Presentador:

Kenneth Walker

Universidad de Chile

Facultad de Medicina

Escuela de Tecnología Médica

Curso de Microscopía Electrónica

Procesamiento de muestra

Usar Paraformaldehido al 4% p/v + Glutaraldehído 1% + 0.5 mM

clorhidrato de calcio por 3hrs a T° ambiente o 24hrs a 4°C.

Lavado en frío con una solución de sucrosa al 3.5% en buffer

fosfato salino 0.1M por 2hrs.

Lavado en una solución de clorhidrato de amonio 50 mM en

buffer sucrosa-fosfato + clorhidrato de calcio 0.5mM a pH 7.4

por 1hr a 0°C.

Lavar en frío con buffer maleato 0,1M con sucrosa al 3.5%.

Utilizado para la remoción de iones fosfato pH 6.5.

Luego, deshidratar en acetonas ascendentes.

La infiltración y polimerización a baja T° favorece la reactividad

antigénica.

Lowicryl: Resina de baja viscosidad a baja T°

La polimerización con radiación UV es independiente de la T° lo

que le permite polimerizar a la T° de infiltración en un tiempo mayor

o igual a 24hrs.

Estas resinas también pueden polimerizar químicamente a 60°C (2

a 3 días).

Impregnación e inclusión

For Resin Concentration

of solvent

Time in min T in°C

KM4 & HM20 30% 30 min 0

50% 60 min -20

70% 60 min -35

100% 2x60min -50

The Progressive Lowering of Temperature (PTL) Method

http://www.emsdiasum.com/

ImmunoGold

Bloqueo con suero de cabra o fetal bovino al 5% por 10 min,

diluido en TBS

Ac primario contra la proteína buscada en TBS + NGS (2.5%

suero de cabra, 2 mM HEPES, pH 7.2) al 1%

Ac secundario contra FC* conjugado con Au en TBS

Pasar por GA al 2% por 5 minutos para estabilizar los complejos

Ag-Ac.

Acs. Hechos en especies distintas para evitar reacciones cruzadas.

Nunca olvidar los tejidos controles a lo largo del procedimiento que son

necesarios para validar la técnica y el estudio mismo.

Contraste

Acetato de uranilo al 4% por 10 min.

y citrato de plomo de Reynolds 5 min.

Tetróxido de osmio 2% por 15min. Y citrato de

plomo de Reynold 3min

Montaje

Los cortes siempre son sensibles al haz

de electrones. Para mejorar su

resistencia, cubrirlos con FORMVAR en

una etapa final. Esto permitirá el mejor

acceso de los anticuerpos por ambos

lados del corte.

Resultados hipotéticos

GFP+ medial ganglionic eminence-derived cells were identified after GFP immunogold staining as mature

neurons 30 day after transplantation into the brain. The left picture shows a panoramic view of a mature

neuron (scale-bar= 2µm). The right picture is a higher magnification image showing morphoogical details such

as RER, mitochondria, synapsis (arrows) or nuclear pores.

Aparato de Golgi

Envoltura nuclear

Cromatina finaNucléolo

MitocondriasRER

Microfotografía electrónica por MET. Se observa una sinapsis en la que el botón sináptico (1) se encuentra

cargado de vesículas de secreción (NT).

Conclusiones

El método vela por la mantención de la mejor morfología y antigenicidad.

El método proporciona un buen contraste entre estructuras y marcaje.

La técnica satisface los requerimientos de la investigación.

Se requiere más información inicial para precisar el protocolo a seguir.

El estudio implica más técnicas a parte de la ME.

Bibliografía

1. H.K. Sreepathi, F. Ferraguti, Subpopulations of neurokinin 1 receptor-expressing neurons in the rat lateral amygdala display

a differential pattern of innervation from distinct glutamatergic afferents, Neuroscience, Volume 203, 17 February 2012,

Pages 59-77, ISSN 0306-4522.

2. Berryman MA, Rodewald RD. An enhanced method for post-embedding immunocytochemical staining which preserves cell

membranes. J Histochem Cytochem. 1990 Feb;38(2):159-70.