-Cultivos celulares a. Microorganismos b. Vegetales c. Animales - Fases de crecimento a. Sincronia de cultivos

CULTIVOS CELULARES

Conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento de las clulas 'in vitro', manteniendo al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas.

Cultivos celulares

Cultivos Primarios(El principio de la historia.....) A- Aislamiento del tejidoB- Diseccin/disgregacin C- Cultivo celular en recipiente (Placa Petri) (Cultivo primario) Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciacin es menor y su capacidad de divisin mayor.

Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran nmero de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenmeno clula.

Como ejemplo de reas de investigacin fuertemente dependientes de las tcnicas de cultivo celular son:

Ventajas de los cultivos celulares

Desventajas de los cultivos celulares

Clases de cultivos

Cultivo primario

El cultivo iniciado a partir de clulas, tejidos u rganos tomados directamente de un organismo.

Un cultivo primario debe ser considerado como tal hasta que se subcultive (o repique) con xito por primera vez.

En ese momento se considera una lnea celular.

Lineas celulares

Una lnea celular se origina a partir de un cultivo primario en el momento del primer subcultivo exitoso.

El trmino lnea celular implica que los cultivos consisten en numerosos linajes de clulas presentes originalmente en el cultivo primario.

Lneas celulares establesControl del entorno celular

Homogeneidad celular

Conocimiento del tipo celular

Economa

VentajasDesventajasFalta de diferenciacin

Inestabilidad de la lnea (mutaciones DNA)

Cultivos en monocapa

Las clulas exhiben una variedad de "comportamientos sociales", permitiendo la formacin de una monocapa que cubrir la correspondiente superficie de crecimiento (confluencia), lo que hace que su multiplicacin sea inhibida cuando establecen contacto entre s.

Cultivo primario en monocapa

Frasco para cultivo primario en monocapa

Frasco para cultivo primario en suspensin

Conceptos bsicos en el mantenimiento de una lnea estableSubcultivoTiempo de duplicacinCriogenizacinCiclo celular: Fases G1, S, G2, M y G0

Qu son y cmo se realizan los subcultivos?Objetivos: Propagacin de la lnea celularProduccin de clulas para la experimentacin

Usualmente se realizan al llegar a confluencia.

Evitar que el medio de cultivo est agotado.

Curva de Crecimiento (lneas estables): Fases del cultivoFase de latencia (perodo lag). Fijacin al sustrato e inicio del ciclo celular.Fase de crecimiento exponencial. El nmero de clulas se duplica aproximadamente cada 24 horas.Fase de confluencia. Las clulas del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibicin por contacto; suspensin: consumo del medio).Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las clulas entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las clulas en cultivo.

Subcultivos Celulares

Establecimiento de un cultivo celular- Cultivos primarios y lneas estables-Preparacin del medio de cultivo-Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad-Rutina en el mantenimiento de la lnea celular estable-Congelacin y almacenamiento de las lneas celulares

Equipo Bsico de un laboratorio de Cultivo CelularCampana de flujo laminarBao termostatizadoIncubador CO2Autoclave5. Nevera y Congelador6. Microscopio Invertido7. Micro centrifuga8. Depsito de Nitrgeno lquido

AutoclaveCualquier recipiente, herramienta... Debe ser esterilizada

Tanque de Nitrgeno lquidoCongelacin de lneas estables

Campana de Flujo laminarEsterilidad!! (no evita contaminacin un mal uso)

Incubador CO2Atmsfera controlada con elevada humedad y tensin de CO2

Micro Centrifuga

Suspensiones celulares (lavados, concentrados, subcultivos)

Microscopio InvertidoSeguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicacin, contaminacin.Control sobre cambios morfolgicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc.

Botellas y Placas de Cultivo

Puntos ImportantesEsterilidadAsepsiaHbito de trabajo

Preparacin cultivos

Cultivos secundarios y lneas establesSi uno o varios tipos de clulas de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario.

La heterogeneidad celular es menor: el medio utilizado determinar qu clulas se desarrollarn.

Las lneas estables son las que se obtienen por sub-cultivo y seleccin de cultivos secundarios. Tambin se pueden obtener a partir de tejidos tumorales.

Medios de Cultivo: Medios BaseMedios base: Eagles Basal Medium, Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM), RPMI1640, etc.Contienen: Hidratos de Carbono, cidos grasos esenciales y otros lpidos, aminocidos, sales minerales, oligoelementos.

*Cada lnea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio

Medios de Cultivo: AditivosAntibiticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y hongos)Tampn pH: Hepes, bicarbonato, etc.Indicador pH.Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (2-50%).Aditivos especficos: Suplemento de piruvato, suplemento de glucosa, etc.

Tamponadores de pHHepes Buffer tamponador que acta de manera muy eficiente en el rango 7,2-7,6

*Importancia de la ppCO2 en el mantenimiento del pH

H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3-

* Rojo Fenol (Phenol Red-Na) (Indicador de pH)

Propiedades fsico-qumicos del MedioCO2: Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO3-]pH.............................................................(7.0-7.7)Osmolaridad.............................................(290-320) mOsm/KgViscosidad................................................ Suero Temperatura............................................. 37C (mamfero)(aves: 38,5C; epitelio de ratn: 33C; insectos: 28C)