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Preparación de métodos de análisis por

espectrometría de masas: aplicaciones clínicas

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Conflicto de Intereses

Declaro no tener

ningún potencial

conflicto de interés


3

SUMARIO


4

SUMARIO

Metodología

Aplicación Clínica


7

Espectrómetros de masas

ICP-MS

LC-MS/MS

GC-MS/MS


8

Espectrómetros de masas

Tecnología Instrumento Analitos

ICP-MS 7700x ICP-MS

(Agilent)

Suero: Al, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Se, Ti, Zn

Sangre: As, Cd, Hg, Pb

Orina: As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, I, Ni, Pb, Zn

GC-MS/MS Scion TQ

(Bruker)

Suero:

AGCML (C22:0, C24:0 y C26:0)

Orina:

Perfíl de ácidos orgánicos (23 analitos)

Confirmación de drogas de abuso

LC-MS/MS QTRAP 5500

(AB Sciex)

Sangre (Cribado Neonatal):

Acilcarnitinas y Aminoácidos

Plasma:

Metanefrinas libres


9

SUMARIO

Introducción

Aplicación Clínica


10

¿Cuántos tipos de espectrómetros de masas hay?


11

¿Como funciona un espectrómetro de masas?

Cuadrupolo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

12

¿Como funciona un espectrómetro de masas?

Cuadrupolo

Un cuadrupolo es un filtro de iones

Se aplican voltajes de

radiofrecuencias (RF)

y corriente contínua (DC)


¿Como funciona un cuadrupolo?

13

+

+

– –

+

VRF Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

+

+

–

–

+

VRF



+

+

– –

+

VRF



+

+

– – +

VRF



+

+

–

–

+

VRF



+

+

– –

+

VRF



+

+

–

–

+

VRF



+

+

– –

+

VRF



+

+

– – +

VRF



+

+

–

–

+

VRF



+

+

– –

+

VRF



+

+

–

–

+

VRF



+

+

– –

+

VRF



+

+

– – +

VRF



+

+

–

–

+

VRF



+

+

– –

+

VRF



+

+

–

–

+

VRF



+

+

–

–

+

VRF


39


40

¿Como funciona un espectrometro de masas?

Cuadrupolo

Señal

m/z

+ +

+

+

+

314

Aplicamos unos voltajes que solo permitan pasar la masa: 314 (ión verde)

Modo SIM Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

41

¿Como funciona un espectrometro de masas?

Cuadrupolo

Señal

m/z

+

+

+

+

+

+

50 - 1000

Modo SCAN

El cuadrupolo también puede hacer un barrido de masas


42

Analizador de triple cuadrupolo

+ + +

+

+ +

314 210

Se obtiene una mayor Sensibilidad (Mejor relación S/N)

Se obtiene una mayor Especificidad (MS2 o MS3)

Q1 Q3

q2

Transición


43

Analizador de triple cuadrupolo

Diseño en forma de C

Q1

Q3

q2


../../../../../Documents and Settings/My Documents/AB Sciex QTrap 5500/Video/QTRAP5500_720x404_102108.wmv

N

H

TFA N

H

TFA

PM = 91

PM = 118

PM = 140

a)

b)

ANFETAMINA-N-TFA PM = 231

Fragmentación a

Fragmentación b

+ +

+


ANFETAMINA-N-TFA

+ + +

+

+ +

231 140, 118, 91

3 transiciones Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

46

SUMARIO

Introducción

Metodología


Feocromocitoma/Paraganglioma

47

Los feocromocitomas / paragangliomas son tumores poco frecuentes

(2-8 casos/millón personas/año) que se forman a partir de células

cromafines del sistema nervioso simpático

Los paragangliomas se suelen

formar cerca de la arteria carótida y

a lo largo de las vías nerviosas de la

cabeza, el cuello y la columna

vertebral



48

Los

feocromocitomas

se forman en la

médula

suprarrenal


49


Un feocromocitoma va a producir cantidades

anormalmente elevadas de catecolaminas

(adrenalina/epinefrina y noradrenalina/norepinefrina)



50

o HTA sostenida

o Cefalea

o Sudoración excesiva

o Palpitaciones

o Debilidad

o Palidez extrema

Síntomas:



51 Genética Molecular Aplicada al Diagnóstico de Enfermedades Hereditarias (2014-2015). Ed Cont Lab Clin; 21: 34-50



52

Metabolismo: Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

53

Metanefrinas

Eisenhofer G, Peitzsch M. Laboratory evaluation of pheochromocytoma and paraganglioma. Clin Chem. 2014;60(12):1486-99


Metanefrinas

54

Därr R, Kuhn M, Bode C, Bornstein SR, Pacak K, Lenders JWM, Eisenhofer G.

Accuracy of recommended sampling and assay methods for the determination of plasma-

free and urinary fractionatedmetanephrines in the diagnosis of pheochromocytoma and paraganglioma:

a systematic review. Endocrine. 2017;56(3):495-503.


Metanefrinas

55

Därr R, Kuhn M, Bode C, Bornstein SR, Pacak K, Lenders JWM, Eisenhofer G.

Accuracy of recommended sampling and assay methods for the determination of plasma-

free and urinary fractionatedmetanephrines in the diagnosis of pheochromocytoma and paraganglioma:

a systematic review. Endocrine. 2017;56(3):495-503.


Metanefrinas plasmáticas

56

Eisenhofer G, Peitzsch M. Laboratory evaluation of pheochromocytoma and paraganglioma. Clin Chem. 2014;60(12):1486-99


57

Metanefrinas plasmáticas (HUCA)

Las metanefrinas plasmáticas libres

son separadas mediante extracción

sólido-líquido (SPE), usando 500 µL

de muestra (plasma-EDTA) y

cartuchos de extracción de

intercambio catiónico


Metanefrinas plasmáticas (HUCA)

58

Las muestras son analizadas por

LC-MS/MS, usando un gradiente

de 7 min. (formato de amonio con

un 0.2% de ácido fórmico, pH=3.2

(Buffer A); y metanol con un

0.2% de ácido fórmico (Buffer B))

Pursuit 3 PFP MetaGuard

10 x 2.0 mm

Pursuit 3 PFP 150 x 2.0 mm



59

Tabla. Transiciones y resto de parámetros utilizados en el espectrómetro de masas para la

monitorización de metanefrina y normetanefrina (y sus análogos deuterados)



60

Figura. Cromatograma representativo de normetanefrina, metanefrina y 3-metoxitiramina


Validación del método

61

Las características analíticas del método

(linealidad, límites de detección (LoD) y

cuantificación (LoQ), precisión, veracidad y

estudio comparativo) fueron evaluadas

siguiendo las guías del CLSI

Documentos:

EP6-A

EP9-A2 IR

EP15-A2

EP17-A

EP21-A


62

https://clsi.org/standards/products/clinical-chemistry-and-toxicology/documents/c62/

Validación del método Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Comparación de un pool de muestras

con dos niveles de metanefrinas

(267 and 1333 pg/mL) pre- y post-

extracción, analizados durante 5 días

(20 réplicas)

Estudio de Recuperación

63

Metanefrina

70% (56-83%)

Normetanefrina

52% (31-89%)


La linealidad fue evaluada entre 10 y 2000 pg/mL, obteniéndose

coeficientes de correlación > 0.995

Linealidad

64

Valor Normal

< 100 pg/mL


Linealidad

65

La linealidad fue evaluada entre 10 y 2000 pg/mL, obteniéndose

coeficientes de correlación > 0.995

Valor Normal

< 165 pg/mL


66

Calibradores

Los patrones de calibración son preparados en una solución de

fosfato amónico, 10 mmol/L, pH 6.5


Calibradores

67

Estos patrones muestran un rendimiento similar al obtenido con

patrones preparados en un pool de muestras de plasma previamente

tratadas con carbono activado (para eliminar las metanefrinas

endógenas) y dopadas con metanefrinas exógenas


La precisión fue calculada mediante un análisis en triplicado (durante

cinco días) de cuatro niveles de metanefrinas en solución de fosfato

amónico (10, 20, 100 y 500 pg/mL) y un control interno de calidad de

Chromsystems (60 y 100 pg/mL de MN y NMN, respectivamente)

Precisión

68

CV (%) - MN CV (%) - NMN

LOQ (10 pg/mL) 11,0 10,9

Otros niveles < 7,5 < 7,8


El arrastre fue estudiado

analizando dos muestras

con concentraciones

elevadas (2000 pg/mL)

y bajas (50 pg/mL)

de MN y NMN

Efecto Arrastre

69

No se observó un efecto de arrastre para este método,

de acuerdo al test de los rangos con signo de Wilcoxon


70

Comparación de métodos

El estudio comparativo con un ELISA (n=22) reveló un coeficiente

de correlación de 0.68 para MN y 0.98 para NMN

La diferencia media fue de un -28% para MN (estadísticamente

significativa) y 16% para NMN (no estadísticamente significativa)


71

QC Interno Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

72

QC Interno - Clinchek

Metanefrina Normetanefrina

QC Normal Patológico Normal Patológico

Teórico 58.2 238 115 381

Media 52.8 217 105.3 346

CV (%) 8.2 4.8 8.1 6.8

Sesgo (%) -9.2 -8.9 -8.4 -9.3

Resultados 2017 (n=52)


73

QC Interno - Clinchek

Metanefrina Normetanefrina

QC Normal Patológico Normal Patológico

Teórico 58.2 238 115 381

Media 52.8 217 105.3 346

CV (%) 8.2 4.8 8.1 6.8

Sesgo (%) -9.2 -8.9 -8.4 -9.3

Resultados 2017 (n=52)


74

QC Externo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

75

QC Externo

Bajo nº de

participantes


76

QC Externo

Metanefrina

-8.9%

Normetanefrina

-7.0%

Promedio de 10

muestras sobre 12

(ciclo 2017)


77

¿Que pruebas se deben realizar?


78


Nº peticiones


79

Metanefrinas fraccionadas urinarias

Nº peticiones
