Microscopio electrnico de transmisin. (MEB)

Microscopio electrnico de transmisin. (MET)Equipo que permite la observacin, caracterizacin y estudio de la estructura y morfologa de muestras slidas polimricas mediante la difraccin de un haz de electrones.

Permite realizar estudios sobre la estructura de la dispersin de arcillas en nano compuestos y sobre la degradacin enzimtica de muestras polimricas.

Con MET puede realizarse anlisis qumico en diferentes niveles y obtener la distribucin de la composicin qumica en la muestra desde un nivel micro hasta manomtrico.

Adicionalmente contamos con capacidad para hacer tomografa y obtener imgenes tridimensionales en los niveles micromtrico y manomtrico.

PARTES.

Las partes principales de un microscopio electrnico de Transmisin son:

Can de electrones; El can de electrones produce un haz de electrones. Tenga en cuenta que este es un can de emisin termoinica. Termoelectrones son emitidos desde un filamento (ctodo) hecho de un alambre de tungsteno delgado (aproximadamente 0,1 mm) mediante el calentamiento del filamento a alta temperatura (aproximadamente 2800 K). Estos termoelectrones se reunieron como un haz de electrones, que fluye en la placa metlica (nodo) mediante la aplicacin de una tensin positiva (de 1 a 30 kV) al nodo. Si se hace un agujero en el centro del nodo, el haz de electrones fluye a travs de este agujero. Cuando se coloca un electrodo (llamado electrodo Wehnelt) entre el ctodo y el nodo y aplicar una tensin negativa a la misma, se puede ajustar la intensidad del haz de electrones.

genera el barrido electrnico que proporciona la imagen.Lentes magnticasencargadas de enfocar el haz electrnico.Sistema de vacoes una parte muy importante del microscopio electrnico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, se debe hacer un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas. Para conseguir este flujo constante de electrones se debe operar a bajas presiones. Esto se realiza para favorecer el contraste de carga entre ctodo y tierra sin que se produzca un arco elctrico.Placa fotogrficao pantalla fluorescente se coloca detrs del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada.Sistema de registroque muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una computadora.

usoPara utilizar un microscopio electrnico de transmisin debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta unmillnde veces.

En un microscopio electrnico los electrones se producen generalmente en un filamento, normalmente de tungsteno, parecido al de unabombilla, mediante un proceso conocido comoemisin termoinicao bien medianteemisin de campo. Los electrones emitidos se aceleran entonces con ayuda de unpotencial elctrico(medido en V, ovoltios) y se focalizan mediante lentes electrostticas o electromagnticas.Tcnicas y AplicacionesLa principal funcin del microscopio electrnico de transmisin es estudio de losmetalesymineralesy el estudio de lasclulasa nivel molecular. Siendo as un papel muy importante en la industria de lametalurgia. A su vez se utiliza en lamicrobiologa, para observar la estructura de losvirus. Tambin es usado en Anatoma patolgica, para diagnosticar partiendo de la ultra hper mega estructura celular

La microscopia electrnica de transmisin sirve para estudiar todo tipo de materiales siempre y cuando cuenten con la preparacin adecuada y tengan dimensiones dentro del rango nanometrico o incluso sub-micrometrico. Por sus caractersticas, es una herramienta importante para la caracterizacin estructural de materiales nano estructuradosde los cuales se puede obtener no solo informacin morfolgica, sino tambin cristalogrfica y de composicin qumica con la ayuda de la espectroscopia de dispersin de energa de rayos-X (EDS). En la modalidad de STEM es posible hacer estudios de dispersin de partculas y mapeos qumicos.funcionamiento del microscopio electrnico de transmisin.En el campo de la ciencia fsica moderna es primordial entender el comportamiento tanto del haz de luz como el de electrones, todas las aplicaciones pticas en cuanto a capturas y ampliacin de imgenes que usan este principio prestan gran utilidad para el desarrollo de las ciencias que incursionan en el microcosmos.. Son diversas las tcnicas que cumplen con estos propsitos, entre ellas, son dignas de ser citadas las siguientes:

