dos tipos de cadenas polipeptídicas, denominadas cadena liviana/ligera y cadena pesada, con pesos moleculares aparentes de unos 25 y 50 kD, respectivamente (Figura 2A y 2C). Se han identificado dos tipos de cadena liviana, kappa (κ) y lambda (λ), y cinco clases de cadena pesada, mu (µ), gamma (γ), alfa (α), delta (δ) y épsilon (ε).

Cada monómero de Ig, independientemente de la clase, consta de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas livianas igualmente idénticas. Las cadenas pesadas establecen abundantes interacciones no covalentes y cierto número de enlaces covalentes (del tipo puente disulfuro) entre sí y con las cadenas livianas.


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La característica bioquímica estructural más resaltante de las cadenas Ig es el "dominio Ig". Muy resumidamente, un dominio Ig es una secuencia polipeptídica de unos 100-110 aminoácidos que presenta, de manera muy conservada, dos residuos de cisteína localizados hacia los extremos opuestos de la secuencia. Estos residuos permiten la formación de un puente disulfuro intracatenario importante para la estabilización de la estructura terciaria del dominio y, consecuentemente, de la molécula. La distribución de aminoácidos hidrofílicos e hidrofóbicos en la secuencia primaria del dominio trae como resultado la formación de lo que, en bioquímica de proteínas, se conoce con el nombre de hojas plegadas tipo β . Estas hojas β se organizan en forma antiparalela, se unen mediante segmentos relativamente cortos de secuencia llamados asas o "loops", en los cuales es usual encontrar la conformación tipo hélice a y se arreglan a nivel tridimensional para formar un par de láminas (Figura 3).


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Estudios comparativos de la secuencia primaria de aminoácidos, en un número importante de moléculas de Ac, han permitido la identificación de dos tipos de dominio en las cadenas Ig: el dominio variable (V) y el dominio constante (C). Esta denominación obedece a la variabilidad encontrada en cada posición de la secuencia primaria. Tanto la cadena liviana como la pesada poseen un dominio variable designados VL y VH, respectivamente. La cadena liviana posee un único dominio constante (CL), mientras la cadena pesada posee tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3, CH4), dependiendo de la clase de Ig (Figura 2A). El dominio Ig tiene implicaciones importantes para la funcionalidad de la molécula de Ac. Por ejemplo, los dominios VL y VH se conjugan en un módulo funcional denominado Fv, en el cual se encuentra el sitio de reconocimiento del antígeno o paratopo (Figura 2A). Mediante la comparación de secuencias de aminoácidos disponibles para numerosos dominios VL y VH, ha sido posible identificar tres sitios en cada dominio V, denominados regiones hipervariables, en los que la variabilidad, en la secuencia primaria de aminoácidos, alcanza un máximo. Estas regiones contienen los residuos principales que conforman el paratopo y, por ello, también se les conoce con el nombre de regiones determinantes de complementariedad (RDC). Las RDC corresponden a las asas o "loops" de los dominios V (Figura 3) y se encuentran flanqueadas por regiones de menor variabilidad designadas marco (M) .

El dominio Ig ha sido explotado más allá del ámbito de los Ac, de manera que hoy se acepta la existencia de una superfamilia de proteínas que contienen en su estructura dominios Ig. Entre estas proteínas se cuentan, además de los Ac, el receptor antigénico de linfocitos T, las moléculas del sistema mayor de histocompatibilidad, receptores para el fragmento Fc de las Ig, moléculas de adhesión intercelular, etc.


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2.2. Genética y repertorio de inmunoglobulinas.

Los genes que codifican las Ig están organizados en complejos genéticos. Existe un complejo genético en el que se encuentran los elementos codificantes de todas las cadenas pesadas (complejo H) y dos complejos para las cadenas livianas, uno para la cadena κ (complejo κ ) y otro para la cadena λ (complejo λ). El complejo H se encuentra localizado en la región telomérica del cromosoma 14 humano y está formado por un número variable de elementos codificantes denominados VH, DH, JH, hH y CH

(Figura 2B). En forma similar, los complejos κ y λ contienen elementos VL, JL y CL, pero no poseen segmentos D ni h y están ubicados en los cromosomas 2 y 22 humanos, respectivamente. Cada complejo posee un número significativo de elementos V y, en menor cuantía, elementos D (complejo H) y J. Los elementos codificantes h y C constituyen exones completos, los cuales contienen la información estructural para la síntesis de la región bisagra (cadena pesada) y de los diferentes dominios constantes, respectivamente (Figura 2B).

Por otro lado, los dominios V son producidos a partir de la combinación de los elementos V, D y J. Durante la ontogenia del linfocito B estos complejos génicos sufren un interesante proceso de reordenamiento, o rearreglo, cuyos detalles mecanísticos no han sido del todo entendidos. Un sofisticado sistema de recombinación somática actúa sobre los elementos V, D y J, permitiendo en cada linfocito B el rearreglo funcional de un segmento VL con un segmento JL, para así generar un exón VL, el cual codifica el dominio VL de la cadena liviana. Algo similar ocurre con los segmentos VH, DH, y JH del complejo H (Figura 2B). Luego de que, en un linfocito B particular, ocurre el rearreglo funcional de estos segmentos y se genera un exón VL y uno VH, el proceso se detiene de manera que cada linfocito B despliega una única especificidad y es capaz de secretar, luego de la estimulación antigénica, únicamente Ac con esa especificidad. En humanos, se ha estimado que el proceso de rearreglo génico de los segmentos V, D, y J, en el cual se ven además involucrados fenómenos de adición de nuevos nucleótidos e inversión y uso simultáneo de varios segmentos D, tiene la potencialidad de generar 104 dominios VL y 108 dominios VH diferentes, pudiendo combinarse aleatoriamente para generar hasta 1012 moléculas de anticuerpo con especificidades diferentes. Este gigantesco repertorio permite al sistema inmune humoral disponer de la capacidad para reconocer y responder prácticamente ante cualquier reto antigénico.

3. Anticuerpos monoclonales de primera generación.

Los anticuerpos policlonales, o antisueros, son poblaciones complejas de Ac, formadas por distintas clases de Ig en las que está presente una variedad de especificidades. Por el contrario, el término anticuerpo monoclonal (AcMo) se usa para referirse a una población de moléculas de Ac, todas idénticas, las cua les consecuentemente, poseen todas la misma especificidad. De lo anterior se desprende que, en una prueba analítica, el chance de obtener falsos positivos, es decir, "reconocer lo que no es como si lo fuera" es mucho menor cuando se usan reactivos monoclonales.

En 1975, en un trabajo que posteriormente les valió el premio Nóbel, G. Kohler y C. Milstein demostraron la posibilidad de producir AcMo mediante la fusión de linfocitos B con células mielomatosas (células tumorales inmortales). Ellos demostraron que los híbridos resultantes de tal fusión heredan la capacidad para crecer


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indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos, y que, además, es posible aislar del producto heterogéneo de fusión aquellos híbridos secretores del anticuerpo en el cual se está interesado. Así nacieron los AcMo, posteriormente denominados de primera generación, para distinguirlos de los anticuerpos producidos mediante técnicas de biología molecular y ADN recombinante, que han sido llamados de segunda generación.

La técnica original descrita por Kohler y Milstein (Figura 4) permite la obtención de AcMo de ratón. De manera resumida, el proceso se inicia con la inmunización de ratones de laboratorio (cepa Balb/c) con el antígeno para el cual se desea producir los anticuerpos. Una vez que se tiene la certeza del status inmune de estos animales (por lo general esto se establece tomando muestras de sangre y examinando y/o cuantificando la presencia de anticuerpos específicos en el suero inmune), los mismos son sacrificados y se obtiene el bazo, en el cual se encuentra una población numerosa de linfocitos B. A continuación, los esplenocitos se fusionan con células mielomatosas inmortales que son mantenidas en el laboratorio en la forma de líneas celulares gracias a su capacidad para crecer indefinidamente en cultivo. La fusión, fenómeno poco común en células somáticas, es facilitada mediante la adición de agentes virales (virus Sendai), químicos (polietilenglicol) o físicos (electricidad), de los cuales el más usado es la sustancia química denominada polietilenglicol (PEG). El producto de la fusión entre un esplenocito y una célula mielomatosa es denominado hibridoma. Los hibridomas heredan características fenotípicas de ambas células parentales de manera tal que son capaces de crecer indefinidamente y de producir el anticuerpo codificado en los genes del esplenocito pariente. Obviamente, la población de hibridomas obtenida mediante una fusión, como la descrita anteriormente, es heterogénea en cuanto a los anticuerpos secretados por ella. Con el objeto de seleccionar los híbridos productores del anticuerpo de interés se realiza clonación celular. Esta clonación consiste en sembrar los hibridomas en microcultivos a una densidad celular tan baja que se garantiza que las células integrantes de la población obtenida en cada microcultivo sean todas idénticas, es decir, conformen un clon. Los anticuerpos secretados por estas poblaciones clonales de hibridomas son anticuerpos monoclonales. Utilizando un principio, similar al antes descrito, se han preparado reactivos monoclonales provenientes de otras especies, inclusive humanos. Numerosas revisiones han sido publicadas en las cuales se examina la producción y uso de estos reactivos.


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Ahora bien, además de su altísima especificidad, es necesario reconocer otros dos atributos que han contribuido al éxito de los AcMo como reactivos analíticos. En primer lugar, los AcMo son sustancias químicamente bien definidas, su naturaleza y estructura se conoce en detalle y ello permite la formulación de preparaciones estables y facilita enormemente los procedimientos para su conjugación a trazadores tales como sustancias fluorescentes, enzimas, radioisótopos, oro coloidal, moléculas electrón-densas (ferritina), etc. En segundo lugar, son reactivos susceptibles de ser preparados en forma pura, en condiciones muy controladas y en grandes cantidades.

En lo concerniente a aplicaciones biomédicas, los AcMo de primera generación han desplazado de muchas aplicaciones a los anticuerpos policlonales, han permitido el desarrollo y avance de numerosas y nuevas pruebas diagnósticas y son, en la actualidad, los reactivos de elección para aplicaciones analíticas, tanto en el ámbito de lo médico-clínico como en distintas áreas de la investigación en biociencias. Lo anterior es cierto para todo aquello relacionado con pruebas de laboratorio "in vitro", tanto en clínica como en investigación.

Se citan algunos ejemplos de AcMo de primera generación, los cuales han encontrado aplicaciones de interés en biomedicina, no sin antes advertir que se trata de una muestra pequeña tomada de un universo mucho más amplio y, por tanto, imposible de cubrir en su totalidad en el presente contexto. En primer lugar, las numerosas pruebas diagnósticas para fenotipificación de tumores sanguíneos que actualmente hacen uso de AcMo de primera generación. Aun cuando algunas de estas enfermedades pueden diagnosticarse claramente, mediante criterios clínicos e histológicos bien establecidos, hay otros casos, como las leucemias linfoblásticas agudas y los linfomas del tipo no-Hodgkin, donde es imprescindible la inmunofenotipificación para el establecimiento inequívoco del diagnóstico, la clasificación, la prognosis y el tratamiento. La forma rutinaria, tomadas por estas pruebas de tipificación, es la citometría de flujo con paneles de AcMo fluorescentes. Estos Ac fluorescentes reconocen moléculas marcadoras de las poblaciones sanguíneas en estudio y las tiñen, permitiendo su identificación diferencial por medios electrónicos.

Otro ejemplo ilustrativo, lo constituyen los AcMo con especificidad por la molécula CD4, la cual se expresa en la superficie de un subset de linfocitos T humanos. Uno de los mejores indicadores de la progresión de la infección por el virus HIV, hacia la aparición del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en los pacientes infectados, es precisamente una caída sustancial en el número de linfocitos T circulantes en la sangre que portan este marcador de superficie CD4. La prueba de rutina empleada para la estimación del número de linfocitos T CD4+ utiliza AcMo fluorescentes anti-CD4 humano para teñir y luego examinar, por citometría de flujo o en el microscopio de fluorescencia, las muestras de sangre de los individuos seropositivos.

La tipificación de grupos sanguíneos humanos, como el ABO, de crucial importancia en transfusiones y transplantes, se realiza en la actualidad mediante pruebas de aglutinación en las que se utilizan AcMo.

Pero los AcMo no han servido, únicamente, para el estudio de moléculas asociadas a la superficie de células. Existe además un sinnúmero de moléculas solubles cuya detección en fluidos biológicos (sangre, orina, etc.) es de interés médico-clínico. Algunos ejemplos son : drogas o metabolitos de drogas como la marihuana, la cocaína, la ciclosporina, hormonas como la hCG (test de embarazo), proteínas asociadas a ciertos


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tipos de cáncer como el PSA (cáncer de próstata) y el CEA (adenocarcinoma de colon) o proteínas indicadoras de infecciones por virus como Hepatitis B y CMV. En la actualidad, los tests para la detección, y/o cuantificación de estas moléculas, utilizan AcMo y, en su mayoría, toman la forma de inmunoensayos en los que una enzima (ELISA), un radioisótopo (RIA) o un colorante ("dipstick") sirven como medio de detección.

Virtualmente, todos los ejemplos de AcMo referidos se han obtenido mediante la generación de hibridomas de origen múrido (ratón o rata). Por desgracia, el uso de este tipo de AcMo, con intenciones profilácticas o terapéuticas, en humanos ha encontrado obstáculos importantes. El primero de ellos es que se trata de proteínas extrañas para el ser humano. Consecuentemente, su administración conduce a la aparición de una respuesta inmune humana anti-AcMo, con la cual se obstaculiza la eficacia del tratamiento. Además, la mediación de funciones efectoras necesarias o deseables en ciertas situaciones, y el catabolismo de estos anticuerpos de ratón o rata en el cuerpo humano, es diferente al de los correspondientes anticuerpos humanos. Por último, hay moléculas humanas, como los aloantígenos del complejo principal de histocompatibilidad y los antígenos del sistema sanguíneo Rh, que no son distinguidos apropiadamente por el sistema inmune de los roedores y, en consecuencia, no es posible producir AcMo de utilidad práctica, con especificidad, por estos antígenos. De esta manera, una de las razones más importantes que ha impulsado el desarrollo de los AcMo de segunda generación es precisamente esta imposibilidad de utilizar Ac de roedores en humanos con fines profilácticos o terapéuticos.

4. Anticuerpos monoclonales de segunda generación.

Como se mencionó, los AcMo de segunda generación, o anticuerpos recombinantes (AcR), son moléculas producidas empleando técnicas de biología molecular y ADN recombinante. Dicho de otra manera, los AcR son generados a través de la inmortalización de los genes que codifican a la molécula de Ig, en lugar de inmortalizar la célula productora del Ac, como es el caso para los AcMo de primera generación.

