soluciones cultivos celulares protocolos

El medio de cultivo El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgnicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones fsico-qumicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estar formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las clulas, las condiciones fsico-qumicas y fisiolgicas del medio, la naturaleza y composicin de la fase gaseosa y las condiciones de incubacin, especialmente la humedad y la temperatura.

El sustrato de cultivo. La mayor parte de las lneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte ms o menos slido. El crecimiento en suspensin est usualmente restringido a algunas lneas celulares especialmente de clulas hematopoyticas y tumores ascticos. Segn si la lnea celular precise o no unirse al sustrato para proliferar se dice que es dependiente (adhesin) o independiente (suspensin) de anclaje:

8 La mayor parte de las clulas que se mantienen en cultivo proceden de disgregacin tisular o de tumores formados por clulas adheridas y mantienen esa caracterstica: necesitan adherirse al sustrato para mantenerse.

8 Los cultivos en suspensin suelen coincidir con los de aquellas clulas que in vivo son circulantes, en general clulas sanguneas. El gran inters que tiene el cultivo de clulas sanguneas (linfocitos) ha extendido notablemente la caracterizacin de los cultivos en suspensin. El cultivo de clulas en suspensin tiene algunas ventajas: mayor facilidad de manipulacin y pase de un cultivo al siguiente (replaqueo) pues no requieren separacin del sustrato mediante por ej. tripsinizacin, posibilidad de cultivo en mayor escala pues slo dependen de la accesibilidad del medio y de los gases pero no de la superficie del recipiente, etc... y algunas desventajas: son cultivos homogneos en los que se pierden las interacciones (espaciales, de adhesin, etc...).

Los tipos de sustrato ms empleados en la actualidad son los siguientes:

8 Vidrio. Empleado usualmente como sustrato de cultivo tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y esterilizacin. Asimismo es especialmente til para su posterior observacin al microscopio por su calidad ptica.

8 Plstico desechable. Muy empleado en la actualidad como material desechable estril por irradiacin. El plstico ms empleado es el poliestireno, de buena calidad ptica. Debido a que este plstico es hidrofbico requiere un tratamiento mediante irradiacin-gamma, qumico, o mediante descargas elctricas que produzca una superficie hidroflica. El tratamiento es caracterstico de los diferentes suministradores, y por ello los productos varan en calidad de uno a otro. Aunque para la mayor parte de los usos rutinarios no es necesario, es recomendable probar muestras de distintos orgenes y medir la eficacia de plaqueo y las tasas de crecimiento para maximizarlas especialmente en aquellas lneas celulares de crecimiento difcil. Otros plsticos que se emplean son polivinil-cloruro, policarbonato (PVC), politetrafluoretileno (tefln, PTFE), thermanox (TPX).

8 Actualmente es de gran inters, especialmente para el cultivo de clulas epiteliales polarizadas, el uso de membranas plsticas porosas. Un ejemplo de este tipo de cmara se representa en la figura.

8 Microsoportes ("microcarriers"). Se trata de soportes plsticos (poliestireno), de sephadex o poliacrilamida en forma de pequeas bolas ("beads") a las que se unen las clulas dependientes de anclaje. Estas bolas con las clulas adheridas se mantienen en suspensin.

8 Otros sustratos artificiales. Se han desarrollado tcnicas para crecer clulas de glia en sustratos metlicos, de paladio (Westermark, 1978) o en discos de acero (Birnie y Simmons, 1967).

8 Superficies tratadas. La adherencia y crecimiento de las clulas en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido a la presencia de colgeno o fibronectina liberada por las clulas, o bien sobre superficies recubiertas de protenas de matriz extracelular (fibronectina, colgeno, vitronectina, Matrigel, etc...). As, se pueden tratar los recipientes de cultivo con fibronectina (1 ng/mL) aadido al medio, o con colgeno. El tratamiento con colgeno desnaturalizado aumenta la adhesin de muchos tipos celulares, y especialmente de las clulas epiteliales.

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Muchos resultados parecen indicar que el tratamiento de las superficies con compuestos biolgicamente activos pueden inducir alteraciones especficas de la adhesin o el comportamiento celular. Se han descrito mtodos para la reconstitucin de membranas basales con la finalidad de optimizar las condiciones de diferenciacin celular (Reid y Rojkind, 1979). Estos resultados refuerzan la nocin cada vez ms extendida de que las interacciones clula-matriz extracelular son determinantes en la regulacin de la proliferacin y la diferenciacin.

Otros tratamientos que se han usado han sido: gelatina (msculo), poli-D-lisina (algunos teratomas de ratn).

8 "Feeder layers". Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus caractersticas diferenciadas precisan de suplementos especficos. Una manera de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares. Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente por irradiacin X o gamma). Este efecto podra ser debido a dos posibilidades: suplementacin del medio, o modificacin del sustrato. Una de las monocapas ms empleadas son los fibroblastos de ratn 3T3 irradiados.

8 Matrices tridimensionales. Son sustratos en los que las clulas penetran, estableciendo una distribucin tridimensional: geles de colgeno (Douglas y col., 1980), esponja de celulosa sola (Leighton y col., 1951), o recubierta de colgeno (Leighton y col., 1968), o "gelfoam". En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una manera anloga a como lo hacen en el tejido de origen: clulas epiteliales de mama se organizan en disposicin tubular, mientras que las clulas del carcinoma de mama lo hacen de una forma mucho ms desordenada (Yang y col., 1981).

8 Sustratos no adherentes. Son sustratos que no permiten la adhesin celular, por ejemplo agar, agarosa, o methocel (metilcelulosa de alta viscosidad). Son de utilidad en situaciones en las que no conviene que exista dispersin de las clulas derivadas de una originaria, por ejemplo en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus.

8 Interfases lquido-gel o lquido-lquido. Se han observado en algunas situaciones proliferacin celular y adhesin a las interfases lquido-lquido o lquido-gel, a pesar de que se desconocen exactamente los mecanismos (Rosenberg, 1965).

8 Haces microcapilares permeables (hollow fiber). Son cmaras de crecimiento de clulas formadas por un recipiente cilndrico en el que se siembra, y en el interior del cual hay un haz de capilares plsticos permeables adecuados para que las clulas se adhieran. Los capilares se encuentran conectados a un circuito de recambio del medio. Este dispositivo ofrece una gran superficie de crecimiento apta para el crecimiento celular, y un eficaz sistema de recambio del medio.

Tal como se ha descrito previamente, el material ms utilizado como sustrato es el plstico desechable, en forma de diferentes tipos de recipientes. Los ms comunes son:

8 placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaos: 3,5, 6,0 y 10 cm de dimetro son las ms empleadas cuando se trata de crecer las clulas para usar directamente en experimentos. No es recomendable, por su escasa estanqueidad, emplearlas para el mantenimiento de lneas.



8 multiplacas. Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96 pocillos.

8 frascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaos, son recomendables para el mantenimiento de las lneas y la produccin de clulas, o bien para el crecimiento de clulas en suspensin.