Microscopia Confocal y de fluorescencia:propia para la observacin de imgenes topogrficas con carcter tridimensional de sus estructuras en diferentes tipos de muestras. Microscopia electrnica de Barrido y micro anlisis de rayos X:Explora las superficies de las muestras realizando un paneo sobre la misma y capturando la radiacin reflejada la cual se codifica en datos computacionales con la idea de reconstruir la imagen del espcimen. Microscopia electrnica de Fuerza Atmica:Una aguja de punta muy fina casi a nivel atmico explora la superficie de la muestra generando entre ambas un campo electro-magntico. El campo sufre variaciones correspondientes a las variaciones de rugosidad de la superficie muestreada. Las variaciones electromagnticas ocasionadas generan una informacin de corriente elctrica que debidamente tratada reconstruye la imagen de la superficie observada. Microscopia electrnica de Efecto Tnel:Conserva el mismo principio que el microscopio de fuerza atmica salvo que la intensidad del campo es mayor y realiza exploraciones bajo la superficie.

Microscopia electrnica de transmisin:A diferencia de los anteriores microscopios, este no explora superficies , por el contrario el haz de electrones incidente atraviesa la muestra o espcimen observado y la sombra de detalles finos o ultra-estructura es capturada en una pantalla fosforescente con propiedades de emisin de luz, ubicada en la parte inferior de la columna. El tener una adecuada preparacin de la muestra da lugar a una excelente definicin de imagen. Son mltiples las facetas el las que interviene este tipo de microscopio. As, en control de calidad sealamientos morfolgicos, conformacin de agregados, tcnicas forenses, determinacin de estratos en restauracin y diferenciacin histolgica entre otros..protectoras que vuelvan a aumentar la imagen primaria.Algunos instrumentos llevan incorporada una pantalla intermedia para facilitar la alineacin, pero no poseen en cambio este accesorio aquellos aparatos dotados de dos lentes proyectoras. La imagen final se observa en una pantalla fluorescente , y separando esta pantalla del camino del haz, se impresiona una placa fotogrfica con dicha imagen. Las dimensiones mas usuales para un microscopio de transmisin pueden ser: Del filamento a la lente condensadora 15 cm, y otro tanto de esta ltima al objeto, mientras que del objetivo a la pantalla que recoge la imagen final pueden haber unos 100 cm, el sistema completo deber ser rgido y capaz de alcanzar un vaco de 0.0001 mmHg con ayudas de bombas de difusin rpidas en serie con bombas rotatorias.

Otras partes importantes del aparato que no han sido representadas en los diagramas son la fuente de alimentacin para crear un potencial del haz, fuentes de alimentacin para las lentes magnticas , medidores de vaco, tornillos de alineacin, vlvulas de vaco , controles de aumento y enfoque, etc. De momento, nuestro inters mas inmediato se centra en la tcnica de preparacin de muestras. Comparacin entre microscopia electrnica de transmisin (MET) y microscopia electrnica de barrido (MEB).Preparacin de las muestrasEl proceso comienza con el tejido altamente hidratado y termina con el tejido virtualmente libre de agua y preservado en una matriz de resina. Existen muchos caminos para la preparacin de tejidos para Microcopia electrnica de transmisin, pero los mtodos siguen bsicamente ocho pasos:1. Fijacin primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se realiza con glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su accin se centra en las protenas as:(COOH-protena-NH2)2+ CHO- CH2-CH2-CH2-CHOEntonces:COOH-protena-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteina-COOH +H2O La penetracin del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en una hora por el glutaraldehido.