La concepción, el diseño y la ingeniería de moléculas artificiales, basadas en Ig, se ha facilitado enormemente gracias a dos características de estas proteínas. A nivel genético, los genes estructurales que codifican las Ig se prestan para hacer el trabajo de biología molecular. Estos genes se organizan en la forma de exones discretos, los cuales corresponden a dominios completos en la proteína (Figura 2B), encontrándose separados por regiones intrónicas. Resulta así, por ejemplo, relativamente fácil manipular las secuencias intrónicas para añadir cambios que permitan la introducción en el gen de nuevas secuencias en lugares específicos, seleccionados previamente, sin implicar riesgo alguno de alterar la secuencia codificadora presente en los exones. De igual manera, a nivel proteico, la organización estructural- funcional de las Ig en la forma de estos módulos discretos, llamados dominios, en donde se encuentra almacenada la información necesaria para realizar una función específica, ha facilitado enormemente el logro de estos objetivos. Sin embargo, un elemento adicional, que no se puede dejar de mencionar y que ha tenido un impacto tremendo en el desarrollo de los AcR, lo constituyen, sin lugar a dudas, los avances ocurridos en el campo de la biología


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molecular, especialmente en lo relacionado con el desarrollo de métodos para la creación de moléculas de ADN recombinante basados en la reacción, en cadena, de polimerasa (PCR).

De esta forma, es hoy posible clonar una pareja de regiones VH y VL, responsables de una especificidad de interés, y ensamblarla en la forma de un anticuerpo funcional en el contexto de, prácticamente, cualquier clase o subclase de Ig humana. Un número considerable de sistemas de expresión están actualmente disponibles para este fin. Varias líneas celulares eucariotas soportan apropiadamente los procesos asociados a la expresión, síntesis, ensamblaje y modificaciones post-traducción de los AcR. En el ámbito de los organismos procariotas, es digno de mencionar cómo el conocimiento detallado que poseemos del genoma, arquitectura y ciclo de vida de bacteriófagos filamentosos y del fago λ ha permitido la expresión eficiente de ADN codificante de Ac en E. coli. Esto, a su vez, ha permitido el desplegamiento, en estos fagos, de repertorios gigantescos de Ac y con ello, la posibilidad de imitar artificialmente la estrategia de selección empleada por el sistema inmune humoral. En la actualidad, esta tecnología de desplegamiento de Ac en fagos filamentosos ofrece una de las vías más poderosas para la creación de Ac humanos artificiales con inmunogenicidad reducida y para la creación de repertorios de Ac en la forma de genotecas combinatorias con una talla similar o igual a la de los repertorios naturales.

Los AcR constituyen, entonces, un conjunto bastante heterogéneo de proteínas artificiales en el que se pueden distinguir dos grandes grupos. El primero incluye moléculas completas de Ac, similares a las conseguidas en forma natural, en las cuales están presentes los dos elementos estructurales, permitiendo así la funcionalidad de la molécula; esto es, las porciones Fab y Fc (Figura 2A). Los Ac quiméricos y


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humanizados son ejemplos representativos de este grupo. El otro grupo está formado por un conjunto más heterogéneo de proteínas noveles, basadas en la estructura de las Ig. Éstas pueden encontrarse en la forma de entidades recombinantes autónomas (fragmentos tipo Fab, Fv de cadena sencilla -scFv-, "diabodies", "triabodies", etc.), o como proteínas de fusión (moléculas en las que se combina la porción Fc o Fab con propiedades nuevas provistas por una toxina, una enzima, un receptor celular, una citoquina, etc.).

4.1. Anticuerpos quiméricos.

Un anticuerpo quimérico (AcQ) es una molécula artificial en la cual, las porciones constantes de las cadenas pesada y liviana provienen de una Ig humana y las regiones variables VH y VL son obtenidas de un AcMo múrido (Figura 5). El objetivo perseguido con la construcción de un AcQ es reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo de ratón o rata, pero sin afectar la especificidad del Ac. Es conocido que las porciones más inmunogénicas de la molécula de Ig están asociadas a la porción constante de la molécula, en particular a la región Fc. Al reemplazar estas regiones por las equivalentes de origen humano se busca que la molécula resultante sea menos "extraña" para los seres humanos y así facilitar su uso in vivo para la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas (Figura 5). Adicionalmente, ya que la fisiología, catabolismo y las funciones efectoras de un Ac están asociadas al fragmento Fc, los AcQ debieran comportarse en forma óptima al ser administrados en humanos.


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La técnica de "quimerización" fue desarrollada por Morrison y col. y Boulliane a mediados de los años 80. El procedimiento implica la clonación de los genes VH y VL múridos y la inserción de los genes clonados en vectores de expresión eucariota a los que, previamente, se ha incorporado los genes codificadores de la porción constante de las cadenas pesada y liviana humanas. Estos vectores son finalmente transfectados en forma estable en una línea celular seleccionada. La clonación de los genes VH y VL se realiza mediante RT-PCR (Figura 5) utilizando como molde ARN total o ARN mensajero (ARNm) obtenido de un hibridoma secretor de la especificidad de interés y oligonucleótidos complementarios a los extremos 3’ y 5’ de cada gen como iniciadores. En la actualidad, se encuentran disponibles familias de oligonucleótidos para la clonación de los genes VH y VL del ratón, del humano y otras especies. Estas familias son capaces de amplificar la mayoría, sino la totalidad, de los genes V funcionales de estas especies y, usualmente, contienen sitios de reconocimiento para enzimas de restricción, las cuales facilitan la identificación, manipulación e inserción en los vectores de expresión de los genes V amplificados por PCR. Una serie de vectores tipo "cassette" están disponibles donde los genes V pueden ser fácilmente clonados en el contexto de cualquier isotipo de cadena liviana y pesada. De forma similar, avances en el campo de la tecnología de transferencia de genes también han facilitado, y hecho más eficiente, el proceso de inserción de ADN foráneo en diferentes líneas celulares eucariotas.

En los trabajos pioneros antes citados, se demostró que los AcQ, ensamblados apropiadamente, son capaces de reconocer y ligar el antígeno y median, eficientemente, funciones efectoras como activación de complemento y reconocimiento de receptores Fc. Más aún, al compararse con los monoclonales equivalentes, se pudo documentar una reducción de la inmunogenicidad. A partir de allí, AcQ con una gran variedad de especificidades han sido preparados. Algunos ejemplos exitosos en el ámbito clínico lo constituyen los productos ReoPro o abciximab (desarrollado por las compañías Centocor y Eli Lilly), IDEC-CD28 o rituximab (desarrollado por IDEC Pharmaceuticals y Genentech), e infliximab (desarrollado por Centocor). ReoPro es el fragmento Fab de un AcQ ratón-humano con especificidad por la glicoproteína GPIIb/IIIa de plaquetas y es usado en la prevención de la isquemia cardíaca aguda que puede ocurrir luego de una angioplastia coronaria. IDEC-CD28 es un AcQ ratón-humano anti-CD20, el cual se utiliza para el tratamiento de linfomas de células B del tipo no-Hodgkin. Finalmente, Infliximab es un AcQ anti-TNFa que ha mostrado efectividad en el tratamiento de la enfermedad de Crohn.

4.2. Anticuerpos humanizados.

En los AcQ las regiones V múridas se mantienen inalteradas de forma que la especificidad y la afinidad de la molécula resultante no se afectan. Desgraciadamente, algunas moléculas quiméricas aún son capaces de inducir una respuesta inmune humoral cuando son administradas en humanos. Esta inmunogenicidad "residual" ha sido atribuida a la presencia de epitopos foráneos presentes en las RDC y en las regiones M de los dominios V múridos del AcQ.

Un paso adelante en los esfuerzos para reducir la inmunogenicidad de los AcMo múridos, lo constituyó la creación de los Ac humanizados (AcH). La tecnología para la producción de AcH fue desarrollada en el laboratorio de G. Winter en Inglaterra poco


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después de la invención de los AcQ y, en la actualidad, engloba un conjunto de procedimientos tales como "CDR grafting" (transplante de CDR), "Ab reshaping" y "Ab resurfacing/veneering". El argumento que la soporta se basa en el supuesto de que el sitio de combinación al antígeno, el paratopo, se forma a partir de la combinación espacial de las asas hipervariables que corresponden a las RDC, mientras que las regiones M sólo funcionan como un andamio cuya única función es servir de soporte estructural al paratopo. Asumiendo esto como cierto en la elaboración de un AcH, las RDC de un anticuerpo múrido son transplantados en el contexto de regiones M humanas (Figura 6A), formándose así una región V híbrida ratón-humano y confiriéndole la especificidad deseada a una molécula que en el resto de su estructura es completamente humana. La ventaja de esto es que los epitopos asociados a las regiones M múridas, los cuales están presentes en los AcQ, no se encuentran en los AcH.

Para producir un AcH es necesario conocer la secuencia entera de los dominios V múridos y la localización de las secuencias de ADN correspondientes a las 3 RDC múridas. Esta información se usa para diseñar y crear genes V sintéticos en los cuales, las RDC múridas son combinadas con regiones M humanas seleccionadas, cuidadosamente, en función de su parecido con las correspondientes regiones M múridas. A continuación, los genes V "humanizados" se insertan en vectores de expresión adecuados que contienen el resto de la información estructural necesaria para la síntesis de una cadena Ig humana liviana o pesada. El resto de la técnica es similar, a lo ya descrito, para los AcQ.

Hay dos aspectos que pudieran considerarse desventajosos en la producción de un AcH. En primer lugar, la manipulación de las RDC múridas y su inserción en el contexto de regiones M humanas, por lo general, conlleva a una disminución de la afinidad del Ac. Ello se debe a que las regiones M no son sólo andamios; ellas juegan un rol determinante en el arreglo tridimensional de las RDC. Además, en algunos casos se ha demostrado la participación directa de ciertos residuos de aminoácido de las regiones M en la combinación con el epitopo. El otro aspecto tiene que ver con la complejidad de la técnica. Mientras que producir un AcQ es un procedimiento relativamente expedito, la creación de un AcH es, comparativamente, más laborioso, consume un tiempo considerable y es un proceso en el cual el mantenimiento de la afinidad depende, en último término, del ensayo y error. En todo caso, el objetivo


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fundamental perseguido por la producción de un AcH (elimina la inmunogenicidad del Ac múrido) no siempre es alcanzado. Se ha reportado cierta inmunogenicidad "residual" en moléculas de Ac completamente humanizadas, ello debido, aparentemente, a epitopos asociados con el idiotipo del Ac.

No obstante, un número sustancial de regiones V múridas han sido humanizadas. Entre ellas mencionaremos a los Ac daclizumab y basiliximab, dos AcH con especificidad por la cadena a del receptor de la citoquina humana IL-2. Ambos han sido probados exitosamente en la prevención del rechazo agudo de alotransplantes de riñón. Estos Ac se encuentran actualmente en el mercado bajo los nombres Zenapax (dacliximab de Roche) y Simulect (basiliximab de Novartis Pharmaceuticals Corp). Otro ejemplo es trastuzumab (disponible comercialmente bajo el nombre de Herceptin de Genentech, USA), el cual es un AcH anti-HER2-Neu que ha mostrado efectividad en el tratamiento de cáncer de mama en los cuales se sobreexpresa la oncoproteína HER2-Neu.

4.3. Moléculas recombinantes derivadas de Ac.

Hasta este punto, hemos tratado la producción de moléculas completas de anticuerpos recombinantes. Adicionalmente, la biología molecular ha sido utilizada para desarrollar moléculas noveles, basadas en la estructura de Ac, ya sea como entidades recombinantes autónomas o como proteínas de fusión. A continuación, revisaremos los ejemplos más significativos de este tipo de moléculas, las maneras como ellas fueron creadas y sus aplicaciones potenciales.

4.4. Fragmentos de Ac.

Mientras la expresión de AcQ y AcH se logra más fácilmente en hospedadores eucariotas, tales como células de mamífero o de plantas, la bacteria es el huésped preferido para la producción de fragmentos recombinantes de Ac. En virtud de las ventajas indiscutibles que ofrece en cuanto a manipulación, transformación, cinética de crecimiento y condiciones de fermentación, E. coli es en la actualidad el sistema de expresión más accesible y amigable para la producción de fragmentos de Ac.


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Existen dos tipos de fragmentos con la capacidad de combinarse al Ag, éstos son el Fv y el Fab (Figura 2A). Versiones funcionales de Fv y Fab fueron producidos en forma recombinante, por vez primera, en E. coli en 1988. Estos trabajos marcaron un hito en la producción de AcR, pues en ellos se demostró que la expresión en el espacio periplásmico de la bacteria permite la obtención, en forma relativamente sencilla, de moléculas de Ac completamente funcionales y con un alto rendimiento. Hasta ese momento, la mayor parte de los intentos persiguieron la expresión intra-citoplasmática, enfrentándose al problema del microambiente intracelular de la bacteria, el cual no es apropiado para el procesamiento post-traducción [plegamiento, formación de puentes disulfuro y glicoxilación asociada a residuos de asparagina ("N-lynked") o serina-treonina ("O-lynked")] de las cadenas polipeptídicas nacientes. Esto trae como consecuencia la formación de cuerpos de inclusión en el citoplasma de la bacteria que contienen la proteína en una forma no funcional y de los cuales la recuperación es bastante ineficiente. La expresión de fragmentos de Ac en el periplasma de la bacteria, por el contrario, sigue una vía de ensamblaje similar a la que ocurre durante la producción de Ac convencionales en el retículo endoplásmico de una célula B. Ello permite producir moléculas activas en un pequeño volumen y en un compartimiento subcelular, el cual está relativamente libre de enzimas proteolíticas activas.

4.5. Cadena simple Fv (scFv).

1988 fue un año importante para la producción de AcR, no sólo por la aparición de los trabajos en los que se describió la expresión periplásmica como una vía eficiente para la producción de AcR en bacterias. Dos artículos fueron publicados ese mismo año en los cuales se reportó la producción en E. colí de una versión recombinante del


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fragmento Fv en la que los dominios VH y VL se encontraban unidos físicamente a través de un "linker" peptídico, pequeño y flexible. Este "linker" (~ 15 aminoácidos) tiene la longitud y flexibilidad necesarias para permitir el arreglo espacial adecuado de los dominios VH y VL, generándose un Fv funcional (Figura 6B). Tales cons trucciones fueron denominadas Fv de cadena sencilla (del inglés single chain Fv, scFv), son más estables, en comparación con el Fv convencional, y conservan la capacidad de reconocer y ligar Ag. Posteriormente, scFv han sido expresados en otros hospedadores además de E. coli, como la levadura P. pastoris, hongos filamentosos, células de insecto y células de mamífero, convirtiéndose en uno de los formatos preferidos para producir fragmentos recombinantes de Ac con capacidad para ligar Ag, para preparar proteínas de fusión en las que se desea especificidad antigénica y para construir genotecas de Ac .

La construcción de genotecas de Ac es un aspecto que merece atención especial, pues ha permitido la generación de repertorios de Ac cuya talla y diversidad hace presumir que la totalidad del repertorio natural se encuentra contenida en ellas. La utilización del bacteriófago l y, posteriormente, de bacteriófagos filamentosos como vectores ha sido la clave en la construcción de estas gigantescas y versátiles genotecas.