8 "roller bottles". Se trata de tubos, con una cara plana sobre la que se fija el cultivo, y que se incuban en los incubadores dotados de "roller". Existen variantes con una gran superficie de adhesin (espirales de plstico...) y que se destinan a la produccin de gran nmero de clulas.

Incubador tipo roller Roller bottles

La fase gaseosa. Los componentes ms significativos de la fase gaseosa son el oxgeno y el dixido de carbono: 8 Oxgeno. Las necesidades de oxgeno para la mayor parte de los cultivos celulares es cubierta con la tensin atmosfrica, aunque existen

cultivos, especialmente los cultivos de rganos que requieren una tensin de oxgeno superior (del 95%) posiblemente debido a la geometra del rgano y a las dificultades de difusin del gas en su interior. Se ha propuesto (McKeehan y col., 1976) que los requerimientos de selenio en el medio podran ser debidos a su papel en la detoxificacin de radicales de oxgeno, especialmente en los medios sin protenas sricas.

8 Dixido de carbono. El dixido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO2 disuelto, el pH y la cantidad de iones HCO3-. Las reacciones que tienen lugar en el medio son:

[1] + ++ 33222 HCOHCOHCOOH



[2] + + 33 HCONaNaHCO

El incremento de la concentracin de in bicarbonato desplaza la ecuacin [1] hacia la izquierda, de modo que el pH se establezca en 7,4. Se puede emplear asimismo otra base, por ejemplo NaOH, siendo la ecuacin:

[3] OHHCONaOHNaHCOCOHNaOH 232332 ++++ +

De modo que para establecer un pH determinado se debe tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato sdico y la tensin de CO2. Cada medio tiene una concentracin recomendada de bicarbonato y tensin de CO2 para alcanzar el pH correcto. Sin embargo, se emplean otras sustancias tamponadoras en la formulacin de muchos medios en la actualidad, lo que permite una estabilidad superior del pH en el medio, as como una mayor capacidad tamponadora (los denominados Good's buffers: HEPES, Tricina,.. (Good et al., 1966)). Aunque aparentemente podra ser posible prescindir del bicarbonato en la formulacin del medio, esto se ha revelado falso, debido probablemente a que la ausencia de bicarbonato sdico desplazara la ecuacin [1] hacia la derecha, de modo que tendera a desaparecer el CO2 disuelto y eventualmente el in bicarbonato, ambos aparentemente necesarios para el crecimiento celular (Itagaki y Kimura, 1974).

Una alternativa es la suplementacin del medio con piruvato. Esto permite a muchos tipos celulares incrementar su produccin de CO2 endgeno, hacindolas independientes de la aportacin de CO2 exgeno.

En resumen, los cultivos crecidos a baja densidad en un recipiente abierto precisan una atmsfera de CO2, cuya concentracin est en equilibrio con el bicarbonato sdico en el medio. A concentraciones celulares muy reducidas (por ej. durante el clonaje) es necesario aadir CO2 en la fase gaseosa de los frascos cerrados. Cuando la concentracin celular es ms elevada puede no ser necesario aadir CO2 a frascos cerrados, pero si en frascos abiertos. En los casos en los que la densidad celular sea elevada, con mucha produccin de cido es recomendable, por la elevada produccin de CO2 endgeno, mantener abierto el recipiente de modo que se pueda eliminar el exceso. En estos casos es especialmente recomendable suplementar el medio con HEPES para asegurar un correcto control del pH del medio.

Propiedades fsicas. Las caractersticas del medio son: pH, osmolaridad, temperatura, viscosidad y tensin superficial. 8 pH y capacidad tamponadora. El pH ptimo de crecimiento para la mayora de tipos celulares es de 7,4 aunque existen pequeas

variaciones: algunas lneas normales de fibroblasto crecen mejor entre pH 7,4 y 7,7 y clulas transformadas lo hacen en el margen de pH de 7,0 a 7,4 (Eagle, 1973), clulas epidrmicas pueden ser mantenidas a pH 5,5 (Eisinger y col., 1979).

El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a pH 7,4, naranja a pH 7,0, amarillo a pH 6,5, azul-rojo a pH 7,6 y prpura a pH 7,8. El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios bruscos de pH. La solucin tamponadora ms empleada sigue siendo el tampn bicarbonato, que equilibra el CO2 atmosfrico, a pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a: su bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el cultivo. HEPES es la solucin tamponadora de eleccin por su elevada capacidad tamponadora en el rango 7,2 a 7,6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mM. Cuando se usa conjuntamente con CO2 externo, debe estar a concentracin doble del bicarbonato para un tamponamiento adecuado (ver figura 3.3).

8 Osmolaridad. Muchas clulas en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo bien en el rango de 260 a 320 mOsm/kg, con pequeas variaciones dependiendo de la especie considerada. Es recomendable emplear medios ligeramente hipotnicos para compensar la evaporacin durante el periodo de incubacin, especialmente en incubadores sin control de la humedad ambiente.

La osmolaridad se controla mediante la determinacin del punto de congelacin o la elevacin de la presin de vapor. Hay que tener en cuenta que la adicin de HEPES, de drogas disueltas en cidos fuertes y la neutralizacin posterior pueden afectar fuertemente a la osmolaridad del medio.

8 Temperatura. La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las clulas, de ah la importancia de un buen control de sta en la incubacin. Influye asimismo en el pH del medio, por lo que se recomienda o bien ajustar el pH del medio 0,2 unidades por debajo del ptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar en la estufa y despus ajustar el pH, antes de aadirlo al cultivo.

8 Viscosidad. La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre el crecimiento. S es importante para evitar el dao celular en la agitacin del cultivo (menor dao a ms viscosidad) y en la tripsinizacin. Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero, aadiendo al medio carboximetil-celulosa o polivinilpirrolidona (Birch y Pitch, 1971).

8 Tensin superficial. La tensin superficial se ha de mantener baja, y en general slo se ve alterada por la aparicin de espumas en los cultivos en suspensin donde se burbujea CO2. En estos casos es recomendable emplear un agente antiespumante de silicona pues en stos casos se produce un aumento de la desnaturalizacin de protenas y se incrementa el riesgo de contaminacin si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo.

Condiciones fisiolgicas. Hacen referencia a la composicin del medio. Ya se indic que la principal dificultad para el establecimiento de las lneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio "natural" como extractos embrionarios, hidrolizados de protena o sueros. Un primer grupo de medios tales como el medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, 1955, 1959) y el ms complejo 199 de Morgan y col. (Morgan y col., 1950) o CMRL 1066 de Parker y col. (1950) eran medios definidos pero que precisaban de un suplemento de suero entre el 5 y el 20%.

A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios ms complejos como NCTC 109 (Evans y col, 1956), 135 (Evans y Bryant, 1965), MB572/1 (Waymouth, 1959), Ham F10 y F12 (Ham, 1963, 1965), serie de los MCDB (Ham y McKeehan, 1978) y los medios de Sato suplementados con hormonas (Barnes y Sato, 1980).

La aproximacin recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12, suplementado con elevada concentracin de suero (20%) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir. Despus de aos de investigacin en la composicin de los medios la eleccin de stos sigue siendo emprica.

Los principales medios empleados y sus aplicaciones son:

8 Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con slo los aminocidos esenciales. Se necesita siempre la suplementacin con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratn y clulas HeLa.



8 Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso ms corriente, contiene ms aminocidos y en mayor concentracin que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adicin de suero (10%).

8 RPMI 1640. Medio diseado para el crecimiento de linfoblastos y lneas celulares leucmicas en suspensin. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados.

8 Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentracin de aminocidos y vitaminas que el BME. Se usa para la seleccin de hibridomas suplementado con HAT o HT.

8 Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulacin albmina bovina, transferrina, selenito, et... Es muy til para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. Tambin sirve para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones.

8 McCoy 5A. Medio diseado para el crecimiento para el crecimiento de lneas celulares diploides tanto de rata como humanas. 8 Medio L-15 de Leibovitz. Utilizado para el cultivo de virus. 8 Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de lneas celulares humanas, debe ser suplementado con protenas y hormonas. Contiene metales

como Fe, Cu, Zn. Es til para el cultivo de clulas amniticas.

8 Medio F-12 de Ham. til para el crecimiento de lneas celulares son suplementos protenicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero.

8 Medio 199. Muy usado para el cultivo de clulas no diferenciadas y estudio de cromosomopatas. Todo medio de cultivo est formado por los siguientes elementos:

8 Soluciones salinas equilibradas (BSS). Una solucin salina equilibrada es una mezcla de sales inorgnicas, incluyendo usualmente bicarbonato sdico, y suplementada con glucosa. Se usan para diluir medios ms completos, como medio de diseccin o lavado, o para incubaciones cortas que requieren un medio isotnico no completo nutricionalmente. Su eleccin depender de:

9 la tensin de CO2. La concentracin de bicarbonato deber permitir el equilibrio a pH 7,54 a 36,5C. As BSS-Eagle es ms usada para 5% CO2 y BSS-Hank (HBSS) es usado a la tensin atmosfrica normal.

9 su uso en la disgregacin de tejidos o monocapas. En ese caso debern carecer de Ca2+ y Mg2+. Son recomendables los medios de Moscona, CMF, o PBS de Dulbeco o Vogt (PBSA).

9 su uso para el cultivo en suspensin o de clulas en monocapa. Es recomendable el uso de MEM(S), variante de MEM sin Ca2+ que reduce la agregacin celular y la adherencia.

Debido a su escasa capacidad tamponadora se recomienda suplementarlo con HEPES para pH en el rango 7,2 a 7,8 y Tricina en el rango 7,4 a 8,0.

8 Aminocidos. Es necesario suplementar el medio basal con los aminocidos esenciales. Asimismo se suplementa con otros aminocidos, pues los requerimientos pueden variar de una clula a otra. Un suplemento comn es el de glutamina, a 2 mM final, aunque hay algunas lneas celulares pueden usar el glutamato. La glutamina es inestable en el medio, y se recomienda aadirla a partir de un stock concentrado (100) que se mantiene congelado, no ms de 1 semana antes de aadir el medio al cultivo (conservando a 4C).

8 Vitaminas. El medio MEM slo suplementa con vitaminas del grupo B, siendo los dems grupos aportado por el suplemento de suero. En medios ms definidos se suplementan todas las vitaminas. La limitacin de vitaminas se manifiesta en la supervivencia de las clulas y en la reduccin de la tasa de crecimiento ms que en la densidad celular.

8 Glucosa. Es la fuente de energa en muchos medios. Metabolizada preferentemente va gluclisis hacia piruvato que puede ser convertido en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs, y genera CO2. La acumulacin de cido lctico en el medio propio de clulas embrionarias y transformadas parece indicar un funcionamiento diferente del ciclo de Krebs en estas clulas respecto al modelo in vivo. En estos casos la mayor parte del CO2 parece proceder de un uso de la glutamina/glutamato.

8 Otros suplementos orgnicos de bajo peso molecular. Dependiendo del medio, ste incluye en su formulacin nuclesidos, intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato, lpidos,... La adicin de piruvato en el medio permite al cultivo incrementar su produccin endgena de CO2 hacindole independiente de la aportacin exgena de ste. El medio de Leibovitz L15 contiene una concentracin superior de piruvato y no contiene bicarbonato sdico, y no requiere aporte de CO2 en la fase gas.

8 Hormonas y factores de crecimiento (suero). En los medios no definidos suele aportarlos el suero. Los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de caballo ("horse serum", HS) y suero humano ("human serum", HuS). El ms usado es el suero de ternera, mientras que el suero bovino fetal es usado en lneas ms exigentes, y el suero humano en lneas humanas. La utilizacin de suero es problemtica pues:

9 a pesar de que la composicin del suero es conocida, existen gran cantidad de componentes presentes en cantidades variables en ste que pueden influir notablemente en el cultivo (hormonas, factores de crecimiento...)

9 el suero vara de lote a lote, y cada uno se puede emplear como mximo 1 ao, probablemente deteriorndose a lo largo de ese tiempo, a pesar del almacenamiento a baja temperatura.

9 cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de controles tediosos y costosos. 9 si se cultivan varios tipos celulares cada uno puede requerir un lote diferente, lo que complica el almacenamiento e incrementa los

costes.

9 crea una dependencia importante de un suministro que no siempre puede mantenerse con la periodicidad y calidad requerida. 9 si se han de purificar productos del medio de cultivo la presencia de los componentes del suero dificulta notablemente estos procesos. 9 el suero est contaminado con desgraciadamente demasiada frecuencia por virus y micoplasmas, lo que representa un grave peligro

para el cultivo.

9 algunos factores sricos como el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) estimula la proliferacin de fibroblastos, lo que puede ser un problema en el establecimiento de cultivos primarios especializados.



En conjunto supone un gran inconveniente para la estandarizacin de protocolos experimentales y de produccin. Por ello se realizan importantes esfuerzos para la definicin de medios definidos para el crecimiento celular. Esto, adems de la reproducibilidad buscada, permite establecer medios selectivos en los que crezca el tipo celular deseado. Tienen como desventaja la gran cantidad de esfuerzo necesario para su definicin, as como que en muchos casos el crecimiento de las clulas en estos medios es menor, las lneas finitas permanecen viables menos generaciones, as como el hecho probable de que la adaptacin del cultivo al medio libre de suero supone un tipo de seleccin per se.

Para conseguir reemplazar el suero completamente de un medio ser necesario reemplazar:

9 los factores de adhesin como la fibronectina. Clulas crecidas en medios libres de suero requieren el suplemento de fibronectina (25-50 g/mL) o laminina (1-5 g/mL) en el medio, o bien el tratamiento de las placas con poli-lisina (1 mg/mL) antes de la siembra.

9 inhibidores de proteasas. Despus de la tripsinizacin de un cultivo el exceso de actividad trptica se inhibe por la adicin de suero al medio. En ausencia de ste deben usarse inhibidores de proteasas como el inhibidor de tripsina de soja.

9 hormonas. El complemento hormonal depender especialmente del tipo celular, tales como hormona de crecimiento, T3, hidrocortisona, dexametasona, FSH, ...

9 factores de crecimiento peptdico. En la actualidad se han identificado algunos polipptidos de actividad mitognica: FGF ("Fibroblast Growth Factor"), EGF ("Epidermal Growth Factor"), PDGF ("Platelet Derived Growth Factor") y MSA, y con un rango amplio de actividad. Asimismo se han aislado otros factores con mayor especificidad de accin.

9 nutrientes: Fe, Cu, Se, y otros minerales, a pesar de que los fundamentos de su funcin son desconocidos en muchos casos. 9 protenas y poliaminas. La inclusin de albmina bovina aade indefinicin al medio, por ello se recomienda el uso de BSA libre de

cidos grasos (usualmente a 1-10 mg/mL). Transferrina (10 ng/mL) se requiere como portador de Fe, y se cree que puede tener actividad mitognica. Putrescina se usa a alrededor de 100 nM.

A fin de reemplazar el suero se han desarrollado una serie de sustitutos comerciales como son SerXtend (NEN), Ventrex (Ventrex Lab Ltd.), Nu-serum (Collaborative Res.), ...

8 Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibiticos y antifngicos). A fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo se suele suplementar ste con sustancias antibiticas de diferente espectro de accin. La adicin de antibiticos ha de ser estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo.

Es importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o ms antibiticos. Las mezclas de uso ms comn son:

9 Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 g/mL). Combinacin anti-microbiana. 9 Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 g/mL) / Fungizona. Combinacin anti-microbiana y anti-fngica. 9 Gentamicina (50 g/mL). Anti-microbiana, conviene ir alternndola con la penicilina-estreptomicina. 9 Anfotericina-B (2,5 g/mL). Antifngico y antilevaduras. Se han observado algunos efectos secundarios sobre el crecimiento de clulas

de mdula sea humana en cultivo.



Las contaminaciones. Uno de los problemas ms frecuentes en el cultivo de tejidos en general es el de las contaminaciones. Las clulas eucariotas en cultivo crecen lentamente, con tiempos de duplicacin superiores en muchos casos a las 24 h. Sin embargo, tanto las bacterias como las levaduras tienen una tasa de crecimiento superior. Si se da el caso de una contaminacin por estos organismos pueden provocar la muerte del cultivo en poco tiempo. Para evitarlo se utilizan una serie de tcnicas de trabajo que suponen la mxima asepsia, as como la esterilizacin del material y el trabajo en ambientes estriles (cabina de flujo laminar). Asimismo se utilizan ccteles de sustancias antimicrobianas y antifngicas en el medio aunque en multitud de ocasiones no es posible usarlas o bien no son suficientes para prevenir la aparicin de microorganismos.

Los tipos de contaminaciones ms frecuentes son por bacterias, por hongos y levaduras, por micoplasmas y por virus:

Contaminacin bacteriana y por levaduras. Los medios de cultivo proporcionan un medio ideal para el crecimiento de los contaminantes microbianos, y los procedimientos habituales de manipulacin (abertura de recipientes, pipeteado,...) son susceptibles de provocar contaminacin por bacterias. Los antibiticos, aadidos en los cultivos a corto plazo de forma habitual no son recomendables en los cultivos a largo plazo. Para evitar las contaminaciones por bacterias es necesario extremar las condiciones de esterilidad y realizar una serie de controles sobre las soluciones y recipientes a usar. As es recomendable comprobar el estado de contaminacin de cualquier tipo celular antes de introducirlo en las salas donde se trabaja con otros tipos celulares...

Los controles de esterilidad estn diseados para detectar no aquellos contaminantes de crecimiento rpido y que producen cambios notables en el medio de cultivo pues estos se detectan fcilmente incubando alcuotas de medio en la estufa durante 24 o 48 h, sino aquellos otros de crecimiento lento y que no se producen cambios apreciables en el cultivo. No existe un test nico capaz de detectar todos los contaminantes.

La fuente ms frecuente de contaminacin es la atmsfera. Las precauciones a tomar sern:

8 trabajo en ambiente estril, en una cabina de flujo laminar o en el rea de influencia de un mechero bunsen. 8 usar pipeteadores automticos y pipetas automticas. Si no se dispone de estos nunca pipetear directamente con la boca sino mediante un

tubo de goma y intercalando algodn en la boca de la pipeta.

8 mantener los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible. 8 todas las botellas de medio y de soluciones atemperadas en un bao deben secarse cuidadosamente antes de usarlas. 8 ante cualquier duda limpiar con alcohol 70% o flamear el material que pueda estar contaminado si no es reemplazable, o reemplazarlo si es

posible.

8 si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Si se han de tomar muestras para su anlisis conviene hacerlo en ambiente estril y despus limpiar cuidadosamente el rea de trabajo y conectar la iluminacin UV.

De todas formas no es fcil reducir a una lista las precauciones a tomar y la nica forma de aprender es practicar bajo supervisin.

Contaminacin por micoplasmas. Los micoplasmas son clulas procariotas pequeas (0,3 a 0,5 m de dimetro) que pueden formar pequeas colonias similares a las que forma el agente productor de la pleuroneumona bovina (de ah su nombre de "pleuropneumonia-like organisms", PPLO). No poseen pared celular y por ello slo son capaces de crecer en ciertos medios. Existen varios grupos serolgicos de micoplasmas de dos gneros (Mycoplasma y Acholeplasma). Los contaminantes responsables de las infecciones de los cultivos celulares proceden mayoritariamente de 4 especies: M.orale (humano), M.hyorhinis (cerdo), M.arginini (bovino) y A.laidlawii (bovino y tambin de roedores).

Los cultivos primarios suelen estar libres de micoplasmas, pero muchas de las lneas celulares continuas estn infectadas. La contaminacin suele proceder de suero animal contaminado con A.laidlawii y M.arginini o de la tripsina de cerdo contaminada con M.hyorhinis. A pesar de que M.hominis, M.pharyngis y M.salivarum se pueden aislar de la boca y la garganta humana, la mayor fuente de contaminacin procede del uso de cultivos contaminados. Se citan datos de que alrededor del 50 al 95% de las clulas utilizadas actualmente estn contaminadas con micoplasmas.

Dado que la contaminacin con micoplasmas no es tan evidente como la contaminacin por bacterias o levaduras es importante por una parte tener en cuenta el posible efecto de los micoplasmas sobre el cultivo, y realizar controles peridicos de su presencia.

Los efectos dependen de la especie implicada. As las especies M.gallisepticum y M.mycoides son patgenos pero son poco frecuentes. Otras especies no producen la muerte celular pero retardan el crecimiento celular. As por ejemplo M.hominis parece retardar el crecimiento del cultivo pues consume toda la arginina presente debido a su elevada actividad arginina deaminasa, mientras que A.laidlawii destruye rpidamente los desoxirribonucletidos, y en un cultivo infectado es realmente difcil realizar medidas de incorporacin de timidina tritiada pues sta es rpidamente convertida a timina.

Los requerimientos de los micoplasmas son complejos y slo crecen en medios donde hay clulas en crecimiento. Parece que requieren los productos de degradacin de ADN celular, pues los nuclesidos son factores de crecimiento esencial para los micoplasmas.

Una observacin cuidadosa de las clulas en cultivo puede dar un primer aviso de la presencia de micoplasmas: aparicin de grnulos oscuros en el citoplasma. A continuacin se detallan algunas de las tcnicas usadas en la actualidad para la deteccin de los micoplasmas:

8 Tincin con orcena (Fogh y Fogh, 1968). 9 sembrar las clulas sobre cubreobjetos de modo que no hayan alcanzado la confluencia en 24 h. 9 sumergir el cubreobjetos en una placa de Petri con 3 mL de citrato sdico 0,6% y aadir lentamente 1 mL de agua. Dejar 10 min y

aadir lentamente 4 mL de fijador de Carnoy (1:3 actico:etanol). Sacar todo el lquido y reemplazar por 2 mL de fijador de Carnoy.

9 dejar fijar durante 10 min. Dejar secar. 9 teir 10 min con orcena, y lavar 3 veces con etanol absoluto. 9 montar en DPX, observar con el microscopio de contraste de fase. Las clulas contaminadas muestran los micoplasmas

preferentemente en el borde celular y en los espacios intracelulares.

8 Autoradiografa de cultivos incubados con timidina tritiada. Un cultivo contaminado muestra seal autoradiogrfica fuera del ncleo por efecto de la degradacin de la timidina a timina propia de muchos micoplasmas.



8 Tincin fluorescente con Hoechst 33258, 33217 o DAPI. Esta tcnica detecta el DNA de los micoplasmas pues el colorante (Hoechst 33258 o 33532, o el DAPI) se une especficamente al DNA. Se emplea la misma tcnica de tincin que para la tincin nuclear.

Cultivo negativo a micoplasmas (ATCC) Cultivo positivo a micoplasmas (ATCC)

8 Test de crecimiento para micoplasmas. El efecto letal de la contaminacin por micoplasmas sobre el cultivo puede acentuarse mediante la adicin al medio de 6-metilpurina desoxirribonuclesido (6-MPDR). Todos los micoplasmas presentan gran actividad del enzima adenosina fosforilasa, capaz de convertir 6-MPDR (no txico) en 6-metil purina y 6 metil-purina ribonuclesido, ambos txicos para las clulas de mamfero (McGarrity y Carson, 1982).

Existen sistemas de cultivo de micoplasmas de gran sensibilidad que permiten detectar la presencia de pequeas cantidades de contaminante. Es el caso del Mtodo directo de cultivo que propone ATCC en su servicio de deteccin de micoplasmas. Este cultivo sin embargo tiene como gran limitacin los 28 das que precisa.

8 Sonda DNA para micoplasma. Es una sonda de DNA tritiada capaz de reconocer el RNA ribosomal de micoplasma en cultivos celulares. Es muy sensible, pero an cuesta 10 veces ms que el ensayo de Hoechst. Supone obtener un lisado celular al que se aade la sonda de DNA, se hibrida a 72C durante 1 h, se precipita y se lava el hbrido DNA/RNA y se cuenta la cantidad de radiactividad retenida.

8 Deteccin de micoplasmas mediante PCR. Se han propuesto diversos mtodos para la deteccin de micoplasmas mediante PCR, y se han comercializado kits, como el producido por la ATCC que permite detectar 5 especies de micoplasmas responsables del 95% de las contaminaciones. En el laboratorio se emplea un mtodo de deteccin mediante PCR que se basa en el descrito por Wong-Lee y Lovett (1998). Empleando una sola pareja de cebadores correspondientes al RNA 16s de 8 especies de micoplasma (M.hyorhinis, M.arginini, M.pneumoniae, M.fermentans, M.orale, M.pirum, Acholeplasma laidlawii y Spiroplasma mirum).

Protocolo:

9 Secuencias de los cebadores: Mico1: GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG Mico2 : CGG ATA ACG CTT GCG AC TAT G

9 Concentracin de trabajo de los cebadores 10 pmol/L Condiciones9 de PCR: 95C 1 min, (95C 1 min, 55C 1

9 min, 72C 1,30 min) 35 ciclos, 4C mantenido

Tamao esperado 0,5 kb



Para la eliminacin de los micoplasmas, en general se recomienda, si el cultivo es reemplazable, eliminarlo, esterilizar todo y volver a

antibiticos. Se ha descrito que la kanamicina (0,1 mg/mL) previene el crecimiento del micoplasma (Fogh y Hacker, 1960), as

8 ltivo con sueros anti-micoplasmas se ha revelado como efectivo, pero costoso. l de

C realmente difcil. Desde que se

ueden tener un efecto citoptico marcado, pero los ms peligrosos son aquellos que crecen a baja tasa o en unas pocas clulas tan

empezar. Slo cuando el cultivo es irreemplazable o importante se recomienda proceder a su eliminacin en el cultivo. Para ello hay varias posibilidades:

8 Tratamientoscomo la tylocina (6,0 g/mL). Asimismo son efectivos contra micoplasmas las quinolonas, como ciprofloxacina (Schmitt y col., 1988), y MRA. Las quinolonas inhiben la DNA girasa procariota.

Tratamientos con sueros inmunes. El tratamiento del cu

8 Pase por un animal. En el caso de cultivos de lneas tumorales se ha revelado como especialmente til la inoculacin a un animaexperimentacin y la recuperacin posterior. El sistema inmune del animal limpia el cultivo de micoplasmas.

ontaminacin por virus. La contaminacin viral es un problema grave pues su prevencin y eliminacin esdescubri que el suero bovino poda ser una fuente importante de contaminacin por diferentes virus (herpesvirus y virus parainfluenza-3) los sueros son controlados rutinariamente, aunque la validez de estos ensayos es limitada. Por ello la nica alternativa es el uso de medios libres de suero.

Los virus pslo. As, en clulas de individuos con linfoma de Burkitt, producido por EBV (Epstein-Barr virus), no muestran seales de EBV en cultivo hasta varios pases, cuando solo unas pocas clulas muestran inmunofluorecencia positiva (Henle y Henle, 1966). La manera ms eficaz de detectar la infeccin por virus es infectar un animal sensible y seguir la aparicin de efectos citopticos.



Tcnicas de contaje celular Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas microscpicas dispersas en un fluido. Habitualmente ser necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la suspensin como el porcentaje de stas que son viables.

Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la relativamente simple cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la cmara de Neubauer, hasta equipos automticos de contaje celular como el "Cell Coulter".

El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia elctrica que se producen cuando una partcula no conductora en suspensin en un electrolito atraviesa un pequeo orificio. Una pequea abertura entre los electrodos es la zona sensible a travs de la que pasan las partculas que se encuentran en suspensin. Cuando una partcula atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partcula. Controlando la cantidad de la suspensin que circula a travs del orificio es posible contar y medir el tamao de las partculas. Es posible contar y medir varios miles de partculas por segundo, independientemente de su forma, color y densidad.

Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando mtodos ms sencillos. Nos basta con una cmara de contaje celular, por ej. la cmara de Neubauer, y un microscopio. Una cmara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensin a medir. El dispositivo presenta unas seales que determinan un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el nmero de partculas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de partculas en la suspensin de origen.

La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0,25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0,1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0,1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0,1 milmetro cbico, es decir 0,1 microlitro.

Si contamos las cuatro reas sombreadas (L) observando un total de x clulas entre las cuatro reas, la concentracin en la suspensin celular ser:

Concentracin en la suspensin (clulas/mL) = 4x

000. 10

En la imagen se puede observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrcula de 16 pequeos cuadrados de 0,25 milmetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.

Existen numerosos modelos de cmaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopa. En la imagen se puede observar una cmara de Neubauer doble:



Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes mtodos. El ms comn es el de tincin con azul tripn. El azul tripn es un coloide que se introduce en el interior de las clulas que presentan roturas en la membrana. As pues las clulas que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar clulas blancas, por exclusin, a clulas viables es un error pues por este mtodo se sobrevalora la viabilidad de las clulas en la suspensin, determinando como inviables slo aquellas con la membrana rota. En la imagen se han representado clulas vivas como puntos blancos y clulas muertas (teidas con azul tripn) como puntos azules. Corresponde a una de las reas de contaje de la cmara de Neubauer (1 mm2).

Existen otros mtodos de determinacin de la viabilidad celular como el ms preciso de la tincin con ioduro de propidio.



Mtodos de disgregacin de clulas en placa La disociacin tisular y el subcultivo celular representan dos aplicaciones en las que es necesario separar las clulas entre s y de un sustrato manteniendo la viabilidad celular. Para conseguirlo es necesario romper la malla de protenas que forman la matriz extracelular que las mantiene unidas mediante procesos que separen las molculas proteicas de la matriz extracelular (por ej. secuestrando los iones calcio que permiten la unin), o bien rompiendo proteolticamente (mediante la accin de proteasas) las mismas protenas.

Generalmente los mtodos empleados se pueden clasificar en tres categoras:

Mecnicos (por ejemplo cortar, picar, cribar, rascar, etc...). En cultivos celulares se emplean con frecuencia los mtodos de rascado (scrapping) de la placa para arrancar las clulas adheridas.

Qumicos. Generalmente se trata de la adicin de soluciones en las que no hay iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. En cualquier caso se reduce la concentracin de los iones que estabilizan las uniones de las protenas de la matriz extracelular y de stas con los receptores celulares.

Enzimticos. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de proteasas activas (colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, papana, pronasa, hialuronidasa, etc...)

Sin embargo en la prctica se suelen emplear tcnicas que combinan dos o tres mtodos. La eleccin de uno u otro procedimiento depender fundamentalmente de la naturaleza y cantidad de tejido o cultivo disponible y del uso previsto de las clulas obtenidas. A continuacin se muestra una clasificacin de mtodos de disgregacin celular clasificados segn una severidad creciente:

Agitacin (sacudidas a la placa). Se separan las clulas que estn en mitosis y las adheridas ligeramente.

Tripsina (0,01-0,5%) en PBS, 5 a 15 min, 37C. La mayora de las lneas celulares. Prelavado con PBS, Tripsina 0,25% en PBS, 37C. Algunas lneas celulares que se adhieren fuertemente, y muchas

lneas celulares a pases bajos.

Prelavado con EDTA 1mM, Tripsina 0,25 % en PBS, 37C. Algunas clulas en pases bajos fuertemente adheridas. Dos lavados con EDTA 1mM, dejando en EDTA 1 mM, 1 mL/5 cm2 Clulas epiteliales, aunque algunas pueden ser sensibles a EDTA Prelavado con EDTA, Tripsina 0,25% con EDTA Clulas fuertemente adheridas, especialmente epiteliales y algunas

tumorales. Hay que tener presente la posible toxicidad del EDTA.

Prelavado con EDTA 1mM, Tripsina 0,25% y colagenasa 200 U/mL en PBS o EDTA/PBS

Cultivos gruesos formados por mltiples capas de clulas, especialmente en cultivos productores de colgeno.

Rascar (scrapping) Todos los cultivos, aunque puede producir dao mecnico y usualmente no produce una buena suspensin celular.

Aadir dispasa (0,1-1 mg/mL) o pronasa (0,1-1 mg/mL) al medio hasta que las clulas desadhieran.

Suspender la mayor parte de las clulas, pero requiere la centrifugacin de la suspensin para eliminar el enzima no inactivado por el suero. Puede ser daino para algunas clulas.



El laboratorio de cultivo celular. La caracterstica principal que define al laboratorio de cultivo celular es el mantenimiento de la asepsia. La tasa de crecimiento de las clulas en cultivo es muy inferior al de los contaminantes habituales: hongos, levaduras, bacterias y micoplasmas, y por ello para el mantenimiento del cultivo ser vital evitar la aparicin en ste de cualquier microorganismo indeseado.

El rea de trabajo para realizar cultivos debe instalarse en una parte del laboratorio tranquila, alejada de las vas de paso y a ser posible dedicada exclusivamente al cultivo de clulas. La solucin ideal es disponer de una habitacin aislada.

Las aparicin de cabinas de flujo laminar redujo las necesidades de aislamiento del rea de trabajo pero an as es recomendable mantener un gradiente de esterilidad, desde el medio exterior o laboratorio general al interior de las cabinas de flujo donde se manipularn los cultivos y del incubador donde se mantendrn.

Las necesidades de asepsia dependen del tipo de material que se va a procesar en el laboratorio. Esto define dos tipos de contencin y de rea de trabajo diferentes:

el laboratorio de cultivo de tejidos general, para la manipulacin de cultivos no patgenos se instalar preferentemente en una sala aislada y a la cual se le suministrar aire filtrado (normalmente mediante un equipo de filtracin y regulador de la temperatura). Esto produce un aumento de presin atmosfrica en el interior del laboratorio (tpicamente entre 15 y 20 mm de Hg) que impide la entrada de aire no filtrado al rea limpia.

el laboratorio de cultivo con patgenos supone un nivel de contencin superior. A fin de evitar la salida accidental de stos agentes se filtra el aire que sale de la sala, generando un dficit de presin en el interior de sta. El aire sale siempre estril.

En el laboratorio de cultivo celular propiamente dicho se encuentran los siguientes tipos de instrumentos:

Las cabinas de flujo laminar. Su funcin es la de mantener un rea libre de partculas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante un dispositivo mecnico que fuerza el paso del aire a travs de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del 99.999% retiene las partculas por debajo de un cierto calibre que es en general de 0,2m. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas partculas contaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del aire, como por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de intensas corrientes de conveccin.

Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se disean con diferentes propsitos:

8 Proteccin personal: proteccin del personal de los posibles agentes dainos del interior de la cabina. 8 Proteccin del producto, experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes exteriores o de la

contaminacin cruzada con otros productos o cultivos situados en la misma cabina.

8 Proteccin medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos o agentes contaminantes. Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena proteccin del producto, pero no son adecuadas para el trabajo con materiales peligrosos o con algn tipo de riesgo pues el operador queda completamente expuesto. En las cabinas de flujo vertical, ms sofisticadas, se segura una buena proteccin del producto, y, dependiendo de su diseo se puede asegurar una proteccin total del operador. Son por ello ms adecuadas para el trabajo con agentes peligrosos.

Cabina de flujo laminar horizontal Cabina de flujo laminar vertical

Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos factores en el diseo de la cabina se trata de cabinas de clase I, II o III.

8 Cabina de clase I. Se trata de una unidad de contencin parcial adecuada para la manipulacin de agentes de bajo riesgo, donde existe una necesidad de proteccin del operario y del medio pero no del producto. Este es el tipo de cabinas normalmente denominadas "de gases", y no son de uso comn en el laboratorio de cultivo de tejidos.



8 Cabina de clase II. Este tipo de cabinas protegen el producto, al personal y al medio ambiente. En general las cabinas de clase II se describen como un equipo de proteccin con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar estable en el interior, con una filtracin HEPA para el aire recircularizado en cada ciclo y una filtracin HEPA del aire exhausto (de salida al medio). Los sucesivos diseos que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases:

9 Tipo A. En este tipo el 30% del aire es eliminado en cada ciclo y el 70% es recircularizado. El escape al medio de los agentes potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal.

9 Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general y en ella se recirculariza slo el 30% del aire en cada ciclo, eliminndose el 70% del aire restante.

9 Tipo 100% exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100% del aire de cada ciclo es eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posibles agentes peligrosos. Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios de toxicologa en los que se requieren reas de contencin limpias y eliminacin del aire posiblemente contaminado.

Las diferencias entre estos tres subtipos se refieren especialmente a la proteccin del usuario, superior en el caso del tipo A, y a la eliminacin de la cabina de posibles contaminaciones de tipo aerosol, no retenibles por el filtro HEPA. La tipo A, que es la ms adecuada para el trabajo con agentes patgenos particulados (filtrables) es la menos adecuada para el trabajo con vapores o aerosoles peligrosos.

Asimismo se ha de tener en cuenta que el funcionamiento correcto para la proteccin del producto y del personal depende de una correcta calibracin del instrumento, especialmente de las velocidades respectivas de entrada de aire en el sistema y de flujo vertical. El punto de calibracin o ajuste es dependiente del instrumento y debe ser realizado por personal especializado cada 6 a 9 meses de funcionamiento para asegurar la proteccin al usuario.

8 Cabina de clase III. Se trata de una cabina de seguridad, estanca, para el trabajo con agentes biolgicos de alto riesgo. Permite mantener al agente patgeno en un ambiente completamente estanco. Permiten controlar tanto los contaminantes particulados como aerosoles y contaminantes gaseosos mediante sistemas de filtracin y disolucin de stos.



Incubadores. Se trata de equipos comunes a la mayor parte de los laboratorios de biologa (estufas, baos termostatizados,...) con la excepcin del incubador de CO2, y del incubador con "roller". Las clulas en cultivo son capaces de soportar sin daos importantes variaciones de temperatura, siempre que sean por debajo de la temperatura corporal del animal del que proceden. As pues las clulas humanas soportan incubaciones a 4C durante das y pueden ser congeladas a -196C durante aos (con sustancias preservantes). Sin embargo no sobreviven ms de unas pocas horas a variaciones de 2C por encima de 37C. Las clulas procedentes de animales poiquilotermos soportan mejor un amplio rango de temperaturas de incubacin.

Las clulas de homeotermo suelen crecer bien entre 33C y 37C, pero en ese margen presentan importantes variaciones en su tasa de crecimiento. En un incubador de clulas es por tanto ms importante la consistencia de la temperatura (invariabilidad durante prolongados periodos de tiempo, con oscilaciones inferiores a 0,5C) que su precisin a fin de mantener a las clulas en condiciones en las que las tasas de crecimiento sean constantes. Por ello se deben usar incubadores con movimiento de aire forzado en el interior, y colocar los contenedores de clulas sobre estanteras agujereadas y nunca sobre el fondo o las paredes del incubador.

Las necesidades de asepsia en el incubador son considerablemente menores que en el rea de trabajo (cabina de flujo laminar) pero sin embargo es muy recomendable mantener una estricta limpieza, desinfeccin peridica del incubador, y especialmente no introducir, o eliminarlos inmediatamente, cultivos contaminados en el incubador.

Para determinar el nmero y tipo de los incubadores requeridos se tendr en cuenta:

9 el tipo de cultivos a realizar: primarios o de lneas celulares estables. Es conveniente no cultivar en el mismo incubador cultivos primarios con lneas celulares estables, pues los primeros son una importante fuente de contaminacin.

9 la especie y el tipo de clulas a cultivar. Es importante la determinacin exacta de la temperatura de incubacin para la que se tendr en cuenta la temperatura corporal del animal del que proceden las clulas, as como cualquier variacin regional de temperatura (la piel suele tener una temperatura inferior). Algunos autores sugieren incorporar asimismo un factor de seguridad a la temperatura de incubacin. Por ejemplo para la incubacin de clulas humanas sugieren el cultivo a 36.5 C, cercano al valor de la temperatura corporal pero un poco inferior para mayor seguridad. Esto es en la actualidad innecesario en los incubadores modernos, capaces de regular la temperatura de incubacin con gran precisin. As pues sern necesarios tantos incubadores como diferentes temperaturas de incubacin se precisen.

Incubador de CO2. El mantenimiento de la temperatura en una atmsfera con una tensin controlada de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de CO2. Un incubador moderno dispone de:

8 dispositivos de control de temperatura, con un termostato de seguridad que desconecta la funcin en caso de anomala. La estabilidad de la temperatura es una caracterstica esencial del incubador, y por ello suelen estar equipados con camisas de agua ('water jacketed') que incrementan notablemente la inercia trmica. Como consecuencia la estabilizacin de un incubador puede tardar varios das.

8 dispositivo de inyeccin de una mezcla de aire y CO2, en la proporcin deseada, entre el 4 y el 7%. El CO2 de elevada pureza se suministra en botellas presurizadas, y se mezcla en el dispositivo de inyeccin. El control de la mezcla se realiza fundamentalmente mediante un dispositivo IRGA ("infra-red gas analyzer"). En incubadores modernos este dispositivo analiza constantemente el porcentaje de CO2 presente en la cmara de incubacin, y realiza las correcciones necesarias. Un problema usual del dispositivo de medida de CO2 es la prdida de calibracin que se produce peridicamente. Para evitarlo algunos fabricantes dotan al sistema de un mecanismo de autocalibracin peridica (basado en la toma de una muestra de aire exterior que se considera tiene un valor determinado de CO2).

8 dispositivo de control de la humedad ambiente. Para mantener el cultivo se requiere una humedad ambiente elevada, a fin de reducir la evaporacin de agua del medio de cultivo. En los incubadores menos sofisticados esto se consigue mediante bandejas de agua en el fondo del incubador. Este recurso es peligroso pues son una fuente importante de contaminaciones al convertirse a los pocos das en caldos de cultivo. En los instrumentos ms modernos se dispone de dispositivos que controlan la humedad atmosfrica, inyectando agua estril y filtrada.

8 dispositivo de recircularizacin de aire. Es importante una recirculacin del aire en el interior del incubador, a fin de homogeneizar la temperatura en su interior. Si adems en el circuito de circulacin de aire se intercala un filtro HEPA se consiguen eliminar las posibles partculas contaminantes, y se asegura la esterilidad del ambiente.



Las condiciones del cultivo (temperatura, humedad atmosfrica y niveles de CO2) son caractersticas de cada lnea celular. El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al 5%.

Incubadores tipo "roller". Se trata de un incubador o estufa, en el interior del cual se ha instalado un "rotor" de baja velocidad. Se utiliza para mantener cultivos en botellas cerradas (no requieren CO2). La finalidad es disponer de una gran superficie para la adhesin de las clulas. En estos instrumentos se incuban las clulas en el interior de roller bottles, botellas con una gran superficie de crecimiento.

Incubador tipo roller Roller bottles

Instrumentos pticos de observacin: microscopio de contraste de fases invertido. El control morfolgico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. El hecho de que las muestras a observar se encuentren en recipientes de un cierto grosor (ms de 3 cm en el caso de frascos de Roux de 250 mL) hace que un microscopio convencional no sea adecuado (por su pequea distancia frontal), por lo que se han desarrollado microscopios de diseo original, en los cuales la fuente de iluminacin y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio ptico convencional.

La segunda caracterstica que condiciona el instrumento ptico es su ausencia de color, es decir se trata de muestras vivas y con poco contraste. El microscopio se equipa con el dispositivo de contraste de fases (diafragmas anulares a nivel del condensador y placa de fases entre las lentes del objetivo). De esta forma el contraste de la imagen aumenta y la calidad obtenida es muy superior.



Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captacin de imgenes, fotogrfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos.

Congeladores e instalacin de criogenia (depsito de N2 lquido). Es recomendable que los congeladores y la instalacin de criogenia estn en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio.

Es preciso el almacenamiento de soluciones y clulas a diferentes temperaturas, para lo que se requiere:

8 neveras (4C) para el almacenamiento de medios, PBS, ... 8 congeladores de -20C para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibiticos) y soluciones enzimticas (tripsina,

colagenasa,...).

8 congeladores de -80C para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibiticos,...) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitgenos, inductores,...).

8 unidad de almacenamiento en nitrgeno lquido (-196C), para el almacenamiento de las lneas celulares.

Equipo de esterilizacin: autoclave y equipo de filtracin. La necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se extiende no slo al

medio en que se realiza el trabajo sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza el cultivo, a los medios lquidos o slidos, y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con ste en algn momento de su manipulacin (pipetas, puntas de pipeta automtica, pinzas, tubos, material variado de vidrio...). Para esterilizar todo este material, de variada naturaleza se emplean una serie de mtodos: irradiacin con radiacin gamma o rayos X, esterilizacin por gas, autoclavado, filtracin,... En el laboratorio general de cultivo de tejidos se suele disponer de: equipo de filtracin y autoclave. La esterilizacin por gas, y la irradiacin son tcnicas propias de grandes instalaciones, por ejemplo hospitalarias o industriales.

8 Equipos de filtracin. En la actualidad se dispone de unidades de filtracin estril muy recomendables para el trabajo rutinario. Sin embargo, su elevado coste por unidad hace que en muchos casos an se empleen unidades reutilizables. Estos equipos de filtracin constan o bien de una fuente de vaco conectada a un kitasato dotado de una unidad de filtracin esterilizada por autoclavado, o bien de una bomba peristltica que fuerza el flujo de solucin a travs de una unidad de filtracin hermtica. En ambos casos la esterilizacin se produce al atravesar la solucin un filtro de poro 0.22 m.



8 Autoclave. Un autoclave es un instrumento que permite la esterilizacin por calor tanto de slidos como de lquidos. La esterilizacin se realiza habitualmente a 121C, 1 atmsfera de sobrepresin durante un tiempo superior a 20 min. Un autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presin, y en algunos casos de un ciclo de secado para permitir secar el material slido (material de vidrio, instrumentos quirrgicos, tubos,...).

8 Mechero Bunsen.

Otros instrumentos. Adems del equipo antes citado el laboratorio de cultivo de tejidos deber estar equipado con otros instrumentos que, o bien no son imprescindibles para un laboratorio de tamao pequeo (por ej. el contador electrnico de clulas), o bien son instrumentos que forman parte de un laboratorio de uso ms general (centrfugas, equipo de purificacin de agua, balanzas, pH-metro, pipeteadores...).

8 Centrfugas. En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario disponer de una centrfuga refrigerada, preferentemente con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeo volumen (1 a 2 mL) a botellas de gran capacidad (250 a 500 mL). Normalmente, para la mayor parte de las aplicaciones bastar con un instrumento que desarrolle hasta 2000 g. La centrfuga se ha de instalar dentro de lo posible alejada de las cabinas de flujo laminar, para evitar las turbulencias de aire que genera.

8 Contador electrnico de clulas ("cell counter"). Un contador electrnico de clulas es un instrumento capaz de contar y medir partculas en suspensin. Este instrumento fue comercializado por Coulter Electronics, y a pesar que posteriormente se han desarrollado mtodos alternativos es an hoy en da el mecanismo ms empleado.

El sistema est formado por los siguientes elementos:



9 dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeo orificio que se introduce en la suspensin de partculas a contar, y un segundo electrodo que se introduce directamente en dicha suspensin. El tubo con el orificio est conectado a un manmetro de mercurio y a una bomba. El manmetro controla mediante el desplazamiento del mercurio la conexin y desconexin de los electrodos.

9 un amplificador electrnico de la seal, un analizador de altura de los pulsos, y una escala, conectados a los electrodos.

Cuando la vlvula que controla el manmetro se abre 0.5 mL de la suspensin entran en el interior del tubo por el pequeo orificio. Durante ese tiempo los electrodos estn conectados y registran y transmiten al equipo de amplificacin y anlisis de la seal las oscilaciones de resistencia que detectan. Cada vez que una clula atraviesa el orificio se produce una variacin de la resistencia proporcional al tamao. Estos datos se registran y se analizan.

8 Equipo de purificacin de agua. Es de gran importancia en la preparacin de los medios, de los aditivos, o en cualquier solucin que pueda estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan provocar alguna alteracin al cultivo. Por ello se utiliza siempre agua de la mxima calidad (tipo MilliQ) obtenida mediante equipos de doble destilacin o de intercambio inico y filtracin. Es muy importante la eliminacin de apirgenos, y restos de materia orgnica.

8 Pipeteadores. Se trata de dispositivos o instrumentos para el trasvase o medicin de fluidos. Los de uso comn en el laboratorio como las pipetas automticas y las pipetas, pero con la salvedad del uso de bombas acopladas a la pipeta, manuales o elctricas que permiten la aspiracin mecnica del fluido. Importante para mantener la asepsia y al mismo tiempo para la proteccin del operador. El aire bombeado es filtrado previamente.

Pipeteador automtico Sistema de aspiracin de lquidos



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