Lavado: Normalmente se hace con un buffer.Buffer: es necesario su uso debido a que el pH de los tejidos se baja drsticamente durante el proceso de fijacin. El uso de buffer mantiene el pH fisiolgico (7,2 a 7,4) los sistemas de buffer ms comunes son: fosfato, s-collidine, tris-maleato y cacodylate.Fijacin secundaria:es llevada a cabo por la accin del tetrxido de osmio, el cual reacciona principalmente con los lpidos. El tetrxido de osmio generalmente no penetra mas de 0,5 mm en una hora.Deshidratacin: La filosofa de la deshidratacin es el reemplazo del agua usando etanol en series 70% 85% 95% y etanol absoluto. Infiltracin con solventes transicionales: procedimiento por el cual hay transmisin de fluidos gradualmente reemplazado por soluciones intermediarias altamente miscibles con los agentes deshidratantes, la mayora de los protocolos emplean un solvente transicional entre el deshidratante y la resina.Infiltracin con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son introducidas reemplazando dentro de los tejidos despus de la deshidratacin. La concentracin del solvente es minimizada gradualmente incrementando las concentraciones de resina hasta llegar a la resina pura. Inclusin: sumergir el tejido en la resina pura.

Polimerizacin de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerizacin aumentando la temperatura. Recipientes de uso comn para la inclusin de las muestras en MET. Normalmente las muestras se marcan con un trozo de papel indicando algn tipo de convencin que ilustre posteriormente su contenido.

Los tejidos debidamente incluidos son cortados con el ultramicrotomo, dependiendo del tipo de microtomo utiliza cuchillas de diamante o vidrio (la ms comn). Procesador automtico de tejidos.MICROSCOPIA ELECTRNICACONCEPTO Y TIPOSUn microscopio electrnico es aqul que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imgenes de objetos diminutos. Los microscopios electrnicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 500.000 aumentos comparados con los 1000 de los mejores microscopios pticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones. Existen dos tipos principales de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin y el microscopio electrnico de barrido.Microscopios Electrnicos

1980 Se desarrolla el primer Microscopio Electrnico de Barrido.

1933 Se desarrolla el primer Microscopio Electrnico de Transmisin.

Resolucin 200 nm0.1 nm0.5 nm

CAON DE ELECTRONESEsquema del can termoinico

Esquema del can de emisin de campo

Punta de un can de emisin decampo

21 de Octubre de 2004Coloquio Material particulado y salud

INTERACCION DE LOS ELECTRONES CON LA MUESTRAElectrones Pares huecos yabsorbidoselectronesElectrones AugerElectrones retrodispersadosHaz incidente de altaenergaElectrones secundariosRayos XElectrones dispersadoselsticosHaz transmitidoElectrones dispersadosinelsticosRayos X deBremsstrahlungLuz visible

Preparacin del Material BiolgicoDeshidratacinevaporacin sublimacinFijacinPost-Fijacin y Primer ConstrasteDeshidratacinIntermediarioInclusinMontaje Sobre SoporteContrasteObservacinCrioultra-MicrotomaAldehdosTetraxido de osmioSerie de alcohol etlicoSerie de acetonaSerie de materialPlstico hidrosolubleResinas epxicasResinas acrlicasResinas poliestricasRejillas con membrana sin membrana

Ranuras con membrana21 de Octubre de 2004Coloquio Material particulado y salud

Preparacin del Material BiolgicoTECNICAS ESPECIALESVENTAJAS Se analiza la muestra clula por clula.

Se diagnostican numerosas Enfermedades.DESVENTAJAS Si una muestra se deshidrata sin un tratamiento previo se producen alteraciones.1. Citoquimica2. Inmunocitoqumica3. Hibridacin in situ de cidos nucleicos4. La autorradiografa ultraestructural5. MorfometraAPLICACIONESEQUIPO PARA LA PREPARACION DE MUESTRAS MEB Y MET

Ultramicrotomos Reichert-Jung

Recubridor de muestras BALZERS

Secadora Punto Crtico BALZERS

Sistema de fotografa digitalOtros equipos: Ionizadora Evaporadora.

Adelgazador inicoPREPARACION DE MUESTRASNormas Generales: No deben contener lquidos Su superficie debe ser conductora de corriente electrica.Tcnicas de Recubrimiento:

Con Oro

Con CarbonoPara el estudio de muestras en microscopa electrnica de barrido han de tenerse en cuenta unas consideraciones de tipo general, tales como el tamao de la muestra, montaje, limpieza y recubrimiento. La muestra ha de tener un tamao de acuerdo con el que admita la cmara de muestras del microscopio. Debe fijarse a un soporte metlico con un tipo de adhesivo que asegure un buen contacto elctrico a tierra y evitar desplazamientos de la imagen que puedan perturbar la obtencin de micrografas o el estudio de microanlisis segn nuestro inters. Las pinturas de plata y grafito son los adhesivos que normalmente se utilizan.Las muestras no conductoras tales como plsticos, cermicas, vidrios , tejidos, etc, se cargan durante la irradiacin de los electrones, provocando la desviacin del haz electrnico y como consecuencia de ello la imagen. La solucin a esto es recubrir la muestra con una pelicula conductora, de espesor comprendido entre 15 y 25 nm.La eleccin del material con el que se va a recubrir la muestra depende fundamentalmente del estudio que se va a realizar. As para la observacin de imgenes de electrones secundarios el oro y el oro-paladio son los materiales que dan mejor resultado pues al ser elementos pesados, producen mayor emisin. Cuando lo que se pretende es un estudio microanaltico es recomendable emplear carbono ya que el bajo nmero atmico de este elemento lo hace prcticamente transparente a los rayos X emitidos por la muestra.

Schematic of the Detector SnoutTEM vs. SEM

Resolucin hasta 20 .Muestra debe ser montada en bloque de resina y teida.Muestras delgadas. Resolucin hasta 200 .

La muestra debe ser cubierta en oroEl microscopio electronico de transmision (MET) produce un haz de electrones que incide sobre una muestra, estos electrones atraviesan la muestra recopilando informacin acerca de la estructura interna del material.

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISIONMICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION

EL SISTEMA DE LENTES Y APERTURAS DE UN MICROSCOPIO ELECTRONICO ES:

1.- LENTES CONDENSADORAS 1 Y 22.- LENTE OBJETIVO3.- LENTES DE DIFRACCION4.- LENTES INTERMEDIAS5.- LENTES PROYECTORAS

APERTURAS1.- CONDENSADORA2.- OBJETIVA3.- AREA SELECTA DESCRIPCION DEL INSTRUMENTO

FEG TEM Philips Tecnai TF20123455678910Can de Electrones.Columna (C1, C2, lente objetiva y rea selecta).rea del espcimen del Compustage.Pantalla principal.Panel de control.Botones de control.Detector de RayosX.Detector del STEM.Detector del EELS.Dewar o trampa fra.Partes principales del FEG TEM

Filamento (Ctodo)Tungsteno: 0.1 mm LaB6 nodo Es un disco metlico perforado y situado en un plano perpendicular al eje ptico y a pocos centmetros del filamento. Est polarizado a un potencial (40-100kV) positivamente respecto a este. Esta carga positiva atrae a los electrones que son acelerados a lo largo del gradiente del campo electrosttico establecido entre nodo y ctodo Cilindro de Wehnelt. Es un disco perforado, situado entre ctodo y nodo. Se polariza con un potencial de unos 200 a 2000 Volts respecto al filamento. Canaliza y regula el haz electrnico. El campo electrosttico establecido entre nodo y Wehnelt es una lente elctrica que recoge la gran mayora de electrones desprendidos por el filamento, los canaliza y enfoca. Los electrones estn obligados a pasar por las perforaciones.de ambos electrodos, son fuertemente acelerados y salen del nodo siguiendo trayectorias casi paralelas. El Condensador.Formado por una o dos lentes magnticas dispuestas una a continuacin de la otra. Enfoca el haz electrnico de tal forma que permita iluminar debidamente la preparacin. Las dos principales caractersticas del condensador son la variabilidad del ngulo de apertura y la variabilidad de la intensidad del haz.El Portaobjetos Todos los componentes que se hallan cerca de las piezas polares de cualquier lente ( y por ende la preparacin) deben ser de materiales no magnticos a fin de evitar las distorsiones del campo magntico. El objeto a observar debe sostenerse por un substrato permeable a los electrones, formado comnmente por una pelcula muy delgada- de unos 150- de una sustancia como el colodin (el colodin es una solucin de diferentes nitratos de celulosa (algodn plvora celoidina etc) disuelta por ejemplo, en acetato de amilo)o el Formvar (polivinilo y formaldehdo), que tiene suficiente resistencia mecnica como para sostener el objeto y resistir el impacto electrnico. Como esta pelcula es extremadamente fina, debe estar bien sujeta y esto se consigue disponindola extendida sobre una rejilla de plancha de cobre, aluminio platino muy fina de 2.3 3 mm de dimetro, segn los casos. Can de ElectronesEs un dispositivo en donde se incorpora una fuente que acta como lente para enfocar los electrones.1.- CENTRADO DE LAS APERTURAS- APERTURA CONDENSADORA- APERTURA OBJETIVA- APERTURA DE AREA SELECTA

2.- AJUSTE DE LA ALTURA AUCENTRICA

3.- CORRECCION DEL ASTIGMATISMO EN LAS LENTES.ALINEACIONES MAS USUALES PARA LA OPERACIN OPTIMA DEL TEMCENTRADO DE APERTURAS

C1C2AJUSTE

APERTURA CONDENSADORA

A OAJUSTEAPERTURA OBJETIVACENTRADO DE APERTURAS

AJUSTECOLOCACION DELA APERTURAA SPERMITE REALIZAR LOS PATRONES DE DIFRACCION SELECCIONANDO UN AREA DETERMINADA POR MEDIO DE UNA APERTURA O ILUMINANDO UNA AREA CON EL HAZ (DIFRACCION DE HAZ CONVERGENTE).APERTURA DE AREA SELECTASISTEMA DE VACIO

PRINCIPALES COMPONENTES DEL SISTEMA DE VACIO:

1.- TANQUE DEL BUFFER2.- CAMARA DE PROYECCION3.- COLUMNA4.- CAON1234COMPUSTAGESE PRESENTA EN 3 DIMENSIONES LOS EJES EN LOS QUE SE PUEDE MOVER LA MUESTRA.

Rayos X (EDS)MUESTRAElectrones Inelsticamente DifractadosElectrones Elsticamente DifractadosHAZ DE ELECTRONES

Imgen Espectroscopa Filtrado de por STEM por EELS EnergaElectrones Inelsticamente Difractados

Imgen por Difraccin Imgen de Contraste Electrnica HREMElectrones Elsticamente DifractadosPrincipales Seales colectadas en el TEM53 DESCRIPCION DEL INSRUMENTODETECTORES LOS PRINCIPALES DETECTORES SON:

1.- DETECTOR DE EDS

2.- DETECTOR DE STEM

3.- DETECTOR DE EELS

PATRONES DE DIFRACCIONDIFRACTAR EN UNAREA SELECTAFORMASCONVERGER EL HAZ EN EL ESPECIMENPropiedades cristalinas del especimen: Simetra. Distribucin de huecos. MorfologaOrientacin con respecto al haz electrnico.

Orden de medida: Nanometros PATRONES DE DIFRACCION

Sistema de imagen de un MET: a) Proyeccin del patrn de difraccin vista desde la pantalla y b) proyeccin de la Imagen sobre la pantalla21 de Octubre de 2004Coloquio Material particulado y salud CONTRASTEUn haz de electrones, al atravesar una muestra experimenta un proceso de dispersin por los tomos que la forman.NUCLEOSATOMICOSELECTRONES DEL HAZDISPERSIONELASTICAINTERACCIONDISPERSIONINELASTICACONTRASTE

CONTRASTETIPOS

FaseAmplitudM: muestraLO: lente objetivaPF: plano focalP: pantalla DIFRACCION CONTRASTEMODOS DE FORMACION DE IMAGEN

Campo Claro: a) imagen formada con el haz transmitido y b) difraccin por Seleccin de rea.Campo Obscuro: a) desplazamiento del diafragma, b) inclinacin del haz y c) Un Obstculo al haz de electrones..Donde: M: muestra ,LO: lente objetiva, DLO: diafragma lente objetiva,DSA: diafragma de seleccin de rea, LI: lentes intermedias, LP: lenteproyectora y P: pantalla

AJUSTE DE LA ALTURA EUCENTRICA

CORRECCION DE ASTIGMATISMO EN LA LENTE OBJETIVAMuestras son tipicamente de 3mm de diametro y