4.6. Expresión de repertorios de Ac en fago λ .

En 1989 fue publicado el primer artículo donde se describe la construcción de una genoteca de ADNc conteniendo el repertorio completo de Ig del ratón. Para ello se utilizó como formato el fragmento Fab y un sistema de expresión que combinaba el bacteriófago lambda (λ) como vector y la bacteria E. coli como hospedador. La estrategia ideada utilizó ARNm obtenido del bazo de un ratón inmunizado. Este ARNm sirvió de materia prima para la preparación, mediante amplificación por RT-PCR, de dos genotecas separadas, una de genes codificantes de cadenas livianas y la otra compuesta por segmentos génicos codificantes de fragmentos Fd (VHCH1). Cada genoteca fue clonada por separado en vectores de fago λ diferentes y luego el ADN de estos fagos fue combinado en forma aleatoria para así construir una genoteca combinatoria de fragmentos Fab compuesta por 107 clones aproximadamente, entre los cuales fue posible demostrar la presencia de numerosos clones Ag-específicos. En una forma similar, se ha logrado construir genotecas de Ac humanos de las cuales se han aislado fragmentos de Ac con especificidad por la hemaglutinina del virus influenza, el


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toxoide tetánico, la peroxidasa tiroidea y el antígeno de grupo sanguíneo Rh(D), entre otros.

Ya que posee una alta eficiencia de ensamblaje y una elevada rata de infección, el bacteriófago λ ofrece ventajas para la construcción de genotecas de Ac en comparación con otros vectores tales como plásmidos convencionales. No obstante, no pasó mucho tiempo antes de encontrarse una forma más conveniente de explotar estas y otras propiedades de los fagos. Dicha forma involucra la utilización de fagos filamentosos, en lugar del fago λ , en la construcción de las genotecas de Ac.

4.7. Desplegamiento de repertorios de Ac en fagos filamentosos.

Los fragmentos de Ac, obtenidos a partir de una genoteca basada en el fago λ , se encuentran en forma soluble en el medio de cultivo en el cual crecen las bacterias infectadas por el fago. Aunque la identificación y selección de fagos productores de una especificidad determinada se puede lograr mediante repetidos procesos de clonamiento y "screening", esto constituye un trabajo arduo que puede tomar un tiempo considerable.

Cuando la tecnología de desplegamiento de proteínas en la superficie de fagos filamentosos recombinantes se aplicó a la expresión de fragmentos de Ac ocurrió una auténtica revolución en el campo de los AcR. La expresión de sitios de combinación con el antígeno (en la forma de scFv o Fab) en la superficie de un fago filamentoso le confiere al fago recombinante la capacidad de ligar el Ag en cuestión. Esto implica que en una población heterogénea, los escasos fagos que expresen la especificidad deseada pueden ser seleccionados y aislados mediante un procedimiento sencillo de "panning" o inmunopurificación (Figura 7), utilizando el Ag de interés como elemento de captura. Como se trata de partículas virales infectivas, los fagos así obtenidos pueden utilizarse para reinfectar nuevas bacterias y producir poblaciones de fagos cada vez más clonales.


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Luego de un número reducido de ciclos de inmunopurificación- infección es posible obtener una población, virtualmente clonal, de fagos expresando una única especificidad. De esta forma, es relativamente fácil pasar de una población altamente heterogénea (una genoteca que alberga el repertorio de Ig de una especie, por ejemplo) a una población virtualmente homogénea que expresa una única especificidad. En consecuencia, las genotecas de Ac basadas en fagos filamentosos son superiores a las basadas en el fago λ porque ofrecen una mayor facilidad para la realización del despistaje y aislamiento de especificidades de interés. La clave del éxito está en que el sistema de expresión en fagos filamentosos permite la asociación física entre la proteína (el fenotipo) y la información genética que la codifica (el genotipo).

Los fagos utilizados en esta tecnología son los colifagos filamentosos M13, fd y f1. Éstos son virus de ADN circular de cadena sencilla, capaces de infectar bacterias E. coli macho, las cuales el episoma F¢ . Dichos fagos poseen una cubierta proteica en la que destacan dos proteínas, la pVIII y la pIII. Ambas han sido utilizadas para la expresión de fragmentos de Ac. pVIII es la subunidad estructural más importante de la cubierta (más de 2000 copias por partícula viral). Mientras tanto, pIII es bastante menos numerosa (3-5 subunidades por virión), pero es la responsable de la infectividad del


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fago. Fragmentos de Ac (tipo scFv y Fab), con una especificidad determinada, así como repertorios provenientes de distintas especies (humanos, ratón, conejo, gallina y macacos) han sido fusionados genéticamente a pVIII y a pIII. La expresión asociada a pVIII conduce a partículas virales multivalentes; en contraste, la expresión ligada a pIII es usualmente monomérica, es decir, un sitio de combinación al Ag por virión. En consecuencia, el formato pIII es usualmente el que se escoge cuando se desea seleccionar fragmentos de Ac con una alta afinidad intrínseca (Figura 7).

La tecnología de desplegamiento en fagos filamentosos ha adoptado numerosas variantes. En el contexto de la producción de genotecas de Ac, merece la pena mencionar la técnica conocida como "combinatorial infection/in vivo recombination", la cual ha permitido construir repertorios gigantescos (estimados en el orden de 1011 distintas especificidades) a partir de los cuales se han podido aislar fragmentos de Ac con afinidad en el rango nanomolar y subnanomolar. Entre las especificidades de interés biomédico-clínico, que se han aislado mediante la aplicación de esta tecnología, se cuentan fragmentos de Ac con especificidad por diferentes patógenos virales como herpes simplex (tipos 1 y 2), CMV, varicella zoster, rubéola, HIV tipo 1 y RSV.

4.8. "Diabodies", anticuerpos biespecíficos y "triabodies"

Como se trata de moléculas que poseen un solo sitio de combinación al Ag (monovalentes), los fragmentos Fab y scFv pudieran ser de uso limitado para ciertas aplicaciones en las cuales se requiere una afinidad elevada. Versiones multivalentes de estos fragmentos debieran presentar una afinidad funcional o avidez mayor. Además, AcR que combinen dos especificidades distintas lucen particularmente atractivos para ciertas aplicaciones como inmunodiagnóstico e inmunoterapia. Diversas estrategias han sido evaluadas para producir dímeros o polímeros de AcR. En muchas de ellas se utiliza el entrecruzamiento por medios químicos de dos fragmentos individuales, anteriormente, preparados y purificados por separado. Esto tiene obvios problemas en cuanto a rendimiento, purificación del fragmento deseado y cantidad de tiempo y trabajo empleado.

Una estrategia más efectiva, basada en técnicas de ADN recombinante, ha sido desarrollada recientemente. Esta estrategia se basa en la construcción scFv descrita en una sección anterior, sólo que la longitud del "linker" es menor en comparación la del scFv original. Esta reducción del "linker" (a tan solo 5 aminoácidos) imposibilita la formación de un Fv funcional entre dos dominios VH y VL en una misma molécula. Ello conduce a la interacción de dos moléculas de scFv , formándose un dímero, el cual posee dos sitios de combinación con el antígeno (Figura 6B). Si la especificidad de los dominios VH y VL es la misma, el producto obtenido es un homodímero bivalente conocido como "diabody" (la traducción más apropiada de "diabody" pudiera ser "fragmento bivalente").

Ahora bien, utilizando el mismo formato, es posible producir moléculas recombinantes con dos especificidades diferentes. Por ejemplo, si se desea combinar en una misma molécula las especificidades A y B de dos anticuerpos diferentes, se diseñan dos construcciones tipo scFv. Una de ellas tendrá la forma VHA-VLB y la otra VHB-VLA (ambas pueden encontrarse en el mismo vector). En forma similar a como ocurre con los "diabodies", los polipéptidos producidos a partir de estas construcciones son


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incapaces de formar scFv funcionales de manera individual. No obstante, sí son capaces de aparearse apropiadamente para generar heterodímeros en donde ambas especificidades A y B son restauradas y se encuentran físicamente asociadas (Figura 6B). Estas moléculas artificiales han sido bautizadas con el nombre de anticuerpos biespecíficos.

Si el péptido que sirve de "linker" entre los dominios VH y VL es eliminado completamente y ambas regiones son expresadas como un polipéptido continuo, entonces, el resultado es la formación de un trímero funcional con capacidad para ligar tres determinantes antigénicos (Figura 6B). A estos fragmentos se les ha designado "triabodies". De manera análoga al "diabody", quizás la mejor traducción de "triabody" sea "fragmento trivalente".

4.9. Minibodies.

Los "minibodies" constituyen un caso interesante en el que dos grupos de moléculas artificiales, completamente diferentes, han sido designados con el mismo nombre. En 1994, Tramontano y col. describieron el diseño de un polipéptido artificial cuya estructura se basa en el dominio V de Ig, al cual bautizaron "minibody". Este péptido tiene una longitud de 61 residuos de aminoácido, adopta una conformación tipo hoja beta plegada con dos asas que corresponden a regiones hipervariables y exhibe capacidad para ligar determinantes antigénicos. Además, retiene otras características deseables del dominio V de la molécula de Ac, como tolerancia a variabilidad de la secuencia en regiones específicas de la proteína y, en consecuencia, la capacidad para "evolucionar". Genotecas de este tipo de "minibodies" han sido preparadas y se ha podido seleccionar de ellas especificidades que ligan Ag con una alta afinidad. Es este el caso de un minibody con especificidad por la molécula IL-6 humana (una citoquina conocida por sus propiedades proinflamatorias), el cual es capaz de inhibir la acción de IL-6 y, en consecuencia, pudiera ser de interés práctico.

Un tipo diferente de "minibody", a los que también se ha llamado proteínas inmunes pequeñas (SIP, "small immune proteins"), fue descrito en 1996. Esta construcción es una variante del fragmento scFv en el que un dominio CH3 está asociado físicamente, en una misma cadena polipeptídica, a un scFv a través de un "linker" que contiene residuos de cisteína en su secuencia (Figura 6B). Homodímeros bivalentes de estos polipéptidos recombinantes se han producido en células CHO y mielomatosas. Se ha comprobado, además, que presentan excelentes propiedades farmacocinéticas y para imagenología de tumores. La reciente descripción de la tecnología "botón en ojal" ("knobs into hole"), la cual permite inducir la interacción entre dos cadenas polipeptídicas no relacionadas, abre la posibilidad para la preparación de heterodímeros biespecíficos de estos interesantes péptidos.

4.10. Anticuerpos "camélidos"

Recientemente, se descubrió en la sangre de los camellos la presencia de moléculas de Ac constituidas por dímeros de cadena H, desprovistos de cadena L. Esta y otras observaciones motivaron a un grupo de investigadores a crear AcR humanos


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constituidos por un único dominio VH. Para simular la estructura de los Ac de camello, se introdujeron mutaciones en los residuos 44 (Gly44Glu), 45 (Leu45Arg) y 47 (Trp47Gly) en un dominio VH humano preseleccionado. Estos cambios fueron suficientes para prevenir la interacción del VH mutado con el VL humano homólogo. A continuación, la secuencia correspondiente a la tercera asa hipervariable del dominio VH fue "randomizada" y el repertorio obtenido se expresó como una genoteca de fagos filamentosos recombinantes en E. coli. En esta forma, fue posible obtener dominios VH solubles con la capacidad para combinar Ag con una alta afinidad.

4.11. Proteínas de fusión.

La tecnología de ADN recombinante ha hecho posible la concepción, diseño y elaboración de moléculas artificiales llamadas proteínas de fusión, en las cuales, motivos estructurales y/o funcionales, provenientes de dos o más proteínas naturales, son combinados. Varias características hacen a la molécula de Ac un candidato ideal para la elaboración de proteínas de fusión. En primer lugar, su diversidad y exquisita especificidad es deseable para la detección de un número virtualmente ilimitado de moléculas "target" con un riesgo marginal de reacciones cruzadas o no específicas. En segundo lugar, sus propiedades biológicas son atractivas para ciertas aplicaciones en las que se requieren moléculas recombinantes con propiedades específicas tales como vida media, talla y funciones efectoras. Finalmente, y como ya hemos mencionado, la organización modular de los anticuerpos, y los genes que los codifican, facilita grandemente el diseño y elaboración de moléculas recombinantes híbridas.

De esta manera, no sorprende que exista un importante número de proteínas de fusión donde se combinan porciones de moléculas de Ac diferentes, o con toxinas, interleuquinas, moléculas de adhesión, componentes de la matriz extracelular, hormonas, factores de crecimiento, superantígenos, moléculas CD, receptores celulares y hasta lípidos. Algunos ejemplos atractivos, con potencial clínico práctico, se resumen en la tabla 1.

Proteína de fusión Manipulación genética Propósito IgG polimérica Fusión de la pieza caudal de la

cadena pesada m al extremo carboxi-terminal de la cadena

pesada g

Incrementar las funciones efectoras de la IgG como

activación de Complemento, aglutinación, etc.

"T-bodies"

molécula de Ac asociada a un

linfocito T

Fusión de un scFv al dominio citosólico de una tiroxina

quinasa ZAP-70 (Syk) a través del dominio transmembrana de

la molécula CD8

Redirigir la especificidad de células T citotóxicas.

"Ab-enzyme" (ADEPT)

Fusión de un scFv específico por la molécula CD20 a la enzima b -glucuronidasa.

Dirigir terapia enzimática (enzimas en la forma de zimógenos) a células de linfoma que porten el

antígeno CD20. "Ab-enzyme" Fusión de las dos subunidades

de la RNAsa A humana a dos Generar un anticuerpo

biespecífico conjugado a una


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(Inmunotoxina binaria)

scFv diferentes. actividad RNAsa, para detección y destrucción de

células tumorales.

Tabla 1. Ejemplos de proteínas de fusión Ig.

5. Consideraciones finales.

Los AcMo de primera generación "llegaron para quedarse". En el ámbito biomédico, estos reactivos abarcan la mayoría de las aplicaciones analíticas en las que se desea detectar moléculas ya sea en forma soluble, o asociadas a la superficie celular o en forma intracelular y ello se ha traducido en un mayor y mejor diagnóstico de distintas enfermedades. Toda la tecnología asociada a su producción constituye, hoy en día, un conjunto de procedimientos estándar y numerosas compañías en Norteamérica y Europa se dedican, casi de manera exclusiva, a producir y comercializar AcMo de primera generación. En ellas, el desarrollo de nuevos productos es permanente.

Por otra parte, las expectativas creadas alrededor de los AcR son considerables. Este es un campo que está en constante progreso e innovación. Se espera que estas moléculas sean capaces de llenar el vacío dejado por los AcMo de primera generación en lo concerniente al desarrollo de herramientas efectivas para el diagnóstico in vivo, profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas. Una muestra de ello es que para el año 1998 más de 30% de las proteínas en proceso de ensayos clínicos fueron AcR. Aunque el uso de moléculas basadas en AcR en el ámbito médico/industrial es aún incipiente, numerosas aplicaciones potenciales son evaluadas en la actualidad tanto en centros académicos como en compañías de biotecnología.

Viendo un poco más hacia el futuro, nuevas tecnologías asociadas a la generación de Ac se están desarrollando y afinando. Ejemplo de ello son los ratones transgénicos humanizados o "xenomouse", la producción de Ac con aplicación médica en animales transgénicos como la vaca, el sistema "Trimera", las técnicas de desplegamiento de Ac en ribosoma "ribosome display" y la así llamada ingeniería de parches "patch engineering".

Es de esta manera muy probable que, más pronto que tarde, seamos testigos de la aparición en nuestras vidas de un nuevo conjunto de herramientas terapéutico-profilácticas con una altísima versatilidad, basadas en moléculas de Ac, que puedan ser utilizadas en el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y otras patologías humanas.


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PRODUCCIÓN

1. Producción de cultivos de anticuerpos monoclonales.

Actualmente, la mayoría de los anticuerpos monoclonales se producen en cultivos celulares de mamíferos, que es un proceso muy costoso, siendo una alternativa la producción a partir de plantas OGM. Sin embargo, los anticuerpos producidos actualmente en plantas no son iguales que los de mamíferos.

La glicoxilación es el proceso por el cual las proteínas se unen covalentemente a oligosacáridos, que tiene lugar en el retículo endoplasmático y en el aparato de Golgi de las células. Los patrones de glicoxilación de los anticuerpos monoclonales producidos células de mamíferos y los producidos en plantas son diferentes, ya que estos últimos presentan una glicoxilación incompleta, lo que reduce o elimina su funcionalidad.

La investigación conjunta de Neose y Monsanto trata de eliminar este problema haciendo que las plantas OGM produzcan anticuerpos monoclonales plenamente funcionales equivalentes a los que se producen en cultivos de células de mamífero.

Los anticuerpos monoclonales son sustancias que tienen una gran variedad de aplicaciones en medicina como tratamientos contra el cáncer o las alergias, fabricación de vacunas, investigación biomédica etc. Su uso esta actualmente limitado por el alto coste que supone su obtención a partir de cultivos celulares.

En el sistema inmune de vertebrados las células productoras de anticuerpos (linfocitos-B) presentan entre sus características la capacidad de producir dichas moléculas de manera específica, sintetizando cada linfocito-B activado un único y particular tipo de anticuerpo. Los tumores derivados de los linfocitos-B (mieloma, plasmocitoma) también producen anticuerpos pero de especificidad impredictible. Dado que todas las células tumorales se originan a partir de una única célula transformada, todas las descendientes producirán exactamente el mismo tipo de anticuerpo, con lo que éste se considerará monoclonal.

Cuando un animal es inmunizado con un determinado antígeno, se produce una respuesta con producción y proliferación de múltiples clones de linfocitos en el animal, obteniéndose de su sangre un suero policlonal, con una amplia variedad de anticuerpos de diferente especificidad y afinidad.

Un clon derivado de la reproducción de un único linfocito producirá, por definición, anticuerpos monoclonales, con especificidad única. La imposibilidad de obtener cultivos de clones celulares de linfocitos-B normales que produzcan los anticuerpos de especificidad deseada ha llevado a buscar las técnicas artificiales que emulen una situación similar. Con tal fin, se pueden llevar a cabo dos procedimientos: la transformación in vitro de los linfocitos B (p.e. mutagénesis mediada por medio de virus oncogénicos) y la fusión de las células productoras de anticuerpos con células de mieloma las cuales confieren inmortalidad a las células B. Esta última es la base de la tecnología de producción de anticuerpos monoclonales, iniciada en 1975 por Kohler y


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Milstein y que, en esta última década se ha desarrollado enormemente, constituyendo una herramienta muy valiosa en múltiples estudios.

La obtención de anticuerpos monoclonales consiste básicamente en inmunizar animales (ratones Balb/c generalmente) contra el antígeno para el que se desea producir anticuerpos. Tras obtener una respuesta adecuada se aíslan del animal los linfocitos B esplénicos (capaces de producir anticuerpos) y se fusionan por medio de polietilenglicol con células de líneas establecidas de mieloma, tumor del sistema inmune. Algunos de los híbridos (heterocariontes formados por recombinación genética) combinarán la capacidad de los linfocitos de producir los anticuerpos deseados con la capacidad de proliferar indefinidamente in vitro de las células de mieloma. Las células mielomatosas, además, han de ser deficitarias en hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HGPT) o timidina-quinasa (TK), enzimas necesarias para la vía silvestre de síntesis de precursores del DNA.

Tras la fusión, el genoma del linfocito compensa en el híbrido la deficiencia enzimática que presentaba la célula de mieloma por sí sola. Así, utilizando un medio de restricción adecuado se pueden eliminar las células de mieloma no híbridas, que son aquellas que no habrán compensado su carencia del enzima.

Una vez obtenidos los híbridos que establecerán ya una línea celular (hibridoma) se seleccionan aquellos que sean productores de las inmunoglobulinas específicas deseadas y, tras diversas fases de clonación para asegurar que las células obtenidas proceden de un único clon, los clones seleccionados se conservan por criopreservación en nitrógeno líquido y/o se expanden bien in vitro, en cultivo, bien in vivo, por inoculación en cavidad peritoneal de ratón. Así, se pueden obtener grandes cantidades de soluciones de medio de cultivo o de líquido ascítico desde donde las inmunoglobulinas específicas pueden purificarse por procedimientos convencionales.

La capacidad en un hibridoma establecido de producir los anticuerpos permanece indefinidamente y siempre es posible reconstituir la línea a partir de los clones congelados, con lo que la disponibilidad del anticuerpo producido así como la reproductibilidad del ensayo realizado con el mismo es permanente.

El desarrollo de esta técnica ha permitido ir introduciendo diferentes variedades metodológicas tales como el uso de linfocitos esplénicos estimulados por inmunización in vitro; la obtención de anticuerpos monoclonales humanos (via fusión de linfocitos humanos con mieloma murino); producción, a partir de monoclonales, de anticuerpos bifuncionales sintetizados químicamente (p.e. por agregación o por reasociación química) o por medio de la fusión, bien entre un hibridoma y un linfocito procedente de una inmunización, bien entre dos hibridomas; y aplicación de tecnologías de DNA recombinante sobre hibridomas.

Los anticuerpos monoclonales han sustituido a los sueros policlonales para las investigaciones llevadas a cabo en las que se requiere ensayos de alta afinidad, sensibilidad, y precisión, o bien donde se necesita trabajar en condiciones que permitan aumentar la detectabilidad de una técnica.


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1.1. Elementos técnicos de la producción de hibridomas y anticuerpos monoclonales.

Los esquemas de inmunización de los animales dependen en gran parte del inmunógeno y el tipo de respuesta deseada. En el esquema se muestra un protocolo para la generación de hibridomas productoras de anticuerpos monoclonales de origen murino. Con estos sistemas se han producido anticuerpos monoclonales contra haptenos, proteínas celulares, glucoproteínas solubles, polisacáridos y células animales y humanas. Tales procedimientos tienen como ventajas:

• Requieren sólo cinco días; • Es posible mantener concentraciones definidas del antígeno durante la

inmunización; • Es posible testar el efecto de varias monoquinas y linfoquinas; • Los cultivos son accesibles al muestreo durante el curso del

experimento; • Es posible producir anticuerpos contra autoantígenos que no son

producidos in vivo, debido a supresión o tolerancia.

Una vez inmunizado el animal, las células parentales (linfocitos de bazo y mieloma de cultivo) se centrifugan juntas, se elimina el sobrenadante y se añade el agente fundente (polietilenglicol) de pesos moleculares (desde 1 000 a 6 000), que aglutina las células y modifica la composición fisicoquímica de la membrana, favoreciendo la fusión intercelular. Esta suspensión se diluye en medio de cultivo apropiado y se distribuyen en alícuotas en placas multipozos. El medio utilizado en esta fase de la técnica contiene, además de antibióticos y suero animal, hipoxantina (fuente de purinas), aminopterina (un bloqueador de la vía endógena celular para la síntesis del adn) y timidina (fuente de pirimidinas) en este medio sólo pueden reproducirse las células híbridas, pues el mieloma parental es deficiente de la enzima que permitiría evadir el bloqueo de la vía endógena, aprovechando la fuente de purinas añadida. Entre una a dos semanas ya es posible observar el crecimiento de los hibridomas formando discretas colonias, se procede entonces a eliminar la aminopterina del medio de cultivo para favorecer la proliferación celular y se comienzan a ensayar los sobrenadantes de los pozos, individualmente, en la búsqueda del anticuerpo deseado.

Existen numerosos procedimientos potencialmente utilizables para detectar la

presencia de anticuerpos monoclonales secretados por los cultivos de hibridomas y para, posteriormente, caracterizar su reactividad. Se incluyen entre ellos la inmunofluorescencia indirecta, la microfluorometría de flujo, los radioinmunoensayos, las tinciones con inmunoperoxidasa, la formación de rosetas y los inmunoensayos enzimáticos de fase sólida. Este último es uno de los más empleados por su rapidez, posibilidad de automatización, consumo mínimo de muestra y sensibilidad. La tendencia moderna es la generación de métodos ultrasensibles pero a la vez sencillos, capaces de procesar simultáneamente y en corto tiempo una gran cantidad de muestras y cuyos detalles dependan del tipo de anticuerpo buscado.

Una vez localizados los cultivos que secretan el anticuerpo deseado, se realiza

el clonaje repetido que asegura su aislamiento y el carácter monoclonal de la preparación. El clon escogido se expande, entonces, en cultivo, y se congela una muestra en nitrógeno líquido para su preservación indefinida y se utiliza el resto para


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la producción masiva de anticuerpos in vitro o en animales. Si bien en el cultivo, luego de la fusión, la mayoría de los laboratorios emplean medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal, caballo o conejo y se utilizan las llamadas "capas alimentadoras" de células (células que no proliferan pero secretan al medio factores estimulatorios de la reproducción de las células b).

Existe una tendencia creciente a reducir o eliminar el suero por su costo, sustituyéndolo por factores de crecimiento purificados. Se ha empleado el sobrenadante de células endoteliales de cordón umbilical humano para suplementar el medio de cultivo y reducir aproximadamente un 50% el consumo de suero fetal bovino, tanto en la siembra de las células recién fundidas, como en el clonaje y expansión de los híbridos obtenidos(48). Algunos laboratorios han logrado diseñar medios químicamente definidos suplementados con factores de crecimiento punficados en los cuales ya es posible crecer algunos hibridomas.

La producción masiva de anticuerpos monoclonales puede llevarse a cabo como se ha mencionado anteriormente, tanto por el cultivo de los hibridomas y la recogida de los sobrenadantes que contienen los anticuerpos secretados, como mediante la inoculación de las células en la cavidad peritoneal de animales compatibles genéticamente con el linfocito y el mieloma parental (para hibridomas ratón-ratón y rata-rata). Este último procedimiento genera tumores ascíticos cuyos fluídos contienen entre 1-10 mg de anticuerpos por ml (aproximadamente 200-1 000 veces más que la concentración alcanzada en el medio de cultivo).


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APLICACIONES

1. Aplicaciones de anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales están siendo utilizados en innumerables campos de la investigación biomédica. Así, han sido utilizados como biosensores acoplados a transductores electrónicos, tanto para la detección de moléculas orgánicas como inorgánicas (contaminación de metales pesados en alimentos y agua, detección de gases tóxicos, etc.). También se han utilizado como catalizadores de múltiples reacciones. En la clínica, uno de los usos más frecuentes ha sido el del diagnóstico, dada su exquisita especificidad y su capacidad prácticamente ilimitada para reconocer cualquier estructura química (por ejemplo, en citometría de flujo para la identificación de poblaciones leucocitarias y leucemias). Puede reseñarse, asimismo, su uso para la detección de trombos.

Las aplicaciones terapéuticas constituyen, sin embargo, uno de los campos más interesantes de aplicación de los ant icuerpos monoclonales, ya que son capaces de erradicar ciertas infecciones y destruir células, incluidas las tumorales, mediante distintos mecanismos. Por esta razón, son excelentes candidatos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, el cáncer o en trasplantes para evitar el rechazo.

El problema de los anticuerpos monoclonales de ratón es que, pese a ser perfectamente válidos para todos los usos indicados, no son útiles para su empleo en seres humanos, especialmente en terapias que requieran tratamientos prolongados, ya que el sistema inmune los identifica como cuerpos extraños y reacciona para destruirlos, por lo que su eficacia terapéutica se ve claramente disminuida. Además pueden presentar posibles efectos secundarios, tales como nefrotoxicidad, reacciones anafilácticas, etc.

La alternativa sería, en este sentido, obtener anticuerpos monoclonales humanos, lo que reviste importantes problemas por razones tanto éticas como técnicas.

Se han desarrollado diferentes técnicas para ofrecer soluciones a la inicial imposibilidad de obtener anticuerpos monoclonales enteramente humanos, entre las que destacan la transformación de linfocitos B humanos un cultivo mediante el virus de Epstein-Barr, la utilización de ratones con inmunodeficiencia severa combinada, el uso de ratones transgénicos, o técnicas de ADN recombinante. Todos ellas han presentado distintos inconvenientes que han imposibilitado el desarrollo final de los anticuerpos monoclonales humanos.

Sin embargo, se ha obtenido una segunda generación de anticuerpos monoclonales, basada en la humanización de los anticuerpos monoclonales de ratón mediante ingeniería genética, evitando así el rechazo del sistema inmune al ser introducidos en el organismo. Son los llamados anticuerpos quiméricos. "Un anticuerpo quimérico", explica el doctor Grillo, "es creado de tal manera que incorpora parte animal y parte humana. La parte animal es indispensable para que el anticuerpo reconozca la sustancia extraña (antígeno) y la parte humana para que el sistema


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inmunológico pueda contribuir a añadir efectividad a su acción". De este modo es posible modificar los anticuerpos monoclonales, casi de manera infinita para dotarlos de propiedades efectoras y de reconocimiento diferentes a las originales.

Aplicaciones:

Investigación biomédica

Identificación y clonaje de genes Identificación y aislamiento de proteínas Activación de enzimas Arquitectura molecular, morfogénesis

Diagnóstico

Hormonas, vitaminas, citocinas, factores tisulares, etc. Monitorización de drogas Enfermedades infecciosas, microbiología Alergia Hematología Trazadores de tumores e infartos de miocardio Inmunoescintografía Aplicaciones forenses Técnicas (ELISA, EIA, citometría, inmunohistoquímica,

inmufluorescencia, etc.)

Catálisis

Biosensores

Terapia

Enfermedades autoinmunes Trasplantes (órganos, médula ósea) Enfermedades infecciosas (virales, bacterianas y parasitarias) Cáncer·

Otras:

Degradación del colesterol Modulación de hormonas Modulación de receptores Reversión de sobredosis de drogas


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BIOTECNOLOGÍA

1. Concepto actual de Biotecnología.

En sentido amplio, la Biotecnología es el aprovechamiento con fines económicos de los procesos físico-químicos desarrollados por los seres vivos. Mejor sería que para este sentido amplio utilizáramos el término Biotecnia, ya que Biotecnología es algo más restringido, como veremos más adelante. Dependiendo de los sistemas, la Biotecnia puede desarrollarse sobre diferentes campos, entre los que se encuentra la producción de anticuerpos monoclonales.

2. Ventajas y problemas.

Como todo avance tecnológico radical, la Biotecnología tiene sus ventajas y sus inconvenientes. De forma somera podemos sistematizarlos así:

Ventajas:

1. Bajo consumo energético

2. Facilidad de acceso a materias primas (producción in situ de las mismas)

3. Procesos contrastados y probados por una experiencia enormemente extensa (la totalidad de la evolución biológica)

4. Especificidad; entenderemos mejor esta característica más adelante.

5. Sustentabilidad medioambiental, por las razones 1 y 2.

Inconvenientes: 1. Requerimiento de muy alta tecnología, que se manifiesta en un personal de altísima cualificación profesional e inversiones generalmente muy fuertes y de alto riesgo.

2. Consecuencias biológicas y medioambientales aún no predecibles. En este sentido, la película "Parque Jurásico" de Spielberg según guión (e idea) de Michael Crichton pone el dedo en la llaga sobre las consecuencias impredecibles que puede llegar a tener la manipulación genética generalizada. No obstante, por la experiencia que ya se va reuniendo, estas posibilidades parece que son cada vez más remotas.


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3. Por supuesto, la aplicación de la biotecnología, y en especial, la ingeniería genética, a la reproducción humana plantea problemas éticos que aún están muy lejos de resolverse.

Aunque estos problemas serán tratados más adelante con cierto detenimiento, el punto de vista que parece prevalecer en la actualidad es que todo avance tecnológico tiene sus inconvenientes (si no conociéramos la electricidad no habría muertes por electrocución, por ejemplo); y que lo realmente importante a desarrollar es un control fuertemente democrático de las actividades biotecnológicas "sensibles", como las que atañen a la reproducción humana, o a los desarrollos de guerra biológica, etc.

3. Ejemplo de planta industrial.

Un ejemplo de planta industrial para el desarrollo de estos cultivos es el Centro de Inmunología Molecular, en Cuba, cuyo objetivo principal de las investigaciones es la búsqueda de nuevos productos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer y enfermedades relacionadas con el sistema inmune.

El CIM es una construcción biplanta, de 15,000 m2. En la planta baja están ubicadas las áreas de investigación, desarrollo, farmacología y toxicología, aseguramiento de la calidad, producción cGMP y producción diagnóstica, mientras que en la planta alta se encuentran los servicios técnicos auxiliares.

El área de producción cGMP (1,100 m2) ha sido diseñada para brindar la máxima protección al producto. Existe una cascada de presiones positivas del área de protección clase 100, hacia las áreas clase 10,000 y convencionales.

En el escalado de la producción se utilizan fermentadores de fibra hueca y tanque agitado para el cultivo a escala industrial de células de mamíferos, que brindan una capacidad de producción de varios kilogramos al año de proteínas recombinantes o anticuerpos monoclonales.

La purificación de productos con calidad inyectable para uso humano se realiza con una tecnología rápida y altamente automatizada, combinando la cromatografía de intercambio iónico, afinidad y tamiz molecular. Brindando un producto de alta pureza y actividad biológica.

Todo el sistema de producción está soportado por poderosos sistemas técnicos auxiliares que incluyen, climatización, generación y distribución de agua inyectable (WFI), vapor puro, aire comprimido, gases medicinales, tratamiento de residuales y unidades de "limpieza en lugar" (CIP) que son utilizadas para limpiar de forma automatizada el equipamiento fijo de gran capacidad, las tuberías de transferencia de medio de cultivo y los tanques móviles.

Un eficiente Sistema de Garantía de la Calidad, con personal altamente calificado y con el equipamiento de más alto nivel para el control analítico y biológico, garantiza la calidad del proceso productivo y de los productos finales.


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PUBLICACIONES

Anticuerpo Monoclonal Humanizado h-R3:

Científicos del Centro de Inmunología Molecular acaban de lograr el primer producto de la biotecnología cubana para el tratamiento del cáncer. Se conoce como el anticuerpo humanizado R3, premiado recientemente con la Medalla de Oro de la Organización Mundial de la Propiedad Industrial, un reconocimiento a quienes contribuyen al desarrollo tecnológico de su país.

El R3, primer producto de la biotecnología cubana para el tratamiento del cáncer, ha llegado a su última fase de estudio con muy buenos resultados, lo cual ha permitido a investigadores del Centro de Inmunología Molecular, con sede en la capital cubana, obtener un anticuerpo capaz de mejorar la acción terapéutica en pacientes afectados por tumores de origen epitelial.

A juicio de los especialistas, este fármaco representa un "prometedor tratamiento de enfermedades incurables", categoría en la cual las regulaciones legales conceden facilidades para la evaluación y ensayo del producto.

Como parte de los estudios, la aplicación del anticuerpo monoclonal en humanos comenzó en 1999 en el Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología.

De una primera serie de 12 pacientes con tumores epiteliales avanzados de cabeza y cuello, seis obtuvieron respuestas completamente satisfactorias. En otros dos, el tumor no desapareció de manera total, pero disminuyó de tamaño, lo suficiente como para que pudieran ser sometidos a cirugía. Es decir, que en dos tercios de los enfermos el tratamiento resultó exitoso y durante los 24 meses posteriores solo dos tuvieron recaída.

"Un elemento interesante en estos casos fue que los ganglios voluminosos y metastásicos que presentaban los pacientes desaparecieron, lo cual es difícil de lograr con el tratamiento convencional cuando no se trata del tumor primario", señala la doctora Marta Osorio Rodríguez, quien dirige los estudios clínicos del anticuerpo monoclonal en la mencionada institución médica.

En una segunda serie de 10 pacientes, tratados con el R3 humanizado, se repitieron los resultados: siete de los involucrados obtuvieron respuestas completas. Frutos tan promisorios dan crédito a la efectividad del R3 humanizado que ahora entra en un período de estudios conclusivos.


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El producto cubano también se pone a prueba en Canadá, pero en fase I-II; China consintió la realización de investigaciones clínicas para registrar esta inmunoglobulina humanizada y México analiza la realización de dos ensayos.

Este compuesto solo encuentra paralelo en el anticuerpo quimérico estadounidense c225, que aunque no es humanizado, también ha dado muy buenos resultados en los ensayos clínicos.

Más genes humanos que de ratón.

"Este anticuerpo tiene en su región variable con genes específicos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (R-EGF). Así, logra identificar y actuar contra algunos tipos de tumores que expresan o sobreexpresan el R-EGF o antígeno. Su función es entonces, entrar en contacto con el tumor, matar sus células e impedir que el EGF desarrolle su actividad natural de proliferación", dice la especialista.

La doctora Mateo indica que esta inmunoglobulina o anticuerpo es generada en el ratón, lo cual provoca que al ser inyectada en el hombre este desarrolle una reacción conocida como respuesta HAMA (respuesta humana de anticuerpos contra los anticuerpos de ratón).

"Tal reacción, agudizada por el hecho de que los tratamientos contra enfermedades autoinmunes como el cáncer, son largos y de dosis repetitivas, motivó que los investigadores comenzaran a buscar soluciones, a través de técnicas de ingeniería genética o de la llamada ingeniería de anticuerpos. De esa manera, se llegó a combinar regiones variables de ratón con regiones constantes humanas.

"Surgen entonces los anticuerpos quiméricos, con un 30 % de la molécula del ratón y un 70 de la humana; pero estos siguieron provocando respuesta HAMA.

"Con esa experiencia se desarrollan por esta vía los llamados anticuerpos humanizados que solamente tienen de ratón los genes que entran en contacto con el antígeno o receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF). El 90 % del anticuerpo es de origen humano, por lo que al ser inyectado en los pacientes no se produce respuesta HAMA.

"El R3 humanizado se obtiene mediante la utilización de las técnicas clásicas de ingeniería genética y de biología molecular para la combinación de genes humanos y de ratón. La molécula resultante consigue la misma especificidad del anticuerpo original del murino (de ratón), pero con una respuesta inmunogénica lo suficientemente baja como para no provocar rechazo o reacciones adversas en el organismo humano." El proceso de surgimiento del R3 humanizado se inició en la década de los 80 en el

Según explica la doctora en Ciencias Biológicas Cristina Mateo, autora principal del R3 e investigadora del Centro de Inmunología Molecular (CIM), las inmunoglobulinas o anticuerpos constan de dos regiones: la constante (efectividad y toxicidad) y la variable (reconocimiento y especificidad).


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Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología, aunque finalmente fue obtenido en el Centro de Inmunología Molecular, donde cumple todo el ciclo de investigación, desarrollo y producción.

Además de una planta que ya ha sido diseñada en el Centro Nacional de Biopreparados (BioCen), sito en la zona de Bejucal, al oeste de La Habana, para la producción del R3, este fármaco ha dado lugar a la creación de una empresa mixta cubano-china que conlleva la construcción de otra fábrica en Beijing destinada a cubrir el mercado de esa nación.

Entre las novedades científicas de esta invención, de la cual ya se han beneficiado el grupo de pacientes participantes en los ensayos clínicos, está el que contribuye al diseño de nuevos anticuerpos recombinantes.

En el Centro de Inmunología Molecular ya ha sido desarrollada una tecnología propia y patentada en Estados Unidos para la obtención de este y de los nuevos anticuerpos que se obtengan en el CIM.

Lunes en la Ciencia,25 de marzo de 2002

Tratamiento contra el cáncer de hígado:

Como resultado de un proyecto doctoral del hospital universitario Hadassah de la Universidad Hebrea, se ha desarrollado un método de tratamiento para la medicación de tumores cancerígenos del hígado.

El nuevo método se basa en la combinación de un agente quimioterapéutico con

un anticuerpo que lleva el agente antitumor directamente hasta el tumor hepático, con lo cual se evitan los efectos adversos sobre tejidos sanos causados por la quimioterapia. Este método ha sido desarrollado por la doctora Ruth Adler en el marco de su tesis doctoral bajo la supervisión del doctor Daniel Shoval.

La doctora Adler explicó que había varias causas o factores de riesgo para el

desarrollo del cáncer primario de hígado. Entre ellas se cuentan la hepatitis B y C crónicas, las infecciones virales, el consumo excesivo de alcohol y las toxinas del medio ambiente.

Hasta hace poco, los pacientes con cáncer primario de hígado eran tratados con

adriamicina, un agente quimioterapéutico que puede llegar a detener el cre-cimiento del tumor, pero que también es tóxico para los tejidos sanos del corazón y la médula ósea. Esto ha dificultado la administración de dosis suficientemente altas como para controlar el crecimiento del tumor.

El nuevo método desarrollado en Jerusalén se ha experimentado sólo en ratones.

Está basado en el concepto de que algunos tumores humanos y de ratones presentan ciertas proteínas en la superficie de las células del tumor que son identificadas por anticuerpos específicos. Estos anticuerpos son proteínas que, al ser inyectadas en la vena, encuentran por sí mismas las células de los tumores.


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Anticuerpos de esta clase contra las células cancerígenas del hígado humano fueron ya desarrollados por el doctor Jack Wands del Hospital General Massachusetts de Boston. La doctora Adler acopló algunos de estos anticuerpos al agente tóxico adriamicina y probó el compuesto en un modelo experimental en el que las células cancerígenas del hígado humano fueron cultivadas en una raza especial de ratones.

La tecnología para el acoplamiento químico del agente antitumor con el

anticuerpo fue desarrollada en el Instituto Weizmann de Rehovot por el doctor Michael Sela y la doctora Esther Hurwitz que trabajaron en estrecha colaboración con el equipo de la unidad hepática del hospital Hadassah de la universidad durante los últimos diez años.

La investigación de la doctora Adler se centró en la experimentación de nuevos

compuestos en animales de laboratorio. Los resultados indican que los anticuerpos acoplados al agente antitumor fueron exitosos en la conducción de dicho agente hacia la zona de acción deseada, sin afectar los tejidos sanos, tales como los del corazón y la médula ósea.

La doctora Adler recalcó que ésta era sólo la primera etapa de un largo proceso antes de que el nuevo método pueda ser evaluado en pacientes humanos que sufren el cáncer de hígado. No obstante, los resultados de su investigación indican que la eficacia del tratamiento del cáncer de hígado puede ser significativamente aumentada, junto con una marcada reducción de los efectos secundarios que normalmente se asocian a la quimioterapia convencional.

Inmunólogos españoles han obtenido AM humanos que reconocen células cancerosas:

Un equipo de investigadores españoles ha obtenido anticuerpos monoclonales (AM) totalmente humanos que reconocen células cancerosas de leucemias y linfomas. El grupo, del Hospital Meixoeiro, de Vigo, es uno de los pocos equipos internacionales que logra alcanzar una de las grandes metas de la inmunología actual. Estos anticuerpos podrían ser la base futura de medicamentos para abordar estas enfermedades.

La obtención de anticuerpos monoclonales (AM) totalmente humanos ha sido una de las grandes metas de la inmunología en los últimos años. El Hospital Meixoeiro, de Vigo, se convierte con este trabajo en el primer hospital español y en uno de los pocos centros sanitarios internacionales que consigue alcanzar este objetivo, según han asegurado fuentes del Servicio Gallego de Salud (Sergas).

En el proyecto de la Unión Europea también participan el Hospital Puerta de Hierro, de Madrid, y el Centro de Biología Celular de Oporto, en Portugal.

Actualmente, la investigación está en fase de divulgación científica y ha generado varias publicaciones internacionales. Los resultados de este proyecto son la consecuencia práctica de la teoría desarrollada por el Nóbel César Milstein, que ideó la manera de obtener anticuerpos de ratón en cantidades industriales.


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"Este hallazgo fue una revolución científica, tanto desde el punto de vista del conocimiento como en la industria de la biotecnología. Nosotros hemos dado un paso adelante produciendo anticuerpos propiamente humanos en ratones modificados genéticamente", ha explicado Francisco Gambón, director de esta investigación y facultativo del Servicio de Inmunología del Meixoeiro.

Inmunización:

El grupo de Vigo ha utilizado ratones que han sido modificados genéticamente y que tienen capacidad para secretar anticuerpos humanos ante cualquier inmunización. "Con estos ratones y utilizando la técnica de Milstein para crear hibridomas, se han obtenido 25 anticuerpos monoclonales que reconocen los leucocitos humanos y que podrían tener un interés terapéutico claro".

En la búsqueda de fármacos útiles para el tratamiento del cáncer se ha descubierto que los anticuerpos cumplían una doble misión: reconocer la célula cancerosa y destruirla. Así, se obtuvieron los anticuerpos anticélulas del cáncer, normalmente de animales grandes. Pero los tratamientos fracasaron en humanos porque el sistema inmune del hombre reconocía estos anticuerpos como extraños y los neutralizaba.

En 1975 Milstein ideó la forma de obtener anticuerpos murinos de especificidad predeterminada en cantidades industriales, un descubrimiento que le valió el Premio Nobel de Medicina de 1984. Estos anticuerpos también se están ensayando para cáncer con resultados mixtos: exitosos en algún tipo de linfoma y con resultados menos alentadores en otros.

Durante tres años, el equipo de Inmunología del Meixoeiro trabajó, en colaboración con Milstein y con Africa González, de la Universidad de Vigo, en la obtención de anticuerpos monoclonales propiamente humanos. La producción de estos anticuerpos no ha sido fácil.

Obtención compleja:

"Los procesos de fusión celular y de obtención de hibridomas son poco eficientes y los hibridomas tienen una gran inestabilidad. A pesar de ello, logramos estabilizar 25 hibridomas que secretan los 25 anticuerpos".

Los siguientes pasos para transformar los anticuerpos monoclonales totalmente humanos en fármacos útiles pasan por la entrada en el proceso de la industria farmacéutica.

Anticuerpo tiroideo:

Un estudio que se publica en el último número de The Lancet informa del descubrimiento del primer autoanticuerpo monoclonal humano estimulador del tiroides, lo que ayudará a entender las causas de las enfermedades comunes de la glándula tiroidea. Así, la enfermedad de Graves, caracterizada por la producción de autoanticuerpos, y el hipertiroidismo, producción excesiva de la hormona tiroxina, se producen por una sobreactivación del receptor TSH estimulador del tiroides por parte del propio sistema inmunológico.


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El equipo de Bernard Rees, de los laboratorios FIRS en Cardiff, Reino Unido, detalla la identificación de un autoanticuerpo monoclonal involucrado en el hipertiroidismo de un chico de 19 años que presentaba la enfermedad de Graves. Los estudios sobre autoanticuerpos pueden derivar en el desarrollo de agentes que controlen su acción. Además, servirán para diseñar moléculas específicas para el control de otras patologías asociadas a anomalías de la hormona tioridea. En un editorial que acompaña al trabajo, Colin Dayan, de la Universidad de Bristol, dice que la información aportada por Rees repercutirá en el tratamiento de la enfermedad de Graves.

(The Lancet 2003; 362: 92-97).

Los anticuerpos monoclonales en la caracterización y vigilancia de los virus de la rabia en América Latina y el Caribe:

Con el fin de responder a los nuevos requisitos diagnósticos necesarios para caracterizar los virus de la rabia, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) ha creado un consorcio de instituciones con reconocido conocimiento técnico (Consorcio de Laboratorios de Referencia para la Rabia) cuyos objetivos consisten en: fortalecer la vigilancia epidemiológica de la rabia en las Américas; optimizar la capacidad de diagnóstico de la enfermedad en la Región; armonizar los métodos y unificar los criterios de interpretación de resultados uitilizados en diferentes laboratorios; llevar al máximo la calidad de los métodos y resultados; alentar un nuevo estilo de trabajo basado en la participación de los miembros, y actualizar continuamente los requisitos y capacidades de todos y cada uno de los participantes.

Como coordinador del Consorcio, la OPS ha designado al Centro Panamericano de Fiebre Aftosa (PANAFTOSA). Los miembros del Consorcio deberán llevar a cabo actividades diagnósticas en los laboratorios de sus países y, a petición de la OPS, en otros países. Las actividades que han de realizarse se han clasificado en dos categorías. Las de la clase A consisten en la confirmación de la detección de la rabia por métodos convencionales (anticuerpos fluorescentes o aislamiento del virus) y las de la clase B en procedimientos de caracterización de los virus con métodos basados en anticuerpos monoclonales (AcMo) o en la secuenciación de genes. En todos los casos, entre sus responsabilidades se incluirán también el suministro de reactivos biológicos para el diagnóstico, el apoyo a los programas de control de calidad, la recepción y distribución de información entre los miembros del Consorcio y el desarrollo de proyectos de investigación. Las actividades futuras deberán poner énfasis en la acreditación de los laboratorios, la definición de la dinámica y estrategias del Consorcio, la promoción de la utilización de recursos complementarios, el impulso de nuevas investigaciones sobre el empleo de los AcMo y de los métodos de secuenciación de genes y la definición de las fuentes de financiación. En este contexto, la OPS organizó en octubre de 1999 una consulta técnica sobre el empleo de los AcMo en la caracterización y la vigilancia epidemiológica de los virus de la rabia en América Latina y el Caribe, cuyas principales conclusiones se exponen aquí.

El virus de la rabia, un virus ARN de cadena negativa, es el prototipo del género Lyssavirus, familia Rhabdoviridae. El análisis genético de los genes G y N ha permitido identificar al menos siete genotipos de lisavirus: (GT1-mundial) rabia; (GT2-África) murciélago de Lagos; (GT3-África) Mokola; (GT4- África) Duvenhage; (GT5-Europa)


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lisavirus 1 del murciélago europeo o EBL1; (GT6-Europa) EBL2, y (GT7- Australia) lisavirus del murciélago australiano o ABLV. Por el momento, en América solo se han encontrado aislados GT1 (rabia clásica). En este continente, el virus de la rabia es mantenido en ciclos en las poblaciones de cánidos domésticos, en carnívoros terrestres salvajes y en murciélagos, que actúan como reservorios y vectores de la enfermedad. Los lisavirus de los siete genotipos se componen de cinco proteínas estructurales derivadas de otros tantos genes estructurales del genoma de ARN: una glucoproteína superficial (G), una proteína de la membrana interna o matriz (M), tres proteínas nucleares —ribonucleoproteína (RNP), nucleoproteína (N) y fosfoproteína (P)— y una ARN-polimerasa dependiente de ARN (L). Las cinco proteínas son producidas a partir de ARN mensajeros monocistrónicos transcritos de los correspondientes genes estructurales.

La proteína G es utilizada por el virus para unirse a las células huésped e inicia las relaciones entre ambos al unirse a los receptores celulares. Se cree que es la determinante del tropismo y de la patogenicidad del virus y que, junto con la proteína M, está implicada en la formación de la envoltura vírica y en la producción de viriones. La proteína G es también una diana de los linfocitos T y de los anticuerpos neutralizantes del virus.

La proteína N encapsula y protege de la degradación al genoma del virus. Tiene

dominios funcionales que se unen al ARN, a la proteína P y, posiblemente, a la proteína M. El comportamiento de la proteína N como superantígeno indica que contiene lugares de unión tanto para el receptor de los linfocitos T como para los antígenos de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad. La proteína P también es multifuncional. Interactúa con la proteína N, evitando su autoagregación, y con el complejo proteína N-ARN, facilitando el inicio de la transcripción del ARN y la elongación de la cadena por la ARN-polimerasa (proteína L). Además interactúa con la proteína L, estabilizándola, y participa en la encapsulación del ARN. Entre las funciones de la proteína M se encuentran la participación en el ensamblaje del virus y en su salida de la célula, así como la regulación a la baja de la transcripción. Por último, la proteína L dirige la transcripción y replicación del ARN vírico.

La tasa de mutación de los genomas de los virus ARN es entre mil y un millón de veces mayor que la de los genomas de los virus ADN, hecho debido en gran medida a que las polimerasas de ARN carecen de los mecanismos intrínsecos de “corrección de pruebas” que poseen las polimerasas de ADN. No obstante, y a pesar del gran potencial de mutación aleatoria, los aislados de virus de la rabia presentan en general altos niveles de conservación, lo cual indica la existencia de fuertes presiones selectivas. Algunos genes de los lisavirus, como el G y el P, sufren más mutaciones que otros, como el N y el M. Estas mutaciones de los genes y proteínas de los lisavirus han recibido gran atención por parte delos epidemiólogos moleculares con el fin de interpretar los ciclos de los lisavirus y, en particular, la transmisión y mantenimiento del virus de la rabia (genotipo 1) en diferentes especies salvajes que sirven como reservorios de la enfermedad. Lamentablemente, se sabe muy poco sobre las consecuencias o la importancia de las mutaciones que alteran la estructura primaria de las proteínas víricas.

Entre las excepciones se encuentran las variaciones de los epitopos que influyen

sobre el reconocimiento de los antígenos por los anticuerpos o por los linfocitos T y las variantes de la proteína G que modifican la patogenicidad del virus en el ratón adulto. Por otro lado, es posible que las proteínas toleren muchas mutaciones sin que su función


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se vea afectada. Aunque los métodos serológicos basados en anticuerpos policlonales permiten diferenciar el virus de la rabia de otros serotipos de lisavirus, solo establecen ligeras diferenciaciones entre los subtipos del virus de la rabia clásico. Los métodos que caracterizan los atributos antigénicos y genéticos del virus de la rabia permiten identificar las variantes responsables de epizootias y de casos individuales de rabia tanto en humanos como en animales.

Los AcMo permiten análisis antigénicos comparativos de las variantes del virus

de la rabia. Generalmente la reactividad se determina utilizando baterías de AcMo antirribonucleoproteína (anti-RNP) específicos para epítopos de la nucleocápside del virus. La reactividad se visualiza por la tinción inmunofluorescente de las características inclusiones intracitoplásmicas. Las pruebas de microneutralización con AcMo frente a epítopos de la glucoproteína (G) también se han empleado con éxito, pero son más laboriosas, hecho que ha impedido su amplia utilización y ha llevado al desarrollo de una batería de AcMo anti-N que pudiera proporcionar la máxima diferenciación entre los virus de la rabia relevantes desde el punto de vista de la salud pública. Los resultados obtenidos han demostrado que estos AcMo se pueden utilizar para estudiar la prevalencia relativa, la distribución y la transmisión de la rabia entre diferentes especies salvajes. Además, han contribuido a diferenciar los animales probablemente infectados por “rebosamiento” de los huéspedes reservorios. La caracterización de las variantes de los virus de la rabia también ha sido muy útil para comprender la epidemiología de la rabia humana, sobre todo en situaciones en las que no hay antecedentes de exposición, como puede ocurrir en países donde la rabia canina está controlada.

Los análisis con AcMo proporcionan una resolución de las diferencias entre antígenos víricos suficiente para identificar la distribución geográfica y por especies de muchas variantes de la rabia. Sin embargo, el empleo exclusivo de AcMo no está exento de limitaciones. Así, por ejemplo, la diversidad de las variantes presentes en los murciélagos no se explica fácilmente con los AcMo existentes. Para detectar polimorfismos, el análisis genómico es, evidentemente, más adecuado que el análisis fenotípico con AcMo, entre otros motivos porque hay más mutantes sinónimos que no sinónimos y porque gran parte de los mutantes no sinónimos no son detectados por los AcMo. El análisis genético proporciona una información más detallada sobre la relación evolutiva de los aislados, los cambios espaciales y temporales que se pueden producir y las similitudes entre los aislados.

Otra ventaja de los métodos genéticos es que a menudo se pueden aplicar a muestras fijadas en formalina o a muestras degradadas. Dependiendo de los objetivos del análisis y del grado de relación entre las variantes, puede ser preferible analizar secuencias totales o parciales del gen N, altamente conservado, del gen G, de divergencia intermedia, o del gen P y de la región intergénica G-L, altamente divergentes. En general, cuanto más conservado esté el gen, menos sensible será a variaciones menores. El análisis genético se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa y el análisis de los productos de la amplificación se puede efectuar mediante análisis de la secuencia de nucleótidos, bien por digestión con endonucleasas de restricción o bien por secuenciación directa de consenso.

La potencial utilidad de la tipificación antigénica y genética del virus de la rabia

es determinada en gran parte por factores relacionados con la recolección y manipulación de las muestras. La tipificación antigénica requiere una adecuada conservación de las muestras por refrigeración o congelación. Debido a la enorme


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sensibilidad de los procedimientos, la tipificación genética requiere cuidados extremos para evitar la contaminación cruzada de las muestras.

Para que los datos resultantes se puedan interpretar correctamente, también es fundamental una identificación exacta de las especies animales de las que proceden las muestras y la anotación de las fechas y lugares de captura.

La aplicación de la tipificación antigénica y genética a la vigilancia de la rabia en América Latina y el Caribe es esencial para mejorar los actuales programas de control de la enfermedad. El reconocimiento de las fuentes de nuevos brotes de rabia canina y la identificación de las especies salvajes que mantienen los ciclos silvestres de transmisión de la rabia posibilitan una mejor utilización de los recursos de salud pública.

El desarrollo de hibridomas productores de AcMo frente a diferentes lisavirus

tiene costos considerables, por lo que no se suelen compartir las líneas celulares con otros laboratorios. No obstante, la mayoría de los laboratorios productores están dispuestos a compartir sus AcMo de forma gratuita, siempre que se cumpla una serie de requisitos especificados en los Acuerdos de Transferencia de Materiales.

Habitualmente, estos acuerdos definen el uso que el receptor va a hacer de los AcMo, impiden su transferencia a otras instituciones sin el permiso del productor y requieren que este participe en la publicación de los resultados de las investigaciones, o bien que se reconozca el origen del material en todos los informes y publicaciones.

Los AcMo pueden ser obtenidos como sobrenadantes de cultivos tisulares de hibridomas o como líquido ascítico de ratón. El líquido ascítico proporciona mayores concentraciones de AcMo, pero su producción está cada vez más restringida por las leyes sobre el uso de animales de laboratorio y en muchos países está ya prohibida. Para las pruebas rutinarias de identificación de variantes víricas por inmunofluorescencia indirecta, los sobrenadantes de cultivos celulares suelen proporcionar concentraciones suficientes de AcMo.

Las baterías de AcMo proporcionadas por los productores deben tener menos de 20 anticuerpos, una vez que la experiencia de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos de América demostró que el empleo de baterías con muchos anticuerpos requería mucho tiempo y aumentaba el riesgo de error en la realización de las pruebas y en la interpretación de sus resultados.

En la actualidad, para las tipificaciones rutinarias se utiliza una batería reducida

de ocho AcMo. El productor puede proporcionar una batería de anticuerpos que haya demostrado ser útil en condiciones similares o pedir al laboratorio receptor que le envíe algunos aislados de virus obtenidos en diferentes contextos epidemiológicos para así poder seleccionar una batería de anticuerpos que permita diferenciar el máximo número de variantes.

En la actualidad son los CDC, como Centro Colaborador de la Organización

Mundial de la Salud para la Investigación y Referencia de la Rabia, quienes proporcionan a las autoridades de salud pública de los países de América Latina la actual batería de ocho AcMo anti-N. Los requisitos consisten en una carta oficial al Director en la que se declare la naturaleza de la solicitud y se especifique que los


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reactivos serán utilizados únicamente con fines de investigación, no serán enviados por el receptor a terceros y no serán utilizados con fines comerciales; que la institución receptora asumirá todas las responsabilidades relacionadas con el envío y el uso apropiado de los reactivos, y que toda comunicación científica derivada del uso de los reactivos reconocerá a los CDC como suministradores del material.

En América Latina y el Caribe, los laboratorios de referencia de Argentina, Brasil, Chile, Colombia, México y Venezuela han tipificado antigénicamente más de 800 aislados de virus de la rabia, utilizando en prácticamente todos los casos la batería de ocho AcMo proporcionada por los CDC. La excepción fueron los primeros 11 aislados de Argentina, que fueron tipificados con los AcMo proporcionados por el Instituto Wistar. Las muestras analizadas procedían de estos cinco países y de otros países de la Región, como Belice, El Salvador, Guatemala, Honduras o Paraguay. En Chile se está realizando, además, un análisis de secuenciación y los correspondientes análisis filogenéticos de los virus de la rabia aislados en el país, servicio que también está a disposición de otros países.

El empleo de una misma batería de AcMo tiene la ventaja de permitir comparar los resultados obtenidos por diferentes grupos de investigadores.

La experiencia acumulada en la Región revela que el empleo de esta técnica ha permitido determinar la distribución geográfica de diferentes variantes antigénicas del virus de la rabia, describir nuevas variantes e identificar variantes conocidas en nuevos huéspedes, información que ha demostrado ser muy útil para la vigilancia epidemiológica de la enfermedad en la Región. No obstante, también se han demostrado algunas limitaciones del análisis antigénico de los aislados víricos con un reducido grupo de AcMo, dado que pequeños errores en la interpretación de una reacción positiva o negativa con uno de los AcMo puede proporcionar un patrón antigénico diferente y esto podría llevar a identificar un reservorio equivocado o un nuevo patrón antigénico también equivocado.

Rev Panam Salud Publica/Pan Am J Public Health 8(3), 2000

Anticuerpos monoclonales disponibles en España:

Más de una decena de anticuerpos monoclonales con fines terapéuticos o diagnósticos están disponibles comercia lmente en España. Alguno con más de diez años de antigüedad en el mercado. La situación es muy parecida al resto de los países de la Unión Europea, dado que desde que existe la Agencia Europea de Evaluación de Medicamentos (EMEA), el proceso de registro de este tipo de fármacos se realiza mediante un procedimiento centralizado europeo, que aúna el esfuerzo de evaluación y control de estos medicamentos tan peculiares.

Uno de los primeros anticuerpos monoclonales en ser registrados en España¸el nebacumab (CentoxinÒ ), fue retirado en 1993, debido a la detección de un exceso de mortalidad en los pacientes tratados. Este anticuerpo monoclonal inactiva selectivamente la fracción lipídica de la endotoxina presente en la membrana exterior de las bacterias Gram-negativas.


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En pacientes con septicemia provocada por bacterias Gram-negativas, esta endotoxina es capaz de provocar una cascada de reacciones bioquímicas que conduce a la liberación de numerosos mediadores bioquímicos, como TNF y otras citocinas de macrófagos y de células endoteliales, todos los cuales pueden conducir a un estado de shock, que podría acabar en la muerte del paciente. Atendiendo a estas características, el nebacumab estuvo indicado en el tratamiento del shock séptico en pacientes con bacteriemia por Gram-negativos.

Sin embargo, esta experiencia negativa no ha impedido que en marzo de 2000 estén comercializados un amplio abanico de anticuerpos monoclonales con fines terapéuticos o diagnósticos "in vivo". Entre ellos, los de mayor trascendencia clínica son los siguientes:

Abciximab (ReoproÒ ).- El abciximab es el fragmento Fab del anticuerpo monoclonal quimérico 7E3 específico frente al receptor de la glucoproteína IIb/IIIa localizado en la superficie de las plaquetas humanas. Actúa inhibiendo la agregación plaquetaria evitando la unión del fibrinógeno, del factor von Willebrand y de otras moléculas, al receptor.

El complejo de glucoproteína (GP) IIb/IIIa reconoce y fija las cadenas de fibrinógeno, siendo por tanto un elemento esencial en la formación de la trama plaqueta-fibrinógeno-plaqueta del tapón hemostático. Este complejo forma parte de la superfamilia de receptores de integrina, que intervienen en fenómenos aparentemente diversos, como la agregación plaquetaria, la adhesión de plaquetas al colágeno, la adehesión de fibroblastos a la fibronectina y a la vitronectina, y a la unión de leucocitos con las células endoteliales y con la matriz proteica.

Abciximab se usa en complicaciones cardiacas de tipo isquémico, específicamente para la prevención en pacientes de alto riesgo de trombosis coronaria aguda que sean sometidos a angioplastia coronaria transluminal percutánea.

Anticuerpos antimelanoma (Tecnemab K1Ò ).- Son fragmentos de anticuerpos antimelanoma 225.28S combinados con tecnecio radiactivo (Tc99), para formar un radiofármaco de uso en diagnóstico para detección tumoral. Concretamente, se usa como coadyuvante junto a otros procedimientos diagnósticos para la visualización mediante inmunogammagrafía (RIS) de metástasis de nódulos linfáticos regionales y metástasis distales, útiles en la clasificación y seguimiento de pacientes con melanoma cutáneo en estadios I a III. Ayuda en el diagnóstico diferencial en caso de sospecha de melanoma ocular.

Arcitumonab (Ces ScanÒ ) es un complejo de tecnecio radiactivo (Tc99) con un fragmento de un anticuerpo monoclonal proveniente del fluido ascítico murino (IMMU-4). El IMMU-4 se une de forma muy selectiva con el antígeno carcinoembrionario (CEA), un antígeno tumoral cuya expresión aumenta presencia de una serie de enfermedades neoplásicas, especialmente del tracto gastrointestinal, así como en ciertas condiciones inflamatorias, como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. El antígeno carcinoembrionario está presente en más del 90% de los cánceres colorrectales.


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Se trata de un producto de diagnóstico que ha demostrado ser eficaz y seguro en la detección, localización y tamaño de cánceres colorrectales recurrentes y/o metastáticos que afectan al hígado y otros órganos abdominales, así como a la pelvis.

Basiliximab (SimulectÒ ).- Es un anticuerpo monoclonal de tipo quimérico que se une selectivamente a la cadena alfa (a ) del receptor de interleucina 2 (IL-2), denominado receptor CD25, bloqueando así la activación de los linfocitos T inducida por IL-2. Este efecto se produce disminuyendo sólo mínimamente el número de linfocitos T circulantes, lo que se traduce es una escasa afectación de los elementos estructurales del sistema inmunológico. La activación de linfocitos T por la interleucina 2 constituye una vía de importancia crítica en la respuesta inmunocelular, intensamente implicada en los procesos de rechazo agudo de injertos.

Es un agente que se utiliza siempre en asociación a otros inmunosupresores estándar (ciclosporina/corticosteroides) como tratamiento preventivo del rechazo agudo en pacientes sometidos a trasplante de riñón. Un interesante aspecto de basiliximab es que su mecanismo de acción es complementario con el de ciclosporina, el fármaco inmunosupresor de base. Esta última actúa evitando la síntesis de interleucina 2 (IL-2), mientras que basiliximab previene la estimulación de los linfocitos T por IL-2.

Se trata de un fármaco moderadamente eficaz en la reducción de las reacciones de rechazo durante los primeros seis meses tras el trasplante de riñón. Pero basiliximab presenta otros aspectos interesantes, como son la facilidad del tratamiento (sólo se requieren dos dosis IV, separadas cuatro días entre sí) y la excelente tolerabilidad del medicamento. Puede ser una interesante alternativa en pacientes que vayan a ser sometidos por vez primera a un trasplante renal.

Infliximab (RemicadeÒ ).- Es una de las "estrellas" de los anticuerpos monoclonales actualmente disponibles en clínica, de la que incluso todavía no parece haberse terminado de sacar todo el potencial terapéutico. Se trata de un anticuerpo monoclonal quimérico capaz de unirse de forma selectiva al factor de necrosis tumoral de tipo alfa (TNFa ), pero no a la linfotoxina (TNFß), inhibiendo sus efectos biológicos.

El factor de necrosis tumoral juega un papel decisivo en la enfermedad de Crohn y en otras condiciones inflamatorios de origen autoinmune. El bloqueo de esta citoquina por medio del infliximab no sólo provoca una reducción sustancial de los niveles de TNF y de la infiltración de células inflamatorias en las áreas inflamadas del intestino, sino además de PCR (Proteína C Reactiva), uno de los marcadores inflamatorios más característicos de la enfermedad, todo ello sin afectar sustancialmente a los recuentos de leucocitos periféricos totales ni a la capacidad funcional de los monocitos. Adicionalmente, también se reduce en estas últimas células la proporción de aquellas capaces de expresar TNF e interferón gamma. En definitiva, todo ello conduce a una rápida resolución de la inflamación de la mucosa digestiva.

Más del 65% de los pacientes refractarios a los tratamientos convencionales experimentan una marcada mejoría en sus síntomas con infliximab, que es mantenida mediante la administración de una única dosis en perfusión IV cada dos meses.

Hay importantes expectativas también en torno a su utilidad en artritis reumatoide , indicación que está siendo objeto actualmente de evaluación en la EMEA.


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Por su parte, la FDA autorizó al infliximab para el tratamiento de la artritis reumatoide en combinación con metotrexato en noviembre de 1999.

En pacientes con artritis reumatoide, el infliximab es capaz de mejorar sustancialmente los síntomas cuando se administra conjuntamente con metotrexato.

En los pacientes con artritis reumatoide, el infliximab produce una reducción de la infiltración de células inflamatorias en las áreas inflamadas de la articulación, reduciendo la expresión de moléculas implicadas en la adhesión celular, tales como E-Selectina, Molécula de Adhesión Intercelular-1 (ICAM-1) y Molécula de Adhesión Vascular-1 (MCP-1), así como en la degradación tisular.

En un amplio ensayo clínico, denominado ATTRACT (Anti-TNF Trial in Rheumatoid Arthritis with Concomitant Therapy), el 50% de los pacientes tratados con esta combinación mostró después de 30 semanas de tratamiento una mejoría de al menos un 20% en los síntomas inflamatorios y funcionales articulares, frente a sólo un 20% de los pacientes tratados exclusivamente con metotrexato.

Palivizumab (SynagisÒ ).- Es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado, dirigido a un epitopo en el espacio antigénico A de la proteína de fusión (F) del virus respiratorio sincitial (VRS). Este anticuerpo monoclonal humano tiene una actividad inhibitoria de la fusión y es un potente neutralizante frente al subtipo A y cepas B del VRS. Por ello, se emplea en la profilaxis de la infección por virus respiratorios sincitiales.

En modelos experimentales, con concentraciones séricas similares a las alcanzadas en los pacientes humanos, se obtiene una reducción del 99% (dos órdenes de magnitud) en la replicación pulmonar del VRS. Sólo requiere una única administración mensual durante la estación del VRS (invierno).

El VRS es un virus ARN, que dispone de tres glucoproteínas de cubierta: G (con la que el virión se adsorbe a las células), F (proteína de fusión, necesaria para la penetración en el interior de la célula) y SH (de la que todavía se desconoce su función biológica). Existen dos subgrupos antigénicos (ligados a variaciones en la glucoproteína G), designados A y B, con una patogenicidad similar.

La presencia de anticuerpos no protege contra la reinfección, pero sí contra las formas graves de la enfermedad. Se cree que la modificación antigénica de las glucoproteínas de envoltura desempeña un papel importante en la incapacidad del sistema inmunitario para evitar las infecciones. De hecho, a los 5 años alrededor del 70% de los niños presentan anticuerpos séricos al VRS y a pesar de ello las infecciones continúan apareciendo en todas las edades. La enfermedad observada en lactantes menores de 6 meses, a pesar de disponer de anticuerpos maternos, está en esta misma línea de fracaso inmune frente al VRS.

La profilaxis con palivizumb produce en una reducción global del 55% de las hospitalizaciones asociadas al VRS, así como en un 27% en las hospitalizaciones debidas a cualquier causa respiratoria, aunque no se registran diferencias en cuanto a la mortalidad de los pacientes.


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Rituximab (MabtheraÒ ).- Es un anticuerpo monoclonal específico para los receptores de superficie CD20 de los linfocitos B humanos. Está indicado en el tratamiento de linfomas no hodgkinianos de células B que hayan recaído o sean refractarios a otros tratamientos. Los receptores CD20 están presentes en el 90% de los linfomas no hodgkinianos de linfocitos B, y actúan como receptores moleculares del antígeno Bp35, una proteína fosforilada responsable de la restricción de la diferenciación de los linfocitos B que es expresada durante las fases más precoces. Rituximab produce la lisis de las células tumorales en presencia del complemento humano.

En el tipo de pacientes donde está indicado rituximab, los índices de respuesta completa son bajos (en torno al 5-10%), aunque los índices de respuesta parcial son sustancialmente mayores (40-60%) y, lo que es más importante, con una supervivencia media de 10-11 meses. Además, algunos estudios han mostrado que la combinación con el protocolo CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona) han alcanzado respuestas mucho más amplias.

Sulesomab (LeukoscanÒ ).- Es un complejo de tecnecio radiactivo (Tc99) con un fragmento de anticuerpo anti-granulocitos humanos NCA 90, ligado a la cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino IMMU-MN3.

La ventaja de utilizar anticuerpos monoclonales para la detección de cuadros infecciosos o inflamatorios radica fundamentalmente en su elevada selectividad para antígenos asociados a células (como el NCA 90, en este caso) y en el hecho de que los vasos y los espacios intersticiales en los tejidos inflamados o infectados presentan una estructura con gran capacidad de drenaje.

En comparación con la detección de tumores, la situación en los cuadros infecciosos e inflamatorios es muy diferente. En los tumores, los anticuerpos monoclonales frecuentemente son inadecuada y erráticamente captados, debido a la existencia de barrera fisiológicas y a un suministro irregular de sangre. Además, la presión intersticial y la distribución heterogénea de los antígenos en el tumor, son una dificultad adicional para la captación de anticuerpos. Por el contrario, en los cuadros infecciosos e inflamatorios, los capilares presentan una elevada permeabilidad, lo que facilita la llegada de los anticuerpos en gran número. Y ni la presión intersticial ni la distribución antigénica he terogénea no afectan a la infección o a la inflamación, ya que usualmente no hay hipertensión intersticial y los antígenos (NCA 90) están siempre presentes sobre los leucocitos.

Todo este conjunto de características fisiopatológicas determina una elevada sensibilidad para los radiofármacos en los cuadros infecciosos para radiofármacos que utilizan como ligando inmunoglobulinas, como es el caso de sulesomab [99Tc]. Por otra parte, el uso de fragmentos de anticuerpos, en lugar de la inmunoglobulina completa, determina una menor inmunogenicidad, que este caso alcanza niveles prácticamente nulos de anticuerpos humanos antimurinos. Además de la sensibilidad, permite la localización extremadamente rápida de las lesiones infecciosas (en una hora), lo cual resulta especialmente importante en la detección de infecciones espinales y de regiones que presenten médula ósea normal.

... y en lista de espera


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Además de los anticuerpos monoclonales citados anteriormente, existe un grupo que previsiblemente aparecerá en breve plazo en nuestro mercado farmacéutico. Entre ellos, destacan los siguientes:

Daclizumab (ZenepaxÒ ).- Es un anticuerpo monoclonal recombinante dirigido contra la cadena alfa del receptor de IL-2, como basiliximab, fármaco con el que comparte las indicaciones terapéuticas (prevención del rechazo agudo en trasplantes de órganos: riñón, corazón, etc). Se caracteriza por una excelente tolerancia y su eficacia es equiparable a la del basiliximab. Fue autorizado en 1999 por la EMEA.

Igovomab (Indimacis 125Ò ).- Se trata de un fragmento de anticuerpo (Fab) IgG monoclonal murino específico para el antígeno CA125, presente en algunos cánceres de ovario. Al ser marcado con indio radiactivo (In111), permite la detección inmunoescintigráfica de recaídas de adenocarcinomas ováricos.

Los ensayos clínicos disponibles demuestran que el valor predictivo del igovomab marcado con indio ractiactivo es muy elevado, en particular cuando hay altos niveles de antígeno CA125. Comparada con los ultrasonidos o la tomografía computadorizada, la escintigrafía con igovomab ha demostrado obtener hasta un 50% de positivos, donde las anteriores pruebas no habían detectado ninguna recaída tumoral.

A todo ello hay que agregar que sólo requiere una única administración y no se han detectado reacciones alérgicas importantes, con un perfil de seguridad bueno. Fue autorizado por la EMEA en 1996.

Trastuzumab (HerceptinÒ ).- Un anticuerpo monoclonal IgG humanizado dirigido contra el receptor HER2, presente en las células tumorales de determinados tipos de cáncer, como el de mama. Ha sido evaluado en clínica en ensayos para el tratamiento de mujeres con cáncer de mama metastáticos avanzado. En combinación con otras terapias antineoplásicas (que incrementan notablemente la eficacia) puede ser empleado como tratamiento de primera línea, pero también puede usarse solo en terapias de segunda o tercera línea. Autorizado en Suiza en 1999.

Votumonab (HumaspectÒ ).- Es un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra los antígenos asociados a células tumorales citoqueratina-positivas de adenocarcinoma de colon humano. Se emplea asociado a un radionúclido como agente de diagnóstico por imagen (tomografía computadorizada por emisión de fotón único, SPECT), para la detección de recurrencias o metástasis en pacientes con carcinoma de colon o de recto histológicamente confirmados. Autorizado en 1998 por la EMEA.

... y muchos más

Existe una larga lista de anticuerpos monoclonales en fase experimental, lo que sugiere la importancia extraordinariamente creciente de este enfoque terapéutico y diagnóstico. Como ejemplo de ello, valga el siguiente cuadro:


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Anticuerpo Tipo de anticuerpo

Dirigido contra... Indicación

2A11 Murino Péptidos de tipo bombesina,

activadores de receptores que estimulan el

crecimiento de células neoplásicas

pulmonares.

Cáncer pulmonar microcítico.

3E10 Murino ADN Nefritis asociada a lupus sistémico eritematoso

estable

BC-4 Murino, marcado con itrio

radiactivo (Y90)

Tenascina Gliomas malignos: astrocitomas, glioblastomas

(radioinmunoterapia)

BW 250/183 Murino, marcado con renio

radioactivo (Re188)

Antígeno NCA (granulocitos)

Leucemia (radioinmunoterapia)

Campath 1H Humanizado. Receptores CD52 (linfocitos)

Leucemia, tratamiento del rechazo agudo en

trasplante renal.

Capromab Murino, marcado con indio

radiactivo (In111)

Metástasis en nódulos linfáticos

Cáncer de próstata (diagnóstico).

CC49 Murino Cáncer metastático de próstata resistente a

hormonas (radioinmunoterapia).

Edrecolomab (17-1A)

Murino Molécula de adhesión de las

células epiteliales (EpCAM)

Cáncer de mama; cáncer de colon.

G250 Quimérico, marcado con iodo radiactivo (I131)

Carcinoma renal metastático

(radioinmunoterapia).

h5G1.1-scFv Humanizado, recombinante, de

cadena única.

Complemento C5 Angioplastia coronaria con derivación

cardiopulmonar.

hMN-14 Humanizado, marcado con yodo radiactivo (I131)

Antígeno carcinoembrionario

(CEA)

Metástasis hepáticas de cáncer colorrectal

(radioinmunoterapia).


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M195 Humanizado, marcado con

bismuto radiactivo (Bi213)

Receptores CD33 (linfocitos)

Leucemia (radiodiagnóstico)

OC-125 Murino, marco con yodo

radiactivo (I131).

Adenocarcinoma ovárico (radioinmunoterapia).

p185HER2 (MKC-454)

Humanizado, recombinante.

Receptores HER2 de células tumorales mamarias

Cáncer de mama.

rhPM-1 Humanizado recombinante

Interleucina-6 (IL-6)

Enfermedad de Castleman.

rhuMab-E25 Humanizado recombinante

Inmunoglobulina E libre (IgE).

Asma alérgica.

Panorama Actual del Medicamento 2000, Vol.24, nº231

Los anticuerpos monoclonales, las enfermedades raras y los medicamentos huérfanos:

Como se ha recordado en el I Congreso Internacional de Enfermedades Raras y Medicamentos Huérfanos, celebrado en Sevilla recientemente, no hay acuerdo sobre el concepto de enfermedad rara. Según las normas norteamericanas, una enfermedad es rara cuando afecta a menos de 200.000 personas en Estados Unidos, lo que supone un caso por cada 1.200 personas, mientras que en Europa parece prevalecer el concepto estadístico de 5 casos por cada 10.000 individuos (uno por cada 2.000).

Según la OMS hay aproximadamente unas 5.000 enfermedades raras, de las que unas 4.000 son enfermedades causadas por una anomalía genética, fundamentalmente monogénica. Uno de los grandes problemas de las enfermedades raras es la dificultad de encontrar un tratamiento adecuado y fármacos eficaces para la mayoría de estas enfermedades.

El coste de desarrollo de un medicamento se cifra actualmente entre 250 y 500 millones de dólares, y el período medio de desarrollo de un medicamento se estima entre 8 y 14 años. Cuando por el fin el medicamento ve la luz en el mercado farmacéutico, el laboratorio fabricante aspira legítimamente a recuperar la inversión y a obtener beneficios, lo que inevitablemente choca con el propio concepto de un medicamento útil para curar una enfermedad rara.

En 1983, gracias al esfuerzo de muchos grupos, incluyendo representantes de pacientes, el Congreso de los Estados Unidos aprobó el Orphan Drug Act (Ley de Medicamentos Huérfanos), una ley que tiene como objetivo fundamental incentivar de diversas maneras la investigación y el desarrollo de medicamentos para prevenir, diagnosticar o curar las enfermedades raras.


61

El incuestionable éxito científico y sanitario obtenido con la aplicación de la Orphan Drug Act ha venido a demostrar que sí es posible obtener un beneficio económico en este campo. De hecho, gracias a esta ley, algunos laboratorios se han especializado en la producción de este tipo de productos, obteniendo en algunos casos importantes beneficios.

Desde 1983 la Food & Drug Administration (FDA) de Estados Unidos, responsable de la aplicación de la Orphan Drug Act ha aceptado cerca de mil aplicaciones huérfanas terapéuticas y, en algunos casos, asociadas a anticuerpos monoclonales. De hecho, la mayor parte de los primeros anticuerpos monoclonales actualmente disponibles en clínica (arcitumonab, basiliximab, etc) fueron antes medicamentos huérfanos, y aún siguen siéndolo en determinadas indicaciones.

Todavía hoy la lista de anticuerpos monoclonales con aplicaciones de medicamentos huérfanos es extensa. En la siguiente tabla, procedente de datos de la FDA, se muestran algunos ejemplos:

Nombre genérico Nombre comercial

Indicación huérfana

Laboratorio investigador

Fecha de designación

Satumonab pendétido

Oncoscint CR/V

Detección de carcinoma

ovárico

Cytogen Diciembre 1992

Gemtuzumab zogamicina

Tratamiento de leucemia

mieloide aguda CD33+

Wyeth-Ayerst Noviembre 1999

Anticuerpo humanizado anti-

CD40L

(IDEC-131) Tratamiento del lupus sistémico

eritematoso

IDEC Pharmaceuticals

Febrero 1999

Anticuerpo humanizado anti-

CD2

MEDI-507 Inmunosupresión en trasplante

renal alogénico.

Biotransplant Septiembre 1998

Imciromab pentetato

Myoscint Detección precoz de necrosis como una indicación de rechazo de

trasplante cardíaco

Centocor Enero 1989

2B8-MX-DTPA marcado con Indio (In111) y con Itrio

(Y90)

Melimmune Tratamiento de linfomas no

hodgkinianos de células B

IDEC Pharmaceuticals

Junio 1994

Anticuerpo quimérico anti-

TNF-1B marcado con Yodo (I131)

131chTNT-1

Tratamiento de glioblastoma multiforme y astrocitoma anaplásico.

Techniclone Diciembre 1999


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Anticuerpo B43.13

Ovarex Mab-

B43.13

Tratamiento del cáncer ovárico

de células epiteliales

AltaRex Noviembre 1996

Anticuerpo murino (lym-1) anti- linfoma de

células B

Oncolym Tratamiento de linfomas no


Berlex Noviembre 1998

Anticuerpo murino anti-

mucinapolimórfica epitelial

Theragyn Tratamiento coadyuvante del cáncer de ovario

Antisoma Marzo 1999

Prevención y tratamiento de hemofilia A/B,

en pacientes con inhibidor de

Factor VIII/Factor IX.

Octubre 1998

Prevención del rechazo del trasplante de

órganos sólidos y de células de

islotes pancreáticos.

Marzo 1999

Anticuerpo recombinante

humanizado 5c8

-

Tratamiento de la púrpura

trombocitopénica inmune y del

lupus sistémico eritematoso.

Biogen

Febrero 1998

Tositumonab (sólo o marco con yodo

I131)

Bexxar Tratamiento de linfomas no


Coulter Mayo 1994

Trastuzumab Herceptin Tratamiento del cáncer de páncreas

p185HER2+

Genentech Diciembre 1999

Panorama Actual del Medicamento 2000, Vol.24, nº231


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El uso de animales puede cambiar el futuro de la I+D farmacéutica:

El futuro de la investigación farmacéutica puede incluir una nueva era en la que razas enteras de nuevas especies se generen con el fin último de curar enfermedades humanas. El objetivo no sólo es dar con soluciones a problemas hasta ahora de difícil curación sino también abaratar los costes del empleo de anticuerpos monoclonales y proteínas en la investigación y posterior producción de los fármacos del futuro.

Cada vez más, las compañías biotecnológicas intentan convertir simples

animales en biorreactores vivos repletos de compuestos capaces de salvar vidas. A través de modificaciones genéticas, se puede inducir a estos animales a producir grandes cantidades de ciertas proteínas en su leche, huevos o sangre y, una vez purificadas, estas proteínas se pueden utilizar para tratar enfermedades.

Los fabricantes de fármacos están especialmente interesados en producir grandes

cantidades de anticuerpos monoclonales, que pueden combatir infecciones, y quizá incluso células cancerígenas, con mucha más precisión que los fármacos sintéticos. El aislamiento de anticuerpos y los genes que los codifican a partir de la sangre y células de animales de laboratorio evita la necesidad de diseñar moléculas terapéuticas partiendo de cero. Durante décadas, los investigadores han soñado con convertir estas balas mágicas en fármacos, pero el problema es que los fabricantes de proteínas terapéuticas deben aplicar un proceso muy complejo para lograrlo en cantidades comerciales.

Según publica The Economist, los diez fármacos basados en anticuerpos que

existen en la actualidad acaparan la producción de todos los centros capacitados del mundo y la alternativa de construir un nuevo centro que pueda fabricar este tipo de material cuesta entre 200 y 400 millones de dólares y requiere entre tres y cinco años. Estas inversiones minan el efectivo de las farmacéuticas, especialmente cuando sólo necesitan pequeñas cantidades de una proteína para completar ensayos clínicos.

Si la producción de biofármacos en animales se pudiera hacer de forma más

eficiente se desbloquearía en parte el atasco que impide la llegada de más nuevos productos al mercado. Más de cien fármacos basados en proteínas están en fases avanzadas de ensayos clínicos y muchos más están en fases más precoces. Los beneficios económicos también son tentadores ya que la fabricación a gran escala de proteínas podría suponer miles de millones de beneficios en la próxima década.

De momento, la tecnología más avanzada en lo que se refiere a biofabricación utiliza cabras y vacas. En la compañía estadounidense GTC Biotherapeutics los científicos están trabajando en los beneficios de la selección natural. Las glándulas mamarias de cabras y vacas han evolucionado de forma que pueden introducir proteínas en la leche que producen. Cuando se modifica genéticamente una cabra para que sea portadora del gen de una proteína terapéutica, las células mamarias tratan a ese gen como cualquier otro. Hasta ahora, GTC Biotherapeutics ha obtenido cabras por ingeniería genética capaces de excretar en la leche 14 variedades de proteínas terapéuticas.

Cualquier compañía interesada en producir una proteína terapéutica en grandes

cantidades puede contratar a GTC para crear cabras transgénicas que excreten la


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proteína deseada en la leche. Según Thomas Newberry, portavoz de la compañía, generar todo un rebaño de este tipo de animales cuesta unos 100 millones de dólares y requiere 18 meses en el caso de las cabras, aunque en las vacas el proceso sería de al menos tres años. Las cabras producen unos dos litros de leche al día mientras que las vacas generan 20 litros.

Muchas otras biotecnológicas intentan convertir animales en fábricas de

proteínas, otras intentan hacer lo mismo con cultivos como el maíz y la alfalfa, pero quedan dos grandes obstáculos por vencer: la necesidad de lograr la aprobación regulatoria para este tipo de productos y el temor público a los riesgos de infecciones cruzadas entre especies, como ocurrió con la encefalopatía esponjiforme.

De gallinas y hombres: La compañía norteamericana TranXenoGen defiende las ventajas del empleo de

gallinas para la producción de proteínas en lugar de cabras y vacas. Para empezar, las gallinas ponen huevos, que son contenedores estériles y sellados de cara a la protección de contenidos delicados. Además, la clara es el medio ideal para introducir compuestos frágiles. Por otra parte, las gallinas maduran mucho más rápidamente y son más baratas que otros animales. Una partida de gallinas se puede multiplicar por diez en un año y cada ejemplar adicional requiere muy poco espacio extra en el mismo gallinero. Sin embargo, la investigación de gallinas transgénicas no está tan avanzada. Hasta ahora TranXenoGen ha producido dos anticuerpos -uno humano y otro de ratón- en la clara de las llamadas gallinas quiméricas, aunque los niveles de las proteínas aún son algo bajos y la compañía necesitará cerca de un año antes de lograr mayores niveles de proteínas en sus gallinas transgénicas.

Diariomédico.com, 30 de diciembre de 2002


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cultivos celulares aplicados a la inmunologia